MICROBIOLOGY

by Šejla Musić

1

MICROBIOLOGY

I. UVOD

Mikrobiologija, ( sama riječ potiče iz 3 grčke riječi, micros=malen, bios =život, logos=nauka) znanost koja istražuje svijet mikroba- tj. microorganizama i acelularnih oblika mikroskopske i submikroskopske veličine (µm = 10-6m , nm = 10 -9m). Te oblike možemo posmatrati samo optičkim ili elektronskim mikroskopom. Mikrobi su veoma zastupljeni kako masom, tako i velikim brojem vrsta na našoj planeti (tj. UBIKVITARNI). Smatra se da je broj kultiviranih vrsta samo 1%. Mikroorganizama ima u tlu, vodi, zraku, tjelu i na tjelu. Nema ih u unutrašnjosti zdravog tijela, cerebrospinalnoj tečnosti, urinu, mokračnom mjehuru, krvi i unutrašnjim organima, izuzetak čine digestivni trakt i gornji dijelovi respiratornog sistema. Mikroorganizmi su velika i veoma raznolika skupina staničnjaka koji u priodi egzistiraju kao jednostaničnjaci , bilo kao Procaryoti ili Eucaryoti. Jednoćelijski mikroorganizmi obavljaju sve životne procese kao i svaki drugi višestanični organizmi. Ta jedna stanica metabolizira, generira (produkuje) energiju i reproducira se samostalno i neovisno od drugih stanica iste ili druge vrste. Iz tog razloga su slobodnoživući jednostaničnjaci organizmi.

STANIČNJACI –mikroorganizmiACELlULARNI OBLICI – virusi i subviralni agensi (patogeni – viroidi, sateliti virusa, satelitne RNA i prioni)

Mikroorganizmi staničnjaci : Bacteria, Archaea (Procaryota) , Protista, Fungi – jednostanične gljive kvasci i pljesni, Plantae – jednostanične alge (Eucaryota). Mikroorganizmi kao i acellularni oblici su vrlo brojna i raznovrsna skupina u pogledu : stanične strukture, metabolizma, ekologije i dr.Mikroobiologija je kompleksna nauka, ona je i bazična ( fundamentalna) i primjenjena nauka. Kao bazična znanost ona ima centralno mjesto među biološkim disciplinama. Proučavanje biologije mikroorganizama pomaže razumjevanju viših organizama. Kao primjenjena znanost bavi se mnogim praktičnim problemima medicine, veterine i industrije.

PODJELA MIKROBIOLOGIJE

• Prema predmetu proučavanja : bakteriologija, protozoologija, mikologija, fikologija i virologija

• Poddiscipline bazične mikrobiologije: mikrobna ekologija, mikrobna genetika, mikrobna morfologija i ultrastruktura, mikrobna taksonomija, mikrobna fiziologija

• Poddiscipline primjenjene mikrobiologije :medicinska mikrobiologija (PATOGENI), veterinarska m., tehnološka m., mikrobiologija voda, zemljišna mikrobiologija, mikrobiologija namirnica i mlijeka, mikrobiologija mora

2

MICROBIOLOGY

MIKROBI I NJIHOV POLOŽAJ U PRIRODI

Whittaker 1969, predložio petocarstvenu klasifikacijsku šemu na osnovu organizacije stanice:

Ova šema ističe diverzitet višestaničnih Eucaryota. Mikroorganizmi čine carstvo Monera, ali neki od njh pripadaju carstvima : Fungi i Planatae. Prema Whittakerovoj šemi carstvu Monera pripadaju: Bacteria, Cyanobacteria i Archaebacteria.Razvoj tehnika molekularne biologije doveo je do sekvenciranja gena i Woes sa svojim saradnicima radi na konparaciji sekvenci rRNA i otkriva filogeniju staničnjaka. Uzimajuči u obzir ranije kriterije u klasifikaciji on predlaže univerzalno filogenetsko stablo. Prema njima, evolucija se odvijala od prapretka (progenot) u 3 pravca (domain) . Kao najviši stupanj biološke klasifikacije na osnovu rRNA 16 S:

• Domen Bacteria• Domen Archaa• Domen Eucaryota

Virusi i subviralni patogeni nisu obuhvačeni ni jednom klasifikacijskom šemom, oni predstavljaju poseban entitet jer ne odgovaraju definiciji organizma.

ULOGA MIKROORGANIZAMA U KRUŽENJU ELEMENATA U PRIRODI∼ SAPROFITI∼ Kruženje elemenata u prirodi∼ Kruženje azota (N), carbona (C), oksigena (O) i u tlu sumpora (S) i fosfora (P)

ULOGA MIKROORGANIZAMA U ŽIVOTU ČOVJEKA

Većina mikroorganizama ne uzrokuju bolesti, dok je samo mali broj patogenih. 1. imaju ulogu u industriji i stočarstvu, azotofiksatori,

3

Nadcarstvo Procaryota

Nadcarstvo Eucaryota

1. Monera::o Bacteriao Cyanobacteriao Archaebacteria

2. Protista3. Fungi4. Plantae5. Animalia

MICROBIOLOGY

2. digestija hrane u lumenu preživara3. biotehnologija – industrija hrane (pekarska i mljekarska industrija), industrija

lijekova (GEMOR – genetički modifikovani organizmi , npr . insulin4. mikroorganizmi i energija (metanogeni)5. mikroorganizmi su omiljeni modeli u fundamentalnim israživanjima 6. zaštita životne sredine (tretiranje otpadnih voda), biološka razgradnja7. ishrana stanovništva.

4

Antonie van Leewenhoek

Luis Pasteur

MICROBIOLOGY

II. KRATAK OSVRT NA RAZVITAK MIKROBIOLOGIJE

Otkričem mikroskopa otkriven je svijet mikroba. Od početka civilizacije ljudi su koristili razne produkte mikroorganizama. Kroz historiju su bile prisutne i razne bolesti čovjeka, životinja i biljaka, za koje se tek kasnije utvrdilo da ih uzrokuju mikroorganizmi.U 6. vijeku, vjeruje se, od kuge je umrlo 100 miliona ljudi, a u 14. vijeku ¼ ukupnog stanovništva Evrope. U početku se vjerovalo da su uzročnici kuge natprirodnog porijekla. Yersinia pestis – uzročnik kuge.

1. Rimski filozof Lucretius (98 – 55 g.p.n.e) je smatrao da bolesti uzrokuju nevidljiva živa stvorenja.

2. Frakastorius (1546.g) iz Verone je u 3 knjige objavio da su uzročnici bolesti živi organizmi koji se sa bolesnih ljudi prenose na zdrave. Italijani uvode prvu karantinu.

3. Svijet mikroorganizama otkrio je Antonie van Leewenhoek, bio je prva osoba koja je posmatrala i opisivala mikrobe pomoču vlastitog mikroskopa koji je uvečavao 300 puta. On je u različitim tekučinama otkrio mnoštvo različitih pokretnih živih bića koje je on nazvao animalicula. O svojim nalazima obavještavao je britansko naučno društvo u Londonu.

4. Luis Pasteur (1822 – 1895). Jedan od najznačajnijih problema, čije je razotkriče bilo presudno u razvoju mikrobiologije, je obaranje teorije abiogeneze – spontane generacije (prema ovoj teoriji vjerovalo se da živa bića sasvim spontano mogu nastati iz nežive materije. Da se žabe formiraju iz blata, a insekti od ostataka jela, je bilo veoma rasprostranjeno mišljenje tog vremena, a da bi se to dokazalo načinjen je intersantan pokus – crvanje mesa je dokaz nastanka crva iz nežive materije). Jednostavnim pokusom, bocom čiji je grlič bio u obliku guščjeg vrata, dokazao je da su mikroorganizmi iz zraka kontaminanti hrane. Paster je otkrio pravu prirodu fermentacije i dokazao da to nisu hemijski več biološki procesi, te da su posljedica aktivnosti mikroorganizama. To je omogućilo razvitak industrijske mikrobiologije. Paster je izumio ezu, pasterizaciju, vještačke tečne hranjive podloge za razvoj mikroorganizama,

5

Robert Koch

Christian Gram

MICROBIOLOGY

sterilizaciju, prvi je otkrio anaerobiozu (život bez prisustva kisika), priredio je prve vakcine protiv antraksa, bjesnila.

5. Bakteriološku tehniku dorađuje i usavršava njemački ljekar Robert Koch (1843 – 1910). Prvi je dokazao da su mikroorganizmi uzročnici zaraza. Bakterije antraksa našao je u krvi zaražene ovce. On je malu količinu te krvi injektirao u zdravu ovcu, i ponovio je postupak 20 puta. Svaki put je našao bakterije u krvi životinje. Koch je otkrio uzročnike antraksa, tuberkuloze, azijske kolere, uveo je bojenje bakterija anilinskim bojama, prvi je razvio metodu čistih kultura, pravio je čiste hranjive podloge. Koch postavlja kriterije za utvrđivanje etiologije (uzročnik) bolesti, koji su poznati kao kochovi postulati:

1) isti mikroorganizam nalazi se u svim slučajevima odgovarajuče bolesti,

2) on se izoluje i uzgaja u čistoj kulturi,3) unošenjem čiste kulture mikroorganizama izaziva se bolest4) isti mikroorganizma izdvaja se iz oboljelog domačina

ZLATNO DOBA MIKROBIOLOGIJE (1857 – 1919)

• period intenzivnog traganja za uzročnicima bolest• Albert Neisser – otkrio Neisseria gonorrhoeae• Edwin Klebs - Klebsiella pneumoniae• Kiyoshi Shiga – Shigella• Ilija Mešnjikov – prvi je objasnio otpornost organizma

prema zaraznim bolestima, otkrio je fagocitozu i samoodbranu organizma

• Christian Gram – uveo difernecijalno bojenje bakterija • Dimitri Ivanovski – otkriva viruse kao uzročnike bolesti

(tobaco mosaic virus)• Aleksandar Fleming (1929) -svojim pronalaskom pencilina otkriva novo

poglavlje u mikrobiologiji – antibiotici

Rezultati suvremenih istraživanja fundamentalne mikrobiologije dali su izvanredan doprinos uopšte u biologiji, a naročito u razvoju genetike, biohemije, fiziologije. Suvremen istraživanja molekularne biologije i genetičkog inžinjerstva dovela su čovječanstvo na prag nove industrijske ere. Danas se ljudski geni kloniraju i ekspresiraju u stanice bakterija pa i eukariota, pa se industrijski proizvode insulin, faktor rasta, interferon. Patogeni mikroorganizmi su uglavnom pod kontrolom, za razliku od acelularnih oblika koji uzrokuju bolesti poput ptičijeg gripa, AIDS-a, SARS-a. Zarazne bolesti su stolječima bile uzrok smrti velikog broja stanovništva, a danas,

6

MICROBIOLOGY posebno u razvijenim zemljama, one imaju manji značaj, ipak u zemljama koje su u razvoju zarazne bolesti su i dalje uzročnik smrti stanovništva. Iako su neke bolesti u svijetu iskorjenjene, još uvijek traje borba protiv malarije, kolere, TBC, dijareičnih oboljenja i dr. Pored visokog stupnja nauke još uvijek se traga i otkrivaju novi uzročnici oboljenja čovjeka i životinja

• 1976 – legionarska bolest, otkrili naučnici iz CDC-a (centar za kontrolu i prevenciju bolesti) u Atlanti, uzročnik bakterija- Legionella pneumophila.

