Técnicas moleculares I“Tecnología del ADN”

Estructura y características de los ácidos nucleicos

mRNA

Propiedades físico-químicas de los AN

Temperatura de melting

Procariotas vs Eucariotas

Genoma de un mamífera3 Gb

Genoma de E.coli1,2 Mb

Tecnología del ADN recombinante

Clivaje del ADN en sitios específicos mediante endonucleasas de restricción, que facilitan el aislamiento y manipulación de genes.

Hibridización de AN que hace posible detectar secuencias específicas de ADN y ARN.

Clonado de ADN usando tanto vectores de clonado como la técnica de PCR

Secuenciación de los nucleótidos que componen un determinado fragmento de ADN

Monitoreo de la expresión de genes en una célula mediante microarrays

Enzimas como herramientas de la tecnología del ADN

Clivaje de secuencias específicas del ADN: Enzimas de restricción

En general reconocen secuencias palindrómicas

Extremos romos

Extremos cohesivos

5’ extendido

3’ extendido

Técnicas electroforéticas: separación, purificación e identificación de AN

Permiten separar lasmoléculas de AN portamaño.

Geles de: Agarosa

Poliacrilamida

Clivaje y purificación de secuencias específicas de ADN

MAPA DE RESTRICCION PURIFICACIÓN DEL ADN

Marcaje de fragmentos de ADN: ADN polimerasa y Polinucleótido quinasa

Oligonucleótidos: son fragmentos cortos de AN de simple cadena, cuyasecuencia es conocida y se encuentra marcado para su posterior seguimiento

Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Southern blot

Técnicas de detección de secuencias de AN específicas: Northern blot

Ejemplos de Southern blot y Northern blot

Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda

Calle 1-9: muestras a chequearCalle L: ladder, patrón de tamañoCalle 10: control positivo

Gel teñido con BrEt Membrana incubada con sonda

Calle M: ladder, patrón de tamaño

Detección de secuencias de AN específicas: Hibridización in situ

Clonado de ADN: Enzima ADN ligasa y vectores de clonado

Componentes mínimos:

1- Origen de replicación2- Gen marcador de selección3- Sitios de restricción “polylinker”

Vectores de clonado: Plásmidos

Estructura CCC y su tamaño es de 3-10 kb y aceptan insertos de hasta 10 kb

Otros tipos de vectores

Fagos: 50 kb y aceptan 15 kb

Cósmidos: híbrido plásmido y fago L(30-40 kb)

Fásmidos: híbrido plásmido y fago M3

Cromosomas artificiales: BACs, PACs y YACs (100-500 kb)

Transferencia de la químera de ADN a la célula huesped

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Ciclos:

Desnaturalización(92-95 ºC)

Hibridación(35-60 ºC)

Polimerización(72 ºC)

http://www.dnalc.org/resources/3d/19-polymerase-chain-reaction.html

PCR : incorporación de secuencias de restricción

EJEMPLO: Objetivo comparar genomas y aislar gen X del jerbo.

Aislar ADN genómico de ambos animales e identificar y comparar gen X en ambas especies

Calle L: Ladder patrón de tamañoCalle 5, 7 y 9: controles negativoCalle 6: ADN del jerbo digerido con ER1Calle 8: ADN del ratón digerido con ER1Calle 10: gen X de ratón

Southern blot

Gen x jerbo

ER1 ER2ER2

ER3ER3

L 3 1 2

purificación

del gen

Gen x jerboPCRER3

ER3

Digerir con ER3 plásmido y fragmento de PCR

ER1

ER2

ER3

+ gen X + ADN ligasa

Transformar bacterias

Ligación

Chequeo de colonias

Extracción de ADN plasmídico:

TECNICA DE MINIPREP

Introducción a los TP 1 y 2

Extracción de ADN plasmídico a partir de bacteriasMiniprep- Hidrólisis alcalina

Cuantificación y análisis de pureza

Chequeo del extracto mediante electroforesis en gel de agarosa

TP nº 1: Extracción y cuantificación de DNA plasmidico