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A P P L I Q U É E A U X P R O T É I N E S

Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire

Objectifs

• L’objectif est de vous donner les bases de la RMN• connaître les avantages de cette technique et ses limites• donner un aperçu de quelques applications de la RMN liquide

pour l’étude des protéines

la RMN ne se limite pas à la détermination de la structure des protéinescaractérisation des interactions protéine-protéine ou protéine-

ligand…criblage de composés à visée pharmacologiqueétude des protéines non structurées identification de modifications post-traductionnelles et étude de

leur impact structural et fonctionnel

2

De la structure à la fonction

3

Structure primaire Structures secondaires

Structure tertiaire

acides aminés

Fonction biologique

Structure quaternaire

interactions protéine-ligand/substrat

protéine-protéine …

Les bases de la spectroscopie RMN

• Spectroscopie : on va mesurer l’énergie qu’il faut fournir pour passer de l’état énergétique fondamental (Ea) à une état excité (Eβ)

• Nucléaire : c’est l’état énergétique des noyaux des atomes qui va être mesuré

• Magnétique : c’est sous l’effet d’un champ magnétique (champ B0, de l’ordre de 105 fois le champ magnétique terrestre) qu’on va pouvoir observer des transitions énergétiques entre les niveaux occupés par les noyaux

• Résonance : on dit que les noyaux entrent en résonance quand ils font la transition d’un niveau à un autre, c’est-à-dire quand l’énergie fournie au système (champ B1) est exactement égale à la différence d’énergie entre les niveaux

3

Appareillage : spectromètre RMN

sonde

Il faut injecter 200A de courant dans la bobine pour créer un champ magnétique de 18,6 tesla.

Appareillage : les sondes

4

Bases de spectroscopie

Les ondes électromagnétiques sont généralement caractérisées par les grandeurs suivantes :

longueur d'onde λ : unité de longueur (distance) qui sépare deux pics d'onde (exprimé généralement en nm)nombre d'onde σ : nombre d'onde par unité de longueur, (exprimé généralement en cm-1)fréquence ν : nombre d'onde par seconde (exprimé en Hz = s-1).

Ces grandeurs sont reliées par la relation suivante :

où c, la célérité est la vitesse de la lumière (3.108 m.s-1).

σ = = 1 νλ c

Spectrométrie UV-visible, IR

Longueur d’onde (nm)

5

Différence d’énergie entre les états de spin nucléaire

distribution de Boltzmann Δn = e -ΔE/kT

B0=0

Seuls les noyaux possédant un spin nucléaire (nombre quantique I) différent de 0 peuvent entrer en résonance

ils ont la capacité de se comporter comme des petits aimants et d’adopter des orientations préférentielles dans un champ magnétique intense

ΔE = h . γ . B0

2 π

B0

Différence d’énergie entre les états de spin nucléaire

distribution de Boltzmann Δn = e -ΔE/kT

B0=0

B0

=> ces 2 états du spin nucléaire en présence du champ B0correspondent à 2 niveaux énergétiques différents

ΔE = h . γ . B0

2 π

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Spectre électromagnétique : la RMN se situe dans la gamme des radiofréquences

ici avec B0 = 9.4T soit 400 MHz

Rapport gyromagnétique γ : constante pour un noyau donné

Le champ magnétique ressenti Beff est différent de B0

Quels sont les noyaux que l’on peut étudier par RMN ?

Noyau Spin Net (I)

γ / 2π (MHz/T)

abondance naturelle

sensibilité relative en abondance naturelle

1H 1/2 42,58 99.98% 1 000 00019F 1/2 40,08 100% 833 05031P 1/2 17,25 100% 66 61013C 1/2 10,71 1.11% 17015N 1/2 -4,31 0.37% 4

pas de marquage isotopique

marquage isotopique nécessaire

Les noyaux qui ont un spin nucléaire non nul (I ≠ 0)

ΔE = h . γ . B0

2 πEnrichissement

isotopiques des protéines en 15N et/ou 13C

7

Champ magnétique et fréquence de résonance

ν0 fréquences (Hz)