• 1981 - AIDS• 1985 - sindrom toksičnog šoka – Toxini bacteria

III. PROKARIOTSKA CELLULA – osnovna građa

Prokarioti su opšte rasprostranjeni tj. ubikvitarni, žive u vodi, tlu, u i na nekim biljkama, životinjama i čovjeku, svuda oko i unutar nas. Prokarioti se odlikuju brzim rastom, kratkim životom generacija i izuzetnom fiziološkom raznolikošću. Bacteria i Archaea su jednostaničnjaci sa organizacijom stanice prokariotskog tipa – prokarioti. Razlike između ove dvije grupe mnogo su više molekularne nego strukturne. Među prokariotima ima i višestaničnih organizama, ali njihove stanice nikada ne grade organizovana tkiva. Prokarioti su uglavnom malih dimenzija, uglavnom 1 – 5 µm, ima ih izuzetno manjih koji se mogu uočiti samo EM. U protoplazmi prokariota uglavnom se ne mogu zapaziti nikakve strukture. U velikim stanicam npr. roda Bacillus u optimalnim uvjetima mogu se zapaziti inkluzije (tj. rezervne materije) i endospore. U nekim slučajevima stanice bakterija možemo posmatrati jedino nakon bojenja, a neke od bakterija kao npr. Mycoplasma (najsitnije), Rickettsia i Chlamidija možemo posmatrati EM. S obzirom na njihovu veličinu, fine strukture prokariotskih stanica možemo istraživati iskljućivo pomoću EM.

Osnovne razlike u građi prokariotske i eukariotske stanice :1. jedrovo područje – nukleoid, nije jedrovom membranom odvojeno od osnovne

citoplazme,2. odsustvo memebranskih organela u prokariota,3. prokarioti se razmnožavaju samo binarnom fisijom (dvojno djeljenje) – djeljenje

predačke stanice na dvije nove.

7

Opča građa prokariotske stanice

MICROBIOLOGY

Prokarioti nemaju ćelijskog ciklusa, u nuklarnom području nemaju nukleolus niti formiraju mitotički aparat. Uglavnom, sve funkcije organela preuzima membrana na jedan specifičan način. Pri diobi stanice pravilno raspoređvanje replicirane molekule DNK u novonastale stanice potomke obavlja plasmamembrana na koju je zakačen bakterijski ˝hromosom˝. Plasmamembrana prokariota obavlja razne i brojne fujnkcije jer ima mogučnost da svoju reakcionu površinu znatno poveča. Pomoču EM mogu se zapaziti intracitoplazmatske membranske strukture u formi vezikula, lamela i tubula koje su locirane na površini stanice ili dublje u citoplazmi. Takve strukture nastaju invaginacijom plasmamembrane sa kojom ostaju u kontaktu. Prema tome, brojne funkcije za koje eukarioti posjeduju specijalizirane organele u prokariota obavljaju intracitoplasmatske membranske strukture – MESOSOMI, tj. plasmamembrana.Stanica prokariota osim plasmamembrane ima i staničnu stjenku. Morfološki, prokarioti su stabilni zahvaljujuči građi njihove stijenke. Osim stjenke, prokarioti mogu posjedovati strukture s vanjske strane staničnog zida u obliku kapsule i sluzavog ovoja, a poznate su pod zajedničkim nazivom glikokaliks. Unutar plasmamembrane je protoplazma, središnji dio stanice je nuklearno područje – nukleoid, koje je elektronski gušće od ostale protoplazme. U nukleoidu je smješten i ˝hromosom˝, njega čini jedna izuzetno duga i specifično upakovana prstenasta molekula DNK koja nije povezana sa histonima. Npr. E. Coli ima bakterijski hromosom hiljadu puta duži od njene stanice. U okolnoj citoplazmi zapažaju se ribosomi koji mogu biti u tolikoj masi prisutni, da cijeloj citoplasmi daju granuliran izgled i mogu maskirati ostale strukture u stanici, ribosomi su 70 S. Rezervne materije prokariota pohranjuju se u vidu granula koje nazivamo inkluzije. Neke od njih su jedinstvene za prokaryota kao npr. lipoidi u formi polyhidroksibuterne kiseline (PHB).

8

MICROBIOLOGY U vezi sa ishranom, bakterije pokazuju specifičnost budući da nemaju nikakvih specijaliziranih struktura za prihvatanje čestica hrane niti imaju mogučnost da fagocitiraju hranu zbog čvrste stanične stjenke, zbog toga su limitirane u iskorištavanju hrane i mogu da koriste samo materije otopljene u vodi, a uzimaju ih cijelom svojom površinom, dok su drugi prokarioti autotrofi.Prokarioti mogu biti pokretni i nepokretni. Kreću se pomoču flageluma, aksijalnih niti i sluznim pokretima.

Morfološki oblici Prokaryota

Prokaryoti žive kao pojedinačne forme – jednostaničnjaci ili se akomuliraju u stanične nakupine u vidu lanca, grozda. Neki oblici prokariota su višestanični ali nikada ne grade tkiva i organizirani su u vidu kolonija, micelija ili grade duge filamentozne niti, tzv. trihome.

Veličina stanica

Dužina stanica se kreče od 0,3 – 20 µm (prosječno 1,5 µm dužina, a promjer 1µm), promjer od 0,2 – 2 µm. Kod prokariota odnos površine nasparam volumena znatno je povečan ( u korist površine). Svjetlosnim mikroskopom može se odrediti veličina, osnovni oblik i pokretljivost bakterija.

Osnovni oblici

Postoji 3 osnovna oblika: • kuglas – cocccus • štapićast – bacillus• spiralan – spirillum

Netipični oblici:• kvadar – arcula – otkrivene u jezerima blizu crvenog mora• zvijezda (astra, stella) - zvjezdaste

Prelazni oblici:• kokobacili• polimorfne bakterije : mikoplasme – nemaju staničnu stijenku

9

Sl. br. TRIHOM

MICROBIOLOGY

1

KOKI – prema obliku mogu biti okrugli, ovalni ili poput zrna graha, promjera 0,5 – 5 µm. Mnoge bakterije dolaze kao pojedinačne stanice, međutim, nakon diobe stanice mogu ostati spojene. Mogu se dijeliti u jednoj, dvije ili 3 ravni pa o tome ovisi i njihov raspored:

• diplokoki – stanice u parovima• streptokoki – lančasta tvorevina• stafilokoki – grozdaste tvotevine• tetrada – 2 ravni dijeljenja, po 4 u skupini• sarcine – po 8 zajedno (3 ravni dijeljenja)

1 Straight rod – sraight = prav, rod = štap, stapiči ili bacilli,branching = račvanje,

10

Streptococcus

MICROBIOLOGY BACILI su štapići različite dužine i promjera. Njihovi krajevi mogu biti ravni ili zašiljeni. Dijele se samo u jednoj ravni, tj. po kračoj osi, a prema međusobnom razmještaju mogu biti pojedinačni, u lancima ili palisadama.

SPIRALNE BAKTERIJE su zavinute bakterije sa zavojima različite veličine, broja i oblika. One mogu imati 1 ili više zavoja. Dužine su od 5 – 20 µm, a promjera 0,1 – 0,5µm. Vibrio je u obliku zareza, dok su druge Spiroheta. Spirilla imaju izrazito spiralan oblik, one se za razliku od spiroheta koje se kreču pomoču aksijalnih niti , kreču pomoču flageluma.

VANJSKI OMOTAČI PROKARIOTA

1. GLYCOKALIKS

11

Bacillus subtilis

Kapsula

Sluzavi omotač

MICROBIOLOGY Bakterijske ćelije su zaštičene staničnom stijenkom. Osim stijenke, prokarioti mogu imati strukture koje se nalaze s vanjske strane stijenke, koje nazivamo glikokaliks. To je želatinozan, viskozan i ljepljiv polimer, obično građen od homo, heteropolisaharida polypeptida ili proteinsko polisaharidnih kompleksa. Sintetizira se u citoplazmi stanice i luči izvan nje. Ukoliko je glikokaliks kompaktne građe, čvrsto priljubljen uz ćelijsku stijenku i čvrstine gela, naziva se capsula (čahura), a ukoliko je slabo priljubljen uz stijenku, fleksibilan, difuzan i rastresit naziva se sluzavi omotač. Oni se u svjetlosnom mikroskopu boje negativnim bojenjem (nigrozin – boja). Kapsula nije od životne važnosti za bakterije, za razliku od stanične stijenke, ali im daje selektivnu prednost , također nekim patogenima omogučuje preživljavanje.

