Técnicas de biologia molecular da análise de genes e produtos ...

Técnicas de biologia molecular

da análise de genes e produtos gênicos únicos a

abordagens em larga escala

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os mesmos genes, qual a diferença?


Dogma central


Localizando alvos

• Técnicas iniciais para evidenciar determinadas moléculas de interesse

• DNA / RNA métodos baseados em hibridização


Hibridizaçãodesnaturação / renaturação de ácidos nucléicos


Light absorption and temperature in DNA denaturation. (a) Melting of doubled-stranded DNA can be monitored by the absorption of ultraviolet light at 260 nm. As regions of double-stranded DNA unpair, the absorption of light by those regions increases almost twofold. The temperature at which half the bases in a double-stranded DNA sample havedenatured is denoted Tm (for temperature of melting). Light absorption by single-stranded DNA changes much less as the temperature is increased. (b) The Tm is a function of the G·C content of the DNA; the higher the G·C percentage, the greater the Tm.


Southern blot

• DNA é hibridizado com uma sonda – um fragmento de DNA de seqüência conhecida que contém algum tipo de marcação e pode ser detectado.

• Mostra sequências complementares à sonda

• detecta pequenas quantidades (1 to 10 pg por banda) de uma sequência específica 1000 vezes mais sensível que EtBr


Southern blot - etapas

• Etapas: amostra de DNA submetida à eletroforese – mobilidades registradas

• DNA transferido para um filtro (nitrocelulose ou nylon) criando uma cópia do gel

• DNA é imobilizado no filtro


Sothern blot - marcação de sonda

• Incorporação no DNA de nt marcado radioativamente (p ex. alfa fosfato P-32), ou por adição de um grupamento químico (digoxigenina ou biotina)

• COMO?

• "End labeling“ enzima polinucleotídeo quinase transfere fosfato terminal de nt radioativo P-32-gamma- para a extremidade 5’ do DNA


Sothern blot - Hibridização da sonda ao DNA imobilizado no filtro

• A sonda é desnaturada (fervida) e adicionada (em excesso) em solução sobre filtro

• Sonda hibridiza com seqüências complementares


Sothern blot - lavagens e detecção

• Lavagens retiram excesso de sonda e desfazem ligações inespecíficas (temperatura, força iônica)

• Permanecem as ligações específicas

• Revelação com base na marcação da sonda


Sothern blot - revelação

• Sonda radioativa- filtro é exposto a filme raio X, revelado

• Sonda marcação química – filtro é exposto a anticorpo conjugado a enzima (p ex. fosfatase alcalina) + substrato que pode gerar produto colorido ou luz

• a posição da sonda é revelada


os mesmos genes, qual a diferença?


Análise dos transcritos: Análise dos transcritos: NorthernNorthern BlotBlot

• Extrair RNA dos organismos ou tecidos• eletroforese de RNA • transferência do RNA para uma membrana• marcação de sequências conhecidas

(sondas)• Hibridização para localizar sequências alvo • Visualização e • quantificação do sinal • de hibridização


Análise da expressão de proteínas: Análise da expressão de proteínas: WesternWestern BlotBlot

• Extrair proteínas das células

• eletroforese desnaturante

• transferência das ptns para uma membrana

• Reação com anticorpo• 2o anticorpo marcado• Visualização e • quantificação do sinal


Sequenciamento de DNA

• Reação de sequenciamento -replicação de DNA

• molde: DNA plasmídeo, fragmento ou produto de PCR (200 ng)

• um primer 20 nt complementar a uma região de uma das fitas de DNA

• tampão + dNTPs

• enzima variante da Taq polymerase


Reação de polimerização

• Desnaturação do DNA 96oC 10 min + formamida

• PCR 96oC 10’’, 50oC 5´´, 60oC 4 ´25 X

• 2 fitas de DNA molde se separam, primer anela a uma delas especificamente, polimerase estende o primer

• apenas uma fita é sintetizada, não amplifica DNA


• dideoxinucleotídeos -sem 3' OH

• ao serem adicionados à extremidade do DNA não há como continuar a síntese

• atuam como terminadores da síntese

• a maior parte dos nt são normais, uma fração são ddNTP

Método término da síntese de DNA por dideoxi-nt


dTTP normal em excesso, incorporado na maioria dos casos, a extensão continua

entrada de ddTTP aleatória, a fita para

ao fim milhões de moléculas incluem paradas em todas as posições de T

todas as moléculas têm o mesmo início mas términos variados

tamanhos variados são separados por eletroforese

Sequenciamento de DNA - reação Ex: ddTTP


• Dideoxi nt quimicamente modificados por adição de corante fluorescente.

• Reação com os 4 ddNTPs (A, G, C, T) cada um com uma cor diferente permite ler a seqüência de DNA

Sequenciamento de DNA - reação


Sequenciamento de DNA - automático

Leitura: sequenciador de DNA contém fonte de laser que atravessa o gel com um scanner, são registrados os comprimentos de onda de emissão quando cada fragmento de DNA passa pelo detector. Cada tipo de base com um comprimento de onda próprio.


Software de análise de sequência fornece a leitura das bases e um gráfico com intensidade de sinal, qualidade da sequência, tamanho pode chegar a 700 nt

Sequenciamento de DNA - resultado


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