COMPARACION DE TRES TECNICAS MICROBIOLOGICAS PARA …

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COMPARACION DE TRES TECNICAS MICROBIOLOGICAS PARA LA IDENTIFICACION Y

DETERMINACION DEL PERFIL DE RESISTENCIA ANTIBIOTICA DE CEPAS DE

STREPTOCOCCUS VIRIDANS AISLADAS DE CAVIDAD ORAL EN EL CENTRO DE

INVESTIGACIONES ODONTOLOGICAS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA ( CIO

/ PUJ ) DURANTE LOS AÑOS 2011 A 2014

Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de

Microbióloga Industrial

LAURA FERNANDA RIOS JIMENEZ

DIRECTOR:

HUGO DIEZ, PhD

PROFESOR TITULAR

FACULTAD DE CIENCIAS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ

1510

http://www.google.com.co/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=Yefy5B71S8THMM&tbnid=yco7-vxvBV8KAM:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http://laurajimenasuarez-sic.blogspot.com/2012/07/pontificia-javeriana-partes-del-escudo.html&ei=UrPYUcOIBo7Y9ASOloDwDA&psig=AFQjCNE4Zn4IWbygYF7o3V17hqTqGOjW2w&ust=1373242578141990

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COMPARACION DE TRES TECNICAS MICROBIOLOGICAS PARA LA IDENTIFICACION Y

DETERMINACION DEL PERFIL DE RESISTENCIA ANTIBIOTICA DE CEPAS DE

STREPTOCOCCUS VIRIDANS AISLADAS DE CAVIDAD ORAL EN EL CENTRO DE

INVESTIGACIONES ODONTOLOGICAS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA ( CIO

/ PUJ ) DURANTE LOS AÑOS 2011 A 2014

_________________________ _________________________

Dr. Hugo Díez, Ph.D Dra. Marcela Franco, PhD

Profesor Titular Directora

Dpto. de Microbiología Carrera Microbiologia Industrial

_________________________ _________________________

Dra. Adriana Rodríguez, M.Sc Dra. Silvia Barrientos, M.Sc

Codirector Jurado de tesis

Dto. De Odontología

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

BOGOTÁ

1510

http://www.google.com.co/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=Yefy5B71S8THMM&tbnid=yco7-vxvBV8KAM:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http://laurajimenasuarez-sic.blogspot.com/2012/07/pontificia-javeriana-partes-del-escudo.html&ei=UrPYUcOIBo7Y9ASOloDwDA&psig=AFQjCNE4Zn4IWbygYF7o3V17hqTqGOjW2w&ust=1373242578141990

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NOTA DE ADVERTENCIA

ARTICULO 23 DE LA RESOLUCION Nº 13 DE JULIO DE 1946

“La Universidad NO se hace responsable por los conceptos emitidos por sus

estudiantes en sus Trabajos de Tesis. Solo velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica, y por qué las tesis no contengan

ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo

de buscar la verdad y la justicia”.

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DEDICATORIA

Este trabajo va dedicado a Dios que me dio la posibilidad de vivir y me inspiro

con cada una de las palabras aquí plasmadas, también se lo dedico a cada una

de las personas que me apoyaron durante mi proceso, aquellas que me tuvieron

paciencia, que fueron honestas, que me apoyaron y a pesar de los tropiezos me

dieron su mano de apoyo para seguir adelante. Les dedico este trabajo a mis

padres que por su esfuerzo emocional, económico y físico han permitido que

este trabajo se realice.

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AGRADECIMIENTOS:

.

Agradecimientos y infinitos a Dios primeramente por darme la oportunidad de realizar este

trabajo, por inspirarme y ser tan maravilloso de darme la mejor tesis junto a las mejores

personas. Gracias a el conocí a mi maravilloso director de tesis Hugo Diez con el cual

estoy completamente agradecido porque es un ser humano esencial el cual mediante su

amor y comprensión, hizo posible cada letra y cada palabra proveniente de mi, el me guio

a través de este proceso con su dulzura, tolerancia y amor. Gracias a Adriana Rodríguez

porque gracias a ella pude conseguir este maravilloso tema, ella ha sido uno de los pilares

sobre el cual se formó este trabajo y con apoyo, consejos y experiencia hizo posible el

decir he finalizado con éxito mi tesis.

Gracias a mis padres por permitirme escribir y no dejarme desfachecer ante la presión, la

tristeza, la pereza y todos aquellos obstáculos que se presentan en el momento de

realizar un proyecto.

Gracias a mis compañeros y a todos los que alguna vez me dieron una palabra de aliento

o tuvieron un par de oídos para escuchar mis quejas, también a aquellos que me hicieron

caer en cuenta de mis errores y que con mucho amor me ayudaron a mejorarlos.

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1. RESUMEN

1.1. Introducción: los microorganismos del grupo de los viridans están asociados a infecciones

odontogénicas, su integrante S.mutans, siendo el microorganismo más patógeno de dicho grupo

en gran proporción en la cavidad oral es causante de caries, infecciones orales y endocarditis

bacteriana; siendo estas infecciones tratadas con antibióticos como amoxicilina este

microorganismo ha desarrollado resistencia a dicho antimicrobiano disminuyendo la efectividad

del tratamiento.

1.2. Objetivo: este estudio evalúa la capacidad del método manual, Cristal BD y MicroScan

Dade para identificar cepas de S. viridans provenientes de un centro de investigaciones

odontológicas utilizando el análisis de secuencia del gen 16S rDNA como referencia.

1.3. Métodos: 180 cepas glicerolizadas/congeladas fueron identificadas por las tres

metodologías y determinado el perfil de resistencia antibiótica por panel MicroScan 34 ID y

método manual Kirby Bauer.

1.4. Resultados: 180 cepas viables identificadas por los métodos PCR (Gold Standard Method),

MicroScan, Cristal y manual dieron como resultado S.mutans 106-105-101-122, S.mitis 12-27-11-

10, S.oralis 15-14-14-10, S.salivarius 16-15-15-14, S.sanguis 10-9-8-8, S.milleri 5-0-2-0,

S.intemedius 4-0-0-4, S.constellatus 4-2-0-0, S.anginosus 1-1-1-0 respectivamente.

Las 180 cepas fueron evaluadas a susceptibilidad a la amoxicilina mediante el método MicroScan

y manual proporcionando sensibles 170-172, intermedias 2-0 y resistentes 8-8, siendo las cepas

que presentaron resistencias identificadas como S.mutans.

1.5. Palabras Claves: Resistencia bacteriana, Streptococcus mutans, amoxicilina, 16S rDNA.

2. INTRODUCCION

La clasificación de los Streptococcus se basa fundamentalmente en la reacción hemolítica de

las cepas en Agar Sangre y el grupo serológico determinado por la presencia del Carbohidrato

C, más no existe una correlación directa entre los dos sistemas de clasificación y hay un alto

grado de heterogeneidad en los resultados de las pruebas bioquímicas especialmente para los

Streptococcus no hemolíticos clasificados como grupo viridans que incluye un complejo

número de microorganismos que son muy diferentes en morfología, en reacciones

hemolíticas, en sus procesos fisiológicos de crecimiento y en sus requerimientos nutricionales

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(1). Por dicha razón la identificación manual fue reemplazada por los métodos comerciales

como VITEK-2 (BioMerieux), MICROSCAN WALKAWAY (Dade Behring), BIOMIC®Vision (Giles

Scientific, Inc.), Bactometer® (bioMerieux), BacTrac® (Sy-Lab), Sensititre ARIS®, BD Phoenix™

Automated Microbiology System (Becton-Dickinson) entre otros, los cuales son rápidos y

precisos, reducen errores de identificación y permiten evaluar marcadores específicos de

resistencia antibiótica (2). Sin embargo, los Estreptococos orales del grupo viridans como son

las especies S. mutans, S. sanguis, S. salivarius, S.mitis y S.anginosus pueden presentar

diferentes serotipos, genotipos y algunas cepas como S. mutans presentan ligeras diferencias

bioquímicas en la fermentación de carbohidratos, aspectos que solo son detectables por

pruebas moleculares debido a las diferencias en la composición del DNA y la secuencia

meteoróloga que existe entre cepas (3,4). El diagnóstico molecular incluye técnicas basadas en

el análisis del ADN como PCR, RFLP, qPCR, análisis filogenético entre otras y recientemente

análisis proteómico basado en la espectrofotometría de masas como el MALDI-TOF (5,6).