Uloge kapsule:

1. zaštita bakterijske stanice od isušivanja,2. omogučuje bakteriji prijanjanje za razne površine,3. neke patogene štiti od fagocitoze

Npr. Streptococcus pneumoniae preživi fagocitozu, Streptococcus mutans (uzročnik karijesa) lući kapsulu u prisutnosti šećera saharoze, a koja mu omogučava prihvatanje za zubnu gleđ. Prema debljini i konzistenciji razlikujemo: mikrokapsule (0,2 nm) i makrokapsule (deblje od 0,2 nm). Kod Gram- bakterija kapsule su heteropolisaharidne i poznate su kao somatski O (out) antigeni, npr. Salomonella ima nekoliko stotina antigena.Sluzavi omotači su homopolisaharidi, npr. Leuconostoc mesenteroides ima kapsulu od dekstrana

12

MICROBIOLOGY

2. STANIČNA STIJENKA

Njena struktura je polukruta, nalazi se vanjske strane membrane, od vitalnog je značaja za bakterije (ne mogu opstati bez nje). Stijenka je jedan od najvažnijih dijelova prokariotske stanice iz više razloga:

1. daje oblik i čvrstoću stanici i održava njen intergritet,2. štiti stanicu od osmotske lize. Usljed visoke koncentracije rastvorenih

supstanci u unutrašnjosti bakterijske ćelije, osmotski pritisak je izuzetno visok, npr. u stanici E. Coli osmotski pritisak iznosi 2 atm (kao napuhana automobilska guma),

3. štiti stanicu od raznih mehaničkih oštečenja,4. ima ulogu citoskeleta,5. komponente stjenke mogu doprinositi patogenosti bakterije, sadrže

endotoksine (toksini koji se oslobađaju nakon smrti bakterijske stanice),6. stjenka predstavlja barijeru za neke toksične supstance i biološke agense, ona

predstavlja i mjesto djelovanja nekih antibiotikaIz tog razloga njeno proučavanje nema samo teorijski več i praktični značaj.Chrisitian Gram 1884.g. je uveo tehniku bojenja bakterija, i na osnovu reakcije na bojenje sve bakterije se mogu svrstati u 2 grupe:

• Gram pozitivne (G+) i• Gram negativne (G-).

Tek razvojem elektronske mikroskopije bila je vidljiva razlika u građi stijenke ove dvije grupe. Stjenka G- bakterija je tanka, tanja od G+ stjenke. Takva stjenka (G-)je višeslojna struktura i znatno kompleksnije građena u odnosu na stijenku G+ bakterija koja sadrži jedan tip molekule i znatno je deblja. (One bakterije koje su

nakon bojenja ljubičaste = G+, a one koje su crvene = G- bakterije.) Posmatrano EM (electron microscope), uočavaju se značajne razlike u strukturi 2 tipa stjenke. Stjenka G+ bakterija je građena od debelog sloja peptidoglikana (murein), dok je u stjenci G- bakterija tanki sloj peptidoglikana smješten u periplasmatskom prostoru i okružen s

vanjske strane tzv. vanjskom membranom.

13

Građa stanične stijenke G+ i G- bakterija

MICROBIOLOGY

Peptidoglikan i murein

Peptidoglikan je gigantska makromolekula, koja poput fino tkane vreče obavija bakterijsku stanicu. Peptidoglikan je polimer koji je izgrađen iz polisaharidno – proteinskog dijela. Osnovna podjedinica koja se ponavljaje glikantetrapeptid (murein) koji je izgrađen od disaharida, 2 aminošećera – NAG (N-acetyl glukozamid), NAM (N-acetyl muraminska kiselina). NAM je isto što i NAG , s tim da je za NAM vezana mliječna kiselina i protenski dio podjedinice čini tetrapeptid građen od 4 aminokiseline. Ova jedinica se sukcesivno ponavlja u molekulu peptidoglikana. Kičmu polimera čine naizmjenično poredani šećeri NAM i NAG koji su međusobno povezani β 1,4 – glikozidnim vezama. Na svakom molekulu NAM vezan je tetrapeptidni lanac. Tetrapeptid čine naizmjenično poredane D i L forme aminokiseline. Dugi paralelni mureinski lanci međusobno su povezani u mrežastu strukturu, bilo direktnim peptidnim vezam, bilo peptidnim mostovima.

U G- bakterija, DAP2, i to njena amino grupa je povezana sa COOH grupom D ala u drguom polipeptidnom lancu, dok su kod G+ bakterija mureinski lanci umreženi različitim peptidnim mostovima. Peptidni most predstavlja kratki lanac aminokiseline npr. kod Staphilococcus aureus rijeć je o pentaglicinskom mostu, tj. 5 aminokis. glicina.

Gusta peptidoglikanska mreža je dovoljno čvrsta da održi oblik i integritet, ali istovremeno dovoljno elastična za razliku od celulozne stijenke. Do sada je otkriveno oko 100 različitih tipova peptidoglikana. Razlika je između mostova, nejčešće mostove grade trycin, aspartman, treonin. Treba istači da su neki sastojci peptidoglikana jedinstveni u živom svijetu, kao npr. NAM i DAP (DAP ima jednu dodatnu COOH grupu za razliku od lizina). Kod eukariota svi proteini su građeni od jedne forme aminokiseline = L forme, dok u sastavu peptidoglikana prokariota, dvije aminokiseline su D konformacije, D alanin i D glutamin.

2 DAP- diaminopimelinska kiselina14

MICROBIOLOGY

Stjenka G+ bakterija

Oko 90 % čini peptidoglikan. Peptidoglikanska mrežica je višeslojna, u prosjeku oko 20 slojeva. G+ stjenka osim peptidoglikana obično sadrži i jednu drugu molekulu teihonska kiselina – jednistvena za prokaryota. Teihonska kiselina je kiseli polisaharid koji predstavlja polimer glicerolfosfatne ili ribitolfosfatne kis., koje su međusobno povezane esterskom vezom. Aminokiseline poput D alanina ili šečer glukoza vezani su za glicerol ili ribitol. Molekule teihonske kiseline kovalentno su vezane za peptidoglikanske lance. Ukoliko su ove molekule vezane za membranske lipide, takva kiselina se naziva lipoteihonska kiselina. Završeci molekula teihonske kiseline strše izvan stijenke pa i kapsule prokariota. Funkcije teihonske kiseline:

• važna je u održavanju strukture stijenke, buduči da ima negativan naboj doprinosi negativnom naboju stanične stijenke,

• moguče je da regulira prolaz katjona kroz stjenku, • smatra se da učestvuje u rastu stanične stijenke.

15

MICROBIOLOGY

16

Dijagram peptidoglikanske mrežice Staphylococcus aureus . G = N-acetyl-glucosamine; M = N-acetyl-muramic acid; L-ala = L-alanine; D-ala = D-alanine; D-glu = D-glutamic acid; L-lys = L-lysine

Struktura muraminsko kiselinske jedinice peptidoglikana kod E. coli , ovaj tip mureina je prisutan kod G- bakterija. N-acetylglucosamine (G) and N-acetylmuramic acid (M). Prikačena N-acetylmuramic kiselina je tetrapeptid, sastavljena od L-ala-D-glu-DAP-D-ala.

MICROBIOLOGY

V. GRAM NEGATIVNA STIJENKA

Stjenka G- bakterija je višeslojna i kompleksnije građena u odnosu na stijenku G+ bakterija. Osim sloja peptidoglikana ona sadrži još jedan vanjski sloj koji se naziva vanjska membrana. Između plasmamembrane i vanjske membrane nalazi se periplazmatski prostor u kojem se nalazi 1-2 sloja peptidoglikana. Stijenka G- bakterija sadrži 5- 10 % peptidoglikana, ona nema teihonsku kiselinu. Umjesto nje u sastavu stijenke nalaze se 2 vrste molekula jedinstvene za G- bakterije, to su LIPOPOLISAHARIDI I LIPOPROTEINI. Lipopolisaharidi (LPS) su u sastavu vanjske membrane, dok lipoproteini povezuju vanjsku membranu sa peptidoglikanskim slojem. G- bakterije su osjetljivije na mehanička oštećenja u odnosu na G+ zbog male količine peptidoglikana. Veza između vanjske membrane i peptidogilkana pomoču lipoproteina je tako čvrsta da se stijenka izdvaja kao cjelina. Lipidni dvosloj vanjske membrane ima asimetričnu građu, u vanjskom sloju su LPS , a u unutrašnjem fosfolipidi. LPS je karakterističan samo za G- bakterije. Ta jedinstvena makromolekula građena ja od 3 komponente, jedne lipidne i dvije polisaharidne: lipid A, središnji polisaharid (polisaharidna jezgra), polisaharidni postranični lanac (O-specifični bočni lanac ili O-antigen). Lipid A je

bazalna podjedinica LPS, građena od disaharida (N-acetylglikozamin fosfata) za koji je vezano nekoliko lanaca nepolarnih molekula masnih kiselina (kopionska, palmatinska , laurinska). Za mnoge toksične efekte patogenih bakterija poput Salmonella, E.coli, Vibrio cholerae, Pertutis i dr, odgovorne su upravo komponente LPS-a, osobito lipid A, njegove masne kiseline djeluju kao endotoksini koji primarno djeluju na makrofage, uskijed čega oni oslobađaju supstanece koje mogu izazvati šok, groznicu, povišenu temperaturu i dr. simptome bolesti. Na lipid A vezana je druga komponenta LPS- središnji polisaharid. To je razgranat polisaharidni lanac sastavljen od 6 C šećera, glukoza, galaktoza i glikozamin kao i dr.

17

MICROBIOLOGY šećeri npr. heptuloza i 2 keto 3 desoksioktant, koji nisu poznati ni u jedne druge grupe organizama.

O- polisaharid se nalazi na samoj vanjskoj površini stijenke. Njegov lanac čini 40 ili više repetativnih jedinca, svaka jedinica je građena od šećera heksoze (6C). O- polisaharid je osnovni površinski antigen G- bakterija, a predstavlja i mjesto prepoznavanja za vezivanje nekih bakteriofaga. O- antigen je izuzetno varijabilan kod različitih G- bakterija pa čak i među sojevima iste vrste. Takva varijabilnost može pretstavljati veliki problem za imuni odgovor organizma. Npr. bakterija E.coli je normalan stanovnik debelog crijeva čovjeka, ali u slučajevima koloniziranja drugih područja organizma, najčešče urogenitalnog trakta, cerebrospinalne tekučine može postati opasan patogen. Na takvim lokacijama bakterije su perzistentne upravo zbog varijabilnosti O- antigena koji mutira tako brzo iz generacije u generaciju stvarajući nove tipove antigena koji ne mogu prepozanti ranije formirana antitjela.Vanjska membrana je relativno propusna za molekule i jone u odnosu na plasmamembranu, međutim nije propusna za protone, enzime i dr. velike molekule, npr. sprečava izlazak enzima iz periplazmatskog prostora. U sastavu vanjske membrane nalaze se porini - proteinski kanali za transport malih molekula i jona (njihov broj kod E.coli je preko 100 000). Največi porini propuštaju molekule mase 5000 D. Porin je transmembranski protein građen od 3 identične proteinske jedinice (proteinski trimer) koji udruženo formiraju mali kanal prečnika 1nm. Postoji mehanizam otvaranja i zatvaranja kanala. Razlikuju se specifični i nespecifični porini. Nespecifični (neselektivni) kanali su ispunjeni vodom i kroz njih prolaze male molekule, dok specifični imaju specifična vezna mjesta za jedan ili više tipova molekula. Vanjska membrana je manje osjetljiva na razne detrđente i razgradnju žučnim solima, ona sprečava ulazak nekih antibiotika.

