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DANIELE REGINA SONZA SÍNTESE E ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VITRO E IN SILICO DE CHALCONAS HETEROCÍCLICAS DERIVADAS DO FURANO Itajaí (SC) 2017
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DANIELE REGINA SONZA
SÍNTESE E ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VITRO E
IN SILICO DE CHALCONAS HETEROCÍCLICAS
DERIVADAS DO FURANO
Itajaí (SC)
2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
DANIELE REGINA SONZA
SÍNTESE E ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VITRO E
IN SILICO DE CHALCONAS HETEROCÍCLICAS
DERIVADAS DO FURANO
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa
Itajaí (SC)
Setembro de 2017
Ficha Catalográfica
Bibliotecária Eugenia Berlim Buzzi CRB - 14/963
S59s
Sonza, Daniele Regina, 1988-
Síntese e atividade biológica in vitro e In silico de
chalconas heterocíclicas derivadas do furano [manuscrito]
/ Daniele Regin Sonza.- Itajaí, SC. 2017.
122 f. ; il. ; tab. ; graf. ; fig.
Bibliografias f. 105-122
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí
como parte dos requisitos para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Farmacêuticas.
“Orientador: Prof. Dr. Rogério Corrêa”.
1. Chalconas. 2. Produtos naturais. 3.Farmacologia.
I. Universidade do Vale do Itajaí. II. Título.
.
CDU: 615.32
Aos meus pais, Juvenir e Carmen,
minha eterna gratidão.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Juvenir e Carmen, por iluminarem e guiarem o
meu caminho, me incentivando sempre, principalmente na realização deste
trabalho. Por tantas vezes abrirem mão dos seus próprios sonhos, para que
eu pudesse realizar os meus.
Ao meu irmão Maurício, pelo apoio, paciência e por torcer pelo
meu sucesso.
Ao meu querido noivo, Vilmar, por entender todos os momentos
que estive ausente, por sempre me incentivar e por me ajudar na finalização
desde trabalho. Neste ano, tão importante para nós, só posso te agradecer
por me completar em todos os momentos.
Aos queridos Vilmar, Denise e Sabrina, por me incentivarem
sempre neste sonho.
À querida Fátima, por todo apoio, auxílio e amizade. Sempre serás
minha maior referência, te admiro muito!
Agradeço à todos os meus líderes, companheiros de trabalho, que
me auxiliaram infinitas vezes para que eu pudesse conciliar o trabalho e
todas as atividades do mestrado. Muito obrigada!
A CAPES/PROSUP pelo apoio financeiro.
Aos colegas e amigos, por todo apoio.
Aos professores da banca, Clóvis, Luisa e Lorena, por todas as
valiosas considerações!
Termino este agradecimento, agradecendo de todo o meu coração,
o meu orientador Rogério, por ter me aceito como sua orientanda e por toda
confiança depositada durante este trabalho. Por entender minha ausência e
me apoiar , não apenas uma,mas diversas vezes, durante estes anos. Não há
palavras que descrevam toda minha gratidão, MUITO obrigada Roger!
À nossa senhora, que por tantas vezes me segurou em seus braços
durante essa etapa. Por escutar minhas orações, por me guiar, por
interceder, tenho certeza que tudo se concretizou como deveria ser!
Vencemos essa etapa!
Carreiras são como escadas.
Para chegar ao topo,
é preciso dar o primeiro passo...
SÍNTESE E ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VITRO E
IN SILICO DE CHALCONAS HETEROCÍCLICAS
DERIVADAS DO FURANO
Daniele Regina Sonza
Setembro/2017
Orientador: Rogério Corrêa, Doutor.
Área de Concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas e bioativas.
Número de Páginas: 121
O presente trabalho aborda a síntese de chalconas heterocíclicas, derivadas do furano,
por meio de uma derivação do método de condensação de Claisen-Shmidt. Foram
obtidas 19 compostos, obtivos pela variação dos aldeídos: furancarboxaldeído e
furfuraldeído. Os rendimentos obtidos estão contemplados na faixa de 27, 3% à
91,3%, destacam-se oito compostos inéditos. Todas as chalconas foram caracterizadas
através de análise elementar, FTIR, RMN1H e RMN13C. Os compostos foram
avaliadas quanto aos efeitos sobre a inibição das isoformas da ciclooxigenase, tipo I
(COX-1) e tipo II e (COX-2), por meio de ensaio imunoenzimático in vitro. Dentre as
chalconas mais seletivas, destaca-se o composto M10, IS=304,6 e o composto F10,
IS=257,5, com seletividade superior ao fármaco referência (Celecoxibe, IS=249). Em
relação a atividade antiproliferativa, os compostos avaliados foram capazes de inibir
a proliferação celular das células humanas de osteosarcoma em 88,8%, quando
comparado à doxorrubicina (F10). Os compostos foram submetidos a análise in silico
por meio das ferramentas Molinspiration, PASSonline e PREadmet, apresentando
potencial biológico para as atividades antiinflamatória e antinociceptiva. Foi realizado
a avaliação do docking molecular com a COX-2, utilizando a ferramenta ARGUS-
LAB e Plataforma MAESTRO, onde observou-se a melhor energia de docking com
os compostos M10, M7, M4, M9; F10, F9, F7 e F3. Os resultados obtidos neste estudo
pemitem identificar moléculas com potencial atividade anti-inflamatória, com
seletividade para isoforma COX-2, promissoras no que se refere ao desenvolvimento
de um novo fármaco. Bem como interessante atividade antitumoral para células
humanas de osteossarcoma, com perspectivas de aperfeiçoamento das rotas sintéticas,
continuidade dos estudos no intuito de avaliar os mecanismos de ação farmacológica
anti-inflamatória e antitumoral e modelagem molecular.
Palavras-chave: Chalconas. Ciclooxigenase-2. Docking molecular
IN SILICO AND IN VITRO SYNTHESIS AND BIOLOGICAL ACTIVITY OF
HETEROCYCLIC CHALCONES DERIVED FROM FURAN
Daniele Regina Sonza
September/2017
Advisor: Rogério Corrêa, Doctor.
Area of Concentration: Natural products and synthetic and bioactive substances.
Number of Pages: 121
This work investigates the synthesis of heterocyclic chalcones derived from
furan, through a derivation of the condensation method of Cleisen-Shmidt. Nineteen
compounds were obtained by varying the aldehydes: furancarboxaldehyde and
furfuraldehyde. The yields obtained were within in the range of 27.3% to 91.3%. Eight
unpublished compounds are highlighted. All the chalcones were characterized by
Elemental Analysis, FTIR, 1 H NMR and 13 C-NMR. The compounds were evaluated
for their effects on the inhibition of cyclooxygenase, type I (COX-1) and type II
(COX-2) isoforms by the in vitro immunoenzyme assay. Among the most selective
chalcones were the compound M10, IS = 304.6 and compound F10, IS = 257.5, with
higher selectivity than the reference drug (Celecoxib, IS = 249). Regarding
antiproliferative activity, the compounds evaluated were able to inhibit the cell
proliferation of human osteosarcoma cells by 88.8%, when compared to doxorubicin
(F10). The compounds were submitted to in silico analysis using the tools
Molinspiration, PASSonline and PREadmet, presenting biological potential for anti-
inflammatory and antinociceptive activities. The molecular docking with COX-2 was
evaluated, using the ARGUS-LAB tool and the MAESTRO Platform; the best
docking energy was observed with compounds M10, M7, M4, M9; F10, F9, F7 and
F3. The results obtained in this study enabled us to identify molecules with potential
anti-inflammatory activity, with selectivity for the COX-2 isoform, which is
promising for the development of a new drug. The results also showed interesting
antitumor activity for human osteosarcoma cells, with prospects for improvement of
the synthetic routes, and the continuity of studies, to evaluate the mechanisms of anti-
inflammatory and antitumoral pharmacological action and molecular modeling.
Keywords: Chalcones. Cyclooxygenase-2. Molecular docking
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Estrutura do anel furânico.......................................................................... 25
Figura 2 Árvore cronológica da descoberta de fármacos......................................... 33
Figura 3 Isomeros Cis e Trans das chalconas........................................................... 34
Figura 4 Estrutura química da sofalcona(a), metochalcona(b) e licochalcona A(c) 37
Figura 5 Estrutura química da licochalcona E (a) e xantohumol (b)........................ 41
Figura 6 Estrutura química da esculetina (a) e benzafibrato(b)................................ 42
Figura 7 estruturas de ressonância do anel furano.................................................... 44
Figura 8 Medicamentos contendo anel furano......................................................... 46
Figura 9 Esquema do mecanismo geral de condensação aldólica da série derivada
da (2E)-3-(furan-2-il)-1-fenilprop-2-en-1-ona (série M)........................... 59
Figura 10 Espectro de IV do composto M9 ............................................................... 72
Figura 11 Espectro de RMN1H do composto M9....................................................... 72
Figura 12 Espectro de RMN13C do composto M9..................................................... 73
Figura 13 Cromatograma da amostra de chalcona M9 com eluente gradiente, no
modo positivo (MS)................................................................................... 74
Figura 14 Cromatograma da amostra de chalcona M9 com eluente isocrático, no
modo positivo (MS)................................................................................... 75
Figura 15 Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero E do
composto M9.............................................................................................. 76
Figura 16 Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero Z do
composto F9............................................................................................... 76
Figura 17 Espectro de IV do composto F9................................................................. 77
Figura 18 Espectro de RMN1H do composto F9........................................................ 78
Figura 19 Espectro de RMN1C do composto F9........................................................ 78
Figura 20 Cromatograma da amostra de chalcona F9 com eluente gradiente, no
modo positivo (MS).................................................................................. 79
Figura 21 Cromatograma da amostra de chalcona F9 com eluente isocrático, no
modo positivo (MS)................................................................................... 80
Figura 22 Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero E do
composto F9............................................................................................... 81
Figura 23 Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero Z do
composto F9............................................................................................... 81
Figura 24 Percentual de inibição da proliferação das células U2OS por chalconas na
concentração de 15 µg/ml e pelo controle positivo doxorrubicina (DOXO
- 2,5 µg/ml) e negativo DMSO 0,5%........................................... 90
Figura 25 Ilustração da interação do sítio ativo COX-2 com inibidor
F10.............................................................................................................. 95
Figura 26 Ilustração da interação do sítio ativo COX-2 com inibidor
M10............................................................................................................ 96
Figura 27 Ilustração da interação do sítio ativo COX-2 com inibidor F10 em
3D............................................................................................................... 96
Figura 28 Ilustração da interação do sítio ativo COX-2 com inibidor M10 em
3D............................................................................................................... 97
Figura 29 Enzima Cyclooxygenase-2 obtida a partir do Proteín Data Bank............. 97
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados analíticos dos compostos obtidas a partir do furfuraldeido, com
diferentes acetofenonas.............................................................................. 61
Tabela 2 Dados analíticos dos compostos obtidas a partir do 3-furancarboxaldeído,
com diferentes acetofenonas..................................... 67
Tabela 3 Quantidades relativas dos isômeros encontrados no composto M9........... 75
Tabela 4 Quantidades relativas dos isômeros encontrados no composto F9............ 80
Tabela 5 Valores comparativos dos parâmetros de Lipisnki e extensão para as duas
séries de chalconas em estudo........................................................... 84
Tabela 6 Avaliação in sílico de parâmetros relacionados à ADMET de chalconas. 86
Tabela 7 Potenciais atividades biológicas preestabelecidas para chalconas
sintetizadas, série M................................................................................... 88
Tabela 8 Potenciais atividades biológicas preestabelecidas para chalconas
sintetizadas, série F.................................................................................... 89
Tabela 9 Ensaio de inibição enzimática in vitro COX-1/COX-2 para as chalconas
da série M................................................................................................... 92
Tabela 10 Ensaio de inibição enzimática in vitro COX-1/COX-2 para as chalconas
da série F.................................................................................................... 94
Tabela 11 Energias de docking molecular, em relação à COX-2, e parâmetros
derivativos para a série M.......................................................................... 98
Tabela 12 Energias de docking molecular, em relação à COX-2, e parâmetros
derivativos para a série F............................................................................ 99
LISTA DE ABREVIATURAS
AA: ácido aracdônico
BHE:barreira hematoencefálica
ADME: absorção, distribuição, metabolismo e excreção
CCD: cromatografia em camada delgada
CD: clorofórmio deuterado
COX: ciclooxigenase
DMSO: dimetilsulfóxido
Doxo: doxorrubicina
EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético
EIA: ensaio imunoenzimático
FDA: food and drug administration –agência regulatória dos Estados
Unidos.
FT-IR: espectrofotometria de infravermelho por transformada de Fourier
HIA: absorção intestinal
HDL:lipoproteína de alta densidade
HCl: ácido clorídrico
Hz: hertz
IS: Índice de seletividade
IL-6: interleucina-6
J: constante de acoplamento
logP: coeficiente de partição octanol/água
LDL: lipoproteína de baixa densidade
LC-MSMS – cromatografia líquida acoplada a detector de massas
MNA: multilevel neighborhoods of atoms
MTT: brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
MS: modo positivo
OPLS: optimized potentials for liquid simulations
PPAR: proliferadores de peroxissoma gama
Pa: probabilidade de "ser ativo"
Pi: probabilidades de "ser inativo"
PF: ponto de fusão
PGH2: prostaglandinas derivadas do ácido araquidônico
pH: potencial de hidrogeniônico
PM: peso molecular
PGF2α: prostaglandina F2α
QSAR: relação quantitativa estrutura-atividade
R: grupo substituinte
Rf: índice de retenção
Rprop: retropropagação resiliente
RMN-13C: ressonância magnética nuclear de carbono
RMN-1H: ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RSCB: research collaboratory for structural bioinformatics – consórcio que
administra o protein data bank
SNC: sistema nervoso central
SnCl2: cloreto de estanho
s: simpleto
t: tripleto
U2OS: células da linhagem de osteossarcoma humano
TNF- α: fator de necrose tumoral α
TPSA: topological polar surface área - área superficial topológica polar
TMS: tetrametilsilano
μM: micro-molar
π: constante de hasch (pi de hansch) – relacionada a fatores estéricos
σ: constante de hammet (sigma de hammet) – relacionada a fatores
eletrônicos
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 24
2 OBJETIVOS ........................................................................................... 28
2.1 Objetivo Geral ....................................................................................... 28
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 28
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 30
3.1 Fármacos sintéticos ............................................................................... 30
3.2Chalconas ............................................................................................... 34
3.3 Heterociclos e derivados furânicos ....................................................... 43
3.4Parâmetros de avaliação in silio ............................................................. 47
3.5Docking molecular ................................................................................. 49
4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 50
4.1 Síntese ................................................................................................... 50
4.1.2 Procedimentos de isolamento e caracterização estrutural .................. 50
4.2 Análise in silico: cálculos teórico computacionais ................................ 51
4.3Avaliação da atividade antiproliferativa ................................................ 54
4.4 Ensaio imunoenzimático: avaliação do efeito inibitório ....................... 55
4.5 Análise do docking molecular............................................................56
4.5.1 Ferramentas de Dockinge Banco de Dados:.......................................56
4.5.2 Planejamento e Modelagem Energética do Ligante............................57
4.5.3 Docking com ArgusLab.......................................................................57
4.5.4 Docking com Glide (Plataforma Maestro) para obtenção de
imagens.........................................................................................................57
4.6 Análise estatística............................................................................... ....58
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................... 59
5.1 Síntese ................................................................................................... 59
5.1.2Purificação e caracterização ................................................................ 60
5.2 Avaliação da atividade in silico: cálculos teórico computacionais ....... 82
5.3 Avaliação da atividade in silico: parâmetros farmacocinéticos ............. 85
5.4 Análise in sílico: avaliação de potenciais atividades biológicas ............ 86
5.5Avaliação da atividade anntiproliferativa in vitro .................................. 90
5.6Avaliação de inibição das isoenzimas COX-1 e COX-2 ........................ 91
5.7Avaliação da atividade do docking molecular da isoenzima COX-2 ..... 95
6 CONCLUSÕES ................................................................................... 102
REFERÊNCIAS ..................................................................................... 104
24
1 INTRODUÇÃO
A descoberta de novos medicamentos tem suas raízes
profundamente ligadas às inovações científicas e tecnológicas. Os avanços
expressivos da química e biologia e a melhor compreensão de vias
bioquímicas, fisiológica, mecanismos e alvos moleculares que levam ao
aparecimento e desenvolvimento de doenças, tornaram possível a descoberta
de formulações terapêuticas notáveis.Estima-se que aproximadamente 80%
da população mundialdepende, sobretudo, de medicamentos de origem
natural para o encaminhamento terapêutico de suas patologias (NEWMAN;
CRAGG; KINGSTON, 2008), com base neste contexto, a subsistência do uso
da medicina popular tem auxiliado a busca e desenvolvimentode novos
medicamentos (BARREIRO, 2007; HAMBURGUER; HOSTETTMANN,
1991; MATOS, 1990).
Até meados do século XIX a farmácia permaneceuuma
ciênciaempírica guiadapela medicina tradicional, aplicando e transferindo
conhecimentos herdados pelos ancestrais. Os medicamentos disponíveis
eram geralmente preparados comextratos vegetais, que em sua maioria eram
eficazes.Atecnologia da fabricação demedicamentos era rudimentar,
produzindo apenastinturas,emplastros, sopas e infusões
hidroalcoólicaspreparadas com ervas secas ou recém-coletadasou ainda
produtos animais, como ossos e gordura (CHAST, 2008).
A partir da segunda guerra mundial, surgem as grandes indústrias
farmacêuticas na Europa e Estados Unidos, os quais passam a utilizar os
recursos da química sintética para desenvolvimento de novos fármacos.
Unindo indústrias, universidades e institutos de pesquisa, inicia-se um novo
conceito para a pesquisa e desenvolvimento de fármacos,baseados em alvos
terapêuticosespecíficos e moléculas otimizadas, afim de descobrir um novo
medicamento (PALMEIRA FILHO & PAN, 2003; MIGNANI et al., 2016;
REICHMAN, SIMPSON, 2016).
O processo de pesquisadura pelo menos doze anos, com pouca
probabilidade de sucesso (LIMA et al., 2003). Assim, de cada 30.000
moléculas sintetizadas, 66,7% entram na fase de estudos pré-clínicos, 0,67%
entram na fase I dos estudos clínicos, 0,13% passam para estudos defase II,
0,04% entram na fase III e somente 0,027%, ou nove moléculas, são
aprovadas pelos órgãos regulatórios. Destes, destaca-se ainda que apenas um
25
medicamento aprovado é incluído nos protocolos terapêuticos (CALIXTO &
SIQUEIRA JÚNIOR, 2008; BERKMANN, EUGSTER, 2017). Durante os
últimos anos, ocorreu uma diminuição ainda mais significativa no número de
medicamentos aprovados pelo FDA (MIGNARI et al.,2016).
