Spettroscopia di Fluorescenza Introduzione (1) · Spettri eccitazione di fluorescenza di singola...

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Spettroscopia di Fluorescenza Introduzione (1)

La spettroscopia di fluorescenza studia la r.e.m. che viene emessa in maniera spontanea da un sistema materiale, a seguito di assorbimento di una r.e.m.intensa, che genera un popolazione non nulla nello stato eccitato.

Tipicamente l’emissione spontanea fornisce un contributo importante al processo di rilassamento della popolazione di stato eccitato solo per transizioni molecolari di tipo elettronico, per le quali l’energia di transizione è grande rispetto all’energia termica contenuta nella sistema a temperatura ambiente (kBT).

La fluorescenza è caratterizzata dal fatto di essere un emissione di tipo incoerente e può essere misurata sia in funzione della frequenza che del tempo.

Recentemente questa tecnica viene ampiamente utilizzata in microscopia ottica, sia in campo bio-medico che in campo analitico

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Introduzione (2)

Nel descrivere il processo di fluorescenza, spesso la si definisce una spettroscopia di tipo lineare, dal momento che presenta una dipendenza lineare dall’intensità della r.e.m. utilizzata per generarala.

Questa approssimazione è vera solo quando la r.e.m. che si utilizza per eccitare il campione è debole, e quindi si forma una popolazione nello stato elettronico eccitato che è piccola rispetto alla popolazione di stato fondamentale.

La spettroscopia di fluorescenza può essere anche descritta come un processo non lineare al terzo ordine dello sviluppo perturbativo.

In questo caso il sistema interagisce con la r.e.m. eccitatrice caratterizzata da una frequenza ωL e genera nel sistema la creazione di un fotone ωS, giàpresente nel sistema come fluttuazione di vuoto.

Per poter descrivere il sistema in maniera corretta non si può più adottare l’approssimazione semiclassica, ma si deve trattare il campo in maniera quantistica.

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Introduzione (3)

Nell’approccio non-lineare, il segnale di fluorescenza è originato dalla combinazione:

SLLS ωωωω +−=

Descrivendo il sistema materiale con un sistema modello a tre livelli, il segnale di scattering nasce dalle seguenti interazioni:

Lω−Lω Sω Sω Lω− LωSω SωLω− Lω Sω Sω

E da altri tre diagrammi che sono i complessi coniugati di questi.

),,,(Im3,1

)3(∑=

−−∝i

LLSSiFLUI ωωωωχ

(1)

(2)

fluorescenza Raman

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Introduzione (4)

Outline:

1. Spettroscopia nel dominio delle frequenze.

Spettroscopia di singola molecolaAbbinamento con microscopia confocale

2. Spettroscopia nel dominio dei tempi

Decadimento di fluorescenzaDipendenza dalla polarizzazione: effetti riorientazionaliDipendenza dalla frequenza: dinamica di solvatazione oprocessi di rilassamento conformazionale.

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Fluorescenza: risolta in frequenze (1)

Nell’approssimazione di Condon la distribuzione in frequenza dello spettro di fluorescenza rispecchia la struttura vibrazionale dello stato fondamentale.

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Fluorescenza: risolta in frequenze (2)

La tecnica di fluorescenza è arrivata ad un livello tale di sensibilità da essere in grado di rilevare una singola molecola (1989-1990).

I primi studi in questo senso hanno portato alla rilevazione di una singola molecole di pentacene o perilene o terrilene dispersa in un cristallo di p-terfenile

Single molecule spectroscopy

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Per riuscire ad osservare una singola molecola si preparano campioni estremamente diluiti e si focalizza la r.e.m. eccitatrice su una zona di campione molto piccola (10-100 µm3).

Si utilizza una concentrazione dell’ordine di 10-7 - 10-9 mol/mol, ed inoltre si eccita il campionealunghezze d’onda che cadono ai bordi della banda di assorbimento del cromoforo ospitato, dove è possibile rilevare assorbimenti di singole molecole.

T prossime a 0K, per evitare allargamenti dovuti ad accoppiamenti con vibrazioni di bassa energia della matrice

Fluorescenza: risolta in frequenze Single molecule spectroscopy (1)

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Set Up sperimentali usati per rilevare la fluorescenza di singola molecola, nei primi studi diretti in tal senso.

a) Il fascio viene focalizzato su un campione e la fluorescenza, raccolta da uno specchio parabolico, viene inviata al detector.

b) B) il campione viene illuminato dalla punta di una fibra ottica e la fluorescenza, raccolta da uno specchio parabolico, vine inviata al detector.