18

MICROBIOLOGY

Funkcija vanjske membrane

Izrazito negativan naboj važan je pri izbjegavanju fagocitoze, ona je barijera za protone, enzime i neke štetne tvari, detrđente, teške metale. Važna funkcija je transport materija kroz membranu. Sadrži receptore za bakteriofage i bakteriocidin.

Periplazmatski prostor

Debljina periplazmatskog prostora je od 12 – 15 nm, želatinozne konzistencije (gel) usljed velike koncentracije proteina. U njemu se nalazi tanak sloj peptidoglikana, uglavnom su prisutna 3 tipa proteina:

1. prva skupina su hidroliotički enzimi uključeni u degradaciju molekula hrane (peniciloze, deanoze, fosfataze)

2. drugi tip su transportni (vezani) proteini specifične male molekule koje su prošle kroz porin i dovode ih do specifičnih proteinskih nosača i kanala u plasmamembrani.

3. hemoreceptori – proteini uključeni u hemotaksiju (kretanje uslovljava raznim receptorima)

NETIPIČNE STIJENKE

Predstavnici Mycoplasme nemaju staničnu stijenku te stoga nemaju stalan oblik, pa su pleomorfne. One prolaze kroz mikrobiološke filtre i dugo su se smatrale virusima. One mogu preživjeti bez stjenke jer imaju neobično čvrstu plasmamembranu i žive u osmotski zaštičenim staništima kao sto je npr. unutrašnjost tijela životinje. Neke mikoplazme imaju sterole (holesterol) koje dodatno učvrščavaju njihovu strukturu. Archaea nemaju stijenku od peptidoglikana nego od pseudopeptidoglikana kod kojeg je NAM zamjenjen nekim drugim šećerom i nedostaju D-aminokis. u tetrapeptidnom lancu. Druge Archaea imaju stijenku isključivo od polisaharida, proteina, glikoproteina npr. halobakterije obitavaju u staništima sa izuzetno visokim salinitetom, imaju stijenke od glikiproteina. Bakterijske mutante sa defektnom stijnkom nakon njihovog izlaganja hemikalijama i antibioticima nazivaju se L forme (prema Listerovom institutu u Londonu). Večna L formi če ponovo sintetizirati svoju stjenku kada se štetni agens ukloni, međutim neke če permanentno izgubiti sposobnost ponovne sinteze stjenke. Zbog njihove osmotske osjetljivosti L forme je teško izolirati i indentificirati u većini laboratorija. Moguče je da su one odgovrone za neke

19

Mycoplasma

MICROBIOLOGY infektivne bolesti čiji uzročnik do sada nije izoliran u kulturi. L forme nisu osjetljive na antibiotike koje djeluju na peptidoglikane poput pencilina.

Oštečenja stanične stjenke

Enzim lizozim koji je sastojak suza, pljuvačke i sluzi katalizira hidrolizu glikozidnih veza između NAM i NAG u peptidoglikanskom lancu čime se razara G+ stjenka i dolazi do rasprskavanja bakterijske stanice. Ako se doda osmostski stabilizator i ne dođe do osmotske lize dobije se loptasta stanica bez stjenke koja se naziva PROTOPLAST. Ukoliko lizozim djeluje na G- bakterije nastaje SFEROPLAST (ostala je vanjska membrana). Dodavanjem supstance EDTA, može se od sferoplasta dobiti protoplast. Sferoplast i protoplast rasprskavaju se u vodi i u vrlo razrijeđenim rastvorima soli i šećera. Neki antibiotici npr. pencilin onemogučavaju formiranje poprečnih peptidnih veza i mostova i na taj način sprečavaju sintezu stanične stjenke. G- bakterije su mnogo osjetljive na ovaj antibiotik jer je njihova membrana otporna na ovaj antibiotik.

20

MICROBIOLOGY

VI. SINTEZA STANIČNE STIJENKE

Tokom rasta bakterijske ćelije za vrijeme procesa njene diobe novosintetizirane glikanske jedinice ugrađuju se u postojeću stijenku da se ne bi narušio integritet stanice. Taj proces odvija se na različitim mjestima kod koka i bacila. Sinteza nove stijenke kod koka odvija se samo na jednom mjestu tj. one imaju samo jednu zonu rasta, dok bacili imaju nekoliko zona rasta. Djelovanjem staničnog enzima autolizina u makromolekularnoj strukturi peptidoglikana nastaju sičušni otvori koji se istovremeno popunjavaju novim materijalom stijenke. Mjesta spajanja nove i stare stijenke vidljiva su poput ožiljka na stijenci G+ bakterija.

Biosinteza peptidoglikana

Cijepanje veza u postoječem peptidoglikanu i uklapanje novosintetiziranog peptidoglikana u nastale otvore odvija se istovremeno. Kako se taj proces nastavlja, povečava se volumen ćelije tj. dvostruko se povečava njena dužina i konačno se formira septum (poprečna pregrada) čime je dioba stanice završena. Većina spoznaja o biosintezi peptidoglikana bazirana je kod Staphylococcus aureus. Lipidni nosać – bactoprenol učestvuje u sintezi stjenke. Bactoprenol je izoprenoidni alkohol i ima 55 carbonova atoma, koji je fosfodiesterskom vezom vezan za NAM na koji je zakačen peptidni most, na koji se potom veže NAG. Bactoprenol omogučava transport glikanske jedinice kroz hidrofobni dio lipidnog matriksa membrane, gdje če se ona potom ugraditi u zoni rasta stjenke. Nakon ugradnje glikantetrapeptida u rastuču stjenku bactoprenol se ponovo

21

MICROBIOLOGY vrača kroz membranu u citoplazmu gdje kupi novu prekurzorsku jedinicu stjenke. Završna faza u sintezi stijenke je poprečno umnožavanje tj. formiranje peptidne veze između susjednih mureinskih lanaca. Taj proces se naziva transpeptidacija. Antibiotik pencilin inhibira transpeptidaciju usljed čega dolazi do slabljenja transpeptidoglikana, lize i smrti bakterijske stanice.

PLASMAMEMBRANA PROKARYOTA

Tanka struktura, koja se nalazi na periferiji prokariota debljine oko 8 nm. Osnovu membrane čini fosfolipidni dvosloj. Ima trilaminaran izgled, usljed bojenja osmiumtetraoksidom. Viskozitet membrane odgovara viskozitetu maslinovog ulja, ona je vrlo dinamična struktura.Singer i Nicolson – model fluidnog mozaika, prema ovom modelu u lipidnom matriksu su nepravilno uronjeni proteini koji membrani daju mozaičan izgled. Ca2+ i Mg 2+ u konbinaciji sa negativno nabijenom glavicom (fosfolipida) stablizuju membranu, prisutne su vodikove veze i dr. Bakterijska membrana za razliku od eukariotske ne sadrži holesterol, izuzetak su mikoplasme koje nemaju staničnu stjenku pa u svojoj membrani sadrže holesterol. Mikoplazme ne mogu sintetizirati holesterol, nego ga uzimaju iz sredine ili iz hranjive podloge. Membrana nekih prokariota ipak sadrži HOPANOIDE koji su strukturno slični holesterolu pa se smatra da imaju i takvu funkciju, tj. da učvršćuju dodatno membranu. Proteini u citoplazmi prema rasporedu mogu biti: integralni (transmembranski) i periferni, a ugljeni hidrati su vezani na vanjskoj strani za lipide i proteine.

Membrana Archaea

Membranski lipidi arhea hemijski su jedinstveni. Za razliku od membranskih lipida eukariota, kod kojih su masne kiseline vezane esterskom vezom, u arhea su hidrofobni bočni lanci povezani lanci povezani eterskom vezom. Umjesto masnih kiselina, lipidi arhea sadrže duge lance hidrocarbona, koji su građeni od repetitivnih jedinica izoprena.

Funkcija plasmamembrane

Plasmamebrana je izuzetno organizirana struktura koja je izuzetno fleksibilna, to je vitalna struktura. Ona obavlja mnoštvo funkcija koje kod eukariota obavljaju mnoge organele. Funkcije plasmamembrane :

1. okružuje stanicu i odvaja je od okoline,2. obavlja transport u stanicu i iz stanice,

22

MICROBIOLOGY

3. mjesto je obavljana značajnih metaboličkih procesa (respiracija, fotosinteza, sinteza lipida i stanične stijenke, replikacija bakterijskog hromosoma i učešće u diobi stanice)

4. sadrži specifične receptore kojima bakterija otkriva signale iz okoline i odgovara na njih,

5. transport tvari kroz membranu:• pasivni i aktivni transport,• pasivni transport: osmoza, olakšana i prosta difuzija,• tvari topive u lipidima: O2, CO2, steroidni hormoni,• olakšana difuzija

Permeaze – nosaći. Največi broj bakterija izlučuje ekstracelularne enzime koji razgrađuju polimere koji se permeazama unose u bakterije.

Pasivni transport

Osmoza je difuzija H2O kroz membranu, ovisi o relativnoj koncentraciji otopljenih tvari u citoplazmi i ekstracelularnom prostoru. Većina bakterija obitava u hipotoničnoj otopini, tj. koncentracija otopljenih tvari je do 1000 puta veća u citoplazmi nego u spoljašnjoj sredini. Ona može akumulirati vodu zahvaljujuči ć. zidu, a ako pređe tu granicu stanica bubri, a taj proces se naziva PLAZMOPTIZA. U hipertoničnoj otopini stanica se smežura – PLASMOLIZA.

