Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

SZÖVETI REGENERÁCIÓ (3)

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 19. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szívelégtelenség

• Az egyik leggyakoribb betegség• Nagy morbiditás és mortalitási ok a fejlett

országokban• Okok:

– Veleszületett rendellenességek– Magas vérnyomás– Szívinfarktus– Mérgek, toxinok– Fertőzések

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szívizom regenerációs terápiák

A szívizom regenerációját célzó terápiák a kutatások fókuszában vannak:• A szívelégtelenség előfordulása egyre

gyakoribb az életkor előrehaladásával • A fejlett országokban a populáció egyre

inkább öregszik• A szívinfarktust túlélő betegek száma

növekszik• A legtöbb MI túlélő szívelégtelenségben

szenved

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

LVAD

• A bal kamra pumpafunkcióját segíti

• Pulzálás vagy • Folyamatos

pumpálás• 7 év az LVAD-al

viselési rekord

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bal kamra kisegítő eszközök

Szívtranszplantációra váró betegekben:• A megfelelő donor megtalálásáig életben tartja a

szívelégtelenségben szenvedő beteget• A kezelés maga is segíti a sérült szívizom regenerációját• Javítja az életminőséget

Transzplantációra alkalmatlan betegeknél:• Palliatív terápia• Javítja az életminőséget

Szövődmények lehetnek:• Infekció veszélye• Alvadási rendellenességek veszélye• Embolizáció veszélye

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Csontvelői sejtek a szívizom regenerációban

VérerekEndotél progenitor

sejtek (hemangioblasztok)

SzívSide population sejtek

Kit+ sejtekSca-1+ sejtek

CsontvelőMesenchimális

őssejtekHemopoetikus

őssejtekSide population sejtek

VázizomSzatellita sejtek

Side population sejtek

Fúziós és nem-fúziósdifferenciációs út

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban I.• Csontvelői sejtek (BMC)• Hemopoetikus őssejtek részt vehetnek a szívizom

regenerációjában• Intenzíven tanulmányozott terület állatkísérletes

modellekben különböző módon jelölt BMC-kkel• Eltérő nemű donortől származó graftok betegekben• Sérülés után BMC homing tapasztalható a sérült

területre• GCSF moblizáció nem reprodukálja a BMC helyi

injektálásának eredményeit

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban II.

Intravenás infúzióSzelectív intrakoronáriás infusionDirekt intramiocardiális injekció

↓Kardiomiocita apoptosisRezidens őssejtek toborzása

Kardiomiocita proliferáció

Matrix:Hegszövet kompozíció

Granulációs szövet

Pro-angiogén cytokinekAngiogén ligandok

↑Szív teljesítménye

↑Funkcionális kardiomiociták

száma↑Perfúzió

Parakrin faktorok szekréciója

Differenciáció érfal komponensekké

Differenciáció a szívre jellemző

fenotípussá

Fúzió a residens kardiomiocitákkal

Perivaskuláris inkorporáció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban III.

• BMC transzdifferenciációjára szívizomsejtekké nincs direkt bizonyíték

• Ha egyáltalán előfordul, nagyon ritka esemény

• Talán az egyetlen nyilvánvaló terápiás előny a sérült szívizomszövet megnövekedett vaszkularizációja, amely a saját regenerációs kapacitást növeli.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtes terápiás lehetőségek a szívizom-regenerációban IV.

• A szívizomsejtek megtartott osztódási képessége bizonyított tény

• Többfajta őssejt-markereket (Sca-1, CD31) és szívizom-markereket expresszáló, proliferáló sejttípus mutatható ki a szívizomban 5-azacitidin-indukálta sérülés után

• Rágcsálókban és emberekben is kimutatható• Jó proliferációs képesség

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Szívizom sejtes terápiája

Szívizomsejt• Egy sejtmag (centrális)• Gap junction (+)• Cx43 expresszió (+)

Myotubulus• Sokmagvú• Gap junction (-)• Cx43 expresszió (-)

Vázizomrost• Sokmagvú (perifériás)• Gap junction (-)• Cx43 expresszió (-)

Myoblaszt(szatellita sejt)• Egy sejtmag• Gap junction (+)• Cx43 expresszió (+)• Proliferáció (+)

Fúzió és differenciáció

???