ΔE = h . γ . B0

2 π= h . ν0

Ce qui revient à dire que tous les noyaux d’une molécule (par exemple, tous les protons 1H) auraient la même fréquence de résonance ν0 qui correspond à la fréquence du champ du spectromètre (B0)

or ce n’est pas le cas…

Spectre proton (1H) d’une petite protéine

en théorie, on devrait avoir autant de signaux que de protons

1H

spectre 1D proton d’une protéine de 200 aa

@ 600 MHz

6000 Hz

8

Spectrométrie RMN à transformée de Fourier (RMN impulsionnelle)

en RMN, on va mesurer la relaxation c’est-à-dire le retour à l’état d’équilibre après excitation, pendant la période dite d’acquisition (ACQ)

RMN impulsionnelle : on excite tous les noyaux simultanément en imposant une impulsion magnétique de forte intensité, de courte durée (p1) = impulsion non sélective

Spectrométrie RMN à transformée de Fourier (RMN impulsionnelle)

ν0

fréquences (Hz)FID (Free Induction Decay) :

décroissance du signal au cours du temps

(ms)FT

(transformée de Fourier)

Domaine temps Domaine fréquences

Cas d’un noyau unique ou d’un groupe de noyaux équivalents

9

Spectrométrie RMN à transformée de Fourier (RMN impulsionnelle)

Domaine temps Domaine fréquences

δ

FT

La réalité de la RMN des protéines

spectre 1D proton d’une protéine (500 aa) structurée

spectre 1D proton d’une protéine (100 aa) structurée

La RMN est limitée aux protéines de 200-250 aa soit 20-25 kDaenviron (pour des études structurales)

10

La réalité de la RMN des protéines

spectre 1D proton protéine structurée

spectre 1D proton protéine non structurée

200 aa200 aa

Possibilité d’étude des protéines intrinsèquement non structurées

20

La réalité de la RMN des protéines : le problème du solvant, l’eau

H2O

11

21

La RMN des protéines : présaturation du signal de l’eau

‘irradiation’ du signal de l’eau

Les structures de protéines obtenues par RMN vs. cristallographie dans la PDB

12

Interpréter un spectre RMN

la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)

aspect quantitatif : l’intégration des signaux du spectre RMN va donner le nombre de noyaux qui résonnent à une même fréquence

L’interaction avec les noyaux voisins (même les noyaux de nature différentes) : par l’intermédiaire des couplages scalaires à plus ou moins longue distance

Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :

Interpréter un spectre RMN

la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)

Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :

identification des groupements chimiques présents dans la molécule (les acides aminés dans le cas des protéines)

leur environnement dans l’espace

13

Déplacement chimique δ (ppm)

la fréquence va dépendre du champ magnétique B0

on va plutôt utiliser une valeur indépendante de B0 : le déplacement chimique (δ) exprimé en ppm (parties par million)

il va falloir utiliser une référence : cette référence est utilisée pour comparer la fréquence de résonance de chaque proton de la molécule à celle de la molécule de référence (cette référence va donc avoir un déplacement chimique de 0 ppm)

donc, pour un proton donné, on aura une même valeur de déplacement chimique quelque soit la valeur du champ magnétique B0

utilisé

δ (ppm)= ν – νref

νref.106

1. La fréquence de résonance (en Hz) ou déplacement chimique (en ppm)

• l'environnement électronique modifie la valeur du champ magnétique local Beff expérimenté par le noyau

Beff = B0 (1 - σ) où σ est la constante d'écran (σ >0 ou <0)

et donc la fréquence de résonance ν du noyau sera

• le déplacement chimique dépend donc de l'environnement local de chaque noyau (groupements fonctionnels…)

ν = γBeff

2π

TMS

δ (ppm) δ0

écran faible

déblindageécran fort

blindage

14

27

Un exemple de l’influence des électrons sur le déplacement chimique : les courants de cycles

Origine de la dispersion spectrale dans les protéines

Protéine repliée Protéine non repliée

spectre 1H @ 600MHz, 298K d’une protéine de 200 résidus

15

Pour les peptides et les protéines

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

α

βγ

δ

ε

lysine

HN

Spectre 1D proton des peptides et protéines

δ

HN amides, H aromatiques H aliphatiques

référence

H2O

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

α

βγ

δ

ε

HN

16

Interpréter un spectre RMN

la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)

aspect quantitatif : l’intégration des signaux du spectre RMN va donner le nombre de noyaux qui résonnent à une même fréquence

Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :

identification des groupements chimiques

Dosage (metabolomics) mais la RMN est une technique peu sensible!