Aktivni transport

Većina molekula u bakterijsku stanicu ulazi aktivnim transportom. Energija za aktivni transport potiče od ATP-a i protonske sile. Isključivo se aktivni transport odvija se kroz proteinske nosače , postoje tri načina aktivnog transporta: uniport, symport i antiport.

Translokacija grupe (premještanje grupe)

To je mehanizam transporta jednistven za prokariote, to je proces u kojem se supstanca tokom transporta kroz membranu hemijski modificira. Najbolje je proučena translokacija šećera kod E.coli, šećera glukoze, manoze, laktoze, NAG i β glukozida, a naziva se fosfotransferazni sistem. Kod E.coli on uključuje 24 proteina od kojih 5 proteina učestvuje u translokaciji šećera glukoza. Energija za odvijanje translokacije P-skupine dobija se hidrolizom jednog ključnog intermedijarnog jedinjenja = fosfoenol piruvat. Proteini fosfotransferaza sistema primaju fosfatnu skupinu od donora i kaskadno se fosforiliziraju, tj. prenose je od jednog do drugog proteina u sistemu predajuči je zadnjem proteinu u nizu. To je zadnji protein, npr. EnzIIc, koji je transmembranski protein i koji transportira a ujedno i fosforilizira šećer glukozu. Kada transportovana supstanca uđe u stanicu

23

MICROBIOLOGY doći če do njene defosforilizacije ili može da učestvuje u metabolizmu glukoza 6 fosfata. Glukoza 6 fosfat može ući u stanicu jer ne postoji elektrohemijski gradijent za tu supstancu. Translokacija grupe je veoma važan način transporta u slučaju kada je u okolini malo hranjivih materija. Jonofori su produkti sinteze nekih bakterija koji djeluju letalno na neke mikroorganizme. Ugrađuje se u kompetitorsku vrstu, to su hidrofobni polipeptidi u formi kanala ili mobilnih nosaća. Neki antibiotici su jonofori npr. vankomicin , kanal za jone kalija, koji kada se ugradi u plasmamembranu bakterije omogučava isticanje kalija iz bakterije, zatim tirocin – proteinski kanal za monovalentne katjone, gramicidin – za H+ jone. Svi joni koji prolaze kroz jonofore transportuju se pasivnim transportom.

Mesosomi

Invaginacije (ubori) plasmamembrane u obliku vezikula, cjevčica ili lamela. Obično se nalaze blizu mjesta gdje se stanica dijeli. Unatoč višegodišnjim istraživanjima funkcija im nije poznata. Moguče je da učestvuju u stvaranju poprečne pregrade i pričvrščenju bakterijskog hromosoma, i njihovoj distribuciji u stanice potomke. Neki znanstvenici smatraju da mesosomi učestvuju u sintezi ATP-a i izlučivanju enzima izvan stanice. Moguće je da su mesosomi artefekat, tj. hemijski različiti dijelovi membrane koji prilikom izrade preparata za EM, fiksativom bivaju prikačeni. Unutarmembranski sistem je kompleksan i razvijen kod fotosintetskih bakterija, cyanobakterija i purpurnih bakterija, nitrofiksatora, kao i kod bakterija sa visokim stupnjem invaginacije plasmamembrane. Invaginacije plasmamembrane povečavaju aktivnu, odnosno reaktivnu površinu i obavljaju sve funkcije koje inače kod eukariota obavljaju organele.

24

MICROBIOLOGY

25

MICROBIOLOGY

VII. POKRETLJIVOST PROKARIOTA

Većina pokretnih prokariota se kreče pomoču specijalnih lokomotornih organela – bičeva, neke bakterije kreču se klizeči po podlozi, zahvaljujuči fleksibilnoj staničnoj stijenci, a spirohete se kreču pomoču fibrila ili aksijlnih niti , dok neki vodeni mikroorganizmi regulišu svoj položaj u vodi pomoču gasnih (plinskih) vakuola.

FLAGELE (BIČEVI)

Karakteristični su za većinu pokretnih prokariota. To su dugački i tanki izdanci na površini bakterijske stanice, čiji je jedan karja pričvrščen za stanicu. Mogu se uočiti specijalnim bojenjem u svjetlosnom mikroskopu u mikroskopijom u tamnom vidnom polju dok se u nativnim preparatima bakterija ne vide. Na osnovu razmještaja bičeva razlikuju se 4 tipa:

1. monotrihan – imaju jedan bič na jednom polu,2. amfitrihan – bakterija ima dva biča na dva suprotna pola3. lofotrihan – bakterija ima čuperak bičeva na jednom polu4. peritrihan – bičevi raspoređeni na cjeloj površini bakterijske stanice

Bič je obično duži od stanice, nekada i do nekoliko puta.

Struktura biča

Flagela nije linearna već je zavojitog oblika i njeni valovi pokazuju sepcifičnu talasnu dužinu za određenuz vrstu bakterija. Bić je građen od tri osnovne strukturne komponente:

• bazalno tjelo• kvačica• filament

Bazalno tjelo učvršćuje bič za staničnu stijenku i plasmamembranu bakterija, ono je djelom ugrađeno u plasmamembranu , a djelom u staničnu stijenku. Sastoji se od sistema prstenova koji su međusobno povezani drškom. Gram- bakterije imaju u bazalnom tjelu dva para prstenova, tzv. vanjski i unutrašnji, dok G+ bakterije imaju samo jedan par prestenova tzv. unutrašnji.

26

MICROBIOLOGY Kvačica je koljenasti pregib (koljeno) koje je građeno od različitih proteina i funkcija mu je da povezuje bazalno tjelo sa filamentom.Filament tj. Nitasti dio bića. Filament ima izgled šupljeg cilindra čiji su zidovi građeni od proteina flagelina. Flagelinske podjedinice su spiralno ljevoruko poredani u filament. Flagelarni proteini značajni su u identifikaciji nekih vrsta bakterija.

Pokretanje bičeva

Bič je polukruta struktura koja se ne savija več se pokreče rotacijom bazalnog tijela slično propeleru, tako da nastali snop tekučine gura bakteriju kroz vodu. Dva unutrašnja prstena bazalnog tijela djeluju kao rotor i stator, pa se često nazva flagelarni motor. Za razliku od bića prokariota bić eukariota je složenije građe i prekriven je plasmamembranom a pokreče se savijanjem. Brzina kretanja bakterijskog biča je oko 200 revolucija u sekundi, a to je 12 000 obrtaja u minuti pomoču koje bakterija može preči preko 10 puta svoju dužinu.

Rast flageluma

Za razliku od životinjske dlake flagelum raste od vrha ( iz tog razloga je šupalj). Sintetizirane na ribosomima flagelinske podjedinice se provlače kroz šupljinu cilindra i slažu zavojito na vrhu filamenta. Nastanak filamenta od proteinskih podjedinica odvija se mehanizmom koji se naziva samosastavljanje. Taj proces je karakterističan i za nastanak virusnih čestica. Ukoliko se dio filamenta ošteti imaju sposobnost regeneracije.

27

MICROBIOLOGY

AKSIJALNI FILAMENT (FIBRIL, PERIPLAZMATIČNI FLAGELUM)

Karakterističan je za spiralne bakterije – Treponema pallidum (uzročnik sifilisa). Na jednoj stanici može biti od 2 do preko 100 fibrila. Ultrastruktura fibrila slična je flagelumu, ima kvačicu i par diskova. Svaki fibril je jednim krajem zakačen za jedan pol stanice i zatim je omotan oko spiralnog protoplazmatičnog cilindra do oko 2/3 njegove dužine. Protoplazmatični cilindar je sadržaj stanice omeđen plasmamembranom i staničnom stijenkom. I aksijalni filamenti i protoplazmatični cilindar okruženi su troslojnim vanjskim omotačem. Ukoliko oba aksijalna filamenta rotiraju u istom smijeru protoplazmatični cilindar če se rotirati u suprotnom smijeru, a suprotno od njega rotira se vanjski omotać.

FIMBRIJE I PILI

Strukturno su slični flagelumu, ali ne služe za kretanje prokariota. Građeni su od proteina pilina. Fimbrije su znatno krače i brojnije od flagela, proteinske su prirode i nemaju ih sve bakterije, to je genetičko svojstvo. Smatra se da fimbrije slično kapsuli posreduju u prijanjanju bakterija za različite površine (Neisseria gonorrhoeae). U vodenoj sredini mikrobi učestvuju u

28

MICROBIOLOGY formiranju biofilmova (npr. u crijevima). Oni također učestvuju u formiranju pelikule na površini tečnosti.Pili su struktruno slični fimbrijama, ali znatno duži i malobrojniji. Na površini stanice ima ih samo 1 ili nekolicina. Neki od njih uključeni su pričvrščavanju za podlogu (npr. Helicobacter pillori). Također smatra se da služe kao receptori za određene tipove virusa. Tzv. konjugacioni (sex) pili učestvuju u procesu konjugacije tj. mehanizma prenosa gena među bakterijama.

HEMOTAKSIJA BAKTERIJA

To je kretanje organizma uslovljeno prisustvom određene hemikalije. Razlikuju se dva tipa hemotaksije : pozitivna – kretanje prema hemikaliji potrebnoj organizmu i negativna – kretanje od hemikalije koja je štetna za organizam. Atraktanti su hemikalije koje uzrokuju pozitivnu, a repelenti uzrokuju negativnu hemotaksiju. Hemotaksija predstavlja neku vrstu primitivnog nervnog odgovora na podražaje iz okoline. Bakterijska hemotaksija može se demonstrirati uranjanjem staklene kapilare napunjene atraktantom u suspenziju pokretnih bakterija koja ne sadrži atraktant, u kapilari je podešen hemijski gradijent atraktanta tj.koncentracija atraktanta se postepeno smanjuje od vrha ka dnu kapilare. Ubrzo če koncentracija bakterija unutar kapilare biti mnogo puta veeča nego u okolnom mediju, međutim ako je u koncentraciji repelent, situacija če biti obrnuta. Budući da se bakterije brzo kreću za posmatranje pojednićnih bakterijskih stanica konstruisan je «tracking» mikroskop.Kretanje bakterije naprijed nastaje kada se flagela rotira u smijeru suprotnom kretanju kazaljke na satu (jer je ljevoruko namotana). Kada su u pitanu peritrihne bakterije , one se kreču naprijed kada se flagele udruže u flagelarni snopić i zajdno rotiraju u smijeru suprotnom kretanju kazaljke na satu. Snopići se rastavljaju na pojedinačne flagele, smanjuje se brzina kretanja bakterije i dolazi do zaokreta.