Adicionalmente a través de estas metodologías comerciales y moleculares se ha evidenciado

que los estreptococos del grupo viridans y principalmente su género más patógeno como es S.

mutans empieza a presentar resistencia a -lactámicos de primera línea usados para

infecciones orales como la Amoxicilina, resistencia que ha ido aumentando progresivamente

(7); razón por la cual es importante realizar una correcta identificación microbiológica y

determinar el perfil de resistencia de estas cepas.

3. JUSTIFICACION

Las infecciones odontogénicas por S. mutans y otros Streptococcus del grupo viridans se tratan

mediante procesos mecánico-quirúrgicos y la antibioticoterapia. El tratamiento antibiótico

incluye el uso de -lactámicos de primera generación como penicilina o amoxicilina. Sin

embargo, la identificación microbiológica y realización de antibiograma del microorganismo no

es una prueba de rutina a nivel odontológico y por eso el tratamiento se da de forma empírica.

Esta práctica ha traído como consecuencia la refractariedad al tratamiento debido entre otros a

la aparición de microorganismos resistentes a los antibióticos (8). La elección del método de

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reconocimiento debe garantizar la correcta identificación del microorganismo y la determinación

de la sensibilidad antibiótica. Aunque los sistemas comerciales de identificación existentes se

consideran fiables se ha demostrado que las pruebas fenotípicas se caracterizan por tener

problemas inherentes como la variabilidad de las cepas dentro de una misma especie, fallas en

la reproducibilidad de resultados con una misma cepa, las bases de datos pueden no incluir

nuevas especies o incluir especies sin todas las pruebas bioquímicas actualizadas, el resultado de

la prueba se basa principalmente en la interpretación y experiencia del profesional (9, 10)

Dado que las aplicaciones de la tecnología en la medicina y el diagnóstico in-vitro son un

importante campo de acción para el microbiológico industrial, y que la seguridad y rapidez en la

identificación bacteriana y estudios de sensibilidad antimicrobiana son esenciales en el manejo

de los pacientes con infecciones odontogénicas, este trabajo pretende determinar el perfil

antibiótica y realizar la identificación de los diferentes géneros y especies presentes en un banco

de cepas aislados de cavidad oral mediante método convencional manual, método de

identificación en miniatura que utiliza substratos convencionales, fluorogénicos y cromogénicos

modificados – Cristal, y método automatizado MicroScan, así como determinar el perfil de

resistencia antibiótica de cada una de ellas, confirmando el resultado mediante antibiograma

manual- Kirby Bauer. Posterior a la identificación se hará una comparación del porcentaje de

identidad para cada uno de los tres métodos y este resultado será definido mediante PCR 16S

rDNA y posterior secuenciación del fragmento amplificado.

4. MARCO REFERENCIAL

4.1. Generalidades

Los estreptococos del grupo viridans son microbiota comensal de la cavidad oral cuya

función es prevenir la colonización de patógenos potenciales y mantener el equilibrio de

la microflora normal. De acuerdo a los postulados de Keyes y Socransky las infecciones

clínicas a nivel oral se dan por procesos multifactoriales que incluyen como factores de

predisposición principalmente los malos hábitos alimenticios como dieta rica en

carbohidratos, presencia de una ecología bacteriana alterada y aparición de superficies

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biológicas que favorecen la colonización y adherencia, los cuales si están acompañados

de una serie de factores de riesgo como lesión en las barreras naturales, la baja defensa

del sistema inmune del huésped, patología de base, el tiempo, defectos en salivación y

otros, contribuyen notablemente a la producción de procesos simples como la caries o

patologías graves como la endocarditis bacteriana entre otros11. Se consideran como

factores de virulencia ligados a los anteriores procesos las proteínas de adherencia

celular, proteínas de superficie de unión a colágeno y adhesina, moléculas para transferir

y degradar sustratos que contribuyen a la conformación del biofilm como

Glucosiltransferasas, y Proteínas Fijadoras de Glucanos, proteínas implicadas tanto en la

producción del proceso cariogénico como en la bacteriemia y endocarditis bacteriana, si

esta llega a alcanzar el torrente sanguíneo tras la realización de un proceso dental de

carácter invasivo y el paciente tiene un factor de riesgo para la enfermedad(12).

Al hablar de los Streptococcus del grupo viridans, se define como un grupo compuesto

por una variedad de microorganismos en los que una de las características que los

identifica es la presencia de hemolisis tipo alfa, produciendo un halo estrecho de

hemolisis verde debido a la destrucción incompleta de los eritrocitos, también carecen de

antígenos de superficie y al no segregar exotoxinas se consideran como bacterias de baja

virulencia13. En cuanto a los requerimientos para su crecimiento óptimo,

nutricionalmente utilizan compuestos variados; algunas especies necesitan para su

crecimiento el compuesto presente en la sangre humana, piridoxal o vitamina B6, por

esta razón, es que algunos medios están suplementados con este. Con respecto al tipo de

atmosfera adecuado es un ambiente de anaerobiosis.

Otra característica esencial, es una serie de factores de virulencia distintivos como la

presencia de ácido lipoteicoico, el cual, favorece la adherencia del microorganismo a las

válvulas cardiacas al momento en el que ocasiona endocarditis infecciosa, otro factor a

distinguir es la producción de polisacáridos extracelulares que intervienen en los

mecanismos de producción de caries14

Debido a que el grupo de los Streptococcus viridans consta de diferentes especies, para

identificar cada una de estas se realizan pruebas bioquímicas que diferencian una especie

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de otra; entre estas pruebas están Voges Proskauer (VP) la cual determina la

fermentación de la glucosa por parte del microorganismo, la hidrolisis de arginina (ARG)

y esculina (ESC), y la fermentación del manitol (MAN) y el sorbitol (SOR).

4.2. Taxonomía

El grupo de los Streptococcus viridans se ha venido clasificando según Kiratisin et al.

(2004) mediante la secuencia del 16S del ADN ribosomal y las reacciones bioquímicas de

cada especie; esto ha permitido su división en cinco grupos llamados Streptococcus mitis,

Streptococcus sanguinis, Streptococcus mutans, Streptococcus anginosus y Streptococcus

salivarius15 El grupo Mitis-Sanguinis según Janda, et al. (2014) está caracterizado por

presentar reacciones variables para la hidrolisis de esculina y la producción de arginina

dihidrolasa, así como la ausencia de actividad ureasa y la producción de acetoina, una

última característica esencial es la no fermentación de manitol y sorbitol16;además

fermenta carbohidratos como la glucosa, lactosa y maltosa. El grupo de los S.mutans

produce ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético y ácido fórmico cuando metaboliza

carbohidratos fermentables como la sacarosa, glucosa y fructosa.

4.3. Sistemas de Identificación

Existen diferentes métodos para la identificación de los Streptococcus viridans, la prueba

de sensibilidad a la optoquina con sensidiscos es una de ellas, siendo los microorganismos

de este grupo resistentes. Esta técnica también puede determinar el perfil de resistencia

a la amoxicilina por parte del S. mutans siendo la cepa más patógena del grupo de los

viridans, la cual, ha creado resistencia al antibiótico17. Otra manera de identificar a estos

microorganismos es recurriendo a métodos tradicionales como pruebas bioquímicas,

fisiología, y morfología de las colonias.

Existen también métodos comerciales y moleculares, dentro de los comerciales tenemos

el sistema de identificación multiprueba BBL CRISTAL para la identificación de bacterias

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Gram positivas y el sistema de microbiología para la identificación y susceptibilidad

antimicrobiana de organismos de interés MICROSCAN; En cuanto a métodos moleculares

encontramos el sistema de identificación bacteriana mediante secuenciación del DNAr

16S y además se encuentra el análisis proteómico realizado mediante la

espectrofotometría de masas como el MALDI-TOF.