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a) Spettro di eccitazione di fluorescenza di pentacene in p-terfenile a T =1.5 K.

Lunghezza d’onda centrale: 592.321 nm

b) Osservando sui lati dello spettro si notano delle linee singole che rappresentano lo spettro di eccitazione di fluorescenza di singole molecole.

c) Spettro di eccitazione di fluorescenza di una singola molecola che assorbe a 592.407 nm


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Pseudoimmagine di emissione di singole molecole.Asse x: lunghezza d’onda di eccitazione, Asse y: posizione spazialeAsse z: intensità


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Schema dell’emissione di fluorescenza osservata per una singola molecola.

Nell’emissione si notano periodi luminosi e bui che si alternano con un tempo medio di attesa che coincide con il tempo di vita dello stato di tripletto,

Osservando invece il comportamento all’interno di questi pacchetti si notano effetti di antibouncing proporzionali all’inverso della frequenza di Rabi. Infatti per poter assorbire un nuovo fotone la molecola deve attendere un tempo confrontabile con la frequenza di Rabi:


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egeg

Rabi

Eω

µω +⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

h(3)

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T=1.5K

T=1.5K

T=4K

Spettri eccitazione di fluorescenza di singola molecola misurati in funzione del tempo. a) ogni 0.25 s.

b) e c) spostamento della frequenza centrale di risonanza col tempo per due molecole diverse alla stessa T=1.5 K

d) Analogo ai precedenti ma a 4 K.

Le fluttuazioni vengono attribuite a processi dinamici di diffusione spettrale della matrice cristallina in cui sono contenute le molecole di pentacene.


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Fluorescenza: risolta in frequenze Microscopia Confocale (1)

La microscopia confocale èuna tecnica di fluorescenza che permette di osservare solo un volume molto piccolo di campione dell’ordine dei < 1 µm3 grazie allo speciale disegno geometrico adottato per illuminare il campione e raccogliere la fluorescenza emessa da nanoparticelle di semiconduttori o da molecole di cromforo disperse nel materiale.

www.olympusfluoview.com/theory/index.html

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Fluorescenza: risolta in frequenze Microscopia Confocale (2)

Solo la fluorescenza emessa dal piano focale riesce a passare attraverso il pin-holesistemato davanti al rivelatore e raggiungere il detector.

Questa geometria permette di focalizzare il fascio nel piano focale (x,y) con un raggio che al limite raggiunge dimensioni di:

2sin61.0r λ

ϑλ

≈⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=

n

Nella direzione z, profondità, invece, la risoluzione è minore e tipicamente:

d 2d

(4)

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Fluorescenza: risolta in frequenze Micorscopia Confocale (3)

Esistono già compagnie che forniscono i probe di fluorescenza specifici per certi siti cellulari e i protocolli di impregnazione, ad esempio:

http://www.invitrogen.com

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http://www.olympusfluoview.com/theory/confocalintro.html

Esempio di scansione lungo l’asse Z

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Fluorescenza: risolta nei tempi Teoria (1)

Gli esperimenti di fluorescenza risolta nel tempo permettono di rivelare informazioni sulla dinamica del sistema materiale a seguito dell’eccitazione.

Dopo aver eccitato il sistema, il ritorno alla condizione di equilibrio può avvenire attraverso diversi tipi di processi:

LωSω

Sω

g

ew

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L’intensità del segnale di fluorescenza è una funzione del tempo e della frequenza. Se si suppone che il fascio di pompa genera istantaneamente una popolazione stato eccitato e, di natura incoerente, allora:

)()()()(),(22

tntntI wSwgwgeSegegSFLU ωµφωµφω +∝

)( Sij ωµ = momento di dipolo di transizione per unità di frequenza.

=)(tni Popolazione del livello “i”-esimo

Le popolazioni dei livelli i, vengono descritte attraverso semplici equazioni cinetiche, che vengono risolte imponendo come condizioni iniziali che ne(0)= ne e ni (0) = 0 per tutti gli altri livelli eccitati.

