Técnicas Microbiológicas

Reyna Alonso Luviano

Diagnóstico Microbiológico

• Identificar el microorganismo causante de infección o enfermedad. Se trata de conocer la causa de la infección para proceder a su tratamiento y tomar medidas necesarias.

• Parte de la información acumulada por el clínico (historia clínica del paciente, síntomas y signos, diagnóstico clínico probable)

Tipos de Diagnóstico

• Toma de muestra: Evitar contaminación• Etiquetado de la muestra• Transporte (medios de transporte)• Procesamiento en el laboratorio de microbiología:

• Observación microscópica• Aislamiento, cultivo, contaje…

Microscopía

• Ayuda a valorar su propiedad e indicar la naturaleza del agente patógeno.

• Las muestras pueden ser de dos tipos: frotis secos (sobre un portaobjetos y se fijan) y preparaciones húmedas.

Tinción

• Hace posible estudiar sus características tales como tamaño, forma, propiedades químicas y estructuras.

• El índice de refracción de las bacterias es similar al del

fondo oscuro y es necesario incrementar el contraste por el uso de tinciones

Tinción Gram

• Tinción básica violeta, yodo, decoloración con acetona y contratinción con carbol fucsina o safranina. Hay gramvariables (Gardnerella vaginalis) y las micobacterias no se tiñen.

• Ácido-alcohol resistentes. Ácidos grasos de cadena larga: propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos.

• Llamada tinción de Ziehl-Neelsen:

– Carbol fucsina caliente – decoloración con ácido sulfúrico concentrado y alcohol;– Se contratiñen con malaquita verde o azul de metileno. Las micobacterias aparecen rojas contra un fondo verde o

azul.

Tinción Fenol auramina

• Frotis secos y secados con calor se tratan con fenol de auramina

• Se decoloran con HCl al 1% en alcohol metilado industrial, seguido de solución diluida de permanganato de potasio.

• Los especímenes se observan bajo luz ultravioleta con el objetivo de 40x y las micobacterias brillan en tonos verdes y amarillos contra un fondo oscuro.

Acridina naranja y fluoresceína

• Usadas en miscroscopía de fluorescencia.• Acridina de naranja: usada para demostrar

bacterias que no se diferenciaron bien con la tinción Gram.

S. aureus

Gram+ S. pneumoniae Gram- (Neisseria sicca)

BAAR Mycobacterium bovis

Cultivo

• Aislamiento, identificación y determinación de la susceptibilidad a antibióticos.

• Recolección por medio de hisopos • La sangre se deposita en recipientes

especiales para probar la presencia de bacterias

• El esputo y orina se recolectan en contenedores estériles.

Pruebas Bioquímicas

• Reacciones bioquímicas en la identificación de bacterias. Pruebas de fermentación, producción de ácido sulfihídrico, utilización de diversas sustancias & detección de ciertas enzimas.

Prueba de la catalasa

• Reducción del oxígeno a peróxido de hidrógeno o superóxido

• Catalasa: medio de defensa

• La prueba consiste en añadir peróxido de hidrógeno al agar, y si hay catalasa se forman burbujas.

Prueba de Citrato

• Capacidad de la bacteria para usar citrato como única fuente de carbono.

• Citrato sódico, produce CO2+ Na =carbonato sódico (compuesto básico).

• Indicador de pH detecta la presencia de este compuesto tornándose azul.

Prueba de la Coagulasa

• Diferenciar entre cepas patógenas & no patógenas de Staphylococcus.

• Coagulación del plasma alrededor. • Inoculación del espécimen en plasma, se incuba a 37oC

durante 1-4 hrs. Si es positiva un coágulo en el tubo de ensayo.

Prueba del indol

• Componente del triptófano.

• Cuando se rompe el triptófano se detecta la presencia de indol con el reactivo de Kovac (amarillo) y cuando reacciona con él, produce color rojo en la superficie del tubo de ensayo.

Prueba Oxidasa

• Oxidación del citocromo c, el cual oxida el reactivo oxidasa.

• El reactivo oxidado cambia de rosa, a morado claro y después a morado oscuro de 10-30 segundos.

Prueba de la ureasa

• Rompe enlaces carbono-nitrógeno y forma CO2, NH3, y agua.

• Producida por los miembros del género Proteus • Si en el medio de urea se fracciona, se libera amoniaco

y aumenta el pH del medio, el cual se detecta con un indicador que en el medio básico es de color rosa.

Izq: S. Epidermis +derecha: E. Fecalis -

Prueba de critrato negativo a la izquierda (E. coli); positivo a la derecha (E. aerogenes)

Prueba de indol positiva a la izquierda (E. coli); negativo al centro (E. aerogenes)

Prueba de oxidasa. E. coli a la derecha; P. aeruginosa a la derecha

P. aeruginosa (oxidasa positiva) a la izquierda y E. coli (oxidasa negativa) a la derecha

Identificación de Bacterias

Pruebas Automatizadas

• Vitek: Tarjeta delgada de plástico 30 pruebas bioquímicas más un instrumento que lee la tarjeta.

• Diferentes tipos de tarjetas, (Grampositivas y gramnegativas).

• Inoculadas e incubadas. Escaneadas cada hora hasta que las características coinciden con alguna bacteria conocida.

• Monoscan: Diseñado para bacterias gramnegativas• Tablilla con diferentes orificios para pruebas

bioquímicas (26 para pruebas bioqimicas y 60 para susceptibilidad a antibióticos).

• Se incuban y escanean periódicamente

Vitek

Microscan

Prueba de Efectividad Antibióticos

• Método Kirby-Bauer: Inóculo bacteriano incluye un número conocido de bacterias para sembrar un medio de cultivo (placa de Petri).

• Discos de papel impregnados con una concentración determinada de antibiótico.

• Placa incubada durante 24 horas para permitir el crecimiento bacteriano confluente

• El tamaño del halo de inhibición permite determinar si el aislado clínico es sensible o resistente a un antibiótico.

Métodos Moleculares

• La infección debe representar un problema clínico relevante en número de casos, morbilidad y mortalidad.

• Segundo, que no sea capaz de ser identificado con los métodos tradicionales de microscopía.

Aglutinación

• Se agrega una cepa del microorganismo al suero y se incuba durante una hora a 37oC.

ELISA (Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas)

no requiere de la formación del complejo antígeno-anticuerpo.

Unión covalente del reactivo del anticuerpo a una enzima que cataliza la conversión de un sustrato incoloro en un producto de reacción coloreado.

Microplacas con 96 celdillas que alojan una gran cantidad de muestras

Los resultados los genera y analiza un lector automático

Bibliografía

• Crocker, J; Burnett, D. La Ciencia del Diagnóstico de Laboratorio. Segunda edición. Inglaterra: Mc Graw Hill, 2005. 538 p.

• Steve A, Strete, D. Microbiology, A Photographic Atlas for the Laboratory.

E.U.A., Canada: Benjamin Cummings, 2001. 193 p. • P. R. MURRAY. Microbiología Médica. 2006. Mosby (Elsevier Science). • http://books.google.com.mx/books?

id=4OQXmnBnjH8C&pg=PA451&lpg=PA451&dq=tecnicas+microbiologicas+basicas&source=bl&ots=5I5P6fuoGz&sig=MPr1_icJrJKUKYVUF-GrFWbZMKo&hl=es&ei=lb3nSqqlDYWwswPk6bWuBQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=2&ved=0CAoQ6AEwAQ#v=onepage&q=&f=false