Con respecto al sistema BBL CRISTAL, este método consta de 29 substratos bioquímicos y

enzimáticos deshidratados los cuales permiten determinar el uso y la degradación de

estos por parte del microorganismo, este método es de fácil lectura, ya que, a que los

substratos fluorogénicos se observan mediante luz ultravioleta y los cromogénicos

seguido a la hidrolisis cambian de color. Una de las desventajas del sistema es que

funciona solo para un grupo taxonómico especifico, la efectiva identificación del

microorganismo está ligada a los medios suministrados para la preparación de los

inóculos es por esto que es recomendable utilizar unos medios en especial, por ejemplo

no se deben utilizar medios que contengan esculina.

Otro de los métodos comerciales utilizados es el MICROSCAN, en el cual se utilizan

compuestos marcados fluorescentes permitiendo dos tipos de reacciones, una

fluorogénica y una fluorometrica, en la primera se presenta una enzima específica en la

suspensión bacteriana y se detectan cambios en el pH como ocurre con la fermentación

de hidratos de carbono18 Una de las incongruencias presentadas por el método

MICROSCAN es que en ocasiones se dan lecturas falsas negativas y por esto se requiere

de un método de respaldo debido a base de datos incompleta.

Con respecto a los métodos moleculares, el ADNr 16S se realiza mediante la amplificación

del gen, la determinación de la secuencia de nucleótidos del amplicon y el análisis de la

secuencia; Rodicio et al. (2004) menciona que el ARN ribosómico (ARNr) 16S es la

macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía

bacterianas. Una de las ventajas es que no es necesario extraer el ADN bacteriano sino

que se puede amplificar directamente de una colonia aislada o cultivo líquido de la

bacteria de interés, si se quisiera realizar una identificación de una bacteria que

raramente sea utilizada en el ámbito clínico se debe recurrir a más de una base de

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datos19. Una desventaja del método en cuanto a la identificación del microorganismo

Streptococcus mutans, es lo mencionado por Ojeda et al. (2013) que como el método

permite la detección bacteriana mediante PCR, al darse un análisis cualitativo esto no

permite la evaluación apropiada de la susceptibilidad a la caries o de la actividad cariosa20

4.4. Clínica oral

La caries es una enfermedad dental, que ataca a todos los grupos de riesgo; esta se ha

definido como un proceso localizado de origen multifactorial que se inicia después de la

erupción dentaria, determinando el reblandecimiento del tejido duro del diente y

evoluciona hasta la formación de una cavidad, debido, a la desmineralización y

remineralización del diente21. Este proceso se produce como “consecuencia de cambios

en el balance natural de la microflora de la placa dental causados por la alteración de las

condiciones ambientales locales (homeostasis microbiana oral)”22. Los microorganismos

pertenecientes al grupo de los Streptococcus viridans son de gran relevancia al tratar

temas relacionados con la cavidad oral, puesto que, estas especies hacen parte de la

microflora de la boca y se ha descubierto que cada una de ellas tiene predilección en

cuanto a la localización de sitios específicos a colonizar, según Ojeda, et al. (2013) “S.

sanguinis y S. mutans preferiblemente colonizan las superficies de dientes y aparatos

prostéticos. S. salivarius está presente en menos proporción en placa y es un colonizador

primario de la boca después del nacimiento, S.mitis no tiene un sitio preferido en cavidad

oral y S. sanguis usualmente no se encuentra sino hasta la erupción de los dientes”23. Este

grupo de microorganismos es de gran interés debido a la similitud que presenta cada una

de las especies que lo integran entre sí, y esto hace difícil la identificación de los mismos.

A nivel odontológico es relevante el estudio de los integrantes del grupo viridans, pero el

microorganismo más importante es la especie más patógena del grupo, S.mutans, ya que

es el mayor agente causante de caries dental y puede ser aislado de la superficie de un

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diente cariado, no siendo este el único lugar en donde se encuentra, ya que, ha sido

aislado de las válvulas dañadas del corazón Marsh et al. (2011)24

Este microorganismo ha sido encontrado en gran número en esta zona debido a que

produce una severa infección conocida como endocarditis bacteriana producida en

pacientes inmunosuprimidos, la cual, es causada por la asociación de alteraciones

morfológicas del corazón y esta proviene de diferentes orígenes, entre ellos el bacteriano

debido a que el origen de la infección misma puede ser bucodental Blanco, 200425,

también puede darse a causa de un procedimiento dental o invasor es por esto que

Taubert et al. (1998) recomienda seguir por las indicaciones AHA las cuales fueron

diseñadas a fin de asistir al uso racional de la profilaxis para la prevención de la

endocarditis bacteriana; aun con el uso de profilaxis antibiótica apropiada la endocarditis

puede darse, es por eso la importancia de la determinación de la resistencia al antibiótico

utilizado para las infecciones orales existentes que comienzan con el proceso cariogénico,

ya que esta es la pauta para la selección del mismo y la dosis a administrar.26

Se dice que el microorganismo llega al torrente sanguíneo cuando la cavidad en el diente

es de tal profundidad para alcanzarlo. El proceso cariogénico afecta el equilibrio en la

cavidad oral, y esta enfermedad se está dando desde etapas tempranas, descubriéndose

como un proceso de transmisión, en el cual las madres desde los primeros años de vida

mediante contacto directo han contribuido a la difusión de esta enfermedad. Es de gran

importancia a nivel odontológico identificar y combatir a S.mutans, que es el mayor

agente patógeno dental, el cual presenta una gran estabilidad en la boca y es causante de

bacteriemia y endocarditis infecciosa; siendo causante de la caries dental, enfermedad

que ha venido afectando a toda la población de una forma exponencial.

4.5. Resistencia antibiótica

Los estreptococos del grupo viridans y su género más patógeno como es S.mutans son

normalmente sensibles a la acción de -lactámicos incluyendo la amoxicilina antibiótico de

primera línea usado para tratar infecciones orales. Sin embargo, a partir de 1949, se notifica de

la existencia de cepas resistentes a la penicilina, y a partir de esa fecha, la frecuencia de

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aislamientos clínicamente significativos resistentes a ß-lactámicos ha ido aumentando

progresivamente. Diferentes estudios In vivo han demostrado que hay diferencias geográficas en

la resistencia que presentan las cepas en general del grupo viridans, mostrando resistencia

antibiótica variable, en virtud de la especie y del origen de su aislamiento. Solo es claro que

existe una relación causa-efecto entre el consumo de antibióticos y el desarrollo de los mismos,

aspecto muy común en el área odontológica dado su uso empírico. Se considera que el grupo

viridans tiene una alta tasa de resistencia a penicilina (10-23%) amoxicilina (13%) y su

importancia radica que muchas infecciones odontogénicas pueden resultar en cuadros clínicos

de diseminación local o a distancia y son complicaciones que requieren terapia antibiótica 27-28.