(5)

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)()()()(

)()()()(

tnktnktnkdt

tdn

tnktnktnkdt

tdn

wwnrw

wreew

w

eeweenre

er

e

−−+=

−−−=


Dove le costanti di velocità k sono dei parametri fenomenologici che indicano la velocità con cui avvengono i processi di rilassamento.

irk Velocità di decadimento radiativo dal livello i allo stato fondamentale g

inrk Velocità di decadimento non radiativo dal livello i allo stato fondamentale g

ijk Velocità di decadimento dal livello eccitato i allo stato eccitato j

In genere le espressioni per le equazioni cinetiche non sono semplici e richiedono un integrazioni numerica.

(6)

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Fluorescenza: risolta nei tempi Effetto della polarizzazionedelle r.e.m. (1)

La descrizione appena effettuata, basata sull’evoluzione della popolazione di stato eccitato, può essere ricondotta alla descrizione basata sulla polarizzazione non-lineare al terzo ordine dello sviluppo perturbativo, sfruttando approssimazioni analoghe a quelle utilizzate nel caso della spettroscopia di pump and probe. In questo caso il campo del probe viene sostituito dal campo della fluorescenza.

Nel seguito centriamo l’attenzione su un aspetto delle r.e.m. che fino ad ora è stato trascurato, ovvero l’influenza della polarizzazione dei campi elettrici sulla risposta ottica del sistema.

La risposta ottica non lineare del sistema materiale dipende dalla direzione di polarizzazione dei campi elettrici applicati, dal momento che l’operazione di interazione è un prodotto scalare:

)(ˆˆ tEVr

⋅−= µ (7)

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Fluorescenza: risolta nei tempi Effetto della polarizzazionedelle r.e.m. (2)

t=0

X

Z

Y

t=τ

X

Z

Y

Solo una parte delle molecole può venire eccitata e quindi emettere

Se si misura il segnale di fluorescenza con polarizzazione parallela a quella della r.e.m. incidente, dopo un certo intervallo di tempo, si noterà una diminuzione del segnale dovuta non solo al decadimento di popolazione, ma anche alla riorientazionedelle molecole ancora eccitate.

Laser

Fluorescenza

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Se si vuole considerare anche la presenza di gradi di libertà rotazionali per la molecola, è necessario utilizzare un Hamiltoniano, per descrivere il sistema materiale, che tenga conto della componente rotazionale:

Se si trascura l’accoppiamento tra gradi di libertà rotazionali, vibrazionali ed elettronici, allora l’Hamiltoniano per il sistema risulta:

Fluorescenza: risolta nei tempi Effetto della polarizzazione delle r.e.m. (3)

La presenza di una distribuzione di possibili orientazioni delle molecole, nel sistema materiale, come pure la possibilità che le molecole ruotino durante l’esperimento fa si che la risposta ottica NL del sistema dipenda da questo prodotto interno.

rotvibel HHHH ˆˆˆˆ ++=

Quando si calcola la funzione responso non lineare si deve mediare su tutti gli stati della molecola: stati elettronici, vibrazionali e rotazionali.

(8)

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L’operatore di interazione con la r.e.m., Eq (7), possiamo riscriverlo come:


( ) )(ˆˆ tEemV ii µrr⋅= (9)

Dove ed sono versori unitari nella direzione del momento di dipolo molecolare e del campo elettrico applicato, mentre ed Ei(t) rappresentano l’ampiezza dell’operatore momento di dipolo e la dipendenza temporale del campo elettrico applicato, rispettivamente.

Nel calcolare la funzione responso è possibile fattorizzare la parte che media rispetto ai gradi di libertà rotazionali da quella che invece media rispetto ai gradi di libertà vibrazionali ed elettronici:

mr ierµ

vibel,123123

)3(

123)3(

123)3(

123)3(

)(ˆˆ)(ˆˆ)(ˆˆ)(ˆˆN),,(

),,(),,(),,(

−∞=

⋅=

ρµµµµ tGtGtGtttS

tttStttYtttR (10)

(11)

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Per descrivere la componente rotazionale Y(3) (t3,t2,t1) , si suppone di poter trattare il moto rotazionale in maniera classica.

