Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of normal epithelial...
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Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of
normal epithelial cell specific-1 geneWei Huang, Xiang-Long Tian, Yun-Lin Wu, Jie Zhong, Li-Fen Yu,
Sheng-Ping Hu, Biao LiWorld J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5810-5.Universidade de Brasília
Estudantes: Carolina Fumico 09/0004434
Inaê Aquino 09/0018516
Luana Lima 09/0028210
Paula Margotto 09/0011872
www.paulomargotto.com.br
Brasília, 17 de janeiro de 2011
Suppression of gastric cancer growth by baculovirus vector-mediated transfer of normal epithelial cell specific-1 gene.
Huang W, Tian XL, Wu YL, Zhong J, Yu LF, Hu SP, Li B.
World J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5810-5.PMID: 18855978 [PubMed - indexed for MEDLINE]Free PMC ArticleFree text
ARTIGO INTEGRAL
Câncer Gástrico Câncer gástrico é a maior causa de morte por doenças malignas (Nakamura, 1992cancer). Diagnostico tardio – biopsia. Desenvolvimento do câncer: - mucosa; camadas seguintes ; ultrapassa as paredes do estômago (atinge pâncreas e baço); metástases Tratamento : ressecção (gastrectomia); quimioterapia e radioterapia tem pouca eficiência ; terapia gênica.
Terapia gênica Consiste em adicionar
fatores genéticos que possam suprir deficiências ou até mesmo inibir a expressão de certos genes nas células-alvo, servindo de tratamento para diversas doenças.
O vetor, no caso, baculovírus, é administrado diretamente ao paciente, permitindo, dessa forma, uma interação in vivo entre o fator genético e as células-alvo.
Introdução Baculovírus - promissores na terapia
gênica, pois: entra mas não se reproduzir em mamíferos, transgenes grandes podem ser acomodados, altos níveis de expressão de gene recombinante.
NES1 – gene supressor de tumor, é provável que funcione como um regulador extracelularmente do crescimento celular.
GFP – proteína fluorescente verde, permitindo a detecção da sua expressão com microscopia de fluorescência.
Objetivo do artigo
Estudar o efeito inibitório do baculovírus mediado pelo gene de
células epiteliais normais específicas (NES1) em câncer gástrico in vitro e
in vivo - terapia gênica.
EsquemaConstrução do vetor recombinante
Verificar a expressão de GFP
Infecção das células CG com Bac-GFP Infecção das células CG com Bac-NES1
Western blot Ensaio de proliferação(in vitro)
Nude mice com tumor de células CG
Estudos in vivo e imunohistoquímica
Bac-GFP e Bac-NES1
Construção de vetores recombinantes de baculovírus
Método Plasmídeo de baculovírus pFBGFPR –
Instituto de Biologia Molecular da Universidade de Hong Kong
pCMV-NES1 – Divisão da Biologia do Câncer do Departamento de Radioterapia, New England Medical Center
Bac-to-Bac (Invitrogen)
Sistema Bac-to-Bac de acordo com o manual padrão (Invitrogen).
Construção de vetores recombinantes de baculovírus
Resultados Derivado do vetor baculovírus contendo o gene
de interesse NES1 com o promotor CMV. Propagação de Bac-NES1 e Bac-GFP em células
de inseto Spodoptera frugiperda (Sf-9).
Cultura de linhagens de células e incubação com o vetor
Método SGC-7901 foram preservadas e mantidas
em RPMI 1640 com 10% de FBS. Sf-9 foram cultivadas a 27ºC em um
frasco de cultura contendo Sf900 II(Gibco), suplementado com 10% de FBS.
SGC-7901 foram semeadas e depois de 1 dia a cultura foi infectada com diferentes MOI de Bac-GFP.
Cultura foi examinada para expressão de GFP por microscopia de fluorescência
Cultura de linhagens de células e incubação com o vetor
Resultados As células transfectadas com Bac-GFP
(MOI=200) 24h após foram examinadas por microscopia de fluorescência, mostrando que as células SGC-7901 podem ser infectadas com baculovírus.
Expressão de NES1 nas células tumorais pela Bac-NES1
A expressão de NES 1 foi comprovada com western blot Eletroforese em gel(separa as proteínas por tamanho) Transferência para membrana de nitrocelulose membrana colocada face-a-face
com o gelcorrente elétrica então as proteínas carregadas se movem do gel para a membrana enquanto mantém a mesma disposição que continham no gel.