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Vázizom myoblasztok

• Biopsziából származó vázizom mioblasztokat alkalmaztak korai stádiumú klinikai kipróbálás során

• Szívizom teljesítmény és életminőség növekszik:– Csökken a NO szükséglet– Javul az NYHA besorolás– Javul a fizikai terhelhetőség

• A betegeknél kamrai aritmiák fordultak elő• Néha ICD beültetése vált szükségessé• A vizsgálatokban részt vett betegek száma alacsony

volt• Nem volt kezeletlen kontroll csoport ezekben a

vizsgálatokban

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Embrionális őssejtek

• A szívizommá differenciálódási képesség bizonyított• hESC-eket beültetés előtt differenciáltatni szükséges• A sérülés önmagában nem indukálja a hESC

növekedését és a szívizommá való differenciációt, sőt, gyulladásos citokinek károsíthatják a beültetett sejteket

• Gyulladáscsökkentő és más védő anyagok alkalmazása szükséges a graft támogatásához (IGF-1, pán-kaszpáz inhibitorok és NO blokkolók)

• A differenciálódott szívizomsejtek immunválaszt váltanak ki immunkompetens egerekben.

• Teratoma kialakulása is kockázatot jelent. Jelenleg kérdéses a klinikai alkalmazás jövője.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Tissue engineering megoldások fogpótlásban• A fogazat nagyon fontos a gerincesek

táplálkozásában• A fogzási rendellenességek vagy a hiányos

szájhigiéné nem életet veszélyeztető kondíció a fejlett országokban

• Ennek ellenére a fogazat károsodása és betegségei jelentősen csökkentik az életminőséget

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fogfejlődés

• Kölcsönös jelátviteli események az epitélium és az alatta lévő mesenchyma között

• A morfogenezis és a végleges differenciáció megkezdődése

1.Csíra szakasz

2.Epitéliális sapka szakasz (körbeveszi a mesenchymát)

3.Harang szakasz

4.Koronai szakasz

Dentin

Odontoblaszt

Foggyökér

Periodontálismembrán

Cement

Zománc

Fogkorona

Vérér

Sharpey rost

Fogíny rost

Pulpaüreg

Fogágycsont

Idegrost

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fogbél eredetű őssejtek (DPSC)

• A DPSC-k multipotens sejtek a fogbélben (pulpa dentis)

• Fontos szerep a dentin sérülés utáni regenerációjában

• Odontoblasztok jelennek meg a sérülés helyén• Differenciálatlan mezenchymális sejtek

folyamatosan vándorolnak a mélyebb rétegekből a dentin felé és odontoblaszt irányú differenciáció figyelhető meg

• Kísérleti bizonyítékok utalnak arra, hogy a migráló sejtek a DPSC-k.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A DPSC-k differenciációs képessége

• Emberi DPSC-k tenyésztése mineralizációt serkentő körülmények között

• A sejtek odontoblaszt-szerű sejtekké differenciálódnak, dentint termelnek és nestin-pozitívak

• A DPSC-k fenotípusosan az MSC-kre emlékeztetnek, de a dentin-termelő képességük egyedi

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Tissue engineering a fogpótlásbanFogképző sejtek

screeneléseSejt ko-kultúra

3D körülmények közöttFogcsíra szövetkonstrukció

transzplantációja

Betegből izoláltőssejtek

Epitéliálissejtek

Mezenchymálissejtek

Transzplantáció

In vitro tenyésztettfogkonstrukció

A transzplantáltszövetkonstrukció

foggá fejlődik

Fogcsíraszövetkonstrukció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fog előállítása mesterséges körülmények között I.Scaffold-alapú foggyökér:

• Biokompatibilis anyagból készült gyökér-implantátum, amelyre mesterséges (pl. porcelán) koronát rögzítenek

• A sejtek belenőnek a scaffold anyagába, így biztosítják a rögzítést

• Sertés állatmodellen végzett kísérletek bizonyítják a megvalósíthatóságot

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fog előállítása mesterséges körülmények között II.Az embrionális fogfejlődés mesterséges reprodukálása:• Az embrionális fogfejlődés tökéletesen

azonos funkciójú fogat eredményez• A foggyökér és a korona is kifejlődik• Rágcsáló kísérletek sikeresek voltak• Nem csak embrionális, hanem újszülött vagy

felnőtt eredetű sejtek is képesek voltak a fog kinövesztésére

• Scaffold alapú és scaffoldmentes rendszerek is kipróbálásra kerültek

SZÖVETI REGENERÁCIÓ (4)

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dr. Pongrácz JuditHáromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 20. Előadás

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Húgyivari szervek sérülésének okai