2. Informations quantitatives

référence : triméthylsilane (TMS)

Exemple : spectre de l’éthanol CH3-CH2-OH

17

Interpréter un spectre RMN

la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)

aspect quantitatif : l’intégration des signaux du spectre RMN va donner le nombre de noyaux qui résonnent à une même fréquence

L’interaction avec les noyaux voisins (même les noyaux de nature différentes) : par l’intermédiaire des couplages scalaires à plus ou moins longue distance

informations structurales à plus ou moins longue distance (à l’échelle d’une protéine)

Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :

3. Couplages scalaires (J)

référence : triméthylsilane (TMS)

Exemple : spectre de l’éthanol CH3-CH2-OH

18

3. Couplages scalaires (J)

On appelle système de spins un ensemble de spins couplés de façon scalaire.

• hétéronucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de nature différente (par exemple 1H et 13C). Il s'agit de couplage 1J

• homonucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de même nature (par exemple des protons) il s'agit de couplages nJ avec n > 1

Couplage Nombre de liaisons

Nom

2J 2 géminal3J 3 vicinal

4J… 4… longue distance

3. Couplages scalaires (J)

Exemple : 2 protons voisins Ha et Hbayant des déplacements chimiques

différents

19

3. Couplages scalaires (J)

Couplages hétéronucléaires dans les chaînes polypeptidiques

BILAN N°1

Paramètres utiles :

fréquence de résonance (Hz) ou déplacement chimique

(ppm) : renseigne sur l’environnement chimique

intégration des signaux : quantification

couplages scalaires : connections entre les atomes

Attribution des spectres = déterminer à quelle résonance correspond quel 1H (ou 13C ou 15N)

À quoi ça sert ?

20

BILAN N°1

H

H

H

De la RMN 1D à la RMN 2D

RMN 1D ↔ 1 seule fréquence

21

De la RMN 1D à la RMN 2D

41

RMN 2D : 2e dimension = 1H ou 15N ou 13C

enrichissement des protéines en 15N et/ou 13C : isotopes stables, non radioactifs!

par exemple : détection des couples 15N-1H dans les protéines (tous les NH du squelette + ceux présents dans les chaînes latérales)

deux 1H qui auraient la même fréquence de résonance proton peuvent avoir deux fréquences de résonances 15N différentes

% 1H 99,9885

% 2H 0,0115

% 3H 0

% 12C 98,93

% 13C 1,07

% 14C 0

% 14N 99,632

% 15N 0,368

ν 1H1H

15N

ν (1H)

ν1 (15N)

ν2 (15N)

RMN 2D ↔ 2 fréquences

De la RMN 1D à la RMN multi-dimensionnelle

22

1H-15N HSQC (2D) spectroscopie de corrélation hétéronucléaire

1H (ppm)

15N (ppm) nécessite un marquage isotopique des protéines en 15Nc’est l’expérience de base en RMN des protéines

Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 1H-15N HSQC

44

1H (ppm)

15N (ppm)

The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum

One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.

23

Attribution du spectre 1H-15N HSQC

45

1H (ppm)

15N (ppm)

The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum

One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.

46

1H (ppm)

15N (ppm)

The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum

One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.

Attribution du spectre 1H-15N HSQC

24

47

1H (ppm)

15N (ppm)

The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum

One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.

Attribution du spectre 1H-15N HSQC

48

1H (ppm)

15N (ppm)

The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum

One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.

Attribution du spectre 1H-15N HSQC

25

1H-13C-HMQC (2D) spectroscopie de corrélation hétéronucléaire

50

Spectroscopie de corrélation homonucléaire

via les couplages scalaires (COSY, TOCSY)

via les couplages dipolaires (NOESY, ROESY)

26

1H-1H NOESY (2D)

nécessite aucun marquage isotopique c’est l’expérience qui va fournir les contraintes de distances en utilisant l’effet NOE

1H

1H

1H-1H COSY et TOCSY

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

COSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J (3 liaisons chimiques)

TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)

α

β γ

δε

nécessitent aucun marquage isotopique

Ce sont des expériences qui vont permettre

l’attribution des résonances protons

27

1H-1H COSY et TOCSY

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

COSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J (3 liaisons chimiques)

TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)

