Patricia D. C. Schaker

Universidade Estadual do Rio Grande do SulUnidade de Bento Gonçalves

Engenharia de Bioprocessos e BiotecnologiaRecuperação e Purificação de Bioprodutos

PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS- Formados por ligações peptídicas.

CLAE, RP-HPLC Coluna: sílica modificada ou

derivatizada

HIDROFÍLICA HIDROFÍLICA HIDROFÓBICA HIDROFÓBICA

Introdução de cadeias alquílicas contendo um número definido de átomos de carbono. Ex.: n-butil (C4), n-octil (C8), n-octadenil (C18), fenil, cicloexil, outros.

Características a serem consideradas:

- Tamanho dos grãos da sílica derivatizada

DEFINEM O VALOR DE “N” (EFICIÊNCIA DE SEPARAÇÃO)

- Poros do grão de sílica: devem ter dimensão 10x maior que o diâmetro do soluto.

- Separações analíticas: coluna com 5-25 cm de comprimento 1-4,6 mm diâmetro recheadas com partículas de 3-5um.

Caráter hidrofóbico da coluna:

C18>C8>C4>C2

C18, C8 para peptídeos C8, C4 para proteínas

|SiO2|-(CH2)17-CH3

Preparado com água bidestilada ou deionizada.

Solvente A: água acidulada + TFA

+Ác. Fosfórico +Ác. Perclórico

+Ác. Hepta-fluorobutírico ph 2-5

Solvente B: solvente A + solvente orgânico (metanol, acetonitrila ou 2-propanol)

- Uso de bombas programáveis. - Mistura desconhecida: variações de 0,2 a 5%/min. do solvente Bem relação a A.

FLUXO:- Coluna analítica: 1-2 mL/min.- Semipreparativa: 3-5 mL/min.- Preparativa: 10 mL/min.

Uso de tampão na eluição Uso de temperaturas elevadas

Detecção:- Comprimentos de onda:210-225 nm (ligação peptídica) 275-280 nm (grupos aromáticos).

Fase estacionária: Fase estacionária: Sílica ou polímero funcionalizado.

Ligação da molécula-alvo baseada na hidrofobicidade, cargas e outras propriedades conferidas pelo grupo funcional.

Interação ligante-biomolécula se dá através dos grupos NH2, OH e SH da proteína na presença do tampão.

Passagem de uma solução que desestabiliza as interações ligante-peptídeo/proteína.

- Redução do pH - Adição de sais caotrópicos (CCl3COO-, SCN-,

CF3COO-, ClO4, I- e Cl-)- Agentes dessorventes específicos (para proteínas sensíveis a desnaturação)

Pode ocorrer quebra das ligações dissulfeto e de hidrogênio.

Escolha do fluxo adequado para uma boa resolução dos picos (condições analíticas: 0,5-1 mL/min.)

Técnicas para Eluição

Separação de compostos ionizáveis em campo elétrico.

Aplicável para moléculas orgânicas e inorgânicas, aminoácidos, nucleotídeos, peptídeos e proteínas.

Rápido, necessita de pouca quantidade de amostra e de solventes, elevada reprodutibilidade e possibilidade de automação.

CE com capilar em solução livre: CE com capilar em solução livre: - Capilar preenchido com tampão.- A amostra injetada é submetida a uma

diferença de potencial que gera um corrente elétrica e um campo elétrico, impulsionando a migração dos íons da amostra.

- A separação ocorre devido a diferença de velocidade dos íons decorrente do seu tamanho, forma e carga.

- Fluxo da solução tampão.

CE micelar:CE micelar: Separação de misturas de componentes

neutros. Interação das moléculas com a micela

que reveste o capilar.

CE em gel:CE em gel: Separação, quantificação e determinação da

massa molar de proteínas. Géis: são estruturas porosas, em que um

componente fluido é imobilizado numa rede polimérica. A distância média entre as ligações, distribuição dos pontos de ligação e conteúdo líquido governam o tamanho e a distribuição dos poros no gel.