Si identifica un sistema di riferimento fisso, (X,Y,Z) rispetto al quale vengono definite le orientazioni delle polarizzazioni dei campi elettrici applicati, ed un sistema di riferimento molecolare (x,y,z), rispetto al quale viene definita la direzione rispetto alla quale è orientato il momento di dipolo di transizione molecolare. E’ possibile mettere in relazione la direzione del momento di dipolo molecolare rispetto al sistema di laboratorio, attraverso un set di tre angoli di Eulero:

( )χϕϑ ,,=Ω(12)

Sfruttando queste approssimazioni, la funzione responso rotazionale risulta:

( ) ( )( ) ( )( ) ( )( ) ( )0001111222

23330123123)3(

,,

,),,(

Ω⋅ΩΩ⋅ΩΩ⋅

×ΩΩ⋅ΩΩΩΩ= ∫∫ ∫∫PemtWemtWem

tWemddddtttY

γβα

ηηαβγrrrrrr

rr

(14)

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Dove:

K,,βα Indicano le direzioni dei campi elettrici applicati e della polarizzazione non lineare generata.

)( 0ΩP Indica la distribuzione iniziale delle direzioni possedute dai momenti di dipolo delle singole molecole. Per un sistema isotropoil suo integrale èuguale a (1/8π2)

),( 11 nnn tW ΩΩ ++ Indicano la probabilità che una molecola con orientazione iniziale Ωn assuma dopo un intervallo di tempo tn+1 un orientazione Ωn+1

X

Y

Z

X

Y

Z

14

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Nel descrivere la fluorescenza come un processo NL al terzo ordine dello sviluppo perturbativo, si considera:

• Le prime due interazioni avvengono con la r.e.m. eccitatrice e questa è un impulso di durata molto minore dei tempi necessari alle molecole per ruotare o rilassare allo stato fondamentale.

• La terza e quarta interazione descrivono la generazione della fluorescenza dalle fluttuazioni di campo locale. Si suppone che il tempo caratteristico di misura del rivelatore sia breve rispetto ai tempi necessari alle molecole per ruotare o rilassare allo stato fondamentale.

tt2

213, ttt <<

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Considerando queste approssimazioni:

( ) ( )( ) ( )0102

2 ,)( Ω⋅ΩΩ⋅ΩΩ= ∫ ∫ PemWemddY LSo

FLατητηα ττ rrrr

Nelle misure sperimentali la r.e.m. eccitatrice viene polarizzata linearmente e la fluorescenza viene misurata ad un angolo di 90º rispetto alla direzione di propagazione del fascio incidente.

Se identifichiamo con Z la direzione di polarizzazione del laser, allora la fluorescenza viene raccolta con una polarizzazione che è contenuta nel piano XZ e che può formare un angolo a piacere rispetto all’asse Z. In genere si selezionano le direzioni parallela e perpendicolare

φ

(15)

0=φ°= 90φX

Y

Z

15

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In questo caso la intensità di fluorescenza risulta:

( )

)(

exp)(

)()(152

31)()(),90(

)()(154

31)()(),0(

)3()3(

)3()3(

τ

τγτ

ττττ

ττττ

r

K

tKrRYI

tKrRYI

e

XXZZFLU

ZZZZFLU

−=

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ −∝∝°

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ +∝∝°

Decadimento dovuto al rilassamento della popolazione di stato eccitato

Funzione di correlazione rotazionale.

Per un angolo generico φ

),90(sin),0(cos),( 22 τφτφτφ °⋅+°⋅= FLUFLUFLU III

(16)

(17)

(18)

30


Combinando le espressioni (16) e (17) si nota come:

),90(2),0(),90(),0()(τττττ°+°°−°

=IIIIr (19)

( )ττ ,7,54)( °= FLUIK (20)

La forma della funzione r(τ) che descrive il moto rotazionale, dipende dalla forma della molecola e dalle caratteristiche del solvente che la circonda, ad esempio, viscosità, temperatura, polarizzabilità, esistenza di interazioni specifiche col soluto.

Dalla Teoria di Debye-Stokes-Einstein, valida per una molecola descritta da un rotatore sferico immerso in un solvente che può essere considerato come un mezzo continuo caratterizzato dalla sola viscosità:

( ))(6

6exp)(TV

TkDDr BRR η

ττ =−=

V=volume del rotatore sfericoη(T) = viscosità del solvente

(21)

16

31

Fluorescenza: risolta nei tempi 1º Esempio (1)

G. R. Fleming

Chemical Applications of Ultrafast Spectroscopy

Oxford University Press, 1986

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Apparato Strumentale

Detector per la fluorescenza che permette di ottenere una risoluzione temporale di 6-8 ps.

laser

17

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Misure di fluorescenza effettuate su Rose Bengal ed in diversi solventi

X= Z = IY=O-

X’=ClY’=OZ’=CO2

-

Come solventi sono stati utilizzati sia solventi che formano legami a idrogeno come metanolo, etanolo etc., che solventi polari come il DMSO, ma che non generano legami a idrogeno..

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Misura del decadimento di fluorescenza misurato con il polarizzatore della fluorescenza parallelo o perpendicolare rispetto alla polarizzazione della r.e.m. eccitatrice.

0º

90º

Curve di rilassamento della popolazione e funzione di correlazione riorientazionale calcolate dai dati sperimentali. Linee continue sono fit mono-esponenziali.

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Andamento della costante di tempo riorientazionale in funzione della viscosità del solvente impiegato

Come si nota essa dipende dalla natura del solvente.

Nel caso dei solventi protici si ha una pendenza maggiore rispetto a quella osservata per solventi aprotici.

Questo andamento viene spiegtaoconsiderando che le molecole di solvente sono fortemente legate al soluto e ne aumentano il volume, rendendolo simile ad una sfera e cadendo nel comportamento “stick”.

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Comportamento della costante di tempo orientazionaledell’eritrosina B nella serie di alcool che passa da metanolo a undecanolo.

Come si nota la teoria di Debye-Stokes-Einstein, non è in grado di prevedere l’andamento sperimentale, che invece viene riprodotto considerando un rotatore sferico di volume maggiore rispetto a quello effettivo della molecola di eritrosina. Questo comportamento viene ascritto a molecole di solvente attaccate al soluto.

19

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O

N

(C2H5)2N NH2+

ClO4-

Esempio . Studio della dinamica riorientazionale del Blu di Nilo e della Cumrina 153 in etanolo bulk e segregato in matrice di SiO2

poroso.

NO

CF3

Blu di Nilo

Cumarina 153Immagine SEM di un vetro sol-gel poroso

20

39


-1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

50 Å sol-gel

75 Å sol-gel

sign

al [a

.u.]

time [ps]

(c)

(b)

sign

al [a

.u.]

Iperp

Iparal

(a)

BULK

sign

al [a

.u.]

R. Baumann, et al., J. Chem. Phys., 114, (2001), 5781

Le molecole di Nile Blu sono adsorbite sulle pareti dei canalicoli della struttura porosa

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Le molecole di Cumarina 153 invece sono libere di ruotare nei pori della matrice sol-gel.

21

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Fluorescenza: risolta nei tempi Dinamica di solvatazione (1)

Negli spettri di assorbimento ed emissione di molecole in solventi organici si nota spesso che il massimo di assorbimento non coincide con il massimo di emissione.

La distanza tra i due massimi viene chiamata Stokes –Shift, ed essa può raggiungere anche valori di 5000-80000 nm per molecole polari in solventi polari.

Fisicamente lo Stokes shift nasce da vari contributi che tendono a variare il gap di energia che c’e’ tra lo stato fondamentale ed eccitato nei processi di assorbimento ed emissione rispettivamente, tra essi ci sono:

• Accoppiamento tra la transizione elettronica e modi di vibrazione sia della molecola stessa che del bagno che la circonda• Moti riorientazionali che variano l’intorno della molecola nello stato fondamentale ed eccitato.• Processi di riarrangiamento conformazionale della molecola di cromoforo che mutano la superficie di energia potenziale di stato fondmentale ed eccitato.

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250 300 350 400 450 500 550 600 650

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Ass C153/Cicloesano Ass C153/Etanolo Flu C153/Cicloesano Flu C153/Etanolo

Inte

nsita

' [a.

u.]

Lunghezza d'onda [nm]

Si nota come sia in cicloesano che in etanolo la cumarina presenti uno Stokes-Shift, e come quest’ultimo dipenda fortemente dalla natura del solvente

22

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Molecola polare in solvente polare

Il processo di eccitazione fa mutare istantaneamente il momento di dipolo permanente della molecola dallo stato fondamentale allo stato eccitato. A seguito di questa variazione, le molecole di solvente polari tenderanno a riorientarsi intorno al soluto, diminuendo l’energia dello stato eccitato ma aumentando l’energia di stato fondamentale.

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Se si misura lo spettro di fluorescenza a tempi brevi rispetto al tempo caratteristico di riorientazione del solvente si dovrebbe osservare uno spostamento dello spettro di emissione dalle alte energie a energie piùbasse.

300 350 400 450 500 550 600 650

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Inte

nsità

(a.u

.)

numero d'onda

Assorbimento Emissione

tempo

23

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Dai singoli decadimenti alle diverse lunghezze d’onda

645 nm 655 nm 663 nm 697 nm 705 nm

Zeit [ps]

8t =

t = 0 Rekonstruierte Spektren

Wellenlänge [nm]

Si ricostruiscono gli spettri di fluorescenza in funzione del tempo

Inte

nsi

tà(a

.u.)

Inte

nsi

tà(a

.u.)

Metodo di misura e ricostruzione dello spettro di fluorescenza transiente

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Lo spostamento del massimo di fluorescenza fornisce una misura diretta della variazione dell’energia della transizione in funzione del riarrangiamentoenergetico del sistema solvente-soluto

)()0()()()(

∞−∞−

=FLFL

FLFL ttSνννν (22)

24

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La teoria esposta non tiene conto dei moti specifici che le molecole di solvente possono avere. Esistono forme più evolute di tale teoria che tengono conto delle caratteristiche molecolari del soluto.

( ) 1

0 1212

exp1)()0()()()(

−∞ =++

=

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛−=

∞−∞−

=

RDDF

FFLFL

FLFL

D

tttS

ττεετ

τνννν (23)

(24)

Dinamica di solvatazione per solventi polari.Supponendo che il solvente si comporti come un mezzo dielettrico continuo, caratterizzato dalla sola costante dielettrica, e che il soluto sia approssimabile ad un dipolo puntuale di forma sferica, è possibile descrivere la variazione dell’energia di transizone in funzione della variazione del campo elettrico locale presente nel solvente, dovuto alla variazione del momento di dipolo molecolare all’atto dell’eccitazione. Sotto queste approssimazioni:

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:Laser a Nd:YAG Mode-Locked o laser a diodi.

Monocromatore

Rivelatore

Computer

Risoluzione temporale : durata dell’impulso e risposta temporale del sistema di rivelazione (minimo raggiungibile 1 ps)

PicoQuantPicoQuant GmbHGmbH12489 12489 BerlinBerlinGermanyGermany

Strumentazione 1

Pump

25

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Strumentazione 2

La risoluzione temporale dipende solo dalla durata dell’impulso. Per ogni lunghezza d’onda di fluorescenza si misura il decadimento e si raggiungono risoluzioni di 80 fs.

50


26

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Spettri di assorbimento ed emissione della Cumarina 153 in etanolo (blu) e 2-metilbutano (rosso).

Lo Stokes shift è molto maggiore nel solvente più polare.

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Decadimento della fluorescenza di C153 in metanolo a λ = 480 nm con un impulso di 80 fs e osservato fino a 200 ps

Esempio di ricostruzione dello spettro di fluo rescenza della C153 in DMSO.

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Andamento della funzione di responso spettrale in funzione del tempo per alcuni solventi polari

Il decadimento avviene su diverse scale di tempi riflettendo la complessità dei moti del solvente.

Inizialmente si ha un decadimento di forma gaussiana con tempi caratteristici inferiori a 100 fs, seguito da componenti più lente dell’ordine dei picosecondi e delle decine o centinaia di picosecondi.

Questa varietà di tempi rispecchia i diversi tipi di moto presenti. La componente ultraveloce è relativa al moto inerziale, mentre quelle che cadono nei picosecondi si riferiscono a moti di tipo diffusivo.

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E’ possibile confrontare la funzione S(t) con la funzione responso spettrale ricavata da misure di costante dielettrica del solvente puro in funzione della frequenza e trasformate nel dominio dei tempi.

A seconda del modello considerato per descrivere il responso del solvente si ottengono degli andamenti diversi per S(t)

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