Ao observar a estrutura dos fármacos empregados na terapêutica,
constata-se que cerca de 62% deles são heterocíclicos, dentre os quais
aproximadamente 95% apresentam-se nitrogenados, 28% comportam átomos
de enxofre e18% átomos de oxigênio. Os valores acima expostos assinalam
a importância da química dos heterociclos, demonstrando que muitas vezes
pode-se observar a presença de dois heteroátomos em um mesmo ciclo
(MENEGATTI; FRAGA; BARREIRO, 2001; TANTAWY et al., 2017;
ZHANG, 2017).
Inúmeras atividades farmacológicas importantes estão relacionadas
à presença destes heteroátomos, principalmente, nitrogênio, oxigênio e
enxofre, pois através deles, formam-se novos grupos funcionais e
heterociclos que contribuem significativamente no processo de interação com
receptores biológicos (QUIN; TYRELL, 2010).
Um exemplo de heterociclo oxigenado, observado em inúmeras
substâncias de ocorrência natural, como plantas e produtos de metabolismo
microbiano, podendo inclusive ser sintetizado, é o anel furânico(figura 1),
que é um ciclo oxigenado de cinco membros. Este núcleo tem sido
amplamente investigado na quimica medicial e possui várias atividades
biológicas relacionadas, como, por exemplo, antiinflamatória(BANERJEE,
HKS,BANERJEE, 2012); antidepressiva (QUIANHUO et al., 2016),
animicrobiana (ISMAIL, 2009; ANSARI et al., 2016),
antiúlcera(BANERJEE, HKS,BANERJEE, 2012), antioxidante (SHEN, et
al., 2017); antineoplásico (ISMAIL, 2009), citotóxica (KURBAKOVA et al.,
2015)sendo considerado promissor para o desenvolvimento de novos
fármacos
Figura 1: estrutura do anel furânico
O
A estrutura química do furano torna-oum precursor com particular
interesse na síntese orgânica, uma vez que pode ser convertido facilmente em
26
estruturas heterocíclicas, cíclicas, e acíclicas, com aplicações na síntese de
produtos naturais e em química medicinal (ALVES, 2016).
As chalconas são substâncias químicas encontradas em plantas, que
por sua vez, podem ser sintetizadas, pela condensação de cetonas e aldeídos
aromáticos num processo reacional conhecido como Condensação de
Claisen-Schmidt (DUCKI, et al., 1998; CORDEIRO, M., 2010). Desta
maneira, chalconas tornam-se uma vasta fonte para a obtenção de novos
princípios ativos, devido sua versatilidade sintética e comprovadas atividades
já estudadas como por exemplo, antifúngica, anticâncer, anti-inflamatória,
antibacteriana, antioxidante (SINGH, ANAND, KUMAR, 2014).
Recentemente, estudos de chalconas contendo núcleos heterocíclicos, vem
sendo publicados, mostrando uma promissora atividade biológica (RAI et al.,
2015; MINDERS et al., 2015; ALCOLEA et al., 2016; MING et al, 2017).
Considerando a importância dos núcleos farmacofóricos em
questão e a necessidade de se investigar novas moléculas com propriedades
biológicas, este trabalho tem como propósito asíntese de chalconas
heterocíclicas, derivadas do furano, avaliação da atividade anti-
inflamatóriain vitro;docking molecular in silico;além da predição in silico
dos potenciais alvos moleculares etriagem daatividade antiproliferatina.
27
28
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Sintetizar chalconas heterocíclicas, derivadas do furano e
avaliar, in vitro, os compostos sintetizados quanto à inibição seletiva, das
isoformas da enzima ciclooxigenase do tipo 1 (COX-1) e tipo 2 (COX-2) e a
atividade antiproliferativa contra células tumorais de osteossarcoma. Avaliar,
ainda, in sílico, os parâmetros ADME, bem como o docking molecular, em
relação à COX-2 e predição dos potenciais alvos moleculares.
2.2 Objetivos Específicos
• Sintetizar chalconas utilizando diferentes acetofenonas e aldeídos
derivados do furano;
• Caracterizar, pelas espectroscopias de FT-IR, RMN1C, RMN13C,
além da análise elementar ( C, H, N, O ) de todos os compostos
sintetizados;
• Avaliaralguns descritores de previsão in silicode acordo com os
parâmetros estipulados na regra dos 5 de Lipinski;
• Avaliar a atividade anti-inflamatória in vitrodos compostos
sintetizados, em relação à enzimaciclooxigenase-2, utilizando
ensaio imunoenzimático e determinando o Índice de Seletividade
(IS) COX-2/COX-1;
• Realizar e avaliar o docking molecular dos compostos sintetizados
(ligantes) com a cicloocigenase-2, utilizando ferramentas
computacionais;
• Avaliar a atividade antiproliferativa, em células de osteossarcoma,
dos compostos sintetizados;
• Avaliar os potenciais alvos biológicos dos compostos estudados,
através da ferramenta PASSonline;
• Avaliar os parâmetros de absorção de HIA (absorção intestinal) e
BHE (barreira hematoencefálica), através da ferramenta PREadmet;
• Relacionar os dados obtidos para estabelecer indícios de relação
estrutura-atividade biológica dos compostos avaliados.
29
30
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Fármacos Sintéticos
O conhecimento adquirido pelos povos primitivos e indígenas com
relação à diversidade química encontrada na natureza pode ser considerado
fator essencial para o descobrimento de substâncias tóxicas e terapêuticas ao
longo do tempo. O aprendizado com estes povos proporcionou valiosas
contribuições para o desenvolvimento da pesquisa em produtos naturais e
desenvolvimento científico-tecnológico, propiciando-nos conhecer a estreita
relação entre a estrutura química de um determinado composto e suas
propriedades biológicas e consequentemente, esclarecer a intrigante interação
entre animais/insetos e plantas. Neste sentido, a natureza forneceu muitos
modelos moleculares que fundamentaram estudos de relação estrutura-
atividade e inspiraram o desenvolvimento da síntese orgânica de fármacos
(VIEGAS JR.; FRAGA; BARREIRO, 2006; BARREIRO, FRAGA, 2015).
A variedade e complexidade de metabólitos secundários, ou seja, de
origem não proteica, biossintetizados pelas plantas, os quais despertam tanto
interesse dentro da química medicinal, formaram-se e evoluíram,
desempenhando um papel fundamental na sobrevivência do vegetal
essencialmente estacionário, fornecendo compostos fisiologicamente
importantes e favorecendo assim as condições de adaptação e regulação, além
de suprir a necessidade básica de substâncias defensivas (NEWMAN;
CRAGG; KINGSTON, 2008; LIU et al., 2016; DELGODA, MURRAY,
2017).
Estas moléculas distintas e complexas geralmente são detentoras de
vários centros estereogênicos, devido aos quais, possivelmente, sejam-lhes
atribuídas inúmeras finalidades alopáticas e biológicas (MONTANARI;
BOLZANI, 2001;LIU et al., 2016). Entre as várias classes de produtos de
metabolismo das plantas, que têm servido como estrutura modelo para o
planejamento tecnológico de fármacos inovadores encontram-se os
alcaloides, terpenóides, esteroides, lignanas, flavonóides, entre outros
(CALIXTO et al., 1990; MONTANARI; BOLZANI, 2001; SILVA JR.;
VIZOTTO, 1996; BARREIRO, FRAGA, 2015).
Apesar da notória importância das plantas no desenvolvimento de
novos medicamentos e considerando o fato de que cerca de 20% das plantas
31
com substâncias medicinais conhecidas serem encontradas no Brasil,
percebe-se que o número de produtos fitoterápicos comercializados no país é
extremamente modesto e sua fatia de mercado se restringe a apenas 2%,
circunstância que ressalta a importante colaboração da química farmacêutica
moderna na obtenção de novos fármacos (BARREIRO, 2007; NIERO, 2010;
BUFAINO, 2013; BARREIRO, FRAGA, 2015).
A descoberta de drogas de origem natural é frequentemente
associada com desafios na purificação, caracterização e modificação química,
devido sua gama complexa de componentes (STRATTON, NEWMAN,
TAN, 2015). Podemos tomar como exemplo os 866 fármacos mundialmente
usados na terapêutica até o ano de 1991, dos quais, 680 (79%) eram obtidos
de forma sintética, os restantes 186 (21%) correspondiam àqueles com
princípios ativos provenientes de fontes naturais ou semi-sintéticos
(MENEGATT; FRAGA; BARREIRO, 2001). Os fármacos sintéticos
representam cerca de 85% do mercado mundial, o que movimentou algo em
torno de 895 bilhões de dólares no ano de 2012 (FARDELONE; BRANCHI,
2006; BARREIRO, FRAGA, 2015). Entre as principais classes de fármacos
de origem natural estão os antibacterianos e os antineoplásicos. Por outro
lado, a maioria dos fármacos pertencentes as classes dos analgésicos,
antidepressivos, antihistamínicos, ansiolíticos, cardiotônicos, hipnóticos,
antifúngicos, anti-inflamatórios e anti-hipertensivos são de origem sintética
(VIEGAS JR.; FRAGA; BARREIRO, 2006).
Um dos mais importantes aspectos a serem observados na busca de
novas moléculas bioativas é a investigação de uma molécula protótipo ou
modelo, a partir da qual se procede a síntese de derivados ou análogos com
propriedades farmacológicas mais intensas, desenvolvendo-se a avaliação da
relação entre estrutura química e bioatividade (POLINSKY, 2008;
REICHMAN, SIMPSON, 2016). Esta relação é o objeto de estudo da química
medicinal, a qual possui base multidisciplinar englobando as ciências
químicas, biológicas, farmacêuticas, médicas, físicas e computacionais,
estando preocupada com invenção, descobrimento, projeção, identificação e
preparação de novas entidades químicas biologicamente ativas. O
desenvolvimento de moléculas que possam ser protótipos de fármacos
eficientes e seguros, com menores efeitos colaterais que os disponíveis no
mercado, que possam ser administrados preferencialmente por via oral e com
custos reduzidos para o tratamento das mais diversas patologias, têm
motivado a pesquisa científica em Química Medicinal(LIMA, 2007;
32
BARREIRO; FRAGA, 2008; GUIDO; ANDRICOPULO; OLIVA, 2010;
BARREIRO; FRAGA, 2015).
Bade e colaboradores (2010), realizaram um estudo envolvendo
cerca de 1.000 medicamentos já comercializados, disponíveis no mercado
atual. Foi verificado que 10% apenas eram compostos de produtos naturais
inalterados, 29% eram compostos de derivados semi-sintéticos e 69% tinham
origem sintética. Dentre os fármacos de origem natural, 29% eram
compostospolicíclicos.
Dentro da química medicinal, podemos definir, de um modo geral,
as etapas comuns do processo de obtenção de um novo fármaco. O ponto de
partida é a eleição de um alvo terapêutico; em seguida inicia-se a otimização
estrutural de uma molécula protótipo, a qual irá interagir com sítio ativo do
alvo selecionado. Esta etapa visa o aumento da potência, seletividade,
diminuição da toxicidade, adequação do perfil farmacocinético e
estabelecimento da relação estrutura-atividade. Finalmente, inicia-se o
desenvolvimento do protótipo, fase que objetiva o melhoramento de suas
propriedades farmacocinéticas e farmacêuticas, como solubilidade, odor,
sabor, de modo a viabilizar seu uso clínico (LIMA, 2007; GUIDO;
ANDRICOPULO; OLIVA, 2010; LIMA, 2007;BERKMAN, EUGSTER,
2017). Trazer uma droga nova para o público normalmente custa uma
empresa farmacêutica ou de biotecnologia, em média, mais de R$ 2.5 bilhões
e leva uma média de 10 a 15 anos (STRATTON, NEWMAN, TAN, 2015;
GAFFNEY, MEZHER, BRENNAN, 2017).
As pesquisas em torno da obtenção de novos fármacos vêm se
destacando gradativamente através de investimentos maciços em matérias-
primas e treinamento de recursos humanos. Estima-se que mais de 150 mil
cientistas com extensa formação acadêmica trabalhem nos setores de
pesquisa e desenvolvimento de laboratórios industriais, em busca de
estratégias inovadoras para o encaminhamento farmacológico de patologias
como diabetes, dores agudas e crônicas, câncer, doenças cardiovasculares,
neurodegenerativas, artrite, osteoporose, fibrose cística, AIDS, entre outras.
Como exemplo, no ano 2000, esta intensa atividade mobilizou, somente na
Europa, cerca de 17 bilhões de dólares, aproximadamente 560 milhões por
dia (FARDELONE; BRANCHI, 2006).
Apesar de todo este investimento, entre os anos de 1990 e 2003, o
FDA aprovou 1.171 novas aplicações de fármacos.No entanto, deste total,
apenas 34% correspondiam a novas entidades químicas, definidas como
33
princípios ativos originais, sem registro ou comercialização prévia nos EUA.
Os demais 66%, em sua maioria, correspondiam a novas aplicações de
fármacos previamente aprovados (LIMA, 2007). No ano de 2016, uma
revisão publicada por Rinch, enfoca que 45 novas entidades moleculares
foram aprovadas no ano de 2015, e reflete os benefícios e riscos, no
desenvolvimento de novos fármacos.
Patridge e colaboradores (2015) realizaram uma avaliação de todas
as aprovações realizadas pela FDA e notou-se que os produtos naturais e seus
derivados representam mais de um terço de todas as novas entidades
moleculares . Cerca de metade destes são derivadas de mamíferos, um quarto
de micróbios e um quarto a partir de plantas . Desde 1930 , a fração total de
produtos naturais tem diminuído,considerando que os derivados semi-
sintéticos de produtos naturais e sintéticos têm aumentado. Em uma breve
retrospectiva da cronologia da descoberta dos fármacos, desde o ácido
acetilsalicílico (AAS, Aspirina®), primeiro fármaco sintético desenvolvido
em 1889, até o apixabano, lançado em 2012 nos EUA, novo agente
antitrombótico (Figura 2), observa-se que a maioria esmagadora das
inovações terapêuticas compreende ou se relaciona a fármacos de origem
sintética (BARREIRO, FRAGA, 2015).
Figura 2: Árvore cronológica da descoberta de fármacos.
Fonte: adaptado de Barreiro e Fraga, 2015.
Com base nestes dados estima-se que apenas uma em cada 25 novas
entidades químicas, que adquirem o status de possível novo fármaco, se
34
tornará um fármaco comercializado, revelando um processo com baixo índice
de êxito. As principais razões para o desfecho mal sucedido deste processo
incluem perda de eficácia clínica, propriedades farmacocinéticas
inadequadas, toxicidade, reações adversas, razões comerciais e limitações
farmacotécnicas (LIMA, 2007; MIGNARI et al.,2016).
Considerando este contexto, justifica-se a necessidade da obtenção
de novos fármacos eficazes e seguros que contribuam para encaminhamento
de doenças prevalentes e outras endêmicas não controladas, conforme as
necessidades de saúde, seguindo critérios epidemiológicos e sociais. A falta
de novas opções para o tratamento de determinadas doenças infecciosas, por
exemplo, leva a utilização de medicamentos já disponíveis, os quais além de
muitas vezes ineficazes e pouco seguros, são tóxicos e promovem elevados
índices de resistência (VIDOTTI, 2007; ANDERSSON et al, 2016; HE et al,
2017).
3.2 Chalconas
Do ponto de vista químico, as chalconas são definidas como
moléculas de cadeia aberta, constituídas por dois anéis aromáticos
(substituídos ou não) ligados por um fragmento enona, de três carbonos,
caracterizando uma cetona α,β-insaturada que apresenta o núcleo
fundamental 1,3-difenil-2-propen-1-ona. Seus anéis aromáticos são
identificados como anel A (advindo da cetona) e anel B (advindo do aldeído)
(THAKRAR; SHAH, 2012; BUKHARI, 2015).
As chalconas representamum grupamento estrutural fundamental,
considerando uma infinidade de moléculas biologicamente ativas (SINGH;
ANAND; KUMAR, 2014). Em função da presença da dupla ligação entre os
carbonos α e β, as chalconas podem adotar configuração E/trans ou Z/cis
(figura 3).No entanto, o estereoisômero E é termodinamicamente favorável
sendo encontrado em maior concentração nas plantas (PADHYE, 2009) e
geralmente obtido de forma pura através de métodos sintéticos (CORDEIRO,
2010; DUCKI et al., 1998) .
35
Figura 3. Isomeros Cis e Trans das chalconas.
O
b
aA
O
B
Chalcona E (Trans) Chalcona Z (Cis)
A química de chalconas permanece fascinante entre os
pesquisadores do século XXI, devido à facilidade de síntese, a grande
possibilidade de substituições, gerando assim um grande número de
derivados, com promissoras e comprovadas atividades biológicas
(MAHAPATRA, D.; BARHDI, S. K.; ASATI, V. 2015).
A metodologia de síntese das chalconas, baseada na condensação
aldólica de Claisen-Schmidt, além de promover,geralmente, a obtenção de
compostos estereoquimicamente puros, ainda possibilita alcançar grande
variedade de moléculas, levando em conta a existência de inúmeros
benzaldeídos e acetofenonas comerciais que podem ser combinados,
contemplando a diversidade estrutural desejada (DUCKI, et al., 1998;
CORDEIRO, M., 2010, WINTER et al., 2016).
Partindo para uma abordagem biológica, chalconas também
podem ser definidas como uma classe de compostos fenólicos pertencentes à
família das fitoalexinas, precursores produzidos durante a via de biossíntese
de flavonóides.Dentre as fitoalexinas, as chalconas têm sido amplamente
estudadas em virtude de suas inúmeras propriedades e, consequentemente, de
sua pontencial aplicação em diversas áreas da indústria (SAHU et al., 201;
SINGH; ANAND; KUMAR, 2014; BEYHAN et al, 2017; ).
Abundantemente encontradas na natureza, esses compostos
apresentam, em sua estrutura, um sistema bastante conjugado capaz de
conferir pigmento amarelo às pétalas de algumas plantas de uso medicinal.
