1

1

Spektroskopske Spektroskopske Spektroskopske Spektroskopske metodemetodemetodemetode

2

Spektroskopske metode zasnivaju se na analizi energije elektromagnetnog zračenja koju ispitivana supstanca apsorbuje odnosno emituje.

Apsorpcione metode – analit apsorbuje energiju i iz osnovnog prelazi u pobuđeno stanje.

Emisione metode – analit emituje energiju vraćajući se izpobuđenog u osnovno stanje.

2

3

Elektromagnetno zračenje

Talasna dužina Vrsta promeneSpektroskopska metoda

Radio talasi 100 m – 1 mPrelazi nuklearnih spinova

NMR

Radio talasi 1 m – 1 cmPrelazi elektronskih spinova

Elektronska spinska rezonancija

Mikrotalasi 1 cm -100 µµµµmPrelazi u rotacionim stanjima

Mikrotalasna spektroskopija

Infracrveno zračenje 100 µµµµm - 1µµµµmPromena vibracionih stanja

IRRamanska spektroskopija

Vidljiva oblast

UV oblast

1µµµµm – 10 nm Promena stanja valencionih elektrona

UV/VIS Fuorescentna Atomska

X zračenje 10 nm- 100 pmPromena stanja unutrašnjih elektrona

Rendgenska Elektronska

Gama zračenje 100 pm – 1 pmPromena nuklearnih stanja

Gama spektroskopija

4

3

5

� Manja talasna dužina, veća energija.

� Rotacioni nivoi u molekulu blizu su jedan drugom, pa je energija mikrotalasa i daleke IR oblasti dovoljna da izazove prelaze u rotacionim stanjima.

� Promene vibracionih stanja dešavaju se pod dejstvom infracrvenog zračenja.

� UV/VIS zračenje menja stanje valencionih elektrona.

� Kod molekula složenije strukture energetski nivoi mnogo su bliži jedan drugome pa zračenje u bliskoj UV oblasti i VIS oblasti može izazvati elektronske prelaze.

6

UV/VIS spektrofotometrijaUV/VIS spektrofotometrijaUV/VIS spektrofotometrijaUV/VIS spektrofotometrija

� Apsorpcija UV i VIS zračenja uzrokuje elektronske prelaze. To znači da elektroni iz osnovnog prelaze u pobuđeno stanje.

� Elektronski prelazi

σσσσ - tipa, ππππ - tipa i n – tipa, što znači da apsorpcija UV i VIS zračenja pobuđuje elektrone σσσσ, ππππ i n elektrone.

σ - σ* alkani

σ - π* karbonilna jedinjenja

ππππ - π* alkeni, karbonilna jedinjenja, alkini, azo jedinjenja

n - σ* jedinjenja koja sadrže atome kiseonika, azota, sumpora i halogene

n - π* karbonilna jedinjenja

4

7

8

� Atomi ili grupe atoma (funkcionalne grupe) odgovorni za apsorpciju svetlosti zovu se HROMOFORE (gr. chroma - boja, phorein – nositi).

Npr. karbonilna, imino ili azo grupa tj. - dvostruka i trostruka veza zasićenih aldehida i ketona, imina i azo jedinjenja, kao i slobodni elektronski parovi ovih atoma.

� Svaku hromoforu karakterišu λλλλmax i εεεεmax.

5

9

Hromofora Elektronski prelaz λλλλmax

nitril n - ππππ* 160

alkin ππππ- ππππ* 170

alken ππππ- ππππ* 175

alkohol n - σσσσ* 180

etar n - σσσσ* 180

ketonππππ- ππππ* 180

n - ππππ* 280

aldehidππππ- ππππ* 190

n - ππππ* 290

amin n - σσσσ* 190

kiselina n - ππππ* 205

estar n - ππππ* 205

amid n - ππππ* 210

tiol n - σσσσ* 210

nitro n - ππππ* 271

azo n - ππππ* 340

C N

C C

CH

CH

R OH

R O R

C O

C

H

O

R NH2

R COOH

R COR1

R CONH2

R SH

R NO2

R N N R

10

Konjugovane hromofore

� Konjugovanjem jednostavnih hromofora (istih ili različitih) nastaju tzv. višestruke hromofore, pa dolazi do batohromnog i hiperhromnog pomeranja apsorpcionog maksimuma.