Otros autores reportan nueva resistencia a eritromicina, clindamicina, tetraciclina29-30-31. En la

medicina actual y con el aumento de resistencia antibiótica que presentan los microorganismos,

resulta difícil para el odontólogo predecir los patrones de resistencia que pueden presentar los

microorganismos en pacientes críticos. Por tal razón la identificación del microorganismo y

antibiograma por métodos automatizados se convierten en una herramienta eficaz dentro de su

trabajo dado que son más rápidos, exactos, detectan el desarrollo bacteriano en micropaneles

que dan las concentraciones adecuadas de antibióticos permitiendo una terapia oportuna,

reducción en los días de hospitalización y reducción en costos totales32

El desarrollo de resistencia a la amoxicilina, clindamicina y eritromicina por parte de los

Streptococcus del grupo viridans ha formado una polémica en cuanto a la solución del problema

como tal, puesto que, al ser utilizados de manera empírica los microorganismos han

desarrollado mecanismos de resistencia, debido, a que el antibiótico se ha administrado por un

tiempo mayor del adecuado, y es así como la bacteria empieza a crear una serie de barreras y

mecanismos los cuales no permiten la acción del antimicrobiano utilizado. Por esta razón se

recomienda el uso de métodos automatizados de estudio a la susceptibilidad y de esta manera

definir cuál es la dosis mínima necesaria para inhibir el desarrollo bacteriano; existen una serie

de antibióticos que son utilizados para combatir los microorganismos del grupo viridans; entre

ellos tenemos la amoxicilina, eritromicina y clindamicina. La amoxicilina es un antibiótico

semisintetico derivado de la penicilina, Westing menciona que la resistencia a la penicilina

presentada en las cepas de S.viridans es causada por las alteraciones en los genes de la proteína

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unión a la penicilina (pbp), además por la habilidad ilimitada que tienen las cepas en los centros

catalíticos para adaptar sus propiedades a nuevas situaciones o condiciones33-34

Con respecto a la eritromicina y la clindamicina, el primero es un macrólido (grupo compuesto

por una serie de antibióticos que se caracterizan por tener un anillo macrociclico de lactona), el

segundo es una lincosamida de origen semisintético, derivada de la lincomicina; estos

antibióticos son utilizados en pacientes que son alérgicos a la penicilina; también ha sido

utilizada para combatir cepas de S.viridans que han sido identificadas como resistentes a la

penicilina. Existen dos mecanismos principales de resistencia a los macrolidos, lincosamidas y

estreptograminas B (MLSB), estos son según Campelo, et al. (2007), “el primer mecanismo es

mediado por la metilación del sitio ribosomal que es codificado por los genes ribosoma

eritromicina metilasa (erm) y expresada como fenotipo MLSB. También encontramos una bomba

de expulsión, codificada por los genes mef(A/E) y expresada como fenotipo M.”35Este gen según

Cerdá, et al. (2003) es el responsable del desarrollo de resistencia a compuestos macrólidos de

14 y 15 miembros36.

La adquisición de resistencias en bacterias se da en gran medida por todo el intercambio

horizontal de material genético que realizan estos microorganismos al convivir entre ellos, en la

cavidad oral y las vías respiratorias se encuentran gran diversidad de ellos y cada uno posee y

adquiere unas características específicas.

La infección odontogénica es la tercera causa de consumo de antibiótico y genera

aproximadamente el 10-12% del total de las prescripciones de estos fármacos en la comunidad.

Es por ello que la aparición de resistencias antimicrobianas a nivel odontológico crea un

problema clínico, epidemiológico y de salud pública, puesto que disminuye la efectividad del

tratamiento antibiótico, conlleva un impacto ecológico sobre la microbiota oral humana y

repercute en un aumento del costo sanitario37. En Colombia no se conoce el tipo de cepa

circulante ni el perfil de resistencia que presenta, razón por la cual es necesario realizar una

caracterización de las cepas en aquellos pacientes que son portadores y pueden estar expuestos

a riesgos clínicos graves tipo Endocarditis bacteriana como son los pacientes odontológicos. Para

dar validez a los datos es necesario determinar el método microbiológico que identifique con

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mayor precisión cada especie del grupo viridans y permita conocer el perfil de resistencia

antibiótica.

5. OBJETIVOS

5.1. OBJETIVO GENERAL

5.1.1. Realizar la comparación de tres técnicas microbiológicas para la identificación y perfil de

resistencia de cepas de S. viridans aisladas de cavidad oral en el CIO /PUJ durante los años 2011

a 2014.

5.2. OBJETIVO ESPECIFICO

5.2.1. Verificar la viabilidad de las cepas congeladas y glicerolizadas de un Banco de Cepas de S.

viridans del CIO / PUJ.

5.2.2. Realizar la identificación bioquímica de las cepas congeladas y glicerolizadas de un Banco

de Cepas de S. viridans del CIO / PUJ por tres métodos microbiológicos.

5.2.3. Determinar el porcentaje de resistencia a la amoxicilina de las cepas congeladas y

glicerolizadas de un Banco de Cepas de S. viridans del CIO / PUJ.

5.2.4. Comparar los resultados obtenidos de las tres metodologías de identificación MicroScan,

Cristal, Manual y el método de difusión según NCCLS .

6. METODOLOGÍA

6.1. ESTUDIO

6.1.1. TIPO DE ESTUDIO: Es un modelo que correspondió a un estudio observacional, con un

diseño factorial experimental confirmatorio.

6.1.2. DISEÑO: Descripción de los géneros y especies de S. viridans y del número de cepas

resistentes a un antibiótico en particular.

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6.2. POBLACIÓN ESTUDIO:

6.2.1. MUESTRA: Correspondió a las cepas de S.viridans congeladas y glicerolizadas conservadas

en el Banco de Cepas del Centro de investigaciones odontológicas durante el año 2011 a 2014.

6.2.2. TAMAÑO DE LA MUESTRA: El tamaño de la muestra fue el número de cepas disponibles

que correspondió a 180.

6.3. CRITERIOS DEL ESTUDIO

6.3.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN: En el estudio solo se incluyeron aquellas muestras que

presentaron una óptima recuperación y presenten un 100% de Viabilidad.

6.3.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN: Se excluyó todas aquellas muestras que no pertenecían al grupo

de estudio o aquellas muestras que no presentaron viabilidad ante el proceso de recuperación.

6.3.3. CONFLICTO DE INTERESES: fue una investigación sin riesgo, y parte de manejó directo de

las cepas cedidas por la institución. Aunque las cepas ya habían sido previamente identificadas

por el laboratorio de microbiología institucional a los estudiantes no se les informo el resultado

de las mismas dado que uno de los requisitos dados por el aval institucional era garantizar la

confidencialidad de la Institución y de los pacientes implicados en la investigación por parte de

los investigadores, así como la de los profesionales de la salud (artículo 11 de la Resolución 8430

de 1993).

6.4. PROCEDIMIENTOS

6.4.1. VIABILIDAD Y RECUPERACION: Para cumplir con el primer objetivo específico se realizó la

descongelación, recuperación y viabilidad de las muestras según protocolo Daryousb (2010)38

6.4.1.1. Descongelación: Las muestras fueron recibidas en medio de transporte

enriquecido para Stafilococos/Streptococos de cavidad oral (BHI con 30 % de glicerol y

suplementado con oxacilina). A partir de los viales recibidos se sometieron a un proceso de

descongelación gradual colocándolas inicialmente en nevera a 15-20ºC por 30 minutos y

posteriormente a temperatura ambiente por 30 minutos.

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6.4.1.2. Recuperación: una vez descongeladas se homogenizaron mediante vortex simple y

una alícuota de ellas fue sembrada en BHI y tioglicolato prereducido y se incubo de 24-48 horas

a 37ªC.

6.4.1.3. Viabilidad: a partir del tioglicolato y BHI se realizó una coloración de Gram para

observar morfología característica y fueron sembradas en Agar Sangre suplementado para

observar pureza y las características morfológicas y de crecimiento características del género y

especie.

6.4.2. IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA PRESUNTIVA: Para cumplir con el segundo objetivo

específico se realizó una identificación del género y especie del microorganismo:

6.4.2.1. Aquellas cepas que presentaron viabilidad del 100% y cuyas colonias tuvieron

características morfológicas y tintoriales (Coloración de Gram) del Género Streptococcos,

catalasa negativa se identificaron por tres métodos microbiológicos a saber: identificación

manual por fermentación de azucares, sistema Cristal, sistema MicroScanSystem de la casa

Dade/ MicroScan Pos ID PC34 para Gram positivos.

6.4.2.2. En el método manual se utilizaron pruebas convencionales sugeridas por Bantar,

199039 como Hemólisis en agar sangre, optoquina, hidrólisis de esculina, acetoína, manitol,

sorbitol, ureasa, Inulina, Rafinosa, catalasa.