Também encontrados em diferentes órgãos vegetais, plantas rasteiras ou
superiores, as chalconas vem ganhando destaque como alvo de estudos de
isolamento, identificação e investigação de propriedades biológicas. No reino
vegetal a presença de pigmentação, radicais hidroxilas e insaturação α,β são
36
características marcantes, peculiaridades às quais são atribuídas uma série de
bioatividades, tais como antioxidante, antimicrobiana, antifúngica,
fotoreceptora, atraente visual e repelente de predadores (BOECK et al., 2006;
CAMPOS-BUZZI, 2007; CORRÊA, 2008; SAXENA et al., 2007; COSTA
et al., 2016; SALAE et al., 2017).
A ação terapêutica atribuída a compostos pertencentes à classe das
chalconas e seus derivados sintéticos, comprovada através de diversas
pesquisas desenvolvidas in vitro e in vivo, vem se destacando no âmbito da
química medicinal. Grande parte desses estudos engloba a avaliação da
relação estrutura-atividade, na tentativa de elucidar as variáveis estruturais
interferentes na atividade biológica desempenhada por esses compostos
(BANDGAR et al., 2010; BANDGAR et al., 2012; CAMPOS-BUZZI, 2007;
LEE et al., 2006; PADARATZ, 2009; MAHAPATRA, BHARTI, 2016; KAR
et al.,2017).
A partir de revisões da literatura especializada, muito já se tem
avançado nos estudos com esta classe de compostos, e entre os estudos mais
recentes, uma grande ênfase tem se dado à atividade antinociceptiva e anti-
inflamatória, pois a dor continua sendo alvo de pesquisas básicas e clínicas
de grande relevância (OZDEHMIR et al, 2015; KAUFMANN et al., 2016;
LI et al., 2017). Recentemente,novasrevisõesforam publicadas, focando
diversos desenvolvimentos em atividades biológicas, incluindo atividade
anti-cancer; anti-malaria; anti-microbiana e anti-oxidante (SINGH; ANAD;
KUMAR, 2014; KELLO et al, 2016). Um avanço importante também foi
reportado por HAMEED e colaboradores (2016), demonstrando chalconas
ativas na inibição da transcriptase reversa, tornando-se promissores
protótipos a fármacos anti-HIV.
Além das características supracitadas, parte do interesse despertado
por esta classe de compostos se dá também em função de seu núcleo
fundamental, o qual pode ser considerado privilegiado no processo
tecnológico de desenho de fármacos (POLINSKY, 2008). Neste núcleo
encontram-se dois anéis aromáticos de seis membros interligados por apenas
três carbonos, constituindo uma estrutura relativamente rígida, o que
minimiza a variabilidade conformacional da molécula, fator considerado
como uma complicação enfrentada rotineiramente nos estudos de modelagem
molecular. A etapa de análise conformacional é o primeiro passo nesses
estudos, buscando identificar aquela mais estável e, idealmente, a
conformação bioativa (VERLI; BARREIRO, 2005). Outra característica
37
interessante é a versatilidade dos anéis, os quais comportam inúmeras
possibilidades de substituintes que podem contribuir para modificar e/ou
melhorar a atividade farmacológica da molécula (CORDEIRO, 2010;
ZHANG, 2017).
Em alguns países como Japão, Itália e Espanha são utilizados
medicamentos que possuem chalconas como princípio ativo. No Japão
comercializa-se um medicamento com ação muco protetora, que possui como
princípio ativo a sofalcona (figura 4a), a qual é utilizada para o tratamento de
gastrite e úlcera péptica, além disso, demonstrou bons resultados quando
combinada com medicamentos já utilizados clinicamente na erradicação de
infecções desencadeadas por Helicobacter pylori. Já, na Itália e Espanha,
existem medicamentos que possuem em sua formulação a metochalcona
(figura 4b), a qual tem a função de estimular a produção da bile pelas células
hepáticas (ISOMOTO et al., 2005; SWEETMAN, 2013).
A atividade antioxidante exibida pela licochalcona A (figura 4c)
também ganha destaque através de uma linha de cosméticos comercializada
em diversos países. Além destas, várias outras chalconas são utilizadas
clinicamente para tratar enfermidades como câncer, infecções parasitárias,
doenças cardíacas, problemas circulatórios, no tratamento da dor e algumas
ainda passam por avaliações pré-clínicas (LEE et al., 2006; MAHAPRADA,
BHARTI, ASATI, 2015).
Figura 4: Estrutura química da sofalcona (3a), metochalcona (3b) e
licochalcona A (3c)
O
O O
CH3
OH
O
CH3CH3
CH3O
(a)
OOCH3
O
CH3
OCH3
(b)
38
O
OH
OCH3
OH
CH2
CH3 CH3
(c)
A ação terapêutica de vários compostos pertencentes à classe das
chalconas e seus derivados sintéticos, tem sido incessantemente reportada por
diversos autores (CORRÊA et al., 2001; DOMINGUEZ et al., 2005;
NIELSEN et al, 2005; HSU et al., 2006; CAMPOS-BUZZI et al., 2006, 2007;
NOWAKOWSKA, 200; OZDEMIR et al., 2015; BHARTI, 2016; KAR et
al.,2017).
Entre as mais conhecidas ações pode-se citar a potente inibição do
crescimento de bactérias patogênicas comuns (NOWAKOWSKA, 2008;
BANDGAR et al., 2009; EL-SAWY et al., 2013; COSTA et al., 2016) e de
cepas resistentes a antibioticoterapia convencional (SIDDIQUI et al., 2011);
relevante atividade antifúngica (SIDDIQUI et al., 2011; MING et al., 2017);
atividade antiproliferativa (SOLOMON; LEE, 2012; FU et al., 2016) e
citotóxica contra diferentes células tumorais (EL-SAWY et al.,2013;
KURBAKOVA et al., 2015; ALCOLEA et al., 2016); inibição da enzima
xantina oxidase, que está envolvida na produção endógena de ácido úrico, ao
qual estão associadas algumas desordens metabólicas de produção anormal,
como gota e hiperuricemia, que podem levar ao desenvolvimento de doenças
renais crônicas e cardiovasculares; e inibição da enzima tirosinase, que
participa da biosíntese de melanina, intimamente ligada ao desenvolvimento
de melanomas (BANDGAR et al., 2012; MAHAPATRA, BHARTI, 2016).
Além destas, destacam-se também as atividades antimalarial, antileishmanial,
imunossupressiva, antituberculose, anti-inflamatória e analgésica
(CAMPOS-BUZZI, 2007; LIU et al., 2007; BANDGAR et al., 2009;
CORRÊA, 200; OZDEMIR et al., 2015; HE et al., 2017). Recentemente,
novos estudos mostram chalconas como promissores fármacos com atividade
cardiovascular (MAHAPATRA, BARTHI, 2016).
Considerando que dor e inflamação são problemas que afligem
grande parte das pessoas, é cada vez mais crescente a busca por novos
39
fármacos analgésicos e anti-inflamatórios. Quando submetidas a testes de
antinocicepção, algumas chalconas inibiram a dor inflamatória de forma
equivalente aos fármacos de referência e outras foram ainda mais ativas
(BOECK et al., 2006; CAMPOS-BUZZI, 2007; CORRÊA, 2008; SAXENA
et al., 200; LI et al., 2017).
Fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) são
terapeuticamente importantes no tratamentoda artritereumáticae vários outros
tipos decondições inflamatórias, entretanto seu uso é limitadoem função
deefeitos gastrointestinais indesejados. O mecanismo através do qual ocorre
esta atividade desempenhada por compostos chalcônicos ainda não está
totalmente elucidado, porém sugere-se que a inibição da ativação do fator de
necrose tumoral alfa (TNF-α) e outras citocinas e a supressão das enzimas
COX-2 e 5-lipoxigenase estejam envolvidas(SANDILANDS, BATEMAN,
2016; SMITH et al., 2017).
O mecanismo envolvendo a enzima COX-2 torna-se importante em
função da seletividade. De forma geral, os AINES inibem não seletivamente
duas isoformas da enzima ciclooxigenase, a COX-1 e a COX-2. A isoforma
COX-1 é responsável pela síntese de prostaglandinas citoprotetoras do trato
gastrointestinal, enquanto a isoforma COX-2 sintetiza as prostaglandinas no
processo inflamatório. Acredita-se que a inibição da COX-1 promova os
efeitos adversos gastrointestinais e a partir desta constatação iniciou-se a
busca pelos anti-inflamatórios seletivos. Entretanto, os anti-inflamatórios de
última geração (coxibes), dotados de alta seletividade, apresentaram
indesejados efeitos cardiovasculares (SANTOS, 2008; MAHAPATRA,
BHARTI, 2016 ).
Outra interessante possibilidade ao mecanismo de ação
desempenhado pelas chalconas e compostos delas derivados é a inibição do
TNF-α e da interleucina-6 (IL-6). Ambas são duas importantes citocinas pró-
inflamatórias multifuncionais envolvidas na patogênese de doenças
cardiovasculares, crônico-degenerativas e câncer, através de uma série de
vias de sinalização de citocinas (SINGH; ANAD; KUMAR, 2014; HAN et
al., 2017).
A ocorrência do câncer é de etiologia multifatorial, podendo ter
origem na combinação de vários fatores, incluindo os genéticos, ambientais,
clínicos e estilo de vida, que interagem entre si para produzir uma
determinada neoplasia. Todavia, observa-se que aproximadamente 25% dos
casos de câncer estão associados a infecções e inflamações crônicas
40
(HUSSAIN; HARRIS, 200; SUMAN et al., 2016). Algumas evidências
fortalecem essa relação, como por exemplo, a associação entre o
Helicobacter pylori e o câncer de estômago (LADEIRA et al., 2004), doenças
inflamatórias pélvicas e fatores relacionados á obesidade, no risco de
desenvolver câncer de ovário e cólon (LIN et al., 2011; GUNDERSON et al.,
2016) e os vírus das hepatites B e C com o carcinoma hepatocelular
(MICHIELSEN et al., 2005; HEMMING, BERUMEN, MEKEEL, 2016).
O TNF-α foi sugerido como alvo de ação para novas terapias
contra o câncer. Váriosestudos têm considerado o TNF-α endógenocomoum
agente auxiliador de desenvolvimento tumoral efator demetástase.Níveis
significativos deTNF-α foramencontrados nomicroambientetumoral de
vários câncereshumanos, incluindoos damama, ovário, próstata,
linfoma,melanoma eleucemia (SZLOSAREK et al., 2003MEHTA,
GRACIAS, CROFT, 2016).
Esta análise revela que compostos inibidores de TNF-αtêm uma
atividadedupla,comoanti-inflamatórios e como tratamentomaiseficaz contrao
câncer, onde acredita-se que possam atuaratravés de dois mecanismos,
diretamentematandoascélulas tumorais eindiretamente, suprimindo
oambienteinflamatório que apóia o desenvolvimento dotumor (BANBGAR
et al., 2010; GHANDADI et al., 2017; WANG et al.,2017).
Uma revisão contempando as atividades biológicas das chalconas,
foi publicada, enfatizando sua atividade antiinflamatória. Foi concluido, por
estudo estrutura-atividade, que os compostos assimétricos possuíam maior
atividade anti-inflamatória do que seus análogos (SINGH,
ANAND,KUMAR, 2014).
Ainda com base neste contexto, encontram-se relatos e revisão
importante na literatura de compostos chalcônicos ativos contra o
desenvolvimento de tumores renais, pancreáticos, pulmonares, mamários e
de cólon (BANBGAR et al., 2010; SOLOMON; LEE, 2012; VENTURELLI
et al., 2016). Compostos que além de efetivos na inibição da proliferação de
vários tumores, demonstram importante segurança, uma vez que sua
interferência sobre células saudáveis é significativamente menor
(SOLOMON; LEE, 2012; RAI et al.,2015; MADHAVI et al., 2017).
Assim como inflamações crônicas e o câncer, outra preocupação da
medicina atual é com a recém identificada síndrome metabólica, que passou
a ser uma dasprincipais causas demortalidade etornou-seum grande desafioà
saúde global do século XXI.Ela está associada avários fatores de risco de
41
origem metabólica que se encontram interrelacionados, como a resistênciaà
insulina, obesidade, diminuição da tolerância à glicose, diabetes do tipo2,
dislipidemia aterogênica (altos níveis de LDL-colesterol e triglicéridos e
baixos níveis de HDL-colesterol), pressão arterialelevada, estado pró-
inflamatório e pró-trombótico.Como consequencia, taismodificações
metabólicaslevam aum aumento acentuadodo risco cardiovascular, elevando
em 2,5 vezes a taxa de mortalidade nesta população (PENALVA, 2008;
ZHONG et al., 2015; TUNE et al.,2017).
Pesquisas demonstram a interessante atividade desempenhada por
duas chalconas frente a alguns fatores que contribuem para o
desenvolvimento desta síndrome. Xantohumol (figura 5b), uma chalcona
isolada da espécie vegetal Humulus lupulus demonstrou importante
diminuição da formação de LDL-colesterol e triglicerídeos, através da
inibição da enzima colesterol éster transferase, que catalisa a transferência de
colesterol entre as lipoproteínas (HIRATA et al., 2012). Esta chalcona
também mostrou recentemente, atividade preventiva da trombose venosa (
XIN et al., 2017). Já a licochalcona E (figura 5a), isolada de plantas da espécie
Glycyrrhiza demonstrou atividade biológica através da redução de índices
lipemicos e glicêmicos em ratos diabéticos. Acredita-se que esta redução
esteja relacionada a estimulação do receptor ativado por proliferadores de
peroxissoma gama (PPAR), o qual desempenha um papel fundamental no
metabolismo da glicose e lipídios, através da diferenciação dos adipócitos
(PARK et al., 2012).
Figura 5: Estrutura química da licochalcona E (a) e xantohumol (b).
O
OH
OCH3
OH
CH3
CH3
CH2(a)
O
CH3
CH3 CH3
OH O
CH3
OH
(b)
Outro estudo interessante traz a sintetize de moléculas híbridas
contemplando traços estruturais importantes na atividade sobre os lipídios,
desempenhada por moléculas conhecidas como a licochalcona A,
42
xantohumol, esculetina (figura 6a), e benzafibrato (figura 6b). O híbrido
construído diminuiu os níveis de colesterol total, fosfolipídios e triglicerídeos
de ratos hiperlipêmicos em 26, 24 e 25%, respectivamente (SASHIDHARA
et al., 2013).
Figura 6: Estrutura química da esculetina(a) e benzafibrato(b).
OOH
OH
O
(a)
Cl
CH2
NH
OCH3
CH3
O
OH(b)
Recentemente, um estudo demonstrou que chalconas possuem
potencial para atuação contra a Amebíase, doença devastadora do trato
gastrointestinal, causada por um parasita protozoário Entamoeba histolytica.
Vários devirados de chalcona demonstraram efeito superior ao fármacado de
referência utilizado para o tratamento (ZAIDI et al., 2015).
Outra questão que impulsiona a pesquisa de fármacos inovadores é
a prevalência de infecções e o consequente consumo de antimicrobianos para
tratá-las. Com base neste contexto é cada vez mais crescente a busca por
novas alternativas seguras e eficazes para curar tais enfermidades. Diante
disso, cabe ressaltar o efeito de alguns compostos chalcônicos, os quais
apresentaram atividade contra bactérias patogênicas Gram-positivas, como
Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus e Gram-negativas, como
Escherichia coli e Salmonela typhimurium (KONDURU et al., 2013;
SUWITO et al., 2016).
Entretanto, o uso descontrolado de agentes antibacterianos
promoveu o que conhecemos como resistência microbiana, ou seja, o
aparecimento de cepas de microrganismos que são capazes de se multiplicar
na presença de concentrações medicamentosas mais altas que as doses
terapêuticas comumente utilizadas na clínica. Atualmente procuram-se
alternativas para o tratamento de infecções causadas por um patógeno
potencialmente fatal, o Staphylococcus aureus resistente a meticilina
(MRSA), causador de graves infecções de pele e pneumonia, adquiridas tanto
em ambiente hospitalar quanto na comunidade. Chalconas com diversos
43
substituintes foram testadas in vitro contra estas cepas resistentes e
apresentaram atividade tanto quando testadas isoladamente ou combinadas
com antibióticos já utilizados clinicamente (NIELSEN et al., 2005; TRAN et
al., 2012; COSTA et al.,2016; FU et al., 2016; SANTOS et al., 2017).
Desde 1940, quando o potencial biológico das chalconas começou
a ser explorado, o número de publicações científicas que tem o núcleo
chalcônico e suas variações, como alvo de pesquisa, cresce
exponencialmente, proporcionando maior conhecimento a respeito da estreita
relação estabelecida entre a estrutura química dos derivados e a atividade
biológica que desempenham (NI et al., 2004; MAHAPATRA, BARTHI,
2015). Os estudos clínicos provaram a sua excelente biodisponibilidade e
tolerância no corpo humano. Portanto, laboratórios de pesquisa de diversos
locais do mundo estão centrando-se sobre a síntese de diferentes análogos de
chalcona para o desenvolvimento de novos fármacos (SINGH; ANAD;
KUMAR, 2014).
3.3 Heterociclos e derivados furânicos
Os heterociclos possuem grande importância dentro da química
orgânica. Tais estruturas são compostos orgânicos cíclicos que contemplam
no anel um ou mais distintos átomos, além do carbono, os quais recebem o
nome de heteroátomos. Os principais elementos que figuram como
heteroátomos são nitrogênio, enxofre e oxigênio (QUIN; TYRELL, 2010).
Dentre oscerca de 20milhões de compostosquímicosidentificadosaté
o finaldo segundo milenio, os heterocíclicosestão presentes
emaproximadamente metade. Diversos sistemas que comportam heterociclos
têm suas atividades farmacológicas amplamente investigadas, como é o caso
das piridinas, piperidinas, piperazinas, pirrolidinas, imidazóis, pirazóis,
indóis, β-lactâmas e aziridinas (DUA et al., 2011; TAYLOR et al., 2010;
SARVESWARI et al., 2015).
Heterociclos configuram unidades estruturais comuns nos
medicamentos e permanecem extremamente importantes no processo de
descoberta de novos fármacos. Estima-se que mais de 80% dos fármacos
vendidos nos Estados Unidos, em 2010, contemplem pelo menos um
fragmento heterocíclico em suas estruturas (GOMTSYAN, 2012).
Em função dos heterociclos serem elementos centrais de uma vasta
gama de substâncias de origem natural, algumas até participantes em reações
químicas do nosso organismo, tais como ácidos nucleicos, aminoácidos,
44
carboidratos, vitaminas e alcalóides, os esforços da química medicinal
evoluiu em torno da mimetização de tais estruturas (DUA et al., 2011). Além
do mais, com a inserção de heterociclos, certas propriedades moleculares,
como potência e seletividade, podem ser moduladas, pois através de
substituições bioisostéricas se torna possível adequar lipofilicidade,
polaridade e solubilidade do composto (ZHANG, 2017).