Os solutos migram através de uma estrutura polimérica, sendo mais ou menos impedidos em seu percurso, de acordo com o seu tamanho, processo este conhecido como Peneiramento.

Identificação e caracterização química de peptídeos e proteínas.

A separação e detecção se dá pela ionização e vaporização das moléculas com diferentes valores de m/z.

O conjunto de valores m/z possibilita a determinação da massa molar e estrutura primária dos peptídeos ou proteínas

Contém uma fonte geradora de íons, um analisador de massas que os separa de acordo com a relação m/z e um detector.

1)1) INSERIR A AMOSTRA NO APARELHO EM CONDIÇÕES IONIZÁVEIS

2) 2) VOLATILIZAR A AMOSTRA3) 3) PROPULSIONAR ELETROSTATICAMENTE OS

ÍONS GASOSOS 4) 4) SEPARAR OS ÍONS5) 5) DETECTAR

Fonte de íons

FAB-MS MALDI-MS

ESI-MS MAIS UTILIZADOS, MÉTODOS SUAVES DE IONIZAÇÃO

FAB-MS: bombardeamento rápido de elétrons.

ESI-MS: spray de elétrons

MALDI-MS: dessorção por laser.

Amostra + solvente + matriz líquida não-volátil

Matriz: absorve a maior parte da energia

Bombardeamento por átomos de xenônio ou por íons Cs+.

As moléculas gasosas carregadas são propulsionadas eletrostaticamente para o analisador de massas e detectadas.

Feixe ionizante de luz laser e matriz sólida.

Matriz: absorve energia do feixe, o que causa sua volatização junto com a volatização da amostra.

As moléculas da matriz ionizada transferem prótons para a amostra.

Os íons formados são dirigidos por lentes eletrostáticas para um analisador de massas de tempo de vôo.

Produz moléculas gasosas ionizadas a partir de uma solução líquida acidificada.

Favorece a formação de moléculas com múltiplas cargas, possibilitando a análise de peptídeos e proteínas de massa molar alta (fluxo de gás perpendicular).

Identificação e caracterização química Determinação da composição real de

aminoácidos Compreensão das propriedades

químicas, físicas e biológicas

Secar e pesar o polipeptídeo isolado Colocar em um tubo de vidro pirex Adição de HCl 6N contendo 1% de fenol

a 110 0 C por 24h, sob atmosfera de N2 em

completa ausência de íons metálicos, para hidrólise das ligações peptídicas.

Hidrólise em estado vapor Podem ocorrer reações secundárias

(Degradação, quebra parcial, oxidação)

DERIVATIZAÇÃO PÓS-COLUNA

DERIVATIZAÇÃO PRÉ-COLUNA

Separação dos AA por cromatografia de troca-iônica de alta eficiência.Após separados os AA

entram em contato com solução de ninidrina em reator tubular a 130 0 C.

Detecção: 570nm ou 440nm (prolina)

Quanto >Intensidade da cor > [AA]

Baseada na propriedade fluorescentes ou de absorção de luz UV.

Uso de RP-HPLC.Reagentes: OPA, PITC, PTC.

ALTA SENSIBILIDADE

ciclo 1

ciclo 2

hidrólise com ácido trifluoroacético

hidrólise ácida

vai para novo ciclo

(1)

(2)

(3)

acoplamento

acoplamento

Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:

1. Reação da proteína com PITC, que se acopla ao grupo amino NH2- livre do aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);

2. Hidrólise ácida da proteína conjugada com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH) do aminoácido 1 e o restante da proteína, tornando o aminoácido 2 o novo resíduo N-terminal (no exemplo uma serina, S);

3. Análise cromatrográfica do PTH-aminoácido e novo ciclo de reação com o novo N-terminal da proteína.

Seqüenciadores automatizados fazem todas as etapas. Limitado para proteínas que apresentam N

terminal bloqueado.