α

β γ

δε

3J4J

5J6J

Couplages HN-Hα, HN-Hβ, HN-Hγ… Couplages entre

protons aliphatiques

1H

1H

1H-1H COSY et TOCSY

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

tables des valeurs δ HN, Ha, Hb, Hg, Hd, He,… :peptides non structurés GGXGG

moyennes de l’ensemble des protéines répertoriées dans la BioMagResBank (BRMB)

α

β γ

δε

Couplages HN-Hβ, HN-Hγ…TOCSY

COSY

Couplages HN-Hα

identification d’un type de résidu

1H

1H

3J

4J 5J

28

Déplacements chimiques 1H des acides aminés

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

α

βγ

δ

ε

lysine

HN

BILAN N°2

Paramètres utiles :corrélations scalaires (TOCSY/COSY) : renseignent sur la nature des

acides aminés (déplacements chimiques, couplages scalaire 1H-1H au sein d’un même acide aminé)

corrélations dipolaires (contacts NOEs) : renseignent sur la proximité des protons dans l’espace

pour les peptides non structurés : identifier les acides aminés en interprétant les connections entre acides aminés (voisins dans la

séquence)

Attribution des spectres à 2 dimensions = déterminer à quelle résonance correspond quel 1H (ou 13C ou 15N)

Identifier chaque résonance = l’attribuer à un proton, à un acide aminé dans la séquence primaire

29

HNCO (3D)

nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HN du résidu i avec le 13C carbonyl (CO) du résidu i-1

HN(CA)CO (3D)

nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HNdu résidu i avec le CO du résidu i et du résidu i-1

30

HN(CA)CO et HNCO (3D)

nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HNdu résidu i avec le CO du résidu i et du résidu i-1

HN(CO)CACB (3D)

nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HN du résidu i avec le Cα et le Cβ du résidu i-1

31

HNCACB (3D)

nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HN du résidu i avec le Cα et le Cβ du résidu i et du résidu i-1

Déplacements chimiques 13C des acides aminés

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

αβ

γδ

ε

lysine

HN

Cα Cβ CO Hn NA 52,5 19,1 177,8 8,35 125,0

C 55,4 41,1 174,6 8,54 118,7

D 54,2 41,1 176,3 8,56 119,1

E 56,6 29,9 176,6 8,40 120,2

F 57,7 39,6 175,8 8,31 120,7

G 45,1 174,9 8,41 107,5

H 55 29 174,1 8,56 118,1

I 61,1 38,8 176,4 8,17 120,4

K 56,2 33,1 176,4 8,36 121,6

L 55,1 42,4 177,6 8,28 122,4

M 55,4 32,9 176,3 8,42 120,3

N 53,1 38,9 175,2 8,51 119,0

P 63,3 32,1 177,3

Q 55,7 29,4 176 8,44 120,5

R 56 30,9 176,3 8,39 121,2

S 58,3 63,8 174,6 8,43 115,5

T 61,8 69,8 174,70 8,25 112,0

V 62,2 32,9 176,3 8,16 119,3

W 57,5 29,6 176,10 8,22 122,1

Y 57,9 38,8 175,9 8,26 120,9

32

Déplacements chimiques 13C des acides aminés

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

αβ

γδ

ε

lysine

HN

Cα Cβ CO Hn NA 52,5 19,1 177,8 8,35 125,0

C 55,4 41,1 174,6 8,54 118,7

D 54,2 41,1 176,3 8,56 119,1

E 56,6 29,9 176,6 8,40 120,2

F 57,7 39,6 175,8 8,31 120,7

G 45,1 174,9 8,41 107,5

H 55 29 174,1 8,56 118,1

I 61,1 38,8 176,4 8,17 120,4

K 56,2 33,1 176,4 8,36 121,6

L 55,1 42,4 177,6 8,28 122,4

M 55,4 32,9 176,3 8,42 120,3

N 53,1 38,9 175,2 8,51 119,0

P 63,3 32,1 177,3

Q 55,7 29,4 176 8,44 120,5

R 56 30,9 176,3 8,39 121,2

S 58,3 63,8 174,6 8,43 115,5

T 61,8 69,8 174,70 8,25 112,0

V 62,2 32,9 176,3 8,16 119,3

W 57,5 29,6 176,10 8,22 122,1

Y 57,9 38,8 175,9 8,26 120,9

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D

64

1H13C

15N

plan HSQC

. . .. .. .. . ...