6.4.2.3. El método BBL™ Crystal™ Identification Systems incluyo 29 tests para la

fermentación, oxidación, degradación e hidrólisis de diversos sustratos unidos a un cromógeno

para detectar las enzimas utilizadas por las bacterias y conformado por L-histidina-AMC FHI,

4MU-α-D-manósido FAM, L-serina-AMC FSE, L-isoleucina-AMC FIS, 4MU-β-D-manósido FBM,

Glicina-AMC FGL, L-alanina-AMC FAL, 4MU-N-acetil-β-D-galactosaminida FGA, L-ácido

piroglutámico-AMC FPY, L-lisina-AMC FLY, L-metionina-AMC FME, 4MU-β-D-celobiopiranósido

FCE, 4MU-β-D-xilosida FXY, 4F L-fenilalanina-AMC FPH, L-leucina-AMC FLE, Escosilo FSC,

Disacárido DIS, Furanosa FUR, Piranosa PYO, p-nitrofenil-α-D-galactósido AGA, p-nitrofenil-β-D-

galactósido NPG, p-nitrofenil-fosfato PHO, p-nitrofenil-α-D-glucósido AGL, p-nitrofenil-N-acetil-

glucosaminida NAG, L-prolina-p-nitroanílida PRO, p-nitrofenil-α-L-fucósido AFU, p-nitrofenil-β-D-

glucósido BGL, L-alanil-L-alanina-p-nitroanílida ALA

de 39

6.4.2.4. En MicroScan el fenotipo se determinó mediante un panel de 32 pozos reactivos

de sustratos para reacción bioquímica conformado por CV Cristal violeta – MS Micrococcus

screen – NIT Nitritos – NOV Novobiacina – PGR B-d glucoronidasa – IDX Indol fosfatasa – VP

Voges proskawer – OPT Optoquina – PHD fosfatasa – BE Bilis esculina – PYR Pirridolina – ARG

Arginina – PGT Galactosidasa – URE urea – MAN Manitol – LAC lactosa – TRE Trehalosa – MNS

Manosa – NaCl Cloruro de sodio – SOR Sorbitol – ARA Arabinosa – RBS Ribosa – INU Inulina –

RAF Rafinosa – BAC Bacitracina – PRV Piruvato, y 6 pozos internos de control.

6.4.2.5. Aquellas colonias que fue necesario confirmar sus características macroscópicas se

sembraron en agar tripticasa soya y agar mitis salivarius.

6.4.3. ENSAYOS DE SENSIBILIDAD.

6.4.3.1. Para cumplir con el tercer objetivo se determinó la resistencia a Amoxicilina se

utilizó el mismo Panel MicroScan 34 siguiendo las normas del Clinical and Laboratory Standards

Institute y las instrucciones dadas por la casa manufacturadora empleándose el mismo panel de

identificación el cual incluyo un set de pozos con antibióticos marcadores para Gram positivos

como Aug Amoxicilina/ clavulónico 4/2 ug – AM ampicilina 8 ug – A/S ampicilina sulbactan

16/8ug – CfxS Cefoxitin 4 ug – Cax Ceftriaxone 32 ug – Cp Ciprofloxacina 2 ug – Cd Clindamicina 4

ug– Dap Daptomicina 4 ug– E Eritromicina 4 ug – Gm gentamicina 8 ug – GmS gentamicina

synercid 500 ug – Icd Clindamicina inducible 4/0.5 ug – Lvx Levofloxacin 4 ug – Lzd Linezolid 4 ug

– Mxf Moxifloxacina 4 ug – Fd Nitrofurantoina 64 ug – Ox Oxacilina 2 ug – P Penicilina 8ug – Rif

Rifampicina 2 ug – StS Estreptomicina synercid 1000ug – Syn Synercid 2 ug – Te Tetraciclina 8 ug

– T/S trimetropin sulfa 2/38 µg - Va Vancomicina 16 ug (CLSI, 2012)40. Los puntos de corte e

interpretación según concentración se explicaron en la tabla 1.

6.4.3.2. A aquellas cepas que presentaron Resistencia a Amoxicilina se les realizó

confirmación por el método de difusión en agar con discos, según las normas del Clinical and

Laboratory Standards Institute. El antibiótico utilizado fue amoxicilina en sensidisco de 6 µg/mL

incubándose a 35 grados C por 24 h.

de 39

Tabla 1. Puntos de corte establecidos para el sistema MicroScan para cada antibiótico.

Nombre del antibiótico Código Puntos de corte en

g/ml

Amoxicilina/ Ácido

clavulánico

AMC S<=4 R>=8

Ampicilina AMP S<=.25 R>=.5

Ampicilina/ Sulbactam SAM S<=8 R>=32

Cefazolina CZO S<=8 R>=32

Ciprofloxacina CIP S<=1 R>=4

Clindamicina CLI S<=.5 R>=4

Daptomicina DAP S<=1

Eritromicina ERY S<=.5 R>=8

Gentamicina GEN S<=4 R>=16

Levofloxacina LVX S<=1 R>=4

Linezolid LNZ S<=4 R>=8

Moxifloxacina MFX S<=.5 R>=2

Oxacilina OXA S<=2 R>=4

Penicilina G PEN S<=.125 R>=.25

Quinupristina/

Dalfopristina

QDA S<=1 R>=4

Rifampicina RIF S<=1 R>=4

Tetraciclina TCY S<=4 R>=16

Trimetoprima/

Sulfametoxazol

SXT S<=2 R>=4

Vancomicina VAN S<=4 R>=32

6.4.4. COMPARACION de METODOLOGÍAS:

6.4.4.1. Para cumplir con el cuarto objetivo en la identificación bioquímica se realizó una

comparación de los resultados obtenidos de las tres metodologías de identificación MicroScan,

API, Manual y en el antibiograma se comparó el método de difusión Kirby Bauer según NCCLS

de 39

contra el resultado de MicroScan presentándose para las dos variables los % de Identificación y

resistencia para cada método.

6.4.4.2. A todas las cepas extrajo ADN según protocolo del kit comercial QIAamp DNA

Blood Mini Kit (Qiagen) y para la PCR se utilizó una mezcla de reacción compuesta por Buffer

0,5X, DNTPs 200M, primers 16s rDNA 0,5M, MgCl2 2M, Taq 0,45U a un volumen final de

20L bajo las siguientes condiciones: 94°C por 5 segundos, luego 35 ciclos así: 94°C por 30

segundos, 55°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto, extensión 72°C por 7 minutos.

6.4.4.3. Los productos de amplificación obtenidos fueron enviados a un servicio técnico de

secuenciación en Macrogen Korea.

6.5. Presentación de resultados:

6.5.1. Recuperación y viabilidad cepas: los resultados se presentaron en porcentajes mediante

tablas.

6.5.2. Identificación de S.viridans: los resultados se presentaron en porcentajes mediante tablas.

6.5.3. Perfil de Resistencia: se presentaron en tablas descriptivas del porcentaje de resistencia

del microorganismo para cada antibiótico.

6.5.4. Comparación de métodos: se presentaron en tablas descriptivas del porcentaje de

identidad para cada método y cálculo de índices Kappa para análisis de concordancia entre los

métodos. Para las incongruencias se analizó BLAST n de la secuenciación de las cepas que así lo

requirieron.

7. RESULTADOS:

7.1. Recuperación y viabilidad cepas: para cumplir con el primer objetivo se verificó la

viabilidad de las cepas congeladas y glicerolizadas y se encontró un 100% de viabilidad y

recuperación en las mismas.