Batohromno pomeranje – pomeranje λλλλmax ka višim talasnim dužinama

Hipsohromno pomeranje - pomeranje λλλλmax ka nižim talasnim dužinama

Hiperhromno pomeranje – veća apsorbancija

Hipohromno pomeranje – manja apsorbancija

6

11

C C

λmax 180 - 200 nm λmax 217 nm λmax 258nm

N N N

λmax 250nm λmax 290nm λmax 360nm

� Konjugacijom se elektronski nivoi približavaju jedan drugome, pa se energija potrebna za pobuđivanje elektrona smanjuje – povećava se talasna dužina.

12

� Ukoliko je karbonilna grupa konjugovana sa jednom ili više dvostrukih veza javlja se batohromni efekat na n- ππππ* prelaz.

C C C

H

O

R1

R2

R3

R1 = H, R2 = H, R3 = H λmax 208 nm

R1 = CH3, R2 = H, R3 = H λmax 220 nm

R1 = H, R2 = CH3, R3 = CH3 λmax 230 nm

R1 = CH3, R2 = CH3, R3 = CH3 λmax 242 nm

C C

R2

R3

R1 = CH3, R2 = H, R3 = H λmax 208 nm

R1 = CH3, R2 = CH3, R3 = H λmax 217nm

R1 = CH3, R2 = CH3, R3 = CH3 λmax 225 nm

R1

COOR

C C

R2

R3

R1

COOH

PR

IMER

1P

RIM

ER 2

7

13

Sterni efekat kod konjugovanih sistema

� Ukoliko je konjugovani sistem planaran veći je uticaj na apsorpcioni maksinum.

� Cis i trans izomeri imaju različite spektre.

� Trans izomeri imaju duže konjugovane hromofore nego cis, pa ih karakteriše veće λλλλmax i εεεεmax.

14

Auksohromne grupe (gr. auxanien – pojačava; chrome - boja)

� Ove grupe same ne pokazuju značajnu apsorpciju u oblasti od 200 nm – 800 nm.

� Imaju slobodne elektronske parove i mogu biti

kiselih osobina: -COOH, -OH, -SO3H

baznih osobina: -NH2, -NHR, -NR2

ostale: -X (halogeni)

� Auksohromne grupe imaju najjači batohromni i hiperhromni efekat ukoliko su vezane za hromoforu sa dvostrukom vezom, tzv. “produžavanje” konjugacije rezonantnim efektom.

� Batohromni uticaj na ππππ- ππππ* prelaz.

���� Uticaj auksohromne grupe na alkene

8

15

� Supstitucija karbonilne grupe auksohromnom grupom ima jako izražen hipsohromni efekat na n- ππππ* prelaz.

� Negativnim induktivnim efekta atomi kiseonika, azota, odnosno halogena otežavaju n- ππππ* prelaz – potrebna je veća energija, tj. manja talsna dužina.

O

C HH3C

O

C CH3H3C

O

C ClH3C

O

C NH2H3C

O

C OCH2CH3H3C

O

C OHH3C

λmax 293 nm

λmax 279 nm

λmax 235 nm

λmax 214 nm

λmax 204 nm

λmax 204 nm

���� Uticaj auksohromne grupe na karbonilnu grupu

16

���� Uticaj auksohromne grupe na benzenov prsten

�U molekulima lekova najčešća hromofora je benzenov prsten.

� Elektronski prelazi u osnovi su ππππ- ππππ*, ali daleko komplikovaniji nego kod drugih jedinjenja.

� Kod svih derivata benzena dolazi do batohromnog pomeranja apsorpcionog maksimuma - koliko je pomeranje zavisi od prirode i položaja (o-, m- ili p- ) supstituenta .

� Auksohromne grupe mogu da “produže” ππππ sistem rezonantnim efektom –batohromni efekat.