. ...

.. ..

. ...

15N

33

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D

65

1H

15N

15N

i-1 iextraction d’un

plan 13C-1H

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D

66

1H

15N

13C

extraction d’un plan 13C-1H

1H

13C

signaux intenses : Cα , Cβ du résidu i

signaux moins intenses : Cα , Cβ du résidu i-1

HNCACB

i-1 i

34

2009 Structures des protéines – MO2 671H

15N

13C

Cα (i)

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cβ (i)

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéine avec les expériences 3D

68

(Cα i, Cβ i) i = Gln (Q)

(Cα i-1, Cβ i-1) i-1 = Ser (S)

paire Ser-Gln (SQ)

séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq33werpsgns

1H

13C

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Q

S

Cα (i)

Cβ (i)

Q33

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéine avec les expériences 3D

35

691H

15N

13C

Cα (i)

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cβ (i)

Q33

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D

70

(Cα i, Cβ i) i = Gln (Q)

(Cα i-1, Cβ i-1) i-1 = Ser (S)

paire Ser-Gln (SQ)

séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq33werpsgns

1H

13C

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cα (i)

Cβ (i)

Q

S

A

Cα (i)

Cβ (i)

Q33 S32

36

2009 Structures des protéines – MO2 71

Cα (i-1)

Cβ (i)

Cα (i)

Cβ (i-1)

S32

1H

15N

13C

Q33

Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D

72

Variations des déplacements chimiques importants dans les protéines structurées !

Structure de PIN1At

Cα chemical shift deviations from random coil values for residues of PIN1At, showing

regions predicted to be α helices and β strands

α helices

β strandsβ1 β2

α1 α2 α3 α4

β3 β4

α helices

β strands

37

Déplacements chimiques 13C des acides aminés

O

NH

H

H

H

H

H

H

HH

H

NH2

αβ

γδ

ε

lysine

HN

Cα Cβ CO Hn NA 52,5 19,1 177,8 8,35 125,0

C 55,4 41,1 174,6 8,54 118,7

D 54,2 41,1 176,3 8,56 119,1

E 56,6 29,9 176,6 8,40 120,2

F 57,7 39,6 175,8 8,31 120,7

G 45,1 174,9 8,41 107,5

H 55 29 174,1 8,56 118,1

I 61,1 38,8 176,4 8,17 120,4

K 56,2 33,1 176,4 8,36 121,6

L 55,1 42,4 177,6 8,28 122,4

M 55,4 32,9 176,3 8,42 120,3

N 53,1 38,9 175,2 8,51 119,0

P 63,3 32,1 177,3

Q 55,7 29,4 176 8,44 120,5

R 56 30,9 176,3 8,39 121,2

S 58,3 63,8 174,6 8,43 115,5

T 61,8 69,8 174,70 8,25 112,0

V 62,2 32,9 176,3 8,16 119,3

W 57,5 29,6 176,10 8,22 122,1

Y 57,9 38,8 175,9 8,26 120,9

74

Identification de structures secondaires avec l’index des déplacements chimiques (CSI)

CSI

CSI

n° résidu

différence des valeurs Cα, Cβ ou CO par rapport aux valeurs Cα, Cβ ou

CO ‘random coil’ respectivement

si ∆Cα <0, ∆Cβ >0, ∆CO <0 feuillet β

si ∆Cα >0, ∆Cβ <0, ∆CO >0 hélice α

38

BILAN N°3

Paramètres utiles :résonances 13C : renseignent sur le type d’acide aminéHNCACB, HNcaCO… : donnent les connections entre acides aminés

permet de les identifier dans la séquence primaire

Attribution des spectres à 3 dimensions = déterminer à quelle résonance correspond quel acide aminé dans le spectre 1H-15N HSQC

Identification de structures secondaires

Paramètres utiles :résonances 13C : les variations des résonances 13C (des Cα, Cβ, CO)

de chaque acide aminé dans la séquence par rapport aux valeurs standards ou ‘random coil’ permet d’identifier et localiser les éléments de structures secondaires

idem pour les résonances HN, Hα, 15N

APPLICATION N°1D É T E R M I N AT I O N D E L A S T R U C T U R E 3 D D E S P R OT É I N E S

39

Différences entre les données cristallographiques et les données RMN

Différences entre les données cristallographiques et les données RMN

diffractogramme

40

Différences entre les données cristallographiques et les données RMN

diffractogramme

Densité électronique

Différences entre les données cristallographiques et les données RMN

Spectres à deux ou trois dimensions = attribution, contraintes de distances…

41

Différences entre les données cristallographiques et les données RMN

Spectres à deux ou trois dimensions = attribution, contraintes de distances…

Quelles informations peut-on tirer de ceci?