O fato dos heterociclos serem capazes de empregar maior potência
e seletividade pode, em muitos casos, ser explicado por sua capacidade em
promover pontes de hidrogênio com proteínas presentes no alvo terapêutico.
Dependendo da estrutura do heterociclo, ele pode se comportarcomo aceptor
ou doador de prótons. A notável capacidade de núcleos heterocíclicos
servirem como unidades reativas contribue largamente para o seu valor como
tradicionais unidades-chave de diversos fármacos (BRONTRÖM et al., 2012;
ZHANG, 2017).
O furano é um composto heterocíclico aromático de cinco
membros contendo um átomo de oxigénio, na sua estrutura cíclica insaturada.
(QUIN TYRELL,2010). A aromaticidade do furano resulta do fato do átomo
de oxigênio possuir dois pares de elétrons livres, sendo que um destes pares
fará parte do sistema de aromaticidade, enquanto o outro ficará no plano do
anel, em um orbital sp2. O anel furânico possui estruturas de
ressonânciarepresentadas na (figura 5). Quando comparado ao benzeno, o
anel furânico possui uma densidade eletrônica π em cada carbono superior
(JOULE, MILLS, 2010).
Figura7: estruturas de ressonância do anel furano
O furano apresenta um papel importante na química orgânica.A
estrutura do anel de furano pode ser encontrada numa vasta gama de
compostos de origem natural, fármacos, têxteis, tintas, e cosméticos. Entre os
exemplos, podemos citar o café, óleo de rosa e mentol (THEOPHIL, 2004).
Uma revisão publicada em 2012, por BERNEJEE e colaboradores,
mostra diversos fármacos, atualmente utilizados na terapêutica, que possuem
o anel furânico. Destaque para aqueles que possuem atividade anti-
inflamatória. Entre eles, pode-se destacar o Rofecoxib (Figura 8a),
45
utilizado para tratar a osteoartrite, condições de dor aguda e dismenorréia
Como relaxante muscular, podemos citar o Dantrolene (Figura 8b),que atua
abolindo o acoplamento excitação-contração em células musculares,
recentemente retirado de circulação por preocupações de segurança sobre o
aumento do risco de ataque cardíaco e acidente vascular cerebral. Na classe
de bloqueadores alfa-adrenérgicos, temos o exemplo do fármaco
Prazosin(Figura 8c), utilizado para hipertensão. Pertencendo a classe dos
anti-diuréticos, podemos citar a Furosemida(Figura 8d). Com comprovada
atividade antiarritmica e muito utilizado atualmente, temos o exemplo do
fármaco Amiodarona(Figura 8e). Com atividade antimicrobiana, a
Cefuroxima(Figura 8f), que é um antibiótico de segunda geração de
cefalosporina. Na classe de atividade esteroidal, temos o exemplo da
Mometasona(Figura 8g), esteróide glicocorticóide usado topicamente para
reduzir a inflamação da pele ou nas vias aéreas.Também podemos citar a
Ranitidina(Figura 8h), antagonista de receptores de histamina H2 que inibe a
produção de ácido estomacal.
46
Figura 8: Medicamentos contendo anel furânico
SO
O
CH3
O
O
O
N+
O-
O
N
N
NH
OO
N N
CH2
O
N
N
NH2
OCH3
O
CH3
NHO
Cl
O OH
S
O
O
NH2
CH3
O
O
N
CH3
CH3
N
S
OHO
O
O
NH2
CH2
O
ON
O
CH3
O
CH3
Cl
OH
CH3
OCl
O O
O
ONCH3
CH3
S
NH NHCH3
N+
O-
O
a b c
d e f
g h
Legenda: a – Rofecoxib; b - Dantrolene; c - Prazosin; d - Furosemida; e
- Amiodarona; f - Cefuroxima; g - Mometasona; h – Ranitidina
As chalconas também podem ser precursoras de uma série de
heterociclos nitrogenados. Esta química de heterociclos é considerada uma
das mais impotantes na descoberta de novos fármacos, pois um grande
número de fármacos sintéticos possui em sua estrutura anéis heterocíclicos
(PRATYUSHA, et al., 2013; ZHANG, 2017).
Atualmente, vários estudos de relação estrutura-atividade de
compostos heterocíclicos,derivadosde chalcona,são relatados na literatura
(HWANG et al., 2012; MING et al.,2017). Entre as propriedades
farmacológicas atribuídas às heterochalconas, encontramos a atividade
citotóxica contra células leucêmicas. Estes estudos indicam que a presença
de heterociclos em substituição ao anel aromático convencional proveniente
do benzaldeído contribuiu positivamente para a atividade dos compostos
(BANDGAR et al., 2009; CORDEIRO, 2010; BANDGAR et al., 2012).
47
Outros trabalhos avaliaram a atividade antimicrobiana de pirazoil
chalconas e pirazolinas delas derivadas. Nestes estudos todos os compostos
foram ativos contra bactérias Gram-positivas (Estreptococos pyogenes,
Staphylococcus aureus - MRSA coagulase positiva), Gram-negativas
(Pseudomonas aeruginosa, Klebisiella pnemoniae e Escherichia coli) e
fungos (Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Trycophyton
mentagrophytes e Penicillium marneffei) e algumas moléculas foram,
inclusive, mais potentes que os antibióticos ciprofloxacino, griseofulvina e
fluconazol, atuais escolhas para o tratamento dos microrganismos
selecionados (SIDDIQUI et al., 2011).
3.4 Parâmetros de avaliação in sílico
Nos primeiros estágios de desenvolvimento dos fármacos, é
amplamente reconhecido pela indústria farmacêutica a importância dos
estudos e propriedades ADMET, os quais se referem aos parâmetros de
absorção (A), distribuição (D), metabolismo (M), excreção (E) e toxicidade
(T). Assim, com o intuito de filtrar e selecionar compostos que possam ter
características necessárias para futuros fármacos, diversos parâmetros físico-
químicos são avaliados, como Lop P, massa molar, entre outros (YUNES;
CECHINEL-FILHO, 2012).
A disponibilidade de programas computacionais de química e os
bancos de dados em rede são, atualmente, instrumentos fundamentais para a
descoberta e o planejamento de fármacos. Assim, ferramentas como
PASSonline, Osiris Property Explore, preADMET e Molinspiration são
programas de acesso livre que auxiliam na determinação de propriedades
farmacocinéticas, permitindo a análise in sílico da atividade biológica versus
as propriedades químicas das moléculas de interesse (CARVALHO, et al.,
2003; ALAFEEFY et al., 2012). Estas técnicas de screening virtual estão
sendo amplamente utilizadas, pois permitem analisar problemas de absorção,
distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET) (YUNES;
CECHINEL-FILHO, 2012).
O software Molinspiration possibilita a execução do cálculo de
alguns parâmetros sugeridos por Lipinski e colaboradores (1997). De acordo
com Lipinski, existem alguns preditores da biodisponibilidade oral, tais
quais: peso molecular menor do que 500 daltons, LogP menor que 5
(indicador que expressa a lipofilicidade), número de grupos doadores de
ligação de hidrogênio menos ou igual a cinco (soma de OH e NH na
48
molécula); máximo de dez grupos de aceptores de ligação de hidrogênio
(expresso pela soma de átomos de N e O). Esses parâmetros tidos como
físico-químicos foram também associados com a solubilidade em meio
aquoso, bem como com a permeabilidade intestinal e caracterizam os
primeiros passos para uma boa biodisponibilidade oral. Essa condição é
conhecida como “regra dos cinco”, porque para cada um dos parâmetros os
valores encontrados têm como limites múltiplos de cinco (LIPINSKI, 2004).
Essas regras foram ampliadas, sendo possível identificar outros
parâmetros importantes, como o número de ligações rotacionáveis, que deve
ser menor ou igual a 10, e a área de superfície topológica polar (TPSA) que
deve ser expressa por um valor menor ou igual a 140 Å (LIPINSKI, 2004).
A utilização da ferramenta PreADMET corrobora os dados
calculados no programa Molinspiration, pois permite calcular um valor
importante na caracterização de uma boa disponibilidade oral, o HIA
(absorção intestinal humana). A absorção intestinal humana vem a ser a
primeira barreira que deverá ser ultrapassada por um fármaco. Outra
característica relacionada ao estudo de HIA é a lipofilicidade dos fármacos,
que apresenta relação direta com a permeabilidade da membrana. Assim,
substâncias lipofílicas possuem a passagem facilitada através da bicamada
lipídica, acessando seu respectivo sítios e ligação. Para avaliação de HIA são
considerados os seguintes valores de absorção: 0 a 20% baixa absorção, 20 a
70% absorção moderada e 70 a 100% alta absorção (HOU et al., 2007).
PreADMET também prediz valores para BHE (Barreira
hematoencefálica). Compostos que apresentam como alvo o sistema nervoso
central (SNC) devem ser capazes de ultrapassar esta barreira, a fim de exercer
sua atividade. Contudo, caso o alvo não seja o sistema nervoso central, esta
passagem pode levar a muitos efeitos colaterais. Para BHE são considerados
os seguintes valores: acima de 2,0, compostos com alta absorção, entre 2,0 e
0,1, compostos com média absorção e abaixo de 0,1 compostos com baixa
absorção (ABREU, 2008).
A ferramenta computacional PASSonline (do inglês PASS
“Prediction of Activity Spectra for Substances”) é utilizada para pré-
estabelecer os potenciais alvos biológicos de uma molécula, prevendo,
simultaneamente, vários tipos de atividades similares a fármacos “drug-like”
de diferentes classes químicas, com base em suas fórmulas estruturais. Para
isso, o programa comporta aproximadamente 3600 atividades que podem ser
avaliadas. Ainda, este servidor estima possibilidades não apenas para o efeito
49
farmacológico desejável, mas também mecanismos de ação moleculares,
efeitos tóxicos e adversos, interações com enzimas metabólicas e
transportadores, influência sobre expressão gênica, etc. (PASSonline, 2016).
Para os cálculos de PASS, são utilizados dois parâmetros: Pa, que
indica a probabilidade do composto ser ativo e Pi, que indica a probabilidade
do composto ser inativo (Pi), sendo que os valores de Pa e Pi podem variar
entre 0,000 a 1,000, em geral Pa+ Pi<1, uma vez que estas probabilidades são
calculadas de forma independente (PASSonline, 2016).
3.5Docking molecular
Docking molecular, também conhecido como atracamento ou
ancoragem molecular, é usualmente definido como uma técnica que permite
a predição da estrutura do complexo formado entre um receptor e um ligante.
O receptor normalmente será uma proteína, um monômero da proteína ou um
segmento de DNA, e o ligante, uma molécula pequena ou uma outra proteína
(BROOIJMANS; KUNTZ, 2003). O docking molecular tem sido, uma das
ferramentas utilizadas para estudar esta formação de complexos receptor-
ligante, sendo, a análise dos mesmos, realizada sob o ponto de vista da
química supramolecular (CARACELLI et al., 2010, swa et al., 2010, SENG
et al. 2008, CUNHA et al., 2006).
Um programa de docking molecular, será sempre dependente de
duas peças chave para a obtenção do sucesso em seu objetivo: um algoritmo
de busca dos graus de liberdade configuracionais e conformacionais possíveis
para a formação do complexo e uma função fitness ou função de ajuste, capaz
de buscar o melhor cenário de energia potencial, avaliando a
complementaridade estérica e química entre o ligante e o receptor, em detalhe
suficiente para encontrar o mínimo global de energia para o complexo
formado (BROOIJMANS; KUNTZ, 2003).
Os estudos por simulação computacional de docking molecular
permitem obter o melhor ajuste entre duas estruturas tridimensionais,
tornando possível prever a estrutura de complexos e/ou adutos formados entre
macromoléculas, o receptor, e outra molécula (inibidor, substrato, etc.), o
ligante. No caso presente, entre a proteína COX-2 (o receptor) e os ligantes
selecionados por demonstrarem capacidade in vitro de inibir a atividade da
proteínaciclooxigenase.
50
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Síntese
As chalconas foram sintetizadas segundo uma derivação do
método geral de condensação aldólica de Claisen-Schmidt (CORRÊA et al.,
2001; CAMPOS-BUZZI et al., 2007; CORRÊA , 2008).
Para a síntese foi utilizado uma mistura equimolar de benzaldeídos
e acetofenonas (substituídos ou não) dissolvidos em etanol, na presença de
hidróxido de sódio a 10%. Segundo o método, a solução permaneceu em
agitação mecânica por 24 horas, ou até o ponto em que não for mais possível
se agitar a mistura (devido à formação de precipitados). Como forma de
confirmar o efetivo término da reação, a formação do produto reacional é
acompanhada por cromatografia de camada delgada. Os produtos
reacionaisforam filtrados à pressão reduzida e lavados, sucessivas vezes, com
água destilada fria, até que as águas de lavagem se apresentassem neutras ao
teste de pH. A utilização de ácido clorídrico diluído,eventualmente, foi
adotada, na lavagem do produto final. Os produtos isolados foram secos sob
vácuo, na presença de pentóxido de fósforo.
4.1.2 Procedimentos de isolamento e caracterização estrutural
O acompanhamento das reações durante os procedimentos
reacionais, bem como a pureza preliminar dos compostos, utilizando-se,
como comparação, os padrões dos reagentes, foi realizado por cromatografia
de camada delgada. Os procedimentos de purificação foram os usuais, por
recristalização com etanol. A caracterização de todos os compostos
sintetizados foi realizada por meio de ponto de fusão, espectroscopia no
infravermelho, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de
hidrogênio 1 e carbono 13e LCMSMS(NIQFAR/UNIVALI). Também foi
realizada análise elementar (C, H e N), através de equipamento Emental
Analyser Perkin-Elmer 2400 Series II (Departamento de Química, USP).
Na técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) foram
utilizadas placas pré-revestidas de sílica gel, com indicador de fluorescência
(F254), em folhas com base de alumínio, Merck. Em todos os procedimentos
cromatográficos foram utilizados gradientes do sistema de solventes
hexano/:acetato de etilaou benzeno:clorofórmio. Os solventes utilizados
51
foram adquiridos comercialmente das marcas Aldrich, Vetec e Merck. Os
compostos foram visualizados como manchas (spots) através de luz UV de
ondas curtas (254 nm) e ondas longas (360 nm). Para a recristalização dos
compostos foram utilizados procedimentos usuais de laboratório, envolvendo
diferentes solventes.
Os pontos de fusão dos compostos obtidos, foram determinados de
forma direta, com equipamento digital Microquímica APF-301, não
necessitando correção por curva de calibração.
As análises elementares foram conduzidas segundo ométodo de
Pregl-Dumas, em que as amostras são sujeitas à combustão, em atmosfera de
oxigênio puro, e os gases resultantes do processo de combustão são
quantificados por condutividade térmica (detector de TCD).
As análises espectrométricas no infravermelho foram realizadas em
espectrômetro interfotométrico por transformada de Fourier, IR-PRESTIGE
21(SHIMADZU, Tokyo, Japan), pelo método de refletância difusa – DRS,
utilizando suportes circulares em alumínio, com 3,0X2,0 mm (diâmetro
interno X altura) e diluindo as amostras em brometo de potássio (KBr) de
grau espectroscópico. Os espectros foram obtidos registrando transmitância
versus número de onda (cm-1) e foram corrigidos pelo algoritmo Kubelka
Munk.
Os espectros de RMN1H e RMN13C foram obtidos em espectrômetro
de ressonância magnética nuclear Bruker DPX-300 - Advance (Bruker,
Karlsruhe, Germany). Os deslocamentos químicos foram expressos em
valores adimensionais (δ = ppm) em relação a um padrão de referência de
tetrametilsilano (TMS). Foi utilizado o solvente deuterado dimetilsulfóxido-
d6, adquirido comercialmente. As constantes de acoplamento (J) foram
expressas em Hertz (Hz). As multiplicidades dos sinais foram indicadas como
segue: s=simpleto, d=dupleto, dd=duplo dupleto, t=tripleto e m=multipleto.
A visualização foi realizada no programa ACDSpec Manager 10.08 e Bruker
TopSpin 5.0.
4.2 Análise in sílico: Cálculos teóricos computacionais
Os valores de peso molecular (PM), Log P, aceptores de ligação
de hidrogênio (N + O) e doadores de ligação hidrogênio (NH + OH), TPSA
e nrotb, foram obtidos a partir do programa freemolinspirationline, por meio
52
do JME Editor, cortesia de Peter Ertl da Novartis, disponível no site:
http://www.molinspiration.com.logi-bin/propeties.
No presente trabalho, foram utilizados os dados referentes à MIPC
(calculadora da propriedade Molinspiration), programa que permite o cálculo
interativo das propriedades moleculares, bem como a geração de tabelas com
dados utilizados nos estudos de relação estrutura e atividade.
Onde LogP (miLogP) é chamado de coeficiente de partição etanol/água,
sendo utilizado na análise de hidrofobicidade de uma molécula. LogP foi
calculado pela metodologia desenvolvida pelo Molinspiration por meio de
uma soma de contribuições tendo como base fragmentos e fatores de
correção, estes dados foram obtidos a partir do LogP calculado e o LogP
experimental de um conjunto de aproximadamente dose mil moléculas. Desta
forma, foram obtidos valores de hidrofobicidade para 35 pequenos
fragmentos moleculares e 185 valores pra fragmentos moleculares maiores.
TPSA é conhecido como área de superfície topológica polar, sendo
calculado com base na metodologia publicada por Ertl e colaboradores, 2012.
Resumidamente, o procedimento baseia-se no somatório de contribuições de
superfície de fragmentos polares já tabulados.
O cálculo de volume molecularé baseado na soma das contribuições de
fragmentos em 3D de cerca de doze mil moléculas que tiveram suas
geometrias moleculares em 3D atribuídas. Estes dados foram otimizados por
meio do método computacional AM1 semi-empírico.
Dados de peso molecular menor ou igual a 500, número de ligação
de aceptores de hidrogênio menor ou igual a 10, e o número de doadores de
ligação de hidrogênio menor ou igual a 5, também são obtidos através do
programa. Para flexibilidade molecular utiliza-se o cálculo denúmero de
ligações rotacionáveis(NROTB). Este parâmetro topológico simples é
medido através da flexibilidade molecular.