� Ukoliko je jedinjenje kiselog ili baznog karaktra pH može imati značajan uticaj na izgled apsorpcionog maksimuma.

9

17

� Hromofora (benzen) “produžena” prisustvom karbonilne grupe (-C=O).

� Prisutna auksohromna grupa (-NH2).

� U baznoj sredini slobodan elektronski par na amino grupi stupa u interakciju sa hromoforom – batohromno pomeranje.

� U kiseloj sredini dolazi do protonovanja amino grupe – više nije auksohromna grupa jer nema slobodnog elektronskog para.

Prokain

18

� Prisutna auksohromna grupa (-OH).

� U baznoj sredini nastaje fenolatni anjon sa tri slobodna elektronska para koji stupaju u interakciju sa hromoforom – batohromno i hiperhromno pomeranje.

� U kiseloj sredini fenolna grupa ima dva slobodna elektronska para – slabija apsorpcija nego u baznoj sredini.

Fenilefrin

10

19

Postavljanje metode

Izbor rastvarača za spektrofotometrijsku analizu u UV oblasti je NAJZNAČAJNIJI, jer fizičko-hemijske karakteristike rastvarača mogu značajno da utiču na apsorpciju u UV oblasti, tj. položaj maksimuma apsorpcije.

���� Prvi kriterijum za izbor rastvarača je dobra rastvorljivost ispitivane supstance u tom rastvaraču.

���� Drugi kriterijum je da rastvarač ne apsorbuje u istoj oblasti talasnih dužina kao supstanca koja se analizira – treba da se primenjuju transparentni rastvarači.

Najčesće se koriste: voda, etanol, metanol, acetonitril i heksan

DirektnaDirektnaDirektnaDirektna spektrofotometrijaspektrofotometrijaspektrofotometrijaspektrofotometrija u UV oblastiu UV oblastiu UV oblastiu UV oblasti

20

���� Treći kriterijum je uticaj rastvarača na apsorpcioni spektar.

� U nepolarnim rastvaračima se ne stvaraju vodonične veze pa se vidi “fina” struktura apsorpcionog spektra.

� U polarnim rastvaračima, usled stvaranja vodoničnih veza, nastaje rastvarač-analit kompleks i “fina” struktura se ne može videti.

11

21

���� Četvrti kriterijum je mogućnost rastvarača da stabiliše molekul analita u osnovnom ili pobuđenom stanju stvaranjem vodonične veze.

Primer I - polarna jedinjenja (karbonilna, nitro i nitrozo grupa sa n→π→π→π→π* prelazima) u polarnim rastvaračima – voda , alkohol, aceton

� Rastvarač formira vodonične veze sa analitom u osnovnom stanju i ima izražen hipsohromni efekat na n- ππππ* prelaz.

� Polarne supstance treba rastvarati u NEPOLARNIM rastvaračima za UV analizu.

Primer II - nepolarna jedinjenja (nezasićene ugljovodonične strukture – hromofore sa π→ππ→ππ→ππ→π* prelazima) u polarnim rastvaračima – alkohol, aceton

� Rastvarač formira vodonične veze sa analitom u pobuđenom stanju i ima izražen batohromni efekat na π→ππ→ππ→ππ→π* prelaz.

� Nepolarne supstance treba rastvarati u POLARNIM rastvaračima za UV analizu.

22

Primer III - polarna jedinjenja kiselog ili baznog karaktera (mogu da jonizuju)

� Konjugovani parovi (kiselina-baza) imaju različite apsorpcione maksimuma u istom rastvaraču.

� Tautomerni oblici, čije postojanje je uslovljeno promenom pH, imaju različite apsorpcione maksimume.

� Uloga pufera je da izdiferencira jedan oblik, molekulski oblik ili odgovarajući konjugovani jonizovani oblik.

� Položaji apsorpcionih maksimuma zavise od osobina rastvarača i pH rastvora.

12

23

�Rastvori obojenih supstanci - direktna spektrofotometrija u oblasti od 380 nm do 780 nm

� Supstance su obojene – veliki broj konjugovanih hromofora i auksohromnih grupa, pa je došlo do jakog batohromnog pomeranja apsorpcionog maksimuma

Apsorpcija u Apsorpcija u Apsorpcija u Apsorpcija u VISVISVISVIS oblastioblastioblastioblasti

� Supstanca apsorbuje svetlost određene λλλλ.