Mehanizam hemotaksije

Bakterije imaju specifične senzorne proteine (hemoreceptore) za detekciju atraktanata i repelenata koji prate promjenu koncentracije hemikalije tokom kretanja bakterije. Takvi senzorni proteini nazivaju se MCP ( metil prihvačajući hemotaksićni proteini) ili transducenti kod E. Coli. Ti proteini su transmemebranski receptrni proteini koji ne utiću direktno na rotaciju flagele več posredno preko niza citoplazmatičnih proteina (CHW) tako da svi ti proteini zajedno čine hemosensorni

29

MICROBIOLOGY sistem. Kompletan proces je tako efikasani brz da od detekcije hemikalije tj. stimulusa , pa do odgovora flagelarnog motora protekne 200 milisekundi ( 200 * 10 -6ms). Transduceri imaju vezna mjesta za jedan ili više atraktanata, ali isto tako i repelenata , npr. E.coli – TAR- transducer ima vezna mjesta za aspartat i maltozu, i repelente teške metale kobalta i nikla. Metiliranje (demetiliranje) molekule transducera indirektno određuje kretanje flageluma. Npr. metilacija TAR-transducera uzrokuje da protein CheW fosfolizira protein CheY, koji potom direktno utiče na paljenje flagelarnog motora tj. Kretanje flageluma u smijeru suprotnom kazaljki na satu. Protein CheB služi za postepeno demetiliranje TAR- transducera, dok protein CheZ utiče na fosforilaciju proteina CheY tj. defosforilizira ga.

30

MICROBIOLOGY

VIII. STANIČNE INKLUZIJE (UKLOPINE)

Rezervne tvari bakterija pohranjuju se unutar stanice u obliku granula koje nazivamo inkluzije. Razne bakterije pohranjuju različite tvari, ali one uvijek predstavljaju rezervne energetske i rezervne gradivne tvari. Neke od inkluzija vidimo svjetlosnim mikroskopom, i to nakon specijalnog bojenja, dok se inkluzije dobro uočavaju u EM-u. Prokarioti kao rezervne materije pohranjuju ugljične hidrate, lipide, anorganske fosfate u polimeričkoj formi, elementarni sumpor, magnetit, enzime i dr. Neke uklopine su slične za veliki broj bakterija, dok su druge inkluzije specifične za određene vrste bakterija, pa se u tim slučajevima mogu koristiti kao taksonomski karakter. Većina inkluzija je okružena tankom neunitatarnom (od unitmembrana – junit) membranom (ovojnicom).

INKLUZIJE POLI Β BUTERNE KISELINE

Takve inkluzije ima veliki broj prokariota, dok ih nemaju eukariote. U EM-u vide se kao svjetle granule, a u svjetlosnom mikroskopu nakon specijalnog bojenja sudan crnim. To su uklopine masti i predstavljaju osnovnu rezervu energije i ugljika u stanici. Monomere tj. β buterna kiselina povezana sa esterskom vezom u dugački polimer PBH (poli β hidroksibutrna kiselina), čiji agregati formiraju inkluzije. Zajednički naziv za te polimere je poli β hidroksi alkanati – PHA. Buduči da su PHA plastične kozistencije, posebno su interesantni u komercijalne svrhe jer su bio razgradljivi i mogu zamjeniti sintetičku plastiku koja se danas koristi , a koja je uglavnom biološki nerazgradljiva. Danas se u svjetu već proizvode takvi mikrobni polimeri kao zamjena za sinetičku plastiku i poznati su kao mikrobna plastika. Jedan od prvih proizvoda BIPOL dobiven je u Velikoj Britaniji iz bekterije Alcaligenes eutrophus, za čiji se rast kao supstrat koristila glukoza. Takva mikrobna plastika je već stigla do potrošača kao ambalaža za šampone

METAHROMATSKA ZRNCA (POLIFOSFATNE GRANULE)

Predstavljaju rezerve anoorganskih fosfata (za sintezu ATP-a i nukleinskih kiselina). Iz razloga što se metilensko plavim boje crveno, nazivaju se volutenska (metahromatska zrnca). U bakterija Cyanobacterium diphteriae te grnule se dugačke i karakteristične te služe za njenu identifikaciju.

ZRNCA SUMPORA (S)

Elementrani sumpor često se akomulira u stanici u obliku krupnih granula. Po potrebi se sumpor oksidira do sulfata. Te oksidacije su vezane za jedan od procesa energetskog metabolizma , kao i jedan od procesa fotosinteze. Takve granule su velike i mogu se uočiti u svjetlosnom mikroskopu. Granule elementarnog sumpora ostaju u ćeliji sve dok je prisutan izvor redukcije, međutim, smanjenjem izvora redukcije sumpor se oksidira do sulfata, a granule polahko išćezavaju kako se reakcija nastavlja. Zrnca sumpora služe kao rezerva energije ali i za biosintetičke procese u ćeliji.

31

MICROBIOLOGY

KARBOKSIZOMI

Karboksizomi su poligonalne inkluzije koje sadrže enzim ribuloza 1,5 – bifosfatkarboksilaza – RUBISCO. Taj proces je neobično važan za proces fotosinteze jer katalizira fiksaciju CO2, pa ga osim kod viših biljaka nalazimo i kod bakterija. Nađen je kod Cyanobacteria, Thyobacillusa i bakterija nitrifikatora.

POLISAHARIDNA ZRNACA (GLIKOGEN I ŠKROB)

Može se dokazati rastvorom joda – Lugolovim reagensom, gdje se boje crveno smeđe ili modro. Predstavljaju rezerve energije i ugljika.

MAGNETOSOMI

Su intracelularne kristlane čestice magnetita (Fe3O4) u stanicama uglavnom akvatičnih bakterija i nekih eukariotskih algi. Takve stanice su dipoli i reagiraju na magnetno polje. Bakterije koje produciraju magnetosome imaju magnetotaksiju tj. orjentaciju i kretanje duž silnica geomagnetnog polja. Magnetosomi su okruženi membranom, građenom od fosfolipida, proteina i glikoproteina, a kod različitih bakterija imaju različit oblik od kavadratnog do šialjatog. Aquaspirillium magnetotaxicum – prva magnetotaksična bakterija istražena u kulturi. Kod nje su uočeni kockasti magnetosomi. Sve magnetotaksične bakterije su G- bacillusi ili koki, nađeni u sedimentima širom svijeta. U sjevernoj hemisferi dominiraju bakterije koje se orijentiraju i migriraju prema sjeveru, odnosno prema jugu. Magnetotaksija je jedan vid kretanja prokariota.

32

MICROBIOLOGY

MV-4 cell with magnetosomes and polyphosphate and sulfur granules.

Magnetotactic bacterium from the Chiemsee, Bavaria, Germany (Biomagnetism Group, University of Munich). Dark blobs are sulfur granules.

33

MICROBIOLOGY

PLINSKE ILI GASNE VAKUOLE

Takve vezikule produciraju mnogi akvatični prokarioti: cianobakterija, neke purpurne i zelene fototrofne bakterije i neke archaea mogu se uočiti kako u svjetlosnom tako i elektronskom mikroskopu. Te uklopine sadrže plin i okružene su krutom proteinskom membranom (2nm) koja je nepropusna za vodu, ali je propusna za plinove. Dvije vrste proteina grade tu membranu. Sastav plina u vezikuli je isti kao u spoljašnjoj sredini, međutim pritisak tog plina je P=1 atm. Plinske vezikule imaju specifičan vretenast oblik, a kod različitih vrsta prokariota su različitog broja i dužine. Duge i tanke vezikule nađene su u bakterija iz velikih dubina, a kratke i debele iz gornjih slojeva vode. Ove inkluzije služe za održavanje stanice na optimalnoj dubini vode, tj. u optimalnim ekološkim faktorima potrebnim za fotosintezu.

PIGMENTI U BAKTERIJA

Sposobnost sinteze pigmenata je genetički uvjetovana. Bakterije tvore pigmente iz grupe karotenoida, to su najčešće Nocardia, Sarcina, Corinobacterium i dr. Pigmenti su sekundarni metaboliti kojio štite stanicu od vidljivog i UV dijela spektra.

ENDOSPORE BAKTERIJA

Neke bakterije produciraju specijalne strukture unutar svoje stanice koje se nazivaju endospore. Takve bakterije nazivaju se sporogene. Endospore su dehidrirane strukture koje imaju veoma debeo i nepropustan omotač, i drugačiji sastav citoplazme u odnosu na vegetativni oblik. Sporogene bakterije u svom životnom ciklusu imaju vegetativni i sporogeni stupanj. Endospore su izuzetno otporne na visoke temperature, isušivanje, radijaciju, nedostatak hranjivih tvari, , toksične hemikalije i dr. u odnosu na vegetativne ćelije. Sporogene bakterije su uglavnom u tlu (Bacillus, Clostridium). Promjer i raspored endospore karakterističan je za vrstu bakterije. Položaj endospore može biti terminalan, subterminalan i/ili centralan, a oblik uglast ili ovalan. Promjer endospore može biti jednak promjeru stanice, te manji ili veči od njega. Otkriče endospora bilo je veoma značajno za razvitak odgovarajučih sterilizacijskih metoda. U svjetlosnom mikroskopu vide se kao bijele tačkice, a boje se specijalnim metodama bojenja.

Struktura endospore veoma je kompleksna i višeslojna. Na samoj vanjskoj površini nalazi se egzosporium, zatim sporin omotač od jednog ili više slojeva proteina u vidu traka, zatim cortex-kora koja predstavlja slabo povezanu peptidoglikansku mrežu. Centralni dio egzospore naziva se jezgra ili srž koju čini njena ćelijska stijenka, plasmamembrana, nukleoid, ribosomi, različite vrste RNK, različiti enzimi i nekoličina malih molekula. Supstanca jedinstvena za endospore je dipikolinska kiselina smještena u jezgri koju ne sadrže vegetativni oblici. U endosporama je

34

MICROBIOLOGY nađena visoka koncentracija kalcijevih jona, koji u konbinaciji sa dipikolinskom kiselinom formiraju kalcijevdipokolinat i čini 10% suhe tvari endospora. To jedinjenje kao i činjenica da se tokom sporogeneze uklanja voda tumači otpornost endospora na visoke temperature. To je genetički determiniran proces i zapravo predstavlja jedan vid diferencijacije stanice.

