T03.2_SepCelFrac
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Separacin de clulasyfraccionamiento subcelular
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Mtodos fsicos de SEPARACION DE CELULAS
* Necesarios para estudiar: - Tejidos con diferentes tipos celulares- Clulas con diferente funcionalidad/ actividad biolgica- Subpoblaciones celulares con diferentes marcadores moleculares- Alternativa a la clonacin: + rpidos, + rendimiento, (- pureza)
* Los ms empleados explotan diferencias en: Tamao celular Densidad Carga/Qumica superficial Dispersin de la luz (light scatter) Emisin de Fluorescencia
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b
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Beckman J2-21M, centrfuga equipada con un rotor y sistema de elutriacin
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Rotor de elutriacin (Beckman)
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Cmara de separacin del rotor de elutriacin
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Apariencia de las clulas aisladas de una fraccion de elutriacin de clulas sanguneas de la mdula sea humana cultivadas durante 8 das (a, b). Las clulas predominantes son de tipo fibroblastoide con un ncleo central, citoplasma difuso y pseudopodos aderentes y clulas grandes, redondas con un estrecho citoplasma y un ncleo central redondo. (tincin con hematoxilina). (a) x200; (b) x400. (c) Apariencia de las clulas aisladas de la misma fraccin de elutriacin y cultivadas en DMEM+20% FCS suplementado con dexametasona, cido ascorbico y b-glicerofosfato durante 8 das. En esas condiciones, las celulas presentan una morfologia redondeada o cuboidal con un ncleo central, x200. Separacion de clulas por elutriacin
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Separacin de clulas sanguneas con Ficoll-HypaqueCentrifugacin
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Separacin inmunomagntica
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SeleccinpositivaSeleccinnegativa
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Absorcin de luz por un e- y la subsiguienteemisin de E como calor y fluorescencia
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Esquema de un Citmetro de Flujo (FACS)
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Funcionamiento de la boquilla vibradora de un citmetro de flujo
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Green fluorescenceRepresentacin de los datos en citometra de flujo
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Esquema de un Citmetrode Flujo clasificador (sorter)Puede seleccionar 1/1000clulas y clasificar miles/s
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Microdiseccin con lserSperm Tail RemovalBiopsy at the Single Cell Level
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Fraccionamiento de componentes subcelularesDiseados inicialmente para comprender el papel bioqumico de cada orgnulo en la clula
La lisis (rotura) celular se suele realizar por: Potter, homogeneizador mecnico de tejidos, sonicacin, cavitacin, soluciones hipotnicas
La separacin de los componentes subcelulares se realiza generalmente por centrifugacin
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Homogeneizacinde la muestraCentrfuga de alta velocidadPotter
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1000 x g, 10 min20.000 x g, 20 min80.000 x g, 1 h (ultracentrfuga)150.000 x g, 3 hFraccionamiento subcelular por centrifugacin diferencialcitosol
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Comparacin dela sedimentacinpor velocidad (A)y por equilibriode sedimentacin(isopcnica, B)5-20%
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Purificacin de orgnulos por centrifugacin en gradiente de densidad
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NcleosMicrosomas (RER)PeroxisomasControl de calidad del fraccionamiento: TEM