42

15N-TOCSY-HSQC (3D)

15N-NOESY-HSQC (3D)

43

Comment peut-on relier ce spectre à la structure 3D d’une protéine?

1H

1H

Contraintes de distances 1H-1H ensemble de structures possibles

Contraintes de distance

distances 1H-1H de moins de 5 Å

44

De la séquence à la structure tridimensionnelle des protéines

1H

1H

conformation étendue

ensemble de structures 3D

NOESY

distances 1H-1H : donne un pic de corrélation pour 2 protons

distants de moins de 5 Å

88

Interprétation du NOESY

1H

1H > 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å

10 000 contacts NOEs ?

environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour une protéine de 40 aa!

45

89

Interprétation du NOESY

ensemble de conformères possiblestous répondant aux contraintes

expérimentales

trop peu de contacts NOEs pour établir une

structure unique

environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour une protéine de 40 aa!

> 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å

10 000 contacts NOEs ?

90

Constante de couplage 3J HN-Hα : détermination de l’angle φ

Equation de Karplus

3J HN-Hα < 6 Hz hélice α3J HN-Hα > 8 Hz feuillet β

6 Hz < 3J HN-Hα < 8 Hz random coil

θ = Φ – 60°

hélice α

feuillet β

hélice α

feuillet β

46

Degré de liberté de la chaîne polypeptidique

91

angles dihédraux :

• phi (φ) : angle de rotation autour de la liaison N-Cα

• psi (ψ) : angle de rotation autour de la liaison Cα-C’

• ω= 0° liaison peptidique cis; ω= 180° liaison peptidique trans

Liaisons peptidiques

CC’

N

O

C’N

O

α CαCα

φ ψω

R1

R2

R3 H

H

H

N C’

O

i i+1i-1

H

H

H

C’ (i)

N

C’ (i-1)

Cα (i)

C’ (i-1)

N

C’ (i)

Cα (i)φ

φ

Degré de liberté de la chaîne polypeptidique

92

Liaisons peptidiques

CC’

N

O

C’N

O

α CαCα

φ ψω

R1

R2

R3 H

H

H

N C’

O

i i+1i-1

H

H

H

φ

ψ

Diagramme de Ramachandran

+180

-180-180 +1800

0

angles dihédraux :

• phi (φ) : angle de rotation autour de la liaison N-Cα

• psi (ψ) : angle de rotation autour de la liaison Cα-C’

toutes les orientations ne sont pas possibles diagramme de Ramachandran : représentation des régions stériquement permises

feuillets β

hélices α

hélices α

47

93

Données structurales : échanges des protons

Données structurales : échanges des protons

94

48

95

Localisation/identification des structures secondaires

contacts NOEs

CSI (A= α helices; B= β strands)

Echange H/D (○échange lent, incomplet après 6h; ●échange très lent, incomplet après 12h)

conclusion

96

Autre méthode pour l’obtention de données structurales par RMN

Simulation des contacts NOEs à partir de la structure d’ADN en

rouge ensemble des structures représentées en noir

short-range

long-range

best fitsuperpositiondone for this end

Zhou et al. Biopolymers (1999-2000) 52, 168.

pas de contacts NOEs (d<5Å)

pas d’angle φ (3J= 3 liaisons covalentes

comment positionner ces 2 régions l’une par rapport à l’autre ?

49

97

RDCs : contraintes orientationnelles à longue distancesans RDCs

15N15N

1H

1H

deux liaisons NHproches l’une de l’autre

15N15N

1H

1H

deux liaisons NH éloignées l’une de l’autre (même

orientation)

avec RDCs

Contrairement aux contacts NOEs et aux angles dièdres qui donnent des informations sur des

noyaux relativement proches dans l’espace (d<5Å ou reliées par 3 liaisons covalentes,

respectivement), les RDCs donnent des informations sur des couples 1H-15N quelque soit la distance qui

les sépare

B0

98

Residual Dipolar Couplings (RDC) : contraintes orientationnelles

Pas d’orientation préférentielle des

protéines en solution (milieu

isotrope)Protéines dans un cristalOrientation totale couplages dipolaires très importants (les couplages dipolaires sont aussi grand que le spectre 1H entier)

B0 B0

Protéines en milieu liquide faiblement orientéacquisition d’une orientation macroscopique dans un champ magnétique

produit un faible couplage dipolaire informations structurales

B0

phages filamenteux, milieu biphasique (bicelles), cristallites

pas de contraintes orientationnelles : les interactions dipolaires sont moyennées à zéro du fait de l’agitation moléculaire pas de couplages dipolaires observables

50

99

Mesure des RDCs

-regular HSQC-decoupled in both dimensions-15N-1H splittings not observed

-HSQC without decoupling in 15N dimension-15N-1H splittings observed, equal to 15N-1H one-bond scalar coupling (1JHN ~92-95 Hz)

-HSQC without decoupling in 15N dimension-15N-1H splittings observed, equal to 15N-1H one-bond scalar coupling 1JHN + RDC (RDC< 0 or RDC >0)

isotropic solution partly oriented

APPLICATION N°2E T U D E D E S I N T E R A C T I O N S P R O T É I N E - P R O T É I N E O U P R O T É I N E -

L I G A N D

51

101

Cartographie des interactions : identification de régions fonctionnelles

Caractérisation d’interfaces protéine-protéine: constante de dissociation d’un complexe

102

A + B ABkon

koffB]A[

[A].[B]K D =

]AB[]A[]A[ 0 +=]AB[]B[]B[ 0 +=

Les concentrations des composants à l’équilibre sont décrites par :

où [A]0 et [B]0 sont les concentrations initiales de A et B.

où [A], [B] et [AB] sont les concentrations de A, B et du complexe AB à l’équilibre.

)]B[]A[4)K]B[]A([K]B[]A([21]AB[ 00

2D00D00 −++−++=

La concentration de complexe à l’équilibre s’exprime de la manière suivante à partir de l’expression du KD :

52

Caractérisation d’interfaces protéine-protéine: cinétique d’association et de dissociation

103

dt]AB[d]B][A[kv onnassociatio +==

dt]AB[d]AB[kv offondissociati −==

0]AB[k]B][A[kdt

]AB[doffon =−=

on

offD k

kB]A[

[A].[B]K ==

Les paramètres cinétiques d’association et de dissociation sont :

à l’équilibre :

A + B ABkon

koffB]A[

[A].[B]K D =

Calcul du KD par RMN

104

νlibre νlié

νlibre

νlibre νlié

νlié

νlibre νlié

1H

1H

1H

1H

1H

[liga

nd] ↑

cas d’un échange lent

complexe fort

le déplacement chimique d’un atome donné est un paramètre sensible à l’environnement chimique de celui-ci

si on considère une protéine (A) de concentration constante en présence d’un ligand (B) de concentration croissante : les signaux RMN de (A) vont varier en fonction de la quantité de (B) ajoutée, c’est-à-dire en fonction de la quantité de complexe (AB)

53

105

νlibre 1H

νlié 1H

[liga

nd] ↑

cas d’un échange rapide

complexe faible

1Hν

1Hν

νlibre νlié

νlibre νlié

le déplacement chimique d’un atome donné est un paramètre sensible à l’environnement chimique de celui-ci

si on considère une protéine (A) de concentration constante en présence d’un ligand (B) de concentration croissante : les signaux RMN de (A) vont varier en fonction de la quantité de (B) ajoutée, c’est-à-dire en fonction de la quantité de complexe (AB)

Calcul du KD par RMN

Calcul du KD par RMN

106

[liga

nd] ↑

Variation des signaux d’une protéine 15N enrichie en présence d’un ligand non marqué

2D : 15N-1H HSQC

[ligand] ↑

54

Calcul du KD par RMN

107

Variation des signaux d’une protéine 15N enrichie en présence d’un ligand non marqué

Δδ (15N)

δ0 (1H)δ (1H)

δ0 (15N)

δ (15N)

Δδ (1H)

∆δ = δ - δ0 = [∆δ (1H)]2 + 0.2 [∆δ (15N)]2

Calcul du KD par RMN

108

Variation des signaux d’une protéine 15N enrichie en présence d’un ligand non marqué détermination de la constante de dissociation (KD)

Δδ (15N)

Δδ (1H)

)][][4)][]([][]([2 00

20000

max BAKBAKBA DD −++−++Δ=Δ δδ

points expérimentauxcourbe théorique

KD = 150 μM

55

Aspect qualitatif : cartographie des surfaces d’interaction

15N

1H

état libre

état lié (saturation)

Criblage de ligands par RMN

on va observer les variations des signaux de la protéine marquée 15N en présence des ligands sur un spectre 1H-15N HSQC :

détermination du KD

détermination du site de liaison

1H

15N

56

APPLICATION N°3C R I B L A G E D E L I G A N D S

Criblage de ligands par RMN

112

Deux grandes stratégies :

• on a accès à une protéine enrichie en 15N

on va observer les variations des signaux de la protéine en présence des ligands sur un spectre 15N-1H HSQC

• on n’a pas accès à une protéine enrichie en 15N

on va observer les variations des signaux du ligand avec ou sans protéine

57

SAR by NMR : structure-activity relationship

113

nécessite de la protéine enrichie 15N car on va observer les signaux de la protéine en présence de ligands

1 2 3+ =

3

2

LiaisonEvolution

Optimisation

Criblage de “fragments”100 à 1000 moléculesComplexité faible

(lead-like)Réussite : 1 – 10 %Criblage d’affinité,

analyses physico-chimiques,techniques transposables àdifférentes cibles

114

SAR by NMR

Criblage “fragments”

Réussite : 1,7 %

Activité initiale faiblemais détectable

Simplicité des hitsoptimisation efficace

Infrastructure plus légère, ∼ 500 molécules testées

Criblage “haut-débit”

Réussite : 0,2 %

Activité initiale élevée(ou indétectable !)

Complexité des hitsoptimisation difficile

Infrastructure lourde, + 100 000 molécules testées

58

115

SAR by NMR

Criblage de ligands pour le site de liaison n°1 KD1

Optimisation des ligands du site de liaison n°1 KD1’

Criblage de ligands pour le site de liaison n°2 KD2

Optimisation des ligands du site de liaison n°2 KD2’

Liaison covalente des 2 ligands et optimisation du linker

KD = KD1’ x KD2’

116

SAR by NMR

59

117

SAR by NMR

SAR by NMR

118

60

119

Protéine cibleMolécules organiques libres

Complexe

+

Perturbations de déplacement chimique

Modification des propriétés de diffusion et de relaxation

Modification de la taille de l’édifice

Environnement électromagnétique modifié

Détection d’échanges par RMN

120

Criblage de ligands par RMN

Sans protéine 15N enrichie

• expériences de diffusion

• STD (Saturation Transfer Difference)

• transfert de NOE

Lorsque le ligand est lié à la protéine, il adopte le même comportement que la protéine

61

121

Méthodes ne nécessitant pas de protéine enrichie

Ligand libre Protéine Ligand liéLargeur de raie étroite large élargieRelaxation lente rapide augmentéetrNOE faible (+) fort (-) faible (-)Diffusion rapide lente ralentieSTD non saturé saturé saturé

122

Saturation transfer difference (STD)

différence B-A

on ne détecte que les molécules libres ( , ) tandis que les

molécules liées ( ) ne sont plus détectables car elles adoptent le

même comportement que la protéine

par soustraction du spectre où on a irradié la protéine par le spectre de contrôle (=sans irradiation de

la protéine), on récupère les signaux du ligand en interaction

avec la protéine

ne nécessite pas de protéine enrichie 15N car on va observer les signaux du (des) ligand(s) en présence de la protéine

62

123

Saturation transfer difference (STD)

ligand non ligand

124

Diffusion

décroissance plus rapide diffuse plus vite

63

125

Diffusion

spectre (A) – spectre (B) : différence dans le spectre des ligands uniquement s’il y a changement de diffusion

Mélange de composés sans protéine + gradient

Mélange de composés avec protéine + gradient

Composé de référence détecté comme ligand en (c)

Protéine seule (référence)