U predstavnika roda Bacillus oko 200 gena uključeno je u sporulaciju, zovu se sporogeni. Sporulacija se odvija u sljedečim etapama:Faza 1 – nakon replikacije bakterijskog ˝hromosoma˝ dolazi do postupnog zgrušavanja molekule DNKFaza 2 – invaginacijom plasmamembrane formira se sporin septumFaza 3 – invaginacija se i dalje povečava sve dok sporin septum ne okruži protoplast buduče spore.Faza 4 – u ovoj fazi nastala je čeona spora čiji su hromosom i citoplazma okruženi dvostrukom membranom. Između dva sloja membrane formira se prvobitni korteks od slojeva peptidoglikana, a oko vanjske membrane se stvara debeli proteinski omotač, egzosporium. Ca se postupno inkorporira u unutrašnjost spore. U posljednjem stupnju su formirani sporini omotaći.Sazrijevanjem endospore dolazi do lize vegetativne stanice i izlaska endospora iz majke stanice. Na eodređeni ekološki stimulus dolazi do inhibiranja sinteza proteina vegetativnih oblika, a aktiviranja sporogena.Transformacija vegetativne stanice u sporangiju traje 6-8 sati. Spore su dormantne , mogu jako dugo da opstanu (nekoliko hiljada pa i do milion godina). Germinacija je prelazak spore u aktivnu vegetativnu stanicu, traje oko 1,5 sat. Odvija se u 3 faze:

1. aktivacija,2. prava germinacija,3. tvorba vegetativne stanice

35

MICROBIOLOGY

Prekidanje dormantnosti endospore odvija se u prisutnosti specifičnog simulusa koji se naziva germinacijski agens (NK, hrana, sol...) . Germinacijski agens stimulira formiranje hidrolitičkog enzima od strane sporine membrane. Taj enzim razgrađuje korteks i time se germinacijski kanal čime je srž izložena vodi. Kako srž rehidrira i uzima hranjive sastojke ona počinje izrastati iz sporinog omotača i na kraju se pretvara u potpuno formiranu vegetativnu stanicu.Egzospore bakterija iz roda Methylosinus i sojevi Rhodomycrobium vanielli imaju egzospore koje se formiraju u vidu pupa na kraju vegetativne stanice. Njihova funkcija je kao i u endospora.

36

MICROBIOLOGY

GENOM PROKARIOTA

Prokariota i eukariota se prvenstveno razlikuju po načinu na koji je genetički materijal upakovan u stanicu. Eukarioti imaju 2 ili više hromosoma koji su smješteni u nukleusu. Genom prokariota je prstenasta DNK poznata kao «bakterijski hromosom». Hromosomi su linearni u specifičnoj interakciji sa histonima, iako genom prokariota nema takvu strukturu uobičajno je da se koristi termin «hromosom». Veličina genoma zavisi od vrste prokariota. Najmanje bakterije Mycoplasme imaju najmanju molekulu DNK.

Genom je skup gena u jednoj stanici u haploidnom broju. Bakterijska stanica je haploidna tokom čitavog života, nema smjene diploidne i haploidne generacije. Područje u kojem je smješten genetički materijal naziva se NUKLEOID. Iako nije obavijen membranom nukleoid je vidljiv kao posebna granularna (vlaknasta) struktura u EM-u, ali i u svjetlosnoj mikroskopiji nakon bojenja. U tom području nema ribosoma je nukleoid vjerovatno u galertnom stanju. Da bi se molekula DNK mogla smjestiti u bakterijsku stanicu ova izuzetno velika molekula (1000 puta duža od stanice) je jako namotana i zbijena tj. superspiralizovana vjerovatno uz pomoč određenih proteina koji ne liče histonima. Kod bakterija super spiralizacija je negativna, tj. DNK se uvrče oko svoje ose u smijeru koji je suprotan ljevorukoj spirali. Pomoču specifičnog enzima – DNK giraza ili topoizomeraza II koji uzrokuje prekid oba lanca DNK i na kraju njegovo ponovno spajanje. Drugi enzim, topoizomeraza I desipralizira supernamotanu molekulu DNK, i koji uzrokuje prekid u samo jednom lancu dvostruke spirale i njegovo provlačenje kroz molekulu i na kraju ponovno ljepljenje tog lanca čime se dobije prstenasta molekula DNK.

Djelovanjem navedenih enzima molekula DNK se naizmjenično despiralizira i spiralizira što je neophodno za njeno spiraliziranje u bakterijsku stanicu kao i

37

MICROBIOLOGY despiraliziranje, što je neophodni za transkripciju i translaciju. Neki antibiotici kao npr. nalidniska kiselina i novobicin inhibiraju djelovanje topomeraze II.

Sada poznajemo potpunu genomsku sekvencu kod preko 60 različitih bakterija, ali je mnogo više genoma upravo u procesu sekvenciranja. Prvu potpunu sekvencu bilo kojeg genoma objavila je grupa autora 1995. godine kod bakterije Haemophilus influenzae koja je čest stanovnik respiratornog sistema čovjeka. Genom ove bakterije sadrži 1,8 x 106 parova baza, 1,8 megabaza, što je za polovinu manje od E. Coli. Genom Mycoplasma sadrži samo 1580 kilobaza, te vjerovatno predstavlja minimum komplet gena potreban za održavanje organizma koji se sam razmnožava. Mnogi geni koji kodriaju komponente biosintetičkih puteva nalaze se u genomu Haemophylusa, ali nedostaje kod Mycoplasmi što je odraz njihovog ograničenog metabolizma. Od 470 gena, genom mikoplazmi sadrži 150 gena čija je funkcija nepoznata. Tako i u najjednostavnijoj stanici ostaje da se odredi biološka funkcija mnogih gena.

Genomska sekvenca Archaea – e Methanococcus jonoscii objavljena 1996 godine omogučila je značajan uvid u evolucijske odnose između arheja , bakterija i eukariota. Genom ove arheje je veličine 1,8 megabaza, ali je samo 1/3 slijedova gena za kodiranje proteina srodna sa poznatim genima bakterija ili eukariota, što upučuje na posebnost genskog sastva arheja. Iako je E.coli omiljeni organizam molekularne biologije, njen genom nije bio potpuno sekvenciran sve do 1997 dod. Njena DNK ima 4,6 x 106 baznih parova i kada bi se ispravila bila bi duga 1mm, dok je cijela bakterija dužine 1-2 µm. Od ukupnih 288 gena, funkcija 40% njih nije poznata. Genomsko sekvenciranje nam pokazuje da se još mnogo toga mora naučiti

38

MICROBIOLOGY o staničnoj biologiji prokariota, pa čak i u jednog tako intenzivno istraživanog organizma kao E. Coli.

Brzina diobe bakterijske stanice veča je od brzine replikacije molekule DNK tako da se u rastučoj bakteriji može naći više kompletnih ili nekompletnih molekula hromosoma. Da bi se osigurala kompletna kopija DNK za svaku stanicu, kćerke nove replikacije DNK počinju prije nego što je prethodna replikacija završena.

Molekule DNK u procesu replikacije prvi je izučavao Kerns 1963. godine uzgajajući E. colie u prisutnosti radioaktivnog timidina. Umnožavanje prokariotske DNK počine na jedinstvenom mjestu bakterijskog hromosoma, zvanog ishodište (origin). Ishodište replikacije je građeno od 245 parova baza čiji dijelovi služe kao vezna mjesta za proteine potrebne za inicijaciju replikacije DNK. Replikacija prstenaste DNK je dvosmijerna ili bidirekciona tj. od ishodišta se kreču dvije replikacijeske viljuške u oba smijera duž hromosoma sve dok se ne kopira cijeli hromosom. Kako se ove viljuške pomjeraju duž hromosoma formira se struktura u obliku grč. slova teta θ, pa se ovakav tip replikacije često označava θ- replikacija. Replikacija se završava susretom dvije replikacijske viljuške na suprotnoj strani hromosoma pri čemu nastaju dva identična hromosoma. Postoje dokazi da je replikacijski aparat vezan za plasmamembranu što upučuje na zaključak da se sama DNK kreče kroz fiksirani replikacijski aparat, umjesto da se replikacijska viljuška kreče duž DNK.

39

MICROBIOLOGY Proces replikacije DNK je složen, učestvuje oko 30 različitih proteina i odvija se u 4 stupnja:

1. ključni korak predstavlja vezanje inicijacijskog proteina za specifičan slijed baza unutar ishodišta. Enzimi helikaze uz pomoč topoizomeraza odmotaju dvostruku spiralu. Proteini koji se vežu za jednolančanu DNK =SSP (single strained proteins) omogučavaju da lanci DNK ostaju jednostruki.

2. Pomoču replikacijskog enzima DNK polimeraze III vodeči lanac (5' – 3') sintetizira se kontinuirano. Za sintezu zaostajučeg lanca (3' – 5') najprije enzim primaza u saradnji sa proteinima primazomima sintetizira kratke odsječke DNK (RNK početnice) duge oko 10 nukleotida na koje se nadovezuje nukleotid pomoču DNK polimeraze III. Nastali odsječci dužine od 1000-2000 nukleotida nazivaju se okazaki fragmenti.

3. Kada je većina okazaki fragmenata sintetizirana DNK polimeraza III otklanja RNK početnice i sintetizira komplementarne DNK odsječke koje če popuniti nastale praznine.

