Técnicas moleculares II“Tecnología de Proteínas”

Estructura y características de las proteínas

Propiedades físico-químicas de los aminoácidos

Procariotas vs Eucariotas: técnicas de extracción

• Ruptura mecánica directa• Alta presión• Sonicación• Bolitas de vidrio• Soluciones hipotónicas• Detergentes

Fraccionamiento subcelular

Centrifugación Diferencial vs. Centrifugación en gradiente

Técnicas electroforéticas: Isoelectroenfoque (relación carga/masa)

Técnicas electroforéticas: SDS-PAGE (independizarse de la carga)

SDS-PAGE

¿Por qué vemos las bandas proteicas en el gel?¿Una banda en un gel SDS-PAGE corresponde aun único polipéptido?

Técnicas electroforéticas: Geles bidimensionales

Los puntos rojos son proteínas comunesLos puntos azules proteínas específicas

Técnicas que involucran la utilización de anticuerpos

• Western blot• Inmunohistoquímica• Inmunoprecipitación• ELISA

Western blot

Inmunohistoquímica

Técnicas cromatográficas

Técnicas cromatográficas: tipos de columnas

HPLC(High-performance liquid chromatrography)

Introducción a los TP 3, 4 y 5

Extracción de proteínas totales

Cuantificación utilizando método de Bradford

Chequeo del extracto mediante electroforesis en SDS-PAGE

Análisis de una proteína pura mediante Western blot

TP nº 3: Extracción y cuantificación de extractos proteicos

• Extracción de proteínas a partir de distintos tejidos, utilizando métodosmecánicos y solución de lisis con detergentes.• Cuantificación de proteínas por métodos colorimétricos: BRADFORD

Curva de calibración

y = 0,8409x + 0,3545

R2 = 0,986

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

y = 0,8816x

R2 = 0,983

0,000

0,0500,100

0,150

0,2000,250

0,300

0,350

0,4000,450

0,500

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Interpolar la absorbancia de las muestras en la curva

TP nº 4: SDS-PAGE y tinción con Coomasie blue

Gel de proteínas extraídas de distintos tejidos de rata

Gel de distintas concentraciones de la proteína IgG

Rf = Dc/DtGraficar log(PM) vs Rf para el ladderExtrapolar el Rf de las bandas de las muestras en la curva

TP nº 5: Western blot