7.2. Identificación Bioquímica de las cepas; para cumplir con el segundo objetivo específico

180 cepas que presentaron viabilidad del 100% y cuyas colonias tenían características

morfológicas y tintoriales (Coloración de Gram) del Género Streptococcus, y reacción

negativa ante la prueba de catalasa, se identificaron por tres métodos microbiológicos a

de 39

saber: identificación manual por fermentación de azucares, identificación por BBL™

Crystal™ Identification Systems, e identificación por sistema MicroScanSystem de la casa

Dade/ MicroScan Pos ID PC34 para Gram positivos. Los resultados se distribuyeron

siguiendo la metodología propuesta por Won-Young et al.(2011) la cual se divide en 4

grupos a saber41:

a. Cepas correctamente identificadas tanto a nivel de género como de especie

b. Cepas correctamente identificadas a nivel de género pero no de especie

c. Cepas incorrectamente identificadas (ni género ni especie)

d. Cepas no identificadas

Tabla 1. Cepas viables identificadas y distribuidas según la metodología propuesta por Won-Young de identificación manual, BBL cristal

y MicroScan y los resultados obtenidos divididos en 4 grupos a saber.

Metodología

Cepas

procesadas

Identificación

correcta de

género y

especie

Identificación

correcta de

género no

especie

Identificación

incorrecta

No

identificadas

Número % Número % Número % Número %

Manual 180 153 85 171 95 5 2,77 5 2,7

BBL Crystal 180 155 86,11 172 95,5 24 13,33 2 1,1

MIcroScan 180 161 89,44 174 96,6 14 7,77 2 1,1

7.3. Discrepancia y resolución final de identificación: ADN de las cepas fue extraido para

realizar una PCR l6S y posterior secuenciación siendo esta la base para analizar las

discrepancias entre los resultados presentados.

7.4. Perfil de Resistencia: para cumplir con el tercer objetivo consistente en determinar el perfil

de resistencia antibiótica que presentan las cepas congeladas y glicerolizadas se

de 39

analizaron los datos a partir del método MicroScan y se realizó confirmación manual por

Kirby Bauer. Los resultados fueron agrupados en torno a la amoxicilina en 3 grupos:

cepas Sensibles, Intermedias, y cepas de S.viridans resistentes. Encontrándose los

resultados que ilustra la tabla 2:

Tabla 2. Numero de cepas evaluadas con amoxicilina y distribuidas entre sensible, intermedias y resistentes dependiendo del

resultado obtenido en cada uno de los métodos utilizados.

AMOXICILINA MicroScan (%) Manual (%)

Sensible 170 (94,4) 172 (95,55)

Intermedia 2 (1,1) 0

Resistente 8 (4,4) 8 (4,4)

El 94.4% de las cepas catalogadas como sensibles mostraron como característico el siguiente

antibiograma:

Tabla 2.1. Concentración mínima inhibitoria para S.viridans correspondiente al 94,4% de las cepas

ANTIBIOTICO MIC INTERPRETACION AMOXIL/CLAVULANICO <=0,5/.25 SENSIBLE

AMOXICILINA <=0.06 SENSIBLE

AZITROMICINA <=0.2 SENSIBLE

CEFACLOR <=0.5 SENSIBLE

CEFEPIMA <=0.25 SENSIBLE

CEFOTAXIMA <=0.25 SENSIBLE

CEFTRIAXONE <=0.25 SENSIBLE

CEFUROXIMA <=0.25 SENSIBLE

CLINDAMICINA <=0.06 SENSIBLE

CLORANFENICOL <=1.0 SENSIBLE

ERITROMICINA <=0.06 SENSIBLE

LEVOFLOXACINA <=0.25 SENSIBLE

MEROPENEM <=0.06 SENSIBLE

de 39

PENICILINA <=0.03 SENSIBLE

TETRACICLINA <=0.5 SENSIBLE

TRIMETROPIN/SULFA <=0.25/4.7 SENSIBLE

VANCOMICINA <=0.12 SENSIBLE

El 4,5% de las cepas catalogadas como resistentes mostraron como característico el siguiente

antibiograma:

Tabla 2.2. Concentración mínima inhibitoria para S.mutans resistentes a la amoxicilina


AMOXICILINA >=8.0 RESISTENTE
















El 1,1% de las cepas catalogadas como intermedias mostraron como característico el siguiente

antibiograma:

Tabla 2.3. Concentración mínima inhibitoria para S.mutans que presente resistencia intermedia a la amoxicilina


AMOXICILINA Entre 1-2 INTERMEDIO


de 39















7.5 Concordancia entre los resultados del antibiograma por el sistema MicroScan y el método

disco-placa CLSI en el grupo de cepas estudiadas: realizada la comparación se observó que no

habían discrepancias entre los resultados sensibles de ambos métodos ni entre los resultados

resistentes de los dos métodos pero que a nivel de Resistencia intermedia a la amoxicilina se

observó discrepancia en 2 cepas (1,1%). Dichas cepas ante el MicroScan mostraron una MIC de

1 y de 2.0 UG/ml pero al ser testeadas manualmente con disco de AML 10 ug/ml resultaron

sensibles. De acuerdo a las normas CLSI dichas cepas deben ser reportadas como sensibles. La

tabla 2.1 ilustra la concordancia observada entre las dos metodologías para los diferentes

antibióticos:

Tabla 2.4. Porcentaje de concordancia entre dos metodologías para los diferentes antibióticos

ANTIBIOTICO % concordancia

AMOXIL/CLAVULANICO 100

AMOXICILINA 98,9%

AZITROMICINA 100

CEFACLOR 100

CEFEPIMA 100

de 39

CEFOTAXIMA 100

CEFTRIAXONE 100

CEFUROXIMA 100

CLINDAMICINA 100

CLORANFENICOL 100

ERITROMICINA 100

LEVOFLOXACINA 100

MEROPENEM 100

PENICILINA 100

TETRACICLINA 100

TRIMETROPIN/SULFA 100

VANCOMICINA 100

7.6 Comparación de métodos: para cumplir con el cuarto objetivo se compararon los

resultados obtenidos de las tres metodologías de identificación respecto a la

secuenciación de la PCR 16S presentados en la tabla 3.

Tabla 3. Resultados tabulados mediante especies y métodos utilizados para la identificación de las mismas en base al Gold estándar

method (PCR)

Microorganismo PCR MicroScan CRISTAL MANUAL

No de cepas (%)

S.mutans 106 (58,88) 105 (58,33) 101 (56,11) 122 (67,77)

S.mitis 12 (6,66) 27 (15) 11 (6,11) 10 (5,55)

S. oralis 15 (8,33) 14 (7,77) 14 (7,77) 10 (5,55)

S.salivarius 16 (8,88) 15 (8,33) 15 (8,33) 14 (7,77)

S.sanguis 10 (5,55) 9 (5) 8 (4,44) 8 (4,44)

S.mobilliforme 5 (2,77) 0 3 (1,66) 0

S.milleri 5 (2,77) 0 2 (1,11) 0

S. intermedius 4 (2,22) 0 0 4 (2,22)

S.constellatus 4 (2,22) 2 (1,11) 0 0

S.anginosus 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55) 0

S.equinus 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55)

S. bovis 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55)

Streptococcus spp 0 0 8 (4,44) 0

Streptococcus viridans 0 0 6 (3,33) 0

E. faecalis 0 1 (0,55) 0 3 (1,66)

Enterococcus spp 0 0 1 (0,55) 0

Micrococcus spp 0 1 (0,55) 4 (2,22) 0

de 39

Micrococcus luteus 0 1 (0,55) 2 (1,11) 0

Lactococcus lactis 0 0 0 2 (1,11)

NI 0 2 (1,11) 2 (1,11) 5 (2,77)

Total 180 (100) 180 (100) 180 (100) 180 (100)

La tabla 4 ilustra el análisis de concordancia observadas en cada uno de los métodos

dependiendo del microorganismo y en la tabla 5 la interpretación para cada intervalo.

Tabla 4. Análisis de concordancia para S.mutans, S.mitis, S.oralis, S.salivarius y S.sanguis

Kappa

S. mutans S.mitis S.oralis S.salivarius S.sanguis

PCR vs MicroScan 0,99 0,59 0,96 0,96 0,94

PCR vs Cristal 0,94 0,86 0,96 0,96 0,65

PCR vs Manual 0,76 0,9 0,87 0,93 0,88

MicroScan vs cristal 0,95 0,54 1 1 0,69

MicroScan vs manual 0,76 0,5 0,82 0,96 0,94

Cristal vs manual 0,79 0,95 0,82 0,96 0,74

Tabla 5. Interpretación de los valores obtenido mediante el índice Kappa

Fuerza de concordancia

Menor 0,2 Pobre

0,21-0,4 Débil

0,41-0,6 Moderada

0,61-0,8 Buena

0,81-1 Muy buena

de 39

7.7Control de calidad técnico: La cepa Streptococcus mutans ATCC 25175 fue testeada para el

sistema Manual, Cristal y MicroScan obteniendo una identificación correcta por cada uno de

los métodos. Los resultados en las diferentes técnicas fueron evaluados contra la

secuenciación de un fragmento de 382pb producto de la PCR 16S cuya secuencia base era:

1 gttagttgcc atcattaagt tgggcactct agcgagactg ccggtaataa accggaggaa

61 ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat

121 ggtcggtaca acgagttgcg agccggtgac ggcaagctaa tctctgaaag ccgatctcag

181 ttcggattgg aggctgcaac tcgcctccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgnatca

241 gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt

301 ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggggcc ngccgcctaa ggtgggatgg

361 atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cg

8. DISCUSION:

El género Streptococcus viridans está compuesto por diferentes especies las cuales difieren unas

de otras, se puede observar que el número de cepas muestreadas y evaluadas presentaron 100%

de viabilidad; esto quiere decir que se pueden utilizar para ser identificadas a nivel de género o

especie mediante los diversos métodos, y de esta manera corroborar cuáles de ellos son más

sensibles y exactos para identificar los microorganismos pertenecientes al grupo viridans. Lo

mencionado anteriormente se puede evidenciar en la tabla 1, la cual, muestra las 180 cepas

viables identificadas por los métodos Manual, Cristal y MicroScan; aquí se puede observar que

métodos identificaron de forma correcta los microorganismos a nivel de especie teniendo al

MicroScan como el más efectivo de todos, seguido por Cristal y Manual. Así mismo se observa

cuales métodos no lograron la identificación siendo el Manual el que mayor valor presento, que

fue proporcional a 5 cepas; una posible razón por la cual se dio esto, es que con el método Manual

se tiene una mayor manipulación por parte del investigador que puede influir negativamente en el

resultado obtenido. La tabla también presenta que método logro una identificación pero solo

hasta nivel de género, Wiltrud et al. (1996) comenta que en la base de datos de BBL Cristal no se

de 39

encuentran diversos microorganismos, razón por la cual, en muchas ocasiones no es posible llegar

a nivel de especie42, y siendo un método automatizado obtuvo casi el mismo valor del manual. Al

analizar la tabla se puede observar que el método más apropiado para la identificación de los

viridans es el MicroScan, ya que presento el mayor porcentaje de cepas identificadas a nivel de

especie (89,44%) y género (96,6%) y un menor valor para las cepas no identificadas (1,1%).

El rol de S.mutans en los procesos cariogénicos y su correcta identificación es de gran importancia,

un estudio realizado por estudiantes de la universidad de Antioquia explica que este

microorganismo está directamente implicado en la iniciación de la caries debido a su gran

potencial acidúrico y acidógeno, también se menciona la importancia del control en Colombia de

la caries en niños, debido a la prevalencia en serotipos del microorganismo; siendo este el posible

causante de la iniciación de este proceso en dientes, es de gran importancia la pertinente

identificación del S.mutans y de esta manera realizar el tratamiento antibiótico con amoxicilina

en la correcta proporción para tratar infecciones odontogénicas de las cuales la caries es el

comienzo, y así evitar que el microorganismo empiece a crear resistencia. Estudios previos han

reportado el aumento de la resistencia a la amoxicilina que ha impedido el tratamiento antibiótico

efectivo en pacientes que lo requieren; al observar los resultados se puede evidenciar en la tabla 2

que de las 180 cepas muestreadas 8 de ellas correspondientes a S.mutans son resistentes a la

amoxicilina, aunque el porcentaje de cepas resistentes es del 4,4% se puede afirmar el desarrollo

de resistencia al fármaco por parte de las cepas; esto se puede argumentar con lo mencionado por

Bilavsky et al. (2008) en su estudio en el que se evalúa la susceptibilidad de S.mutans a la

penicilina y se señala que la resistencia a este es directamente proporcional a la exposición del

microorganismo al tratamiento antibiotico43; lo mencionado por Bilavsky conlleva al origen de las

cepas, ya que las 180 provenían de dos clases de pacientes, en una de ellas estaban bajo

tratamiento antibiótico con amoxicilina durante un periodo mayor de 3 semanas, los demás

provenían de pacientes sanos los cuales no estaban expuestos a dicha sustancia. Lo anteriormente

discutido puede ser la razón por la cual el número de S.mutans resistentes a la amoxicilina no fue

alto, debido a que la población muestreada no utilizada dicho antibiótico en su totalidad.

de 39

Aunque la resistencia por parte de S.mitis a la penicilina es de las más reportadas ya que Westling

et al. (2006) en su estudio en el hospital universitario suizo comenta que S.mitis es uno de los

microrganismos que tiene más alto grado de insensibilidad a la penicilina; no obstante en el

presente estudio ninguna cepa de S.mitis presento un resultado diferente a sensible.44 La tabla 2

también muestra los resultados arrojados por los dos métodos utilizados para la evaluación de la

susceptibilidad a la amoxicilina por parte de las cepas evaluadas, las cepas intermedias fueron dos,

y en estas se presentó discrepancia entre los métodos y el microorganismo con dicho resultado

fue S.mutans; los resultados intermedios correspondieron en ambos casos a lo evaluado con el

sistema MicroScan. Un estudio realizado por Lee et al. (2015) en el cual también fue utilizado el

método MicroScan para la determinación de susceptibilidad en el caso específico fue a el

ertapenem, reporto que al utilizar el sistema de MicroScan este presento resultados similares con

respecto a la dilución en caldo, ya que hubo mayores discrepancias entre microscan y Vitek2 el

cual fue otro método utilizado en dicho estudio45, se utilizó también el método de difusión con

discos, el cual presento sensibilidad del 50% siendo el menor valor reportado; además este fue el

método que más resultados sensibles otorgo. Relacionando lo mencionado por Lee se puede

evidenciar que los resultados obtenidos mediante el antibiograma de las 2 cepas que presentaron

resistencia intermedia en MicroScan fueron susceptibles con el método de disco-placa

confirmando la poca sensibilidad discutida por Lee. Otros autores consultados como Rittenhouse

et al. (1996) utilizan el método de microdilución en caldo y difusión en disco para corroborar los

resultados obtenidos mediante métodos automatizados como MicroScan y Vitek2; en dicha

investigación se presentaron mayores discrepancias entre los métodos de confirmación y el

MicroScan en comparación de los métodos de confirmación y el Vitek2, llegando a la conclusión

que el mejor método para determinar la susceptibilidad fue el Vitek2.46

En las tabla 3 se puede evidenciar la inclusión del método molecular PCR, el cual fue escogido

como el Gold Standard. Este método fue seleccionado debido a la especificidad que tiene y a los

resultados otorgados, los cuales siempre fueron a nivel de especie; López et al. (2013) confirma lo

mencionado anteriormente, proponiendo que el mejor método de identificación de los

microorganismos del grupo de los viridans es el análisis de secuencia del gen sodA, ya que es una

de 39

técnica efectiva para la tipificación a nivel de especie,47 y aunque no se amplió este gen en

específico se observó el fragmento 16s el cual permitió la identificación requerida. Esta tabla

muestra los resultados obtenidos mediante los diferentes métodos y cuál fue el porcentaje de

identificación para cada microorganismo dependiendo del sistema utilizado.