4. Na kraju se odsječci DNK spajaju pomoču enzima DNK ligaze pri čemu nastaje lanac u smijeru 3'-5'.

Dok se lanci roditeljske DNK razmotaju, DNK ispred replikacijske viljuške prisiljena je na rotaciju. Nekontrolisana rotacija bi uzrokovala da se kružne molekule DNK odmotaju same od sebe, što bi na kraju blokiralo replikaciju DNK. Ovaj problem je riješen dijelovanjem enzima topomereza koji kataliziraju reverzbilnu transkripcijju i ponovo spajanje DNK. Topoizomeraza II kida istovremeno oba lanca DNK, a topoizomeraza I samo jedan. Prekidi nastali djelovanjem ovih enzima služe kao ose koje omogučavaju da se 2 lanca DNK kalupa slobodno rotiraju jedan oko drugog čme se replikacija može neometano odvijati bez uvijanja DNK ispred replikacijskih viljuški

40

MICROBIOLOGY

PLASMIDI

Plasmidi predstavljaju ekstrahromosomalne genetičke elemente nađene u mnogih prokariota i nekih eukariota (npr. kvasci). To su male prstenaste molekule koje se autonmno repliciraju (neovisno od bakterijskog hromosoma). Broj plasmida može biti različit i određen je genetički ili faktorima okoliša. Veličina plasmida se kreče od 1-

41

MICROBIOLOGY 1000 kilobaznih parova ili 1/10 bakterijskog hromosoma, sadrže do 30 gena (max. 100).

Genetička informacija u plazmidima za razliku od bakterijskih hromosoma obično nije od životne važnost za bakterije, ali im daje selektivnu prednost (izuzetak su simbiotski azotofiksatori). Na plazmidima se obično nalaze geni koji omogučavaju rezinstenciju bakterija na antibiotike ,rezistentnost na teške metale , aromatična jedinjena i dr. inhibitorne supstance, kao i sposobnost sinteze sexipila. Plazmidi se mogu eliminisati iz stanice spontano ili dijelovanjem UV i ionizirajučeg zračenja, visokih temperatura, itd. Plazmidi se u stanici mogu nalaziti neovisno od bakterijskog hromosoma ili se po ulasku u ćelije ugrađuju u hromosom pa se nazivaju epizomi. Epizomi mogu uzrokovati prijenos bakterijskog hromosoma iz stanice u stanicu. Neki plazmidi su odlični genetički vektori i široko se primjenjuju u genetičkom inžinjersvu. Plazmidi se mogu izloirati iz bakterije i potom modifivirati u laboratoriji dodavanjem specifičnih gena. Takvi geni obično kontroliraju sintezu vrijednih produkata poput humanog inzulina. DNK koja se dodaje plazmidu može biti iz bilo koje prokariotske ili eukariotske ćelije. Tako modificiran plazmid se potom reintroducira u bakterijsku stanicu čime se ona usmjerava na sintezu željenog produkta. Plazmidi G- bakterija repliciraju se na način sličan bakterijskom hromosomu, a G+ bakterije mehanizmom kotrljajučeg prstena, slično fagu Φ x 174. Samo iz sojeva E.coli izolirano je oko 300 različitih tipova plazmida.

IX. INERBAKTERIJSKI PRIJENOS GENA

42

MICROBIOLOGY Poznata su 3 načina prenosa gena između bakterija u prirodi: transformacija, transdukcija i konjugacija. Takav transfer gena je lateralan (horizontalan) i odvija se

unutar iste generacije bakterija za razliku od vertikalnog transfera gena koji podrazumjeva transfer gena iz generacije u generaciju. Stanica koja daje gene naziva se donor (davalac), a stanica koja prima recepient.

Transformacija je najstariji poznati proces prirodnog transfera gena među bakterijama. To je proces u kome se slobodna DNK prenosi iz donora u recipienta pri čemu dolazi do promjene genotipa primaoca. Fenomen transformacije otkrio je engleski ljekar Griffit 1928. god istraživajuću bakterije uzročnike epidemije pneumonije u Londonu. Bakterije Streptococcus pneumoniae su obično okružene polisaharidnom kapsulom, i kada se uzgajaju na površini čvrste hranjive podloge formiraju glatke kolonije, takve bakterije označene su kao S-soj (s-smoth), međutim nakon duže kultivacije na vještačkim hranilištima neke stanice su izgubile sposobnost formiranja kapsule, a površina njohovih kolonija bila je naborana i gruba, takve kolonije označene su kao R-kolonije (r-rough). Gubitkom kapsule bakterije gube i svoju virulentnost jer nemaju zaštitu od imunog sistema domačina. U svom čuvenom eksperimentu Grifft je ubrizgavajuči streptokoke virulentnog soja S u miševe uzrokovao njihovu bolest i na koncu smrt, kada bi ubrizgao bakterije avirulentnog soja R eksperimentalne životinje bi preživjele. Isto se dešavalo i prilikom injektiranja toplotom ubijenih bakterija soja S, međutim kada je u miševe inokulirao s mješavinom živih stanica soja R i mrtvih soja S oni bi ubrzo uginuli, a žive bakterije oba soja su izolovane iz njihovog tijela. Griffit je zaključio da je neka supstanca prešla iz mrtvih virulentnih stanica u žive avirulentne bakterije i uzrokovala promjenu njihog fenotipa, tu je supstancu nazvao transformirajuči princip, a proces transformacija. Zahvaljujuči ovim pokusima Avery, Macleod i McCarthy 1944. godine uspijeli su dokazati da je tvar odgovorna za genetičku transformaciju streptokoka molekula DNK , time je prvi put nesumnjivo dokazano da je DNK genetički materijal. Ovaj eksperiment postavlja kament temeljac molekularne biologije.Samo neke vrste podložne su prirodnoj transformaciji. Stanice sposobne da prihvate ekstracelularnu DNK i da se transformiraju nazivaju se kompetentne stanice i to je nasljedno svojstvo. U procesu transformacije učestvuju različiti proteini npr. receptorni, rekombinantni, kompetentni proteini, nukleaze i dr. Veličina transformirajučeg fragmenta DNK mnogo je manja od veličine genoma npr. Bacillus subtilis oko 15 gena maksimalno pri čemu se taj fragment tokom vezanja za površinu stanice i dalje degradira. Transformirajuča dvolančana DNK veže se za površnu stanice (postaje specifični receptorni protein) pri čemu se jedan lanac degradira djelovanjem površinskih nukleaza, tako da jedan lanac DNK prolazi kroz

43

MICROBIOLOGY plasmamembranu pomoču specifičnog kompetentnog proteina smještenog u plasmamembrani. Po ulasku u citoplazmu taj lanac DNK se veže za rekombinantni protein (receptor A) koji štiti fragment od djelovanja citoplazmatskih nukleaza i integrira se u genom recepienta. Kao rezultat replikacije takve hibridne molekule nastaje jedan roditeljski i jedan rekombinantni hromosom. Treba istači da se transformacija može odvijati i plazmidom. Ukoliko je transformirajuča DNK plazmid onda ne dolazi do rekonbinacije između plazmida i bakterijskog hromosoma. Kompetentnost bakterijske stanice može se i vještački inducirati npr. kod E.coli pomoču CaCl2 i toplotnog šoka, ili elektroporacija (niske struje na kulture bakterija) u ranoj fazi rasta kulture bakterija.

44

MICROBIOLOGY

Transdukcija – interbakterijski prijenos gena posredstvom bakteriofaga.U vrijeme sazrijevanja virusa u stanici domačina u toku pakiranja DNK u proteinski omotač dešava se da se dijelovi bakterijskog hromosoma upakuju greškom i česticu virusa. Kada takav transducirajuči virus inficira novog domačina ubrizga se i genetički materijal iz prethodnog domačina. Fragment hromosoma donora može u procesu rekonbinacije sa homosoma recipijenta dati genom sa novim osobinama. Razlikuju se dva tipa transdukcije : opća (generalizirana) i specijalizirana. U opčoj transdukciji bilo koji bakterijski gen se može prenositi putem virulentnih faga (imaju litički ciklus) a u sepcijaliziranoj se prenose samo određeni geni pomoču umijerenih faga (lizogena).Opća transdukcija - otkrili Ledenberg i Zinolez 1952.god na Salmonella typhy pomoču bakteriofaga P22. tokom virusne infekcije (virulentnim fagom) bakterijski hromosom se fragmentira u odsječke male veličine i rijetko se desi da se fragment veličine slične veličini virusnog genoma upakira u virusnu kapsidu, takva čestica naziva se transducirajući fag i takva čestica se nemože više replicirati. Takve čestice se normalnom virusnom lizom oslobađaju bakterijske stanice. Ukoliko virusna partikula inficira bakteriju geni od prethodnog domačina dospijevaju u novog domačina i dolazi do genetičke rekonbinacije. Na ovaj način se može prenositi bilo koji fragment bakterijskog hromosoma.Specijalizirana transdukcijaNajviše je proučavana na E.coli pomoču λ (lamda) faga. DNK umjerenih faga inkorporira se u bakterijski hromosom na određenom mjestu i naziva se profag, DNK faga se izrezuje iz hromozoma nakon čega slijedi njena replikacija i sastvaljanje

45

MICROBIOLOGY virusnih čestica. U nekim slučajevima virusna DNK prilikom izrezivanja iz bakterijskog hromosoma slučajno povuče i neke gene koji se nalaze blizu mjesta njene ugradnje. Nakon replikacije takve hibridne DNK i njenog pakiranja u kapsidu svi nastali virusni potomci u ćeliji su transducirajuče čestice. Nakon infekcije nove stanice dolazi do rekonbinacije. Specijaliziranom transdukcijom prenose se geni koji se nalaze blizu mjesta ugradnje virusne DNK.

KONJUGACIJA

Za ovaj proces genetičkog transfera potreban je neposredan kontakt između stanice donora i recipienta putem sexpila pri čemu se prenose mnogo veči fragmenti DNK u odnosu na druga dva tipa. Iako podsječa na sex reprodukciju konjugacija ne predstavlja seksualno razmnožavanje jer ne dolazi do oplodnje. Ovaj proces je najbolje proučen kod E.coli u čijoj se populaciji mogu razlikovati 2 tipa stanica označenih kao F+ muške i F-, ženske. F+ stanice se odlikuju time što posjeduju slobodan F plazmid na kome se nalaze geni za sintezu pilina i geni za sopstveni prenos. Zahvaljujuči ovoj osobini F+ stanice imaju sexpile, ti pili su mnogo puta duži od fimbrija i ima ih manje, u vidu su šuplje cijevi. Iako predstvaljaju receptorno mjesto za neke fage glavna im je funkcija da stupaju u kontakt sa specifičnim receptorom na površini F- bakterija tako da se stvori proteinski most – konjugacijoni kanal kroz koji F plazmid prelazi iz donora u recipienta. Na taj način nije došlo do rekonbinacije več do izmjene gena extrahromosomalnom DNK.

F plazmid se replicira mehanizmom kotrljajučeg prstena, