TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINATE

QUE ES LA TECNÓLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE?

Conjunto de técnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. Usase para obtener proteínas a gran escala, por exemplo con esta técnica unha bacteria ou virus pode producir unha proteína humana.

El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante fue posible gracias a varias líneas de investigación:a) Conocimiento de las

enzimas de restricción b) La replicación y la

reparación de ADNc) La replicación de virus y

plásmidos d) La síntesis química de

secuencias de ADN

¿CÓMO CORTAR Y PEGAR EL ADN? ENZIMAS DE RESTRICCIÓN

Enzimas de restricción actúan como “tijeras moléculares”. Éstas cortan la doble cadena de ADN a través de los fosfatos sin dañar las bases. El descubrimiento de estas enzimas dio origen a la ingeniería genética

Las enzimas de restricción pueden dejar dos tipos de extremos. En el 1ª caso, el corte genera nucléotidos de simple cadena llamados extremos cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ligasa. En el 2ºcaso, se generan extremos doble cadena(extremos romos). En este caso las ligasas pueden unirlos pero no son complementarios, la unión será más inespecífica.

¿Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias?

Lós plásmidos (pequeñas moléculas de ADN circular presentes en muchas bacterias) contienen uno o más genes de resistencia a antibióticos y son capaces de autorrerplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación. Esto les permite replicarse de manera independiente del ADN genómico.

Se puede crear una molécula de ADN recombinante usando un plásmido. •Este proceso consta de las siguientes etapas:•Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas de restricción, para generar extremos cohesivos.•Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los extremos del plásmido y los del ADN a insertar sean complementaris y pueden unirse.•Unimos el gen que queremos introducir por medio de la enzima ligasa y luego se introduce el plásmido con la ayuda de antibióticos.

Dado que todas las copias del gen provienen de una sola molécula multiplicada a partir de una única bacteria que dio origen a la colonia, a esta técnica se le conoce con el nombre de clonación.Un clon es un grupo de células u organismos genéticamente idénticas.El uso de fragmentos de ADN como vectores sirven para transferir material genético de un organismo a otro.

¿Cómo amplificar el ADN? Reacción en cadena de la polimerasa?

La reacción en cadena de la polimerasa se basa en la separación de ambas hebras de ADN, de la posterior unión de pequeños fragmentos y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de la muestra. Así se obtienen dos copias idénticas por cada molécula en cada ciclo de reacción. Para llevar a cabo esta reacción se requiere de una enzima polimerasa que sea capaz de soportar la alta temperatura del proceso de desnaturalización. Esta enzima es una ADN- polimerasa especial obtenida de una bacteria termófila, resistente a altas temperaturas

¿Cómo encontrar el gen adecuado? Imanes biológicos: sondas y anticuerpos

Las técnicas más empleadas para localizar fragmento de un determinado genoma es la hibridación in situ,. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o químicamente.La sonda “navega” por el interior de la célula hasta encontrar una secuencia complementaria a ella. Una vez que esto ocurra se formará una doble cadena que permitirá no sólo detectar la presencia de esta secuencia, sino indicar el lugar específico que ocupa dentro de la célula.

¿cómo estudiar la expresión de diversos genes?La electroforesis en gel es uno de los métodos más utilizados en los laboratorios para separar ácidos nucleicos o proteínas, de acuerdo con su tamaño. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las moléculas a lo largo de un gel sometido a un campo eléctrico. La carga eléctrica sirve como fuerza impulsora que atrae las moléculas cargadas negativamente hacia el otro extremo del gel que posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel; comúnmente se utiliza agarosa. Las moléculas más grandes correrán más retrasadas en el gel que las moléculas más pequeñas.

¿cómo estudiar la expresión de diversos genes?

Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denomina Northern Blot( en alusión al científico que lo inventó).

Tècnica de Southern

Northern Blot

¿Cómo sacar fotos de genes activados? MicroarreglosOtra técnica que emplean la hibridación de sondas

específicas marcadas es la de microarreglos, que consta de una membrana dividida en celdillas que poseen adheridas sondas que representan un gen en particular. En conjunto, estas celdillas contienen todos los genes conocidos de un organismo. De esta manera, cuando se coloca una muestra en estos chips se irá hibridando cada gen que se encuentre en la muestra con su sonda correspondiente en la casilla determinada. Cuando una celdilla da positivo, quiere decir que eses gen determinado está presente en la muestra.

FIN