Bloqueio(ligações não específicas ) leite Anticorpo primário (membrana incubada overnight ) Anticorpo secundário (1h) Quimioluminescencia foi detectada e analisada
Consultem o artigo integral
Expressão de NES1 nas células tumorais pela Bac-NES1
Resultado Comprovação de que o gene estava
sendo expresso nas células tumorais.
Análise de western blot, mostrando a expressão de NES1 em celulas do tumorResultado: 1 proteína na banda 43 kDa
Ensaio de proliferação de SGC-7901(in vitro)
Placas com células tumorais (SGC-7901)
Bac-NES1 Bac GFP PBS
Quantificado o crescimento celular por absorbância
Infectado
com Infectado com
Tratado com
Estudos de enxerto de tumor in vivo
Objetivo : Estudar o efeito inibitório do gene NES1 no crescimento do tumor nos nude mice enxertados com GC
Nude mice: devido a uma modificação genética o camundongo não tem o timo, apresentando uma deficiência no sistema imunológico.
Estudos de enxerto de tumor in vivo Método: Foram usados nude mice com 5 semanas obtidos
da Shanghai Experimental Animals Centre of Chinese Academy of Sciences
As células SGC-7901 foram injetadas subcutanêamente no flanco dorsal de cada camundongo
Conforme o tumor foi crescendo, ele foi cortado em pequenos pedaços e re-implantados no flanco dorsal de cada camundongo
Isso foi feito mais de três vezes e quando o tumor estava palpável os camundongos foram divididos em três grupos e foi injetado baculovírus contendo: 1. Bac-NES1 2. PBS 3. Bac-GFP * foi aplicado diretamente no tumor durante 3 dias
Estudos de enxerto de tumor in vivo
O peso e o volume do enxerto foi medido de forma aleatória com um “ calliper” a cada três dias durante 3 semanas de tratamento
Após a terapia, o camundongo foi sacrificado e o tecido do tumor foi fixado com formol 10% para o próximo teste
Estudos de enxerto de tumor in vivo Resultados O crescimento do tumor
foi significativamente inibido por Bac-NES1(42,3%) comparando com os outros grupos.
Foi observado diferença significante no volume do tumor a partir do 9˚ dia; Os outros dois grupos não obtiveram diferença significativa entre si
Expressão do GFP Objetivo: Verificar se baculovírus podem ser
infectados in vivo
Resultado: Só teve expressão das células com GFP na letra A, então o enxerto com o tumor podem ser infectados com o baculovírus
Imunohistoquímica Objetivo: Avaliar a expressão de NES1 em SGC-7901 xenografts Método: Os tecidos fixados com formol foram desparafinizados,
rehidratados e lavados com PBS Depois de incubados com 3% H2O2 por 10 minutos a temperatura
ambiente, o antigeno foi ativado As secções foram cobertas com soro animal por 20 minutos e
incubadas com anticorpo policlonal NES1 de coelho a 4˚C durante a noite
Então foram tratadas com EnVision kit por 30 minutos a temperatura ambiente
As secções foram visualizadas por diaminobenzidina e contrastada com hematoxilina
Controle negativo: anti-corpos primários TBS foram substituidos por TBS
Os cortes foram observados no microscópio
Imunohistoquímica
Resultados: O tumor tratado com Bac-NES1 exibiu uma expressão de NES1 significativamente maior que os outros tratados com Bac-GFP e PBS. Isso sugere que redução do crescimento do tumor e tamanho deve estar associado com o aumento da expressão do gene NES1.
Análise estatística
Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
Os dados foram analisados utilizando o sofware SPSS 10.0 (Chicago, EUA).
Conclusão
O estudo da terapia gênica mediada por gene NES1 no câncer gástrico, mostrou-se eficiente para a inibição do crescimento do tumor.
Maiores estudos são necessários para avaliar reações sistêmicas, afeitos adversos e possíveis problemas de resposta imunológica.
Estratégia potente para tratamento de CG
Bibliografia
• http://www.ghente.org/ciencia/terapia/index.htm
• http://www.invitrogen.com.br/
• www.inca.gov.br