Para os cálculos de absorção intestinal (HIA), barreira
hematoencefálica (BHE), foi utilizado o site https://preadmet.bmdrc.kr/
(ferramenta PreADMET). O aplicativo é escrito principalmente em PHP,
uma linguagem de script comumente utilizado para aplicativos Web que se
comunica com o navegador por meio de uma interface CGI. O código PHP,
por sua vez, utiliza um conjunto de programação C que implementa grande
parte da funcionalidade do PreADMET, econsiste em:
1. Cálculo de descritores moleculares: As propriedades ADME/Tox estão
intimamente relacionados com descritores físico-químicos, tais como
53
lipofilicidade (log P), peso molecular, área de superfície polar e
solubilidade em água. Estes cálculos são realizados através do modulo
TOPOMOL, capaz de calcular mais de 2500 descritores moleculares
incluindo descritores constitucionais, eletrostáticos, físico-químicos e
geométricos a partir das estruturas químicas 2D e 3D.
2. Predição de similaridade a fármacos (drug-likeness): a regra mais
conhecida que relaciona as estruturas químicas com atividades biológicas
é a regra de Lipinski, ou "regra dos cinco". Outra regra bem conhecida é
a regra de líder-similar (lead-like) ou seja, a partir de levantamento
quantitativo baseado em 18 líderes e pares de estruturas de fármacos.
3. Predição ADME: vários métodos in vitro têm sido utilizados no processo
de seleção de fármacos para avaliar a absorção intestinal de candidatos a
fármacos. Entre eles, o modelo de células Caco2 e MDCK (Madin-Darby
rim canino) têm sido recomendados como parâmetros de modelos in vitro
para a predição de absorção oral de fármacos. Adicionalmente, o modelo
in sílico de absorção intestinal humana (HIA) e o modelo de
permeabilidade na pele podem predizer e identificar fármacos potenciais
para liberação oral ou transdérmica. Na distribuição, a penetração na
barreira hematoencefálica (BHE) pode fornecer informações sobre a
terapêutica do composto estudado no sistema nervoso central (SNC),
modelo de ligação às proteínas plasmáticas na sua disposição e
eficácia. A fim de construir esses modelos QSAR, a aproximação
funcional genética é usada para selecionar os descritores relevantes entre
todos os descritores 2D calculados pelo módulo Topomol, seguido pela
rede neural de retropropagação resiliente (Rprop) para desenvolver um
modelo não linear bem sucedido.
Para estabelecer os principais alvos biológicos dos compostos
estudados, foi utilizada a ferramenta PASSonline a partir do site :
http://www.pharmaexpert.ru/passonline/index.php.
Este software é formado por um conjunto de mais de 260.000
compostos biologicamente ativos, incluindo fármacos comerciais, candidatos
a fármacos, compostos tóxicos e compostos de chumbo. Estes dados são
obtidos a partir de fontes diversas como patentes, bancos de dados, etc.
Os resultados são emitidos a partir de um cálculo que trabalha com
os dados de MNA (Multilevel Neighborhoods of Atoms), gerados com base
em uma tabela de conexão apresentada pelo programa, por meio de
aproximação topológica, onde a estrutura da molécula é representada pelo
54
conjunto de vizinhos e de níveis de descritores de átomos calculados de forma
interativa. O cálculo é baseado na abordagem Bayesiana, em que, para cada
tipo de atividade prevista, a base estrutural da molécula é representada pelo
seu conjunto de descritores MNA.
Após a análise quantitativa, feita por meio do programa, pode-se
obter uma resposta qualitativa, ("sim / não").Vale ressaltar que o programa
faz uma predição, que pode ser ou não encontrada nos testes realizados.
Portanto, o espectro de atividade previsto é apresentado em PASS, pela lista
de atividades, com probabilidades "ser ativo" Pa ou "ser inativo" Pi. Esta
lista é organizada em ordem de P um descendente - P i assim, as atividades
mais prováveis são colocadas no topo da lista. Todas as atividades incluídas
na base de dados de SAR são previstos com P a> P i. Estas duas interpretações
das probabilidades P A e P i são equivalentes e podem ser usadas para a
compreensão dos resultados da previsão.
Ou seja, resumidamente para os cálculos de PASS, os valores de
Pa e Pi podem variar entre 0,000 a 1,000, em geral Pa+ Pi<1, onde os valores
de Pa devem estar acima dos valores dePi para caracterização de atividades
dos compostos analisados. Quanto mais próximo a 1, mais ativo o composto,
é claro que esta atividade é dependente de Pi, pois se este valor de inatividade
for muito próximo de Pa, acabará influenciando no resultado final. .
4.3Avaliação da atividade antiproliferativa:
O teste para avaliação da proliferação celular foi realizado no
Departamento Biotecnologia Vegetal de Plantas Medicinais da Universidade
de Ribeirão Preto, sob a supervisão do Prof. Dr. Mozart de Azevedo Marins.
O ensaio para avaliação da proliferação celular foi realizada
utilizando o métododo brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazólio (MTT), no qual o mesmo é reduzido a cristais púrpuros de
formazan pela mitocôndria de células viáveis(MOSMANN, 1983).
As células da linhagem de osteossarcoma humano (U2OS) foram
cultivadas em placas de 96 poços em uma concentração de 1x104 células por
poço, durante um período de 24 horas e aclimatadas a 5% de CO2 com
temperatura de 37ºC para aderência. Após este período, os compostos de
interesse foram diluídos nas concentrações desejadas e aplicados na
microplaca. Foi utilizado o DMSO 0,5% com controle negativo e a
doxorrubicina (Sigma-Aldrich®) como controle positivo. Após 24 horas de
tratamento, o meio da placa foi retirado e adicionado meio fresco em conjunto
55
com 20 µL de MTT (5 mg/ml) (Sigma-Aldrich®) por poço, por um período
de incubação de 3 horas a fim de favorecer a transformação do sal de MTT
em formazan, um cristal de coloração violeta, processo que ocorre nas
mitocôndrias pela ação da enzima succinato desidrogenase. Para
sedimentação dos cristais, a placa foi centrifugada a 4000 g por 5 minutos, o
sobrenadante descartado e adicionado 200 µl de DMSO para solubilizar os
cristais de formazan, seguindo por mais 1h de incubação para solubilização
dos cristais.
Após este período foi feita a leitura da absorbância em leitor de
espectrofotômetricono comprimento de onda de 550 nm. Os ensaios foram
conduzidos em três experimentos independentes e os dados obtidos são
representados como a porcentagem de inibição (media e desvio padrão) em
relação ao controle.
Inibição da viabilidade celular (%) = (1–[média absorbância do poço
experimental/média absorbância do poço controle negativo) ] x 100.
4.4Ensaio imunoenzimático, avaliação do efeito inibitório:
O ensaio imunoenzimático foi realizado pela aluna Gerusa
Werlang Rizzi.
As moléculas sintetizadas foram submetidas a ensaios in vitro para
a determinação da atividade inibitória para COX-1 e COX-2 através do kit
para ensaio imunoenzimático COX (ovine) Inhibitor Screening Assay Kit (no
560101, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI , EUA).
Todas as análises foram realizadas em triplicata. Para o grupo
controle, foi selecionado o fármaco Celecoxibe®, que possui atividade
seletiva para COX-2 e é tido como controle positivo, neste tipo de ensaio.
As chalconas testadas e o fármaco controle foram inicialmente
dissolvidos em DMSO.Após dissolução, foram preparadas as soluções
iniciais, na concentração de 100µM/ml, através da adição de 960µL de
solução tampão (0,1M Tris-HCl pH 8,0 contendo 5mM de EDTA e 2mM de
fenol), 10µL das enzimas COX-1 ou COX-2 (origem ovia), 10µL de heme e
10µL das soluções obtidasdas chalconas sintetizadas e do controle
(Celecoxibe).
Cada reação foi incubada por 5 minutos a 37°C.Posteriormente,
foi adicionado 10µL de ácido araquidônico (AA), na concentração de
56
100mM. A reação foi bloqueada após 2 minutos pela adição de 10µL de
ácido clorídrico (HCl), na concentração de 1M. Os tubos foram retirados do
banho maria e adicionado, a cada um, 20µL de cloreto de estanho (SnCl2).
A ciclooxigenase catalisa o primeiro passo na biossíntese de ácido
araquidônico (AA) para prostaglandina H2 (PGH2). A prostaglandina F2α
(PGF2α), produzida a partir de PGH2, por redução com cloreto de estanho, é
medida por meio do ensaio Imunoenzimático (EIA) . Este ensaio baseia-se
na competição entre as prostaglandinas (PG) e um conjugado PG-
acetilcolinesterase (PG-marcado) em uma quantidade limitada de anti-soro
PG. A quantidade de um conjugado PG- acetilcolinesterase, que é capaz de
se ligar ao anti-soro PG, é inversamente proporcional à concentração das PGs
nos poços. Uma vez que a concentração do conjugado PG-acetilcolinesterase
é mantida constante, enquanto a concentração das PGs testadas varia,
conforme a capacidade de inibição de cada composto.
Durante a incubação, o conjugado PG-acetilcolinesterase se liga
ao anticorpo monoclonal previamente ligado ao poço. A placa foi lavada e
em seguida, 200µL do reagente de ellman, que contém o substrato para a
acetilcolinesterase, foi adicionado ao poço. A leitura da reação foi realizada
por ELISA a 405 nm, após 1 hora de incubação, no escuro, sob agitação
(Figura 9).
A intensidade da cor produzida é diretamente proporcional à
quantidade de prostaglandinas presente nas amostras ou controles.
A porcentagem de inibição foi calculada pela comparação dos
poços tratados, com os compostos em estudo ou com os controles
(Celecoxibe), com a ligação máxima para COX-2. A concentração que
provoca 50% de inibição (CI50 uM/ml) foi calculada, para cada composto, a
partir da curva de resposta (concentração-inibição). Os ensaios foram
realizados em triplicata.
4.5 Análise do docking molecular
O análise do docking molecular foi realizado pelo alunoThales
Uchoa da Costa Sobrinho.
4.5.1 Ferramentas de Dockinge Banco de Dados:
O docking foi realizado utilizando ArgusLab 4.0.1., algoritmo
ArgusDock em que o ligante se comporta como flexível. Por meio do RSCB
57
Protein Data Bank – Banco de dados de proteínas, obteve-se a estrutura da
enzima Cyclooxygenase-2 (3LN1) complexada com inibidor seletivo
Celecoxibe.
4.5.2 Planejamento e Modelagem Energética do Ligante:
Todos os ligantes foram desenvolvidos pelo espaço de trabalho do
ArgusLab 4.0.1., sendo estes submetidos a posterior otimização geométrica
por pacotes de aproximações hamiltoniana como mndo (modified neglect of
diatomic differential overlap) e pm3 (método paramétrico), observadas pela
mecânica quântica.
4.5.3Docking com ArgusLab:
Após a separação da estrutura da COX-2 em cadeias, selecionou-
se os aminoácidos que caracterizam o sítio ativo da enzima presente na cadeia
A. Determinando estes como sítio de acoplamento realizou-se sucessivos
dockings no volume da caixa delimitadora de sítio ativo. Após iniciado o
docking, foram gerados grids (grades), com dados das forças de interações
intermoleculares das moléculas presentes na enzima, numa resolução de 0.4
ângstron. Utilizou-se mecanismo ArgusDock para obtenção da energia de
docking, com precisão regular, admitiu-se o ligante como flexível em número
máximo de 150 poses, sendo selecionadas e apresentadas pelas menores
energias.
4.5.4 Docking com Glide (Plataforma Maestro) para obtenção de
imagens
Na plataforma Maestro, a enzima COX-2 (3LN1) foi importada
através do PDB e preparada pela ferramenta Protein Preparation Wizard,
onde foram feitas correções quanto aos hidrogênios e realizadas ligações de
dissulfeto. Modificações e correções foram realizadas no receptor, sendo
deletadas as cadeias B, C e D e seus resíduos pertencentes. A preparação da
COX-2 foi finalizada com a remoção de águas e minimização de sua
estrutura.
Para os ligantes foi realizada preparação com LigPrep, utilizando
pacote Force Field OPLS (Optimized Potentials for Liquid Simulations),para
a obtenção da conformação mais estável.
58
Utilizando o inibidor seletivo complexado celecoxibe, produziu-
se grids do sítio ativo na cadeia A por meio da ferramenta Grid Generation.
Utilizando a ferramenta Glide, foram realizados os dockings com o ligante
flexível sendo obtidas as imagens 3D das melhores poses e 2D da interação
do ligantes com os aminoácidos do sítio ativo.
4.6 Análise estatística
Os resultados obtidos no teste para avaliação da atividade inibitória
sobre a COX-1 e COX-2 foram expressos como a média ± erro padrão da
média (EPM). O ensaio foi realizado em duplicata. A análise estatística foi
realizada utilizando-se a análise de variância de uma via (ANOVA), seguida
pelo teste “t” de Bonferroni. Os valores de p < 0,05 foram considerados
significativamente estatísticos. Os dados apresentados foram comparados
pelo teste “t” de Student ou ANOVA. Foi utilizado o teste de comparações
múltiplas (Tukey) para determinar a significância das diferenças calculadas
entre os valores para a condição experimental. O software GraphPadPrism
5.0 (San Diego, CA, EUA) foi utilizado. As diferenças foram consideradas
significativas para p < 0,05.
59
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Síntese
As chalconas foram sintetizadas, reagindo quantidades equimolares
de diferentes acetofenonas com furfuraldeído e furancarboxaldeído, no
intuito de formar duas séries de moléculas com derivados furânicos. Por meio
de uma derivação do método geral da reação de condensação aldólica de
Claisen-Schmidt, as reações foram realizadas e o mecanismo desta reação
encontra-se demonstrado na figura 09.
Figura 09. Esquema do mecanismo geral de condensação aldólica da série
derivada da (2E)-3-(furan-2-il)-1-fenilprop-2-en-1-ona (série M).
CH2H
O
-CH2
O
CH2
O-
-CH2
O OO-
O
OOH
O
O-
OH
O
OH- OH2
O H
H
OH-
OOH
H H
O
OH-
OH2OH
-
++
+
+ +
++ +
1ª etapa
2ª etapa
3ª etapa
4ª etapa
H
O
O
OO-
O
O
O
X
X
X X
X X
X X X O mecanismo destas reações ocorre em quatro etapas, conforme
apresentado no esquema acima. Na primeira etapa ocorre a remoção do
60
próton do carbono metílico da acetofenona, promovido a partir da ação
catalítica básica do NaOH, ocorrendo a formação do íon enolato, que se torna
estável por ressonância. Na segunda etapa, o íon enolato atua como nucleófilo
(carbânion) atacando o carbono da carbonila proveniente dos diferentes
aldeídos aromáticos, formando um alcóxido. Na terceira etapa, o alcóxido
remove um próton de uma molécula de água, para formar um aldol. Na quarta
etapa, ocorre a remoção do hidrogênio α devido à sua acidez, seguida da
eliminação da hidroxila β formando uma dupla ligação. A estrutura formada
é estabilizada pela ressonância das duplas ligações conjugadas (SANTOS,
2008).
5.1.2 Purificação e Caracterização
Todas as moléculas sintetizadas, foram purificadas por
recristalização, afim de se obter compostos mais puros e facilitar a
caracterização. Observando a tabela 1 e 2, podemos concluir que o maior
rendimento ocorreu com a mesma derivação, utilizando 4-
morfolinoacetofenona, apresentando rendimento de 91% para molécula M4
e 87% para a molécula F4.
Todas os compostos obtidos foram purificados por recristalização,
utilizando etanol absoluto sendo que a umidade excedente foi retirada em
dessecador com uso de pentóxido de fósforo, como agente secante.
Após a purificação, foi determinado o ponto de fusão, observando-
se uma variação de 65,3 – 193, dependendodo composto formado.
São apresentados na sequência abaixo, os dados dos compostos
sintetizados:
61
Tabela 1. Dados analíticos dos compostos obtidas a partir do furfuraldeido,
com diferentes acetofenonas, série M:
_____________________________________________________________
O
O
R1
R3
R2
Substituinte
-R1, -R2, -R3
Códig
o
Massa
(g/mol)
Rendi-
mento
(%)
Tempo
reacional
(h)
P.f.
(°C)
Inédito
CH3, H, OH M1 228,24 86 2 118,7-119,9 NÃO
OCH3, OCH3, H M2 258,26 51,2 1 85,5-87 NÃO
H, H, H M3 198,21 43 3 78,7-79,9 NÃO
C4H8NO M4 283,32 91,3 0,9 190,5-193,6 NÃO
CH3, H, H M7 212,24 46,4 2 65,3-67,9 NÃO
OCH3, H, H M8 228,24 92 2,2 81,2-83,1 NÃO
Cl, H, H M9 232,66 72,2 0,3 80,7-81,9 NÃO
Cl, Cl, H M10 267,1 33,2 0,1 121,1-123,2 NÃO
C3H4N2, H, H M12 264,27 42 1,4 137,9-140,4 SIM
C3H4O2, H, H M13 242,22 52,2 1,8 110,8-112,1 NÃO
NH2, H, H M14 213,23 43,4 2,3 113,8-114,9 NÃO
(2E)-3-(furan-2-il)-1-(2-hidroxi-4-metilfenil)prop-2-en-1-ona (M1)
CH3 OH
O
O
1
23
45
67
89
10
11
12
13
14
Fórmula molecular: C14H12O3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3128 (OH), 1635 (C=O), 1475 (C=C, Ar), 1020
(C-O).
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 3, 73 (s, 3H, C14); 6,7 (s, 1H, C2-
H); 6,8 (d, 2H, C10); 7,1 (d, 1H, C12); 7,6 (s, 1H, C9); 7,7 (d, 1H, C6,
J=8,1Hz); 7,72 (s, 1H, C3); 7,94 (d, 1H, C5, J=8,1 Hz); 7,98 (s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 55,7 (C14);110,1- 151,2 (9C, Ar);
118,7 (C5); 129,7 (C6); 153,22 (C13); 186,8 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.):C: 73,6 (73,67); H: 5,52 (5,30); O:
21,08 (21,03).
62
(2E)-1-(3,4-dimetoxifenill)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1-ona (M2)
O
O
O
CH3 OCH3
1
23
45
678
910
11
1213
1415
Fórmula molecular: C15H14O4
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2997 (C-H, Ar), 1654 (C=O), 1477 (C=C, Ar),
1024 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 6,97 (s, 6H, C14,C15); 6,7 (s, 1H,
C2); 7,1 (m, 2H, C10,C9); 7,6 (d, 3H, C5,C6,C9); 7,8 (dd, 1H, C3, J=8,4Hz);
7,9 (s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 39,7 (C14-C15); 119,9 (C5);
126,1 (C6); 113,2-162 (10C, Ar); 191,9 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:69,7(69,76); H:5,49(5,46); O:24,81
(24,78)
(2E)-3-(furan-2-il)-1-fenilprop-2-en-1-ona (M3)
O
O
1
23
45
67
89
10
11
12
13
Fórmula molecular: C13H10O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3062 (C-H, Ar), 1662 (C=O), 1560 (C=C, Ar)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,1 (s, 1H, C2); 7,5 (m, 5H, C10,
C11, C12); 7,8 (s, 1H, C3); 8,1 (d, 2H, C5-C6, J=7,2Hz); 8,2 (s, 1H, C3).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 121,7 (C5); 128,3 (C6); 108-146
(10C, Ar); 189 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:78,72 (78,77); H:5,11 (5,09); O:
16,17 (16,14)
63
(2E)-3-(furan-2-il)-1-[4-(morfolino-4-il)fenil]prop-2-en-1-ona (M4)
1
23
4
5
67
89
10
1112
13
O
N
O
O
14
15
1617
Fórmula molecular: C17H17NO3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2856 (C-H, Ar), 1647 (C=O), 1473 (C=C, Ar),
1301 (C-N), 1232 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 3,73 (s,4H,C14C15,C16,C17); 6,7
(s, 1H, C2); 7,0 (m, 3H,C3,C10,C12); 7,5 (d, 2H, C5-C6); 7,9 (s, 1H, C1);
8,0 (d, 2H, C9-C13).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 118,9 (C5); 127,3 (C6); 112-151
(10C, Ar); 154 (C7); 46,7 (C14-C17); 65,8 (C15, C16).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:72,03 (72,07); H:6,07(6,05); N:4,93
(4,94); O:16,97 (16,94).
(2E)-3-(furan-2-il)-1-(4-metilfenil)prop-2-en-1-ona (M7)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
CH3
14
Fórmula molecular: C14H12O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3049 (C-H, Ar), 1654 (C=O), 1552 (C=C, Ar)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 6,7 (s, 1H, C2); 7,1 (d, 1H, C3); 7,4
(d, 2H, C10,C12, J=8,1Hz); 7,5 (s, 2H, C9-C13); 7,9 (s, 1H, C3); 7,9 (d, C5-
C6, J=8,1Hz).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 21,3 (C14);118,7 (C5); 128,4
(C6); 113-151 (10C, Ar); 188 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:79,19 (79,22); H:5,71 (5,70);
O:15,10(15,08).
64
(2E)-3-(furan-2-il)-1-(4-metoxifenil)prop-2-en-1-ona (M8)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
OCH3
14
Fórmula molecular: C14H12O3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2968 (C-H, Ar), 1656 (C=O), 1479 (C=C, Ar)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 3,8 (s, 3H, C14); 6,7 (s, 1H, C2);
7,1 (d, 3H, C10,C12,C3); 7,5 (d, 2H, C9,C13, J=8,1Hz); 7,9 (s, 1H, C1); 8,1
(d, 2H, C5,C6).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 39,5 (C14);118,4 (C5); 128,9
(C6); 113-151 (10C, Ar); 187,6 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:73,63 (73,67); H:5,32 (5,30);
O:21,05 (21,03).
(2E)-1-(4-chlorofenil)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1-ona (M9)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
Cl
Fórmula molecular: C14H9ClO2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3059 (C-H, Ar), 1656 (C=O), 1473 (C=C, Ar),
1400 (C-Cl)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 6,7 (s, 1H, C2); 7,1 (s, 1H, C3); 7,6
(dd, 4H, C10,C12,C9,C13, J=8,1Hz); 7,9 (s, 1H, C1); 8,1 (d, 2H, C5,C6,
J=6,9Hz).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 146,46 (C11);118,3 (C5); 128,9
(C6); 113-151,7 (10C, Ar); 187,6 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:67,09 (67,11); H:3,93 (3,90); O:
13,78 (13,75).
65
(2E)-1-(3,4-dichlorofenil)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1-ona (M10)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
Cl
Cl
Fórmula molecular: C13H8Cl2O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 1654 (C=O), 1471 (C=C, Ar), 1219 (C-Cl)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 6,7 (s, 1H, C2); 7,2 (d, 1H, C10); 7,6
(d, 2H, C9,C13, J=8,1Hz); 7,8 (d, 1H, C6); 7,9 (s, 1H, C3); 8,0 (dd, 1H, C5,
J=8,4Hz); 8,3 (d, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm):139, 133 (C11, C12);118 (C5); 128
(C6); 113-151,7 (8C, Ar); 189 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:58,41(58,46); H:3,04(3,02);
O:12,0(11,98).
(2E)-3-(furan-2-Il)-1-[4-(1H-imidazol-1-il)fenill]prop-2-en-1-ona (M12)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
N
N
14
15
16
Fórmula molecular: C16H12N2O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3072 (C-H, Ar), 1651 (C=O), 1477 (C=C, Ar),
1020 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 6,7 (s, 1H, C2); 7,2 (d, 2H, C3); 7,6
(s, 2H, C14,C15); 7,9 (dd, 4H, C9,C10,C12,C13); 8,2 (s, 2H, C5,C6); 8,4 (s,
1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm):146 (C11);140 (C5); 130 (C6);
113-151,7 (12C, Ar); 187,3 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:72,69 (72,72); H:4,59 (4,58);
N:10,58 (10,60); O:12,14 (12,11).
66
(2E)-1-(1,3-benzodioxol-5-il)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1-ona (M13)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
O
O
14
Fórmula molecular: C14H10O4
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2908 (C-H, Ar), 1653 (C=O), 1471 (C=C, Ar),
1047 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 6,1 (s, 2H, C14-H); 6,7 (m, 1H, C2);
7,1(m, 2H, C3,C9, J=6,9Hz); 7,5 (d, 3H, C12,C13); 7,8 (d, 1H, C5,C6); 7,9
(s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm):146 (C11, C10);118 (C5); 130
(C6); 102-146 (8C, Ar); 187,3 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:69,39 (69,42); H: 4,17 (4,16); O:
26,45 (26,42).
(2E)-1-(4-aminofenil)-3-(furan-2-il)prop-2-en-1-ona (M14)
1
23
45
67
89
10
1112
13
O
O
NH2
Fórmula molecular: C13H11NO2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2997 (C-H, Ar), 1654 (C=O), 1477 (C=C, Ar),
1024 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm):6,1 (s, 1H, C2); 7,1 (s, 1H, C3); 6,6
(dd, 4H, C10,C12,C9,C13, J=8,1Hz); 7,0 (s, 1H, C1); 7,5 (d, 2H, C5,C6,
J=6,9Hz).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 153(C11);119 (C5); 128 (C6);
112-151 (10C, Ar); 185,2 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:73,21 (73,23); H:5,21 (5,20); N:6,56
(6,57); O: 15,03 (15,01).
67
Tabela 2. Dados analíticos dos compostos obtidas a partir do 3-
furancarboxaldeído, com diferentes acetofenonas, série F:
_____________________________________________________________
O
O
R1
R3
R2
Substituinte
-R1, -R2, -R3
Código Massa
(g/mol)
Rend.
(%)
Tempo
Reac.
(h)
P.f.
(°C)
Inédito
CH3, H, OH F1 228,24 49,3 0,5 110,3-111,2 SIM
OCH3, OCH3, H F2 258,26 74,6 0,7 87,0-88,7 SIM
H, H, H F3 198,21 39,3 1,9 77-78 SIM
C4H8NO F4 283,32 87 0,7 99,2-99,8 SIM
CH3, H, H F7 212,24 41 2 SIM
OCH3, H, H F8 228,24 72 0,3 90,6-91,6 NÃO
Cl, H, H F9 232,66 73,7 0,2 133,3-134,7 SIM
Cl, Cl, H F10 267,1 27,3 0,1 114,1-115,6 SIM
(2E)-3-(furan-3-il)-1-(2-hidroxi-4-metilfenil)prop-2-en-1-ona (F1)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
O
OOHCH3
14
Fórmula molecular: C14H12O3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3136 (OH), 1660 (C=O), 1446 (C=C, Ar), 1230
(C-O).
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,1 (s, 1H, C3); 7,5 (m, 2H, C9,C10);
7,6 (d, 3H, C12); 7,8 (s, 1H, C2); 8,1 (d, 2H, C5,C6); 8,2 (s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 39,5 (C14);145 (C5); 128 (C6);
108-146 (10C, Ar); 189 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:73,36 (73,67); H:4,51(5,30);
O:21,23 (21,03).
68
(2E)-1-(3,4-dimetoxifenil)-3-(furan-3-il)prop-2-en-1-ona (F2)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
O
OO
OCH3
CH3
14
15
Fórmula molecular: C15H14O4
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2999 (C-H, Ar), 1658 (C=O), 1514 (C=C, Ar),
1082 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,1 (s, 1H, C3); 7,5 (s, 1H, C2); 7,6
(s, 2H, C10,C13); 7,7 (s, 1H, C4); 7,8 (s, 1H, C5); 8,1 (s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 55,9 (C14,C15);145,7 (C5); 130,5
(C6); 108-153 (10C, Ar); 187,5 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:69,59 (69,76); H:5,58 (5,46);
O:24,82 (24,78).
(2E)-3-(furan-3-il)-1-fenilprop-2-en-1-ona (F3)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
O
O
Fórmula molecular: C13H10O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3062 (C-H, Ar), 1660 (C=O), 1446 (C=C, Ar)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,0 (d, 2H, C9,C10); 7,1 (s, 1H, C3);
7,6 (s, 2H, C5,C6); 7,7 (s, 1H, C2); 8,1 (d, 2H, C9,C13); 8,2 (s, 1H, C1)
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm):145,1 (C5); 127,3(C6); 108-153
(10C, Ar); 189,7 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:78,56 (78,77); H:5,14 (5,09);
O:16,29 (16,14).
69
(2E)-3-(furan-3-il)-1-[4-(morfolino-4-il)fenil]prop-2-en-1-ona (F4)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
O
ON
O
1415
1617
Fórmula molecular: C17H17NO3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2843 (C-H, Ar), 1658 (C=O), 1448 (C=C, Ar),
1197 (C-O)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 3,74 (s,8H,C14C15,C16,C17); 6,7
(s, 1H, C2); 7,0 (m, 3H,C3,C10,C12); 7,6 (d, 2H, C5-C6); 8,1(s, 1H, C1); 8,0
(d, 2H, C9-C13).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 144,8 (C5); 130 (C6); 112-146
(10C, Ar); 154 (C7); 46,8 (C14-C17); 65,8 (C15, C16).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:72,02(72,07); H:6,07 (6,05);
N:4,93(4,94); O:16,97(16,94).
(2E)-3-(furan-3-il)-1-(4-metilfenil)prop-2-en-1-ona (F7)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
14
O
OCH3
Fórmula molecular: C14H12NO2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2918 (C-H, Ar), 1656 (C=O), 1409 (C=C, Ar)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 2,5 (s, 3H, C14); 7,7 (s, 1H, C2); 7,1
(d, 1H, C3); 7,0(d, 2H, C10,C12, J=8,1Hz); 7,6 (s, 2H, C9-C13); 8,1 (s, 1H,
C3); 7,8 (d, C5-C6, J=8,1Hz).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 26,1 (C14);113 (C5); 130 (C6);
38,6-130,4 (10C, Ar); 154 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:79,16 (79,22); H:5,72 (5,70);
O:15,12 (15,08).
70
(2E)-3-(furan-3-il)-1-(4-metoxifenil)prop-2-en-1-ona (F8)
1
2
34
5
67
89
10
1112
1314
O
OO
CH3
Fórmula molecular: C14H12O3
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2962 (C-H, Ar), 1660 (C=O), 1512 (C=C, Ar)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,1 (s, 1H, C3); 7,6 (s, 2H, C9 ); 7,6
(s, 2H, C10); 7,8 (s, 1H, C2); 8,1 (d, 2H, C5,C6); 8,2 (s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 55,5 (C14);144,8 (C5); 123,2
(C6); 108,1-163 (10C, Ar); 187,2 (C7).
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:73,51 (73,67); H:5,36 (5,30);
O:21,13 (21,03).
(2E)-1-(4-clorofenil)-3-(furan-3-il)prop-2-en-1-ona (F9)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
O
OCl
Fórmula molecular: C13H9ClO2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 2962 (C-H, Ar), 1660 (C=O), 1512 (C=C, Ar),
1415 (C-Cl)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,1 (s, 1H, C3); 7,6 (m, 4H,
C9,C10,C12,C13, J=8,4Hz); 7,8 (s, 1H, C2); 8,1 (d, 2H, C5,C6, J=8,4Hz);
8,2 (s, 1H, C1).
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 145 (C5); 128 (C6); 108-145
(10C, Ar); 147 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:67,08 (67,11); H:3,92 (3,90);
O:13,85 (13,75).
71
(2E)-1-(3,4-diclorofenil)-3-(furan-3-il)prop-2-en-1-ona (F10)
1
2
34
5
67
89
10
1112
13
O
OCl
Cl Fórmula molecular: C13H8Cl2O2
IV (Pastilhas de KBr, cm-1): 3116 (C-H, Ar), 1662 (C=O), 1460 (C=C, Ar),
1226 (C-Cl)
RMN1H (300 MHz, DMSOd6, δ ppm): 7,1 (s, 1H, C3); 7,6 (m, 2H, C9,C13,
J=8,4Hz); 7,8 (s, 1H, C10); 8,1 (d, 2H, C5, J=8,4Hz); 8,2 (s, 1H, C4); 8,3 (s,
1H, C1)
RMN13C (75,47 MHz, DMSOd6, δ ppm): 145 (C5); 128,4 (C6); 108-145
(10C, Ar); 147 (C7)
Análise Elementar: Enc. % (Calc.): C:58,41 (58,46); H:3,05 (3,02);
O:12,00 (11,98).
A formação das chalconas foi monitorada por cromatografia em
camada delgada, utilizando benzeno:clorofórmio (80:20) como mistura
eluente e ao término das reações as substâncias foram isoladas, analisadas e
caracterizadas quimicamente, utilizando dados espectroscópicos usuais,
como infravermelho (IV), ressonância magnética nuclear de próton (RMN 1H) e carbono13 (RMN13C).
Os espectros de IV (figura 10), RMN 1H (figura 11) e RMN13C
(figura 12) da molécula M9 foram selecionados à título de ilustração para esta
série.
72
Figura 10: Espectro de IV do composto M9 – Técnica DRS, em KBr
Figura 11. Espectro de RMN1H do composto M9
73
Figura 12: Espectro de RMN1C do composto M9
Observa-se, nos dados espectroscopicos obtidos, como as bandas de
absorção no infravermelho, características dos grupos funcionais presentes
na molécula e também os dados obtidos a partir dos espectros de ressonância
magnética nuclear, que as atribuições de sinais contemplam as estruturas dos
compostos sintetizados. Assim os compostos propostos foram todos obtidos
e caracterizados. Adicionalmente, os dados de análise elementar corroboram
a obtenção de todos os derivados propostos.
Apesar de, em processos sintéticos de chalconas, o estereoisômero
E ser geralmente obtido de forma majoritária (considerado
termodinamicamente mais estável), não é incomum a ocorrência de uma
mistura diasteroisomérica, contendo os isômeros E e Z, em proporções muito
próximas (DUCKI et al., 1998 ; PADHYE, 2009 ; CORDEIRO, 2010).
A identificação, por espectroscopia de RMN, do isômero
majoritário, se dá por meio da análise das constantes de acoplamento (J) que
envolve os hidrogênios olefínicos da dupla ligação enona. Por regra, sabe-se
que quando se obtém constantes de acoplamento maiores ou iguais a 15 Hz,
considera-se o composto obtido na forma isomérica E. Abaixo dos 15 Hz, o
composto será Z (CORREA, 2008). Contudo, em misturas diasteroisoméricas
em que ocorre um equilíbrio proporcional na formação dos dois isômeros
74
(misturas próximas a 50:50), torna-se muito difícil se estabelecer o isômero
preponderante. Esta situação ocorreu na maioria dos compostos obtidos, no
presente trabalho.
Assim sendo, procedeu-se a análise dos compostos sintetizados por
cromatografia líquida de alta performance, acoplada a detector de massas
triplo quadrupolo (LC-MSMS), no intuito de se avaliar a existência de
misturas diasteroisoméricas e a proporção de formação dos isômeros
observados.
A figura 13 mostra o cromatograma obtido para o composto M9,
com método de eluição gradiente, no modo positivo (MS). O íon molecular
detectado, num tempo de aquisição de 8,581 minutos foi de 232 Da, o que
está de acordo com a estrutura proposta para M9.Em seguida, na figura 14
verifica-se o cromatograma obtido para o mesmo composto M9, agora com
método de eluição isocrático, no modo positivo (MS). Observa-se que, numa
varredura feita de 70 Da a 340 Da, destacam-se dois compostos com a mesma
massa molar de 232 Da e tempos de retenção distintos. O primeiro a 3,021
minutos e o segundo a 3,146 minutos. Esta situação caracteriza,
perfeitamente, a ocorrência de diasteroisômeros.
Figura 13:Cromatograma da amostra de chalcona M9 com eluente gradiente,
no modo positivo (MS) e a varredura feita de 120 a 1000 Da. O íon avaliado
foi o 232 Da (íon molecular).
75
Figura 14: Cromatograma da amostra de chalcona M9 com eluente
isocrático, no modo positivo (MS) e usando o íon molecular de 232 Da e a
varredura feita de 70 a 340 Da.
Com base nas evidências observadas quanto à ocorrência de
mistura diasteroisomérica em M9, procedeu-se, via software Agilent, a
integração das áreas dos picos relativos a cada um dos dois isômeros
observados, atribuindo-se o percentual de ocorrência de cada um deles.
Conforme a tabela 3 tem-se 43,92% de ocorrência, para o isômero cujo tempo
de aquisição se apresentou 3,021 minutos (o primeiro a sair) e 56,08% de
ocorrência, para o isômero com índice de retenção de 3,146 minutos (o último
a sair).
Tabela 3:Quantidades relativas dos isômerosencontrados no composto M9.
RT: tempo de retenção
Sabe-se que, considerando a natureza apolar da fase sólida da
coluna cromatográfica, o composto que apresentar o maior tempo de
aquisição, naturalmente, é o que apresenta maior tempo de retenção e
consequentemente, é aquele que apresenta maior afinidade pela coluna,
sendo, portanto, mais apolar. Assim, procedeu-se à análise do momento
dipolar dos dois isômeros (E e Z) atribuíveis ao composto M9, através do
Software ARGUS LAB (figura 15 e figura 16), para identificar cada um dos
PICO RT AREA AREA% ALTURA LARGURA TOTAL
1 3,021 887481 78.32 111327 0,24 43,92
2 3,146 1133159 100 121576 0,288 56,08
76
isômeros no cromatograma e consequentemente, atribuir-lhes o
respectivopercentual de ocorrência.
Figura 15. Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero E
do composto M9.
Momento dipolar = 3.26846007 debye
Figura 16. Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero Z
do composto M9.
Momento dipolar = 2.37468744debye
Dos valores apresentados para o momento dipolar dos isômeros de
M9, pode-se concluir que o isômero E é aquele que apresenta o maior
momento dipolar e, portanto, por ser mais polar, tem a menor afinidade com
o sistema cromatográfico adotado, o que lhe proporciona menor tempo de
retenção, sendo o primeiro a sair. Assim, pode-se afirmar que, da mistura
77
diasteroisomérica de M9, tem-se 43,92% do isômero E e 56,08% do isômero
Z. Tais percentuais de ocorrência ilustram bem as dificuldades em
caracterizar espectrometricamente, por ressonância magnética nuclear, a
mistura, uma vez que os percentuais são muito próximos a uma mistura
50:50, além de ocorrer leve predominância do isômero termodinamicamente
menos estável.
Para a série de compostos F, também foram adotados os mesmos
procedimentos de elucidação estrutural considerados na série M. O mesmo
êxito na obtenção e caracterização dos compostos foi alcançado.
Os espectros de IV (figura 17), RMN 1H (figura 18) e RMN13C
(figura 19) da molécula F9 foram selecionados à título de ilustração para esta
série.
Figura 17: Espectro de IV do composto F9
78
Figura 18: Espectro de RMN1H do composto F9
Figura 19: Espectro de RMN1C do composto F9
79
As mesmas dificuldades encontradas para a elucidação estrutural,
já reportadas para a série M, também se verificaram para a série F. Assim, os
mesmos procedimentos foram adotados, procedendo-se a análise dos
compostos sintetizados por cromatografia líquida de alta performance,
acoplada a detector de massas triplo quadrupolo (LC-MSMS), no intuito de
se avaliar a existência de misturas diasteroisoméricas e a proporção de
formação dos isômeros observados.
Conforme mostra a figura 20, obteve-se um cromatograma do
composto F9, com eluição gradiente, no modo positivo (MS), resultando num
íon molecular de 232 Da, coerente com a estrutura proposta para F9.
Figura 20: Cromatograma da amostra de chalcona F9 com eluente gradiente,
no modo positivo (MS) e a varredura feita de 120 a 1000 Da. O íon avaliado
foi o 232 Da (íon molecular).
O cromatograma do mesmo composto F9, agora obtido em modo
de eluição isocrática (figura 21), considerando o íon molecular de 232 Da,
previamente detectado, mostra, neste mesmo peso molecular, a ocorrência de
dois diasteroisômeros, com tempos de aquisição de 2,302 e 2,398 minutos,
respectivamente.
80
Figura21: Cromatograma da amostra de chalcona F9 com eluente isocrático,
no modo positivo (MS) e usando o íon molecular de 232 Da e a varredura
feita de 70 a 340 Da.
Calculando-se a área dos picos que representamcada um dos
isômeros (Tabela 4), obtêm-se a ocorrência percentual de 48,01% para o
isômero cujo tempo de retenção é de 2,302 min e 51,99% para o isômero com
tempo de retenção de 2,398 min.
Tabela 4:Quantidades relativas dos isômerosencontrados no composto F9.
PICO RT AREA AREA% ALTURA LARGURA TOTAL
1 2,302 583440 92,36 76622 0,201 48,01
2 2,398 631730 100 83203 0,307 51,99
RT: tempo de retenção
Procedendo-se o cálculo do momento dipolar para os dois
isômeros atribuíveis à F9, obtém-se os resultados mostrados nas figuras 22 e
23.
81
Figura 22. Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero E
do composto F9.
Momento dipolar = 1.99670632debye
Figura 23. Mapa de densidade eletrônica e momento dipolar do isômero Z
do composto F9.
Momento dipolar = 2.41781298 debye
Considerando-se os valores apresentados para o momento dipolar
dos isômeros de F9, pode-se concluir que o isômero Z é aquele que apresenta
o maior momento dipolar e, portanto, por ser mais polar, tem a menor
afinidade com o sistema cromatográfico adotado, o que lhe proporciona
menor tempo de retenção, sendo o primeiro a sair. Assim, pode-se afirmar
82
que, da mistura diasteroisomérica de F9, tem-se 48,01% do isômero Z e
51,99% do isômero E. Nota-se que a predominância isomérica muda de uma
série para a outra (na série F há uma leve predominância do isômero E,
termodinamicamente favorecido) o que, sem dúvida, é resultante das
diferenças estruturais e conformacionais experimentadas pelo
posicionamento diverso do anel furânico em cada série. A exemplo da série
M, também a série F apresenta proporções de ocorrência isomérica muito
próximas a 50:50, o que corrobora as dificuldades encontradas na primeira
série, no que tange a uma mais completa identificação estrutural dos
compostos. Nesses casos, adota-se como padrão a atribuição da isomeria pelo
que se considera o isômero termodinamicamente mais estável (calculado
teoricamente).
5.2Avaliação da atividade in silico: cálculos teóricos computacionais
Na avaliação in silico da predição das propriedades moleculares
das substâncias sintetizadas para esta Série (Tabela 4), foram calculados os
parâmetros disponíveis no site www.molinspiration.com.br; utilizando-se
quatro métodos, discutidos separadamente.
Alguns parâmetros estruturais relevantes para a predição
teórica do perfil de biodisponibilidade oral de um composto podem ser
avaliados por meio da regra de Lipinski, também denominada regra dos 5.
Dentro desta regra os parâmetros analisados permitem identificar derivados
promissores pontuando propriedades físico-químicas e estruturais, uma vez
que a previsão dos processos farmacocinéticos, logo nos estágios iniciais de
uma pesquisa, é de extrema importância no desenvolvimento de um
candidato a fármaco.
Ao analisarmos a tabela 5, podemos observar que nenhum
composto violou à regra de Lipinski.
O peso molecular (PM) também foi avaliado, pois o aumento de
massa molar implica diretamente na absorção e biodisponibilidade de
diferenciadas substâncias. Ao analisar a tabela 5, podemos observar que todas
as chalconas apresentaram valores abaixo do limite.Levando em
consideração que o fármaco de referência, Celecoxibe possui um PM=381,
estima-se que quanto menor o peso molecular, mais facilmente o fármaco
permeará a barreira hemato encefálica e atingirá seu alvo.
Em relação ao número de doadores e aceptores de hidrogênio,
todos os compostos, bem como os fármacos de referência, exibiram valores
83
dentro dos parâmetros exigidos. Sendo assim, pode-se predizer que todas
estas moléculas são suficientemente hidrofóbicas para penetrar as membranas
biológicas e acessar o sítio de ligação (SWATHI, et al., 2013). Bali e
colaboradores (2012) também afirmam que a baixa permeação e a baixa
absorção de uma substância estão diretamente ligadas a estruturas que
possuem mais de 5 e 10 doadores e aceptores de H, respectivamente.
O valor de TPSA indica uma boa perspectiva sobre a absorção de
um fármaco, incluindo a absorção intestinal, a biodisponibilidade e a
penetração da barreira hematoencefálica (HASSAN, SHIRSEEN,
MURALEEDHARAN, ABDUL MUJEED, 2015). Bakht e colaboradores
(2010), também afirmam que para o desenvolvimento de moléculas com
atividades terapêuticas a biodisponibilidade é uma propriedade muito
importante. Sendo assim, baixos valores de TPSA são necessários para que
as moléculas em desenvolvimento sejam biodisponíveis por via oral. Na
análise de TPSA todos os compostos apresentaram um valor inferior a 140
Åo que indica uma boa permeabilidade na membrana plasmática celular
(SWATHI, et al., 2013). Ao compararmos os valores de TPSA encontrados
nos compostos com os dos fármacos de referência podemos observar valores
maiores de TPSA nos fármacos de referência, comparados aos compostos em
análise.
Para finalizar, o número de rotações também é uma característica
abordada, pois o valor pode influenciar nas mudanças conformacionais de
uma molécula. Valores menores ou iguais a 10 são considerados parâmetros
para uma biodisponibilidade adequada. Todos os compostos sintetizados e
inclusive o fármaco de referência apresentaram valores menores a 6.
84
Tabela 5. Valores comparativos dos parâmetros de Lipisnki e extensão para as duas séries de chalconas em estudo.
Compostos Parâmetros de Lipinski Extensão
LogP PM Aceptores Doadores Violações Vol TPSA Nrot
M1 3,25 228 3 1 0 208 50,44 3
M2 2,23 258 4 0 0 234,51 48,68 5
M3 2,89 198 2 0 0 183,42 30,21 3
M4 2,84 283 4 0 0 261,55 42,68 4
M7 3,34 212 2 0 0 199,98 30,21 3
M8 2,95 228 3 0 0 208,97 39,45 4
M9 3,57 232 2 0 0 196,96 30,21 3
M10 4,17 267 2 0 0 210,49 30,21 3
M12 2,22 264 4 0 0 236,04 48,04 4
M13 2,78 242 4 0 0 207,35 48,68 3
M14 1,97 213 3 2 0 194,71 56,23 3
F1 2,94 228 3 1 0 208 50,44 3
F2 2,23 258 4 0 0 234 48,68 5
F3 2,57 198 2 0 0 183,42 30,21 3
F4 3,04 283 4 0 0 288,72 42,68 4
F7 3,03 212 2 0 0 199,98 30,21 3
F8 2,63 228 3 0 0 208,97 39,45 4
F9 3,26 232 2 0 0 196,96 30,21 3
F10 3,86 267 2 0 0 210,49 30,21 3 AAS 1,43 180 4 1 0 155 63,60 3
PAR 0,68 151 3 2 0 140 49,33 1
COXIB 3,61 381 5 2 0 298 77,99 4 Legenda:LogP=coeficiente de partição octano/água;PM=peso molecular;Vol=volume;TPSA=área total superfície polar;Nrot=ligações rotacionais.
85
5.3 Avaliação da atividadein sílico: parâmetros farmacocinéticos
O equilíbrio entre solubilidade e lipossolubilidade é essencial na
absorção de uma substância, assim, a busca de dados sobre a absorção no
intestino humano (HIA) corroboram para a escolha de testes farmacológicos
futuros. Este parâmetro pode dizer muito sobre a lipofilicidade de um
composto e com isso pode-se prever a probabilidade da permeação de uma
molécula através da membrana biológica (HOU et al., 2007). Outra
característica que deve ser avaliada em uma substância, vem a ser a
capacidade de atravessar, ou não, a barreira hematoencefálica (BHE).
Lembrando que apenas compostos ativos no sistema nervoso central devem
atravessar esta barreira, a fim de evitar efeitos colaterais no sistema nervoso
central (preADMET, 2016).
Na tabela 6 é possível observar os resultados de HIA e BHE
referentes às séries de chalconas sintetizadas. O teste in sílico de HIA
apresenta valores acima de 91%, indicando boa absorção e lipofilicidade,
podendo-se sugerir que estes compostos possam atravessar livremente a
membrana alcançando o alvo desejado. As chalconas M9, M10, F9 e F10, as
quais possuem em sua estrutura substituintes –Cl, apresentaram os melhores
valores de absorção (100%), corroborando os demais resultados deste
trabalho.
Ao compararmos os dados in sílico obtidos, é possível observar
que o número de rotações (Nrot) e os valores de TPSA corroboram com os
resultados de HIA, pois para uma boa absorção intestinal a flexibilidade
molecular e baixos valores de área de superfície polar topográfica são
necessários (HASSAN, SHIRSEEN, MURALEEDHARAN, ABDUL
MUJEED, 2015). Além disso, o número de aceptores e doadores de
hidrogênio também se manteve dentro dos padrões, enfatizando a
possibilidade de boa permeação e biodisponibilidade (BALI, et al., 2012).
Ao analisarmos os valores de BHE, observamos que o composto
com maior valor de absorção, para ambas as sériés é o que não possui
substituinte no arel aromático. Também encontramos bons valores de
absorção, os compostos M9, M10, F9, F10, principalmente quando
comparados aos fármacos de referência.
86
Tabela 6.Avaliação in sílico de parâmetros relacionados à ADMET de
chalconas:
Compostos PREadmet
BHE HIA%
M1 0.530524 95.201
M2 0.0196824 98.123
M3 2,28378 100
M4 0,0284939 97,82
M7 0,373491 100
M8 0,0332818 98,34
M9 0,757569 100
M10 0,659784 100
M12 0,0300153 96,06
M13 0,0202075 98,16
M14 0,0293368 96,25
F1 0,323989 95,21
F2 0,0178632 98,12
F3 2,41781 91,66
F4 0,0237041 97,82
F8 0,0287176 98,34
F9 1,5945 100
F10 1,05786 100
AAS
PAR
COXIB
0,71
0,61
0,27
90,17
88,23
96,68
Legenda: HIA:Porcentagem de absorção no intestino humano. BHE: Penetração na barreira
hematoencefálica in vivo (concentração cérebro/concentração sangue)
5.4 Análise in sílico: avaliação de potenciais atividades biológicas
A ferramenta PASSonline é utilizada para avaliar o potencial
biológico de uma molécula, sendo capaz de fornecer previsões simultâneas
de cerca de 3.600 tipos de atividades com base na estrutura de compostos
orgânicos, sendo assim, o software é considerado uma boa ferramenta na
estimativa da atividade biológica de um composto, antes da realização da
síntese química e dos ensaios biológicos (SRINIVAS et al., 2014;
PASSonline, 2016).
87
Para realizar as análises referentes aos cálculos feitos através do
programa, como já citado, verificam-se os valores de Pa e Pi fornecidos
(Pa>Pi). O valor de Pa quanto mais próximo de 1,000 apresenta maior
atividade do composto analisado. Na tabela 7 e 8, é possível observar os
resultados apresentados para as duas séries sintetizadas, em que foram
selecionados algumas atividades biológicas para análise. Todos os resultados
apresentam valores de Pa>Pi, indicando assim uma possível atividade
biológica.
Observa-se que o fármaco de referência ácido acetil salicílico
apresentou valores de Pa para as atividades anti-inflamatórias e
antinociceptivas maior dos que os compostos analisados. Já o paracetamol
apresentou valores de Pa inferiores aos compostos quando analisados em
relação a atividade anti-inflamatória, o que está de acordo com a sua atividade
terapêutica, pois este composto possui característica analgésica, e não anti-
inflamatória. O mesmo ocorre para o fármaco celecoxibe, que possui valores
inferiores de atividade anti-inflamatória, quando comparado a alguns
compostos analisados.
88
Tabela 7. Potenciais atividades biológicas preestabelecidas para chalconas sintetizada,série M:
Compostos Anti-
inflamatório
Anti-
inflamatório
(intestinal)
Anti-
inflamatório
não esteroidal
Antinociceptiva Anticancer
(mama)
Anticancer
(próstata)
M1 0,586-0.024 0,316-0,06 0,234-0,074 0,427-0.088 0,352-0,041 0,3-0,042
M2 0,502-0,056 0,375-0,031 0,246-0,067 0,379-0,125 0,271-0,041 0,356-0,029
M3 0,523-0,05 0,381-0,028 0,205-0,096 0,374-0,128 0,273-0,039 0,265-0,051
M4 0,4-0,096 0,205-0,18 --- 0,418-0,095 0,323-0,019 0,41-0,02
M7 0,528-0.049 0,318-0,058 0,212-0,09 0,389-0,117 0,317-0,05 0,237-0,06
M8 0.496-0,058 0,428-0,016 0,229-0,078 0,38-0,124 0,279-0,035 0,318-0,037
M9 0,505-0.055 0,278-0,089 0,237-0,072 0,25-0,224 0,254-0.053 0,176-0,091
M10 0,452-0,072 0,26-0,108 0,199-0,101 0,247-0,226 0,206-0.091 0,165-0,1
M11 0,43-0,081 0,471-0,01 0,169-0,134 --- 0,309-0,053 0,328-0,035
M12 0,27-0,192 --- --- --- 0,166-0,12 ---
AAS 0,765-0,009 0,695-0,003 --- 0,530-0,022 --- ---
PAR 0,324-0,140 0,414-0,019 --- 0,413-0,099 --- ---
COXIB 0,432-0,080 --- --- --- --- ---
Legenda: AAS – ácido acetil salicítico, PAR – paracetamol, COXIB - celecoxibe
89
Tabela 8. Potenciais atividades biológicas preestabelecidas para chalconas sintetizada,série F:
Compostos Anti-
inflamatório
Anti-
inflamatório
(intestinal)
Anti-
inflamatório
não esteroidal
Antinociceptiva Anticancer
(mama)
Anticancer
(próstata)
F1 0,615-0,028 0,353-0,039 0,303-0,042 0,427-0,088 0,26-0,048 0,252-0,055
F2 0,541-0,045 0,416-0,019 0,318-0.038 0,379-0,125 0,483-0,021 0,312-0,038
F3 0,571-0,038 0,423-0,017 0,267-0,055 0,374-0,128 0,373-0,037 0,198-0,075
F4 0,433-0,08 0,238-0,134 0,178-0,122 0,418-0,095 0,31-0,052 0,375-0.026
F7 0,57-0,038 0,356-0,038 0,275-0,051 0,389-0,117 0,293-0,028 0,182-0,086
F8 0,536-0,047 0,473-0,01 0,296-0,044 0,38-0,124 0,31-0,023 0,266-0.05
F9 0,547-0,044 0,314-0,06 0,308-0,041 0,25-0,224 0,284-0,032 0,138-0,128
F10 0.497-0.058 0,295-0,075 0,261-0,058 0,247-0,226 0,267-0,043 ---
AAS 0,765 - 0,009 0,695 0,003 --- 0,530 0,022 --- ---
PAR 0,324 0,140 0,414 0,019 --- 0,413 0,099 --- ---
COXIB 0,432 0,080 --- --- --- --- ---
Legenda: AAS – ácido acetil salicítico, PAR – paracetamol, COXIB - celecoxibe
90
5.5 Avaliação da atividade antiproliferativa in vitro:
As chalconas M7, F3, F7, F8, F9 e F10, na concentração de 15
µg/ml, apresentaram percentual de inibição da proliferação das células
osteossarcoma humano (U2OS) superior à 70%, sendo a última com melhor
potencial, inibindo em 88,8% a proliferação celular (Figura 24). A maioria
das chalconas avaliadas apresentou percentual de inibição celular maior que
o controle positivo utilizado – doxorrubina (2,5 µg/ml).