� Oko vidi propuštenu svetlost komplementarne boje.

Boja apsorbovane svetlosti

λλλλ apsorbovane svetlosti (nm)

Boja propustene svetlosti

ljubičasta 400 žuta

plava 450 narandžasta

plavo-zelena 500 crvena

žuto-zelena 530 crveno-ljubičasta

žuta 550 ljubičasta

narandžasto-crvena 600 plavo-zelena

crvena 700 zelena

24

Rifampicin

kristalni prašak crveno-braon boje

u fosfatnom puferu pH 7,8 λmax 445 nm

Riboflavin

kristalni prašak žute ili narandžasto-žute boje

Apsorpcija u VIS oblasti

13

25

Kada je potrebna hemijska transformacija?

� Ispitivana supstanca nema jasno izražen apsorpcioni maksimum u UV oblasti.

� Kada je potrebno sprečiti interferencije u UV oblasti – pomoćne materije iz farmaceutskog oblika interferiraju, zato što apsorbuju svetlost u UV oblasti.

IndIndIndIndirektnairektnairektnairektna spektrofotometrijaspektrofotometrijaspektrofotometrijaspektrofotometrija

� Supstance koja se određenim hemijskim reakcijama sa pogodnim reagensima kvantitativno prevode u jedinjenja koja apsorbuju u VIS oblasti - indirektnaspektrofotometrijska analiza.

Apsorpcija u VIS oblasti

26

Postavljanje metode

Izbor reagensa

� stabilan u rastvoru,

� manje stabilni reagensi moraju da budu sveže pripremljeni,

� stehiometrijski reaguje sa ispitivanom supstancom i dodaje se u višku,

� sa analitom daje kvantitativnu reakciju,

� selektivan i specifičan,

� obojeno jedinjenje – proizvod reakcije brzo nastaje i

� ne apsorbuje u istoj oblasti talasnih dužina kao supstanca koja se analizira (εεεε = 0)

Apsorpcija u VIS oblasti

14

27

O

CH3

H

H

CH3

OH

O O

H

(D-digitoksoza)3

O

O

H

H

NO2

NO2

O-

NO2

Digoksin

� Kardiotonični glikozidi daju veliki broj hemijskih reakcija čiji su proizvodi obojeni. Ove reakcije mogu se podeliti u tri grupe, prema tome da li u njima učestvuje:

1. nezasićeni laktonski prsten na C17

2. alkoholna grupe steroidne strukture

3. šećerna komponenta.

� Prvu grupu reakcija daju reagensi koji sa metilenskom grupom, odnosno sa aktivnim vodonikovim atomima αααα,ββββ–nezasićenog laktonskog prstena, daju karakteristično obojena jedinjenja. Od reagenasa za ovaj tip reakcije najčešće se koriste pikrinska kiselina (Baljetova reakcija). Ovu reakciju daju glikozidi sa alkalnim rastvorom pikrinske kiseline, pri čemu nastaje jedinjenje žute boje koje se može odrediti spektrofotometrijski:

Apsorpcija u VIS oblasti

28

� metoda izbora za kvantitativnu analizu – primenjuje se kad god je to moguće,

� određivanje pKa vrednosti farmaceutskih supstanci,

� određivanje particionog koeficijenata farmaceutskih supstanci,

� određivanje brzine rastvaranja kod farmaceutskih oblika (eng. dissolution

test) i

� primenjuje se kao farmakopejski test za identifikaciju u rutinskoj kontrolifarmaceutskih supstanci.

Prednosti

☺☺☺☺ jednostavna, laka za upotrebu, jeftina metoda

Nedostaci

���� metoda nije selektivna

Primena Primena Primena Primena spektrofotometrijspektrofotometrijspektrofotometrijspektrofotometrije u farmaceutskoj analizie u farmaceutskoj analizie u farmaceutskoj analizie u farmaceutskoj analizi