Húgyivari szervek sérülései vagy funkcióvesztése:

• Fejlődési rendellenességek• Trauma• Fertőzés, gyulladás• Orvosi beavatkozás mellékhatása (iatrogén

ok)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Megoldások a húgyivari szervek szöveti regenerációjábanSaját nem-húgyivari eredetű szövetek:• Bőr• Gasztrointeszinális

eredetű szövetek• Más szervekből kivett

nyálkahártyaAllogén eredetű szövetek:• Kadáver vagy

élődonoros eredetű vesegraft

• Kadáver eredetű fascia

Xenogén anyagok:• Szarvasmarha kollagénMesterséges anyagok:• Szilikon• Polyuretán• Teflon

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Sejtek izolálása szöveti regeneráció céljára• Autológ vagy allogén• Végstádiumú szervelégtelenség gyakran

behatárolja a szöveti regenerációra alkalmas sejtek mennyiségét

• In vitro tenyésztési eredmények különbözőek:– In vitro tenyészett hólyag simaizomsejtek:

alacsony kontraktilitás• Alacsony sejtszám behatárolja a regenerációs

lehetőségeket• Őssejtek jelenthetik a megoldást• Terápiás klónozás is megoldást jelenthet

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában I.• Mesterséges anyagok• ECM funkciók pótlása:

– 3D struktúra kialakítása a szövet kialakulásának támogatására

– Sejtdifferenciáció szabályozása és serkentése bioaktív molekulák tárolása és leadása útján

– Sejtek injektálása a megfelelő scaffold támogatása nélkül nem eléggé hatékony

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Bioanyagok a húgyivari szervek rekonstrukciójában II.Természetes eredetű bioanyagok• Kollagén• Alginát• Sejtmentes szöveti alapanyagok:

– Hólyagi submucosa– Vékonybél submucosa (SIS)

Szintetikus polimerek• PLA, PGA, PLGA

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Urothelium – különleges funkciók

• Kiválasztó, nem felszívó funkció• Jelenlegi sebészeti rekonstrukciós

megoldások a gasztrointesztinális autograftokat részesítik előnyben a húgycső, húgyvezeték vagy a hólyag sérüléseinek a rekonstrukciójában

• Az intesztinális hám és az urothelium különböző szerkezete és funkciója gyakran okoz mellékhatásokat, amelyeknek súlyos következményeik is lehetnek

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Húgycső rekonstrukció I.

Szűkületek, sérülések, trauma, fejlődési rendellenességek (pl. hypospadiasis)

Leggyakrabban a bukkális nyálkahártyát használják graftként a rekonstrukciós sebészetben:

• A graftot a pofa vagy az ajkak belső felszínéről veszik

• A hám vastag és a nyálkahártya erezete gazdag

• Emiatt a graft ellenálló a fertőzésekkel szemben

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Húgycső rekonstrukció II.

Hólyag-eredetű urotélium:

• Megfelelőnek bizonyult a rekonstrukcióban nyulakban

• Klinikai kipróbálás eddig nem volt

Sejtmentes kollagén szövetek:

• Az anyag szükség szerint rendelkezésre áll• Az eredmények jók a „csak” rekonstrukciós

sebészeti megoldások esetében• A szűkületek gyakoriak, ha a húgycsövet teljes

átmérőjében, tubularizáltan kell rekonstruálni

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Húgycső rekonstrukció III.

Sejtmentesített és tubuláris scaffold konstruktok, amelyekre autológ urotéliumot növesztettek:

• Állatkísérletes eredmények biztatóak• A szövetkonstrukciók hisztológiai szerkezete a natív

urotéliumhoz hasonlatos• Kollagén scaffold sejtek kiültetése nélkül szűkületet

eredményezett

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hólyag rekonstrukció I.

Leggyakrabban intesztinális eredetű nyálkahártyát használnak rekonstrukcióra:

• Az intesztinális hám különbözik az urotéliumtól• Az intesztinális hám szerepe a táplálék

abszorpció és a nyákszekréció• Szövődmények: infekció, vesekő, anyagcsere

rendellenességek, perforáció, megnövekedett nyákszekréció, rosszindulatú daganatok kialakulása

Az ellentmondásos eredmények miatt alternatív terápiás lehetőségek felé fordult az érdeklődés

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hólyag rekonstrukció II.