Figura 24. Percentual de inibição da proliferação das células U2OS por
chalconas na concentração de 15 µg/ml e pelo controle positivo
Doxorrubicina (DOXO - 2,5 µg/ml) e negativo DMSO 0,5%.
Resultados apresentados como média seguido de EPM. Os asteriscos
denotam significância estatística quando comparados ao grupo controle
(DMSO) (###p<0,001, quando comparado ao grupo controle; ##p<0,01;
#p<0,05, quando comparato ao controle positivo (doxorrubicina). Os dados
91
foram submetidos à análise de variância ANOVA de uma via seguido pelo
post-hoc de Tukey. Siglas: DOXO-doxorrubicina, DMSO-dimetilsulfóxido
Os mediadores moleculares e celulares do processo inflamatório
são constituintes importantes no ambiente local dos tumores. Em grande parte
dos tumores, condições inflamatórias estão presentes antes do aparecimento
das alterações malignas. Estas alterações inflamatórias atuam na proliferação
e sobrevivência das células malignas, promoção da angiogênese e
metastização, e na supressão das respostas imunes adaptativas. A COX-2 é
normalmente encontrada em lesões pré-malignas como atipias da glândula
mamária (Hartmann et al., 2006), pólipos adenomatosos do cólon (Khan et
al., 2001), carcinoma in situ (Boland et al., 2004; Perrone et al., 2005; Barnes
et al, 2006), cancro invasivo e doença metastática.
A inibição da COX-2 promove o decréscimo de formação de
tumor “de novo” e causa regressão dos focos tumorais existentes. Este efeito
acontece por uma combinação de indução de apoptose das células tumorais e
diminuição do fator de crescimento de endotélio vascular – (HOWE et al.,
2001).
Os inibidores da COX-2 têm efeitos anti-proliferativos, pró-
apoptóticos, antimetastáticos, inibidores da angiogénese e supressores do
sistema imunitário.Mesmo sendo um teste preliminar, estes resultados,
corroboram com a comprovada atividade antiproliferativa de chalconas
(SOLOMON; LEE, 2012; SILVA, et al., 2015; FU et al., 2016).
5.6Avaliação de inibição das isoenzimas COX-1 e COX-2:
Em face do vasto conhecimento acerca da atividade anti-
inflamatória das chalconas e derivados estruturalmente análogos a
elas(BANDGARet al., 2009; BANDGA et al., 2010; BANERJEE,
HKS,BANERJEE, 2012; SINGH, ANAND, KUMAR, 2014;CHEN et al.,
2015; FANG et al., 2015; ÖZDEMIR et al., 2015; ZHONG et al., 2015;
KAUFMANN et al., 2016; LI et al.,2017), optou-se por avaliar,
especificamente, a atividade inibitória das isoenzimas COX-1 e COX-2.
Além disso, avaliou-se o índice de seletividade, no intuito de se identificar,
entre os derivados furânicos sintetizados (séries M e F), aqueles com maior
seletividade à COX-2, especialmente, considerando-se a comparação com o
fármaco de referência.
92
Assim, observa-se na tabela 9 os resultados obtidos no ensaio in
vitro de inibição enzimática COX-1/COX-2, considerando os compostos
sintetizados na série M e o fármaco de referência, Celecoxibe©.
Tabela 9. Ensaio de inibição enzimática in vitro COX-1/COX-2 para as
chalconas da série M
O
O
R
Composto R CI50 COX-1 (μM)a CI50 COX-2
(μM)b
ISc
M1 2-OH,4-CH3 29,85 ± 1,73*** 0,12 ± 0,004*** 248,8
M2 3,4-(OCH3)2 51,10 ± 1,26*** 0,29 ± 0,01*** 176,2
M3 -H 32,15 ± 0,62*** 0,15 ± 0,02*** 214,3
M4 N O.4
38,26 ± 1,12*** 0,21 ± 0,004*** 182,2
M7 4-CH3 22,57 ± 0,24*** 0,09 ± 0,002** 250,8
M8 4-OCH3 20,13 ± 0,22*** 0,10 ± 0,001* 201,3
M9 4-Cl 20,08 ± 0,64*** 0,08 ± 0,004* 251
M10 3,4-Cl2 21,32 ± 1,16*** 0,07 ± 0,003*** 304,6
M12 N
N.4
83,15 ± 1,62* 0,63 ± 0,004*** 132
M13 O.
O.4
3
74,08 ± 2,06* 0,48 ± 0,02*** 154,3
M14 4-NH2 91,67 ± 1,78* 0,70 ± 0,04*** 131
Celecoxibe - 14,99 ± 1,23 0,06 ± 0,003 249,8
CI50a = corresponde à concentração requerida do composto para produzir 50% de inibição da
COX-1 ou da COX-2 através de três determinações, sendo o desvio da média inferior a 10%, em
todos os casos.ISc (Índice de Seletividade) = CI50 COX-1 / CI50 COX-2. p<0,001(***),
p<0,001(**), p<0,05(*)quando comparado ao celecoxibe.
Todos os derivados da série M apresentaram maior atividade
inibitória para a COX-2, do que para a COX-1. Comparando-se os índices de
93
seletividade (IS) obtidos, verifica-se que os derivados M7, M9 e M10 foram
ainda mais seletivos do que o fármaco padrão. Destaque para M10, com um
IS de 304,6, enquanto o fármaco referência obteve, no mesmo ensaio, o IS de
249,8. Outros derivados também se destacam com índices de seletividade à
COX-2 bastante próximos ao do fármaco de referência, como o composto
M1, com IS igual a 248,8.
Importante destacar os resultados obtivos para os compostos M12,
M13, M14, apresentando resultados de CI50 respectivamente de: 83,15, 74,08,
91,67, mostrando uma baixa seletividade, promissores também , devido sua
elevada segurança gastrointestinal .Estudos mostram que os AINES mais
promissores, são aqueles que conseguem combinar a atividade
antineoplásica, com aumento da segurança gastrintestinal (Brzozowski et.
Al., 2017).
94
Para a série F, obteve-se os resultados apresentados na tabela 10.
Tabela 10. Ensaio de inibição enzimática in vitro COX-1/COX-2 para as
chalconas da série F
O
O
R
Composto R CI50 COX-1
(μM)∞
CI50 COX-2
(μM)∞
IS#
F1 2-OH,4-CH3 17,80 ± 1,12** 0,09 ± 0,002*** 197,8
F2 3,4-(OCH3)2 16,9 ± 1,20 0,18 ± 0,002 93,9
F3 -H 18,9 ± 0,44*** 0,11 ± 0,002 171,8
F4 N O.4
17,30 ± 1,08* 0,14 ± 0,006 123,6
F7 4-CH3 18,07 ± 0,12** 0,09 ± 0,001 200,8
F8 4-OCH3 17,60 ± 0,21** 0,12 ± 0,004 146,7
F9 4-Cl 16,10 ± 0,82 0,08 ± 0,004 201,3
F10 3,4-Cl2 20,60 ± 0,23*** 0,08 ± 0,002 257,5
Celecoxibe - 14,99 ± 1,23 0,06 ± 0,003 249,8
∞CI50 = corresponde à concentração requerida do composto para produzir 50% de inibição da
COX-1 ou da COX-2 através de três determinações, sendo o desvio da média inferior a 10%, em
todos os casos.#IS (Índice de Seletividade) = CI50 COX-1 / CI50 COX-2 . p<0,001(***),
p<0,001(**), p<0,05(*) quando comparado ao celecoxibe.
Os resultados obtidos na Tabela 10, referentes à série F,
corroboram aqueles já apresentados na tabela anterior, com relação à série M.
Todos os compostos apresentaram também maior atividade inibitória para a
COX-2, do que para a COX-1. Os IS apresentados são bastante significativos,
com destaque para o composto F10, com IS = 257,5, sendo ainda mais
seletivo que o fármaco de referência avaliado no mesmo ensaio.
95
5.7Avaliação da atividade do docking molecular da isoenzima COX-2:
Optou-se por melhor investigar os resultados obtidos na inibição
da COX-2, através da avaliação das energias de acoplamento ou ancoragem,
mais conhecidas pelo jargão técnico docking molecular, bem como da
interação dos ligantes (compostos sintetizados) com os aminoácidos
presentes no sítio de ligação da enzima. Utilizando a plataforma Glide, foi
possível a realização de sucessivos acoplamentos na COX-2, obtida através
do Proteín Data Bank (PDB-1CX2). Seu sítio ativo encontra-se na cadeia A,
complexado com inibidor seletivo Celecoxibe, sendo este utilizado para
delimitação espacial na realização do acoplamento molecular. Os níveis de
inibição demonstrados pelos compostos, acima ou muito próximos daqueles
aferidos pelo fármaco de referência, justificam a decisão de melhor avaliar as
interações “proteína – ligante”.
É possível observar para a ancoragem entre COX-2 e o composto
F10, a presença de um bolsão hidrofóbico caracterizado pela presenta dos
aminoácidos VAL523, MET522, GLY 526 e ALA527, e interações por pontes de
hidrogênio observadas nos aminoácidos ARG120 e TYR355. A carbonila é
atraída por interação dipolar pelo aminoácido SER530 (figura 25).
Figura 25. Ilustração do interação do sítio ativo com inibidor F10.
96
É possível observar para a ancoragem da COX-2 e o composto
M10,a presença de um bolsão hidrofóbico caracterizado pela presenta dos
aminoácidos VAL523, MET522, GLY 526, ALA527 e PHE518 . Não há interações
por pontes de hidrogênio pelo aminoácidos dos sítio e partes polarizadas da
cadeia aproximam-se da faixa em azul que circunda o inibidor, interagindo
com os amiácidos SER530e SER353 (figura 26).
Figura. 26. Ilustração do interação do sítio ativo com inibidor M10.
Figura 27. Ilustração da interação do sítio ativo com inibidor F10 em 3D.
97
Figura 28. Ilustração da interação do sítio ativo com inibidor M10 em 3D.
Figura 29. Enzima Cyclooxygenase-2 obtida a partir do Proteín Data Bank.
.
As Tabelas 11 e 12 mostram os resultados obtidos, em termos de
energia de acoplamento (energia de docking) para os compostos da série M e
F, respectivamente, além de alguns parâmetros físico-químicos, os quais
98
chamamos de “parâmetros derivativos”, calculados no intuído de se obter
alguma racionalização quanto às tendências observadas na atividade
inibitória da COX-2, considerando-se a base molecular dos compostos. O log
de P, que é o coeficiente de partição octanol/água, nos dá uma noção da
permeação dos compostos, em relação à membrana celular. O sigma de
Hammet, é um parâmetro que visa analisar a influência da demanda
eletrônica molecular na atividade biológica em análise.
Tabela 11. Energias de docking molecular, em relação à COX-2, e
parâmetros derivativos para a série M:
Comp. Ea (kcal/mol) Cl50
(uM)* 1/log(Cl50) Log P Sig. Ham. IS*
M10 -10,7893 0,07 -0,86587 4,17 0,6 304,6
M7 -10,4519 0,09 -0,95624 3,34 -0,17 250,8
M4 -10,4372 0,21 -1,4754 2,84 - 182,2
M9 -10,2636 0,08 -0,91165 3,57 0,23 251
M1 -9,90498 0,12 -1,08599 3,25 - 248,8
M3 -9,63718 0,15 -1,21373 2,89 0 214,3
M14 -9,1128 0,7 -6,4557 1,97 -0,66 131
M12 -8,8013 0,63 -4,98357 2,22 - 132
M8 -8,67858 0,1 -1 2,95 -0,27 201,3
M13 -8,49419 0,48 -3,13717 2,78 - 154,3
M2 -8,2327 0,29 -1,86011 2,23 -0,15 176,2 *CI50 = corresponde à concentração requerida do composto para produzir 50% de inibição da
COX-2 através de três determinações, sendo o desvio da média inferior a 10%, em todos os
casos.
99
Tabela 12. Energias de docking molecular, em relação à COX-2, e
parâmetros derivativos para a série F:
*CI50 = corresponde à concentração requerida do composto para produzir 50% de inibição da
COX-2 através de três determinações, sendo o desvio da média inferior a 10%, em todos os
casos.
Analisando-se os resultados obtidos para as energias de docking
dos compostos avaliados na série M, verifica-se que os melhores
acoplamentos ocorrem com os compostos M10, M7, M4, M9 .
Estruturalmente, pode-se constatar que os substituintes presentes à estrutura
geral da chalcona, nestes compostos são, respectivamente:
O
O
R
M10 3,4-Cl2 Cloro possibilidade interações hidrofóbicas
M7 4-CH3 Interações de VanderWaals
M4 N O.4
Composto aceptor de ligações de hidrogênio
M9 4-Cl Cloro possibilidade interações hidrofóbicas
Comp. Ea
(kcal/mol) Cl50 (uM)* 1/log(Cl50) Log P Sig. Ham. IS*
F10 -10,5397 0,08 -0,91165 3,86 0,6 257,5
F9 -10,13 0,08 -0,91165 3,26 0,23 201,3
F7 -10,0946 0,09 -0,95624 2,94 0 200,8
F3 -10,0144 0,11 -1,04318 2,57 - 171,8
F1 -9,88795 0,09 -0,95624 3,03 - 197,8
F8 -8,51858 0,12 -1,08599 2,63 -0,27 146,7
F4 -8,30415 0,12 -1,08599 3,04 - 123,6
F2 -8,02731 0,18 -1,34277 2,23 -0,15 93,9
100
Comparando-se estes resultados com os índices de seletividade obtidos a
COX-2, verifica-se que, dos quatro acoplamentos, dois deles (M9 e M10),
possuem os melhores índices de seletividade da série, o que demonstra a
relação dos resultados in vitro e in silico. Quanto aos parâmetros de
modelagem molecular, dois dos derivados listados acima, estão entre os
compostos que obtém os melhores resultados na inibição da COX-2, M9 e
M10 são os compostos mais hidrofóbicos (logP=3.57 e 4, 17,
respectivamente), demonstrando que a interação hidrofóbica com o receptor
pode ser um fator determinante na inibição de sua ação biológica. Com
relação ao composto M4 e M7, as interações por ligações de hidrogênio foram
importantes para garantir uma boa energia de acoplamento para o composto
M4; e para o composto M7, ocorreram interações de VanderWaals. Contudo,
estas interações não garantiram um resultado tão pronunciado quanto ao
efeito inibitório e ao índice de seletividade à COX-2.
Para a série F, verifica-se que as melhores energias de acoplamento
ficaram com os compostos F10, F9, F7 e F3. A diferença no grau energético
obtido nos acoplamentos destes quatro compostos, ao receptor, considerando
o maior para o menor valor, é de apenas 0,52kcal/mol, e , novamente,
verifica-se a presença, entre os compostos com as melhores energias de
docking, os derivados F9 e F10, com substituintes 4-Cl e 3,4-Cl2,
respectivamente, também os mais hidrofóbicos da série e novamente
possuidores dos melhores índices de seletividade à COX-2.
101
102
6 CONCLUSÕES
- Foram sintetizadas duas sérias de chalconas heterocíclicas,
derivadas do furano, com rendimentos satisfatórios, compreendidos na faixa
de 41 a 91%, sendo apenas um dos derivados (F10), com rendimento abaixo
desta faixa (27%);
- Todos os compostos foram purificados e caracterizados por
FTIR, RMN-1H, , RMN-13C, onde comprovou-se as estruturas propostas
neste trabalho;
- Durante caracterização, foi identificado por espectroscopia de
RMN, valores de acoplamento J diferentes do esperado. Os compostos foram
submetidos a análise por LC-MSMS, concluindo-se que, a maioria dos
compostos possui mistura diasteroisomérica, onde o isômero E é
preponderante. Considerando a estabilidade dos compostos em estudo, sob
condições variadas, especialmente temperatura, quando misturas
diasteroisoméricas de composição proporcional praticamente equivalente são
obtidas, atribui-se a conformação E, que é a termodinamicamente mais
estável;
- Os compostos sintetizados submetidos a análises in silico, onde
foram avaliados segundo regras de Lipinski através do site molinspiration,
em que nenhuma análise obteve violações de regra, indicando que os
compostos sintetizados são possíveis candidatos a fármacos;
- Os compostos submetidos à analises in silicopor meio da
ferramenta PREadmet, apresentaram valores acima de 91% de absorção HIA
e bons valores de absorção BHE, correspondentes aos valores dos fármacos
de referência, o que demonstra a boa capacidade de transporte e distribuição
em meio biológico;
- Os compostos avaliados por meio da ferramenta PASSonline,
apresentaram valores condizentes a bons candidatos à fármacos,
principalmente em atividades anti-inflamatória e antinociceptiva.
- Os compostos submetidos à análise preliminar de atividade
antiproliferativa em células de osteossarcoma humano, vários apresentaram
resultados superiores ao fármaco referência (57%), com destaque para o
composto F10 com 88,8% de inibição;
- No ensaio de inibição enzimática in vitro COX-1/COX-2, os
resultados foram significativos, com destaque para o composto F10, com IS
103
= 257,5, M7, com IS= 250,8 e M10, com IS=304.6, sendo ainda mais
seletivo que o fármaco de referência avaliado no mesmo ensaio;
-Nodocking molecular com a COX-2, em quese observa que a
melhor energia de docking está com os compostos M10, M7, M4, M9, F9 e
F10, mostrando assim a maior facilidade desses compostos em inibir a COX-
2, o que corrobora os demais resultados obtidos nos ensaios in vitro, e
demonstram o melhor índice de seletividade para estes compostos.
Diante destas constatações, pode-se concluir que as chalconas
heterocíclicas derivadas do furano, apresentam um grande potencial de
aplicabilidade biológica, especialmente, considerando o bom desempenho
apresentado na inibição seletiva da COX-2, a atividade antiproliferativa em
células tumorais de osteossarcoma humano e a grande viabilidade estrutural,
no que se refere as possibilidades de obtenção de novos derivados que, por
sua vez, podem apresentar características moleculares condizentes com os
resultados obtidos neste trabalho. Por exemplo, a presença de substituintes
que configurem à estrutura molecular básica, maior hidrofobicidade,
proporcionando assim, interações mais efetivas no sítio alvo da COX-2, o que
possibilitará a obtenção de inibição seletiva ainda mais pronunciada.
Novos estudos ainda devem ser realizados visando ensaios
toxicológicos, avaliando segurança gastrointestinal e renal, a fim de se
estabelecer maior segurança na aplicação destes compostos em meio
biológico, bem como estudos mais pormenorizados envolvendo a
investigação da relação estrutura-atividade, em termos quantitativos.
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