Los métodos Manual, Cristal y MicroScan con respecto a el método molecular difieren en la

medida en la que existe un criterio personal al realizarse una lectura con base a los colores

proporcionados, mediante la reacción del microorganismo al entrar en contacto con el compuesto

a evaluar; por el contrario la PCR solo necesita de la correcta extracción del ADN y hacer correr el

gel, seguido a esto todo el proceso depende de un programa el cual proporciona resultados según

la base de datos que posee, esta es una de las razones por la cual el método molecular es más

específico en la identificación. Sin embargo S.mutans y S.mitis al tener un alto grado de similitud,

influyen en la obtención de resultados incongruentes mediante métodos como la PCR, Alcaide

explica que estos dos microorganismos junto con S. sanguis tienden a ser parecidos por la

capacidad de producir dextranos extracelulares que actúan como mediadores en los mecanismos

de fijación.48 Consultando la bibliografía y observando los resultados discutidos, se puede

corroborar lo mencionado por Arevalo et al. (2014)49 el cual dice que se ha encontrado una gran

similitud entre la secuencia del 16S rRNA entre S. mutans, S.mitis y S. parasanguinis, lo cual indica

que el método molecular tampoco es el mejor debido a que no es tan especifico. Janda confirma el

alto grado de similitud fisiológico y genético entre los microorganismos pertenecientes al grupo

Mitis-Sanguinis, y menciona que este método de secuenciación está siendo utilizado para

establecer relaciones entre las especies pertenecientes al grupo de los Streptococcus viridans.51

Drancourt et al. (2003) señala que la secuenciación de genes mediante dicho método, ha sido

descrita con limitada capacidad de discriminación entre especies y esto se evidencia mediante la

afirmación, que la secuencia del gen 16S rRNA ha mostrado tener mayor del 99% de similitud

entre microorganismos como S. mitis y S. oralis.50

Con respecto a los métodos convencionales y fenotípicos, Janda comenta, que estos no son

recomendables de utilizar para la identificación de los microorganismos del grupo viridans, desde

que se descubrió que las reacciones a los sustratos utilizados en estos métodos tienen resultados

de 39

casi idénticos, en dicha investigación se menciona también que todas las especies en el grupo

Mitis-Sanguinis fermentan glucosa, maltosa y lactosa; además tienen características variables

dependiendo de las otras reacciones para la fermentación de carbohidratos.51 Es por esta razón

que se puede observar que el método manual presenta muchas incongruencias frente al

molecular, con respecto a la identificación de S.mitis, S.oralis y S.sanguis al no lograr identificar en

su totalidad el número de cepas que la PCR tipifico. También se puede observar que esta técnica

presenta un porcentaje mayor de identificación para S.mutans que los demás métodos. Westling

indica que las bioquímicas no son un buen método para identificar microorganismos

pertenecientes al grupo de los viridans ya que presentan muchos resultados erróneos en la

identificación de los mismos.52

En la tabla también se puede evidenciar que la mayor congruencia entre resultados se dio entre el

método de PCR y MicroScan, aunque este es el método que mejor identificación presenta después

del Gold Standard se evidencia la dificultad para identificar microorganismos pertenecientes al

grupo viridans; Snyder et al. (2008) soporta la idea aclarando que sistemas como Phoenix o

MicroScan identifican incorrectamente debido a que muchos de los aislamientos no están

incluidos en su software de bases de datos53. La bibliografía consultada, menciona que los

métodos que tienen su base de datos actualizada debido al avance tecnológico que poseen con

respecto a la identificación de los viridans son: manuales API Rapid Strep and ID32 Strep

[bioMérieux, Durham, NC]) y automatizados Vitek 2 [bioMérieux] y Phoenix [BDMS, Cockeysville,

MD]) ya que los otros sistemas no tienen las nuevas especies incluidas en sus bases de datos y es

por esto que en ocasiones no se da la identificación54

Se realizó un análisis de concordancia, en el cual se halló el índice kappa comparando los

resultados obtenidos para S.mutans, S.mitis, S.oralis, S.salivarius y S.sanguis mediante los

diferentes métodos; no se realizó este análisis de todos los microorganismos identificados debido

a que los anteriormente mencionados se encontraban en mayor proporción y son miembros del

grupo de los viridans. Los resultados obtenidos en este análisis se observan en la tabla 4 y para la

respectiva interpretación de los valores obtenidos mediante el índice Kappa, la fuerza de

concordancia se encuentra en la tabla 5. Microorganismos como S.salivarius, S.sanguis y S.oralis

de 39

presentan una fuerza de concordancia entre buena y muy buena indicando que todos los métodos

utilizados son pertinentes para la identificación de los mismos.

Con respecto a los demás microorganismos, para el caso de S.mitis, MicroScan es el sistema que

presenta fuerza de concordancia más baja con respecto a PCR, Cristal y Manual; siendo esta

moderada y presentando mayor número de incongruencias entre dichos métodos, evidenciándose

en la tabla anterior, que S.mitis es un microorganismo el cual ha sido identificado por MicroScan

en mayor proporción de lo que se encuentra.

S.mutans presenta una fuerza de concordancia muy buena entre PCR y MicroScan lo cual se

demuestra en la tabla anterior presentando que por el método de MicroScan solo una cepa no fue

identificada como S.mutans. Al analizar los valores más bajos del índice kappa estos corresponden

a la comparación entre el método manual con la PCR, el MicroScan y el cristal respectivamente, y

se obtienen fuerzas de concordancia buenas, pero se evidencia que mediante este método el

número de cepas identificadas como S.mutans es mayor; esto es de gran importancia en la medida

en la que este es el método comúnmente utilizado para la identificación de dicho microorganismo

y los resultados demuestran que mediante esta técnica se obtienen falsos positivos.

Epidemiológicamente esto es de suma importancia, puesto que, la identificación de este

microorganismo en gran proporción en la boca es indicio de susceptibilidad a la caries por parte

del paciente y como el sistema más utilizado para la identificación de este en clínicas es el método

manual se puede corroborar que este arroja falsos positivos con respecto a S.mutans; esto

conlleva a el mal diagnóstico y tratamiento del pacientes debido a que se podrá catalogar como

susceptible a la caries pero no ser precisamente así, ya que el método otorgo una proporción

mayor de S.mutans que la que en realidad tenía la persona en cuestión. Otro punto a tratar que

está ligado a la identificación correcta de S.mutans es la resistencia que este presenta a la

amoxicilina; siendo este el antibiótico más utilizado a nivel clínico y su administración es

directamente proporcional a la cantidad de colonias de S.mutans presentes en cavidad oral, al

haber una mala identificación del mismo cada paciente podría estar recibiendo la dosis incorrecta

de este compuesto y de esta manera es que el microorganismo ha venido creando una resistencia

debido a la no necesidad del antibiótico pero aun así a su constante exposición al mismo.

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9. CONCLUSIONES:

Basado en los resultados obtenidos el método más indicado para la identificación de los

microorganismos pertenecientes al grupo de los viridans es la PCR, seguido por el MicroScan. El

método manual no permite la identificación correcta de S.mutans ya que no logra llegar a nivel

de especie y presenta falsos positivos en sus resultados; la resistencia a la amoxicilina se llega a

ver influenciada por la inapropiada identificación de la población de S.mutans en la cavidad oral

y de esta manera el antibiótico es suministrado en mayor proporción de lo requerido y debido a

la constante exposición del microorganismo al compuesto este ha creado resistencia al mismo.

10. SUGERENCIAS:

Realizar una evaluación de la susceptibilidad a algún antibiótico es recomendable utilizar el

método de difusión con discos solo para confirmar los resultados obtenidos mediante los

diversos métodos automáticos utilizados; es decir es aconsejable utilizar más de un método

automatizado para la determinación de la susceptibilidad.

Aunque se presentaron mayores concordancias en algunas cepas que en otras no se puede

hablar que hubo un 100% de congruencia entre los métodos, se podría observar que ninguno de

los métodos utilizados fue con exactitud el más adecuado para la identificación de este grupo de

microorganismos; debido al gran número de discrepancias encontradas, como sugerencia se

podría utilizar el método molecular de referencia pero otros métodos automatizados más

reportados para la identificación de los viridans, por ejemplo el Vitek, el Phoenix y el MicroScan.

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