Hólyag megnagyobbító megoldások:

• A húgyhólyag progresszív dilatációja a leggyakrabban alkalmazott konzervatív megoldás

• Augmentációs cisztoplasztika: a hólyag megnagyobbítása húgyvezeték-eredetű urotéliummal

• Jobb eredmények érhetőek el ezzel a megoldással, mint a gasztrointesztinális eredetű graftokkal

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hólyag rekonstrukció III.

Sejtmentes ECM-eredetű anyagok:

• Xenogén SIS → sejtmentesített kollagén-alapú szöveti mátrix → nincsen mukózális izomréteg (str. muscularis mucosae)

• A graft hámosodása rendben lezajlott• Az izomréteg miatt a kontrakciós compliance

akadályoztatott

Scaffold-okra ültetett hám- és simaizomsejtek:

• Az izomréteg sikeresen kialakult, a kontrakciós compliance megfelelő

• Scaffold-ok: PGA és kollagén kombinációja

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Húgyvezeték rekonstrukció

Húgyvezeték rekonstrukció állatokban:• Sejtmentes scaffold-ok beültetésével sikeres

volt a húgyvezeték fal minden rétegének a regenerációja patkányokban

• Merev anyagokból készült csövek (teflon) beültetése nem bizonyult sikeresnek kutyákban

• 3cm hosszú csőszerű sejtmentes scaffold-ok beültetése kutyákban szűkület kialakulásához vezetett

• Sejtes scaffoldok beültetése sokkal kielégítőbb eredményekhez vezetett kutyakísérletekben

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Vesepótló kezelések

Jelenleg rutinszerűen két típusú kezelést alkalmaznak a végstádiumú veseelégtelenség (ESRF) kezelésében:

• Művesekezelés (Dialízis)• Vesetranszplantáció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Dialízis

• Hemodialízis, hemofiltráció– Dializátorok: szintetikus anyagból készült porózus

rostok alkalmazása a leggyakoribb – Alvadásgátolt vénás vért eresztenek át a dializáló

berendezésen, ellenáramú dializáló oldatot alkalmaznak

• Hasi (Peritoneális) dialízis– A dializáló oldatot katéteren keresztül a hasüregbe

vezetik

• A toxikus metabolitok és a felhalmozódott víz eltávolítása a betegből a plazma és a dializáló folyadék közötti ozmotikus különbségeken alapul

• Szív- és érrendszeri, metabolikus és mozgásszervrendszeri szövődmények előfordulása gyakori

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Vesetranszplantáció

• A leggyakrabban átültetett parenchimás szerv• Kadáver vagy élő donor• A dializált betegekhez képest jelentősen javul

az életminőség• Allogén eredetű graft beültetése után

immunszupresszív kezelés szükséges• Az immunszuppresszív kezelés mellékhatásai:

fertőzések és malignus daganatok kialakulására való hajlam növekedése, máj- és vesetoxicitás, szív- és érrendszeri, valamint metabolikus mellékhatások

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TE vese előállítása I.

Bioartificiális megközelítés:

• A dializáló gépek helyettesítése biológiai művesével

• Extrakorporeális és beültethető változatok is • Preklinikai kísérletek kutyákon sertés vese

tubulus sejtekből kialakított biológiai művesével: sikeres karbamid és kálium-szint kontroll

• Legnagyobb hátrány: a beteg még így is géphez kötve éli az életét

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Biológiai művese

Pumpa 370-80 ml/min

Szürlettartály

Hőcserélő

Hőcserélő

Ultrafiltrátum(RAD lumenbe)

Hem

ofilt

er

Pressure monitor

Hemofilterből jövő vér(RAD extrakapilláris térbe)

Plazmapótlófolyadék

RAD dializátor

Feldolgozottszűrlet

(vizelet)

Pumpa 25-7 ml/min

Pumpa 180 ml/min

5-10mm Hg

10-25 mm Hg

Vénás vér

Dializátorbóljövő vér

LumenProximális tubulussejtek

Extrakapilláris tér

Rostok fala

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

TE vese előállítása II.

In vivo megközelítés:

• Humán vesesejteket tubuláris polikarbonát scaffoldkonstrukcióra ültettek

• Immundeficiens egérbe való beültetés során megfelelő sűrűségű érhálózat alakult ki

• Vizeletszerű folyadék termelése: karbamid és kreatinin tartalom

• A hámsejtek tubuláris differenciáció jeleit mutatták

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

In vitro előállított egér vese

Wolff cső

Metanefrikusmesenchyma

4-6 nap

Bimbó

Sejtek

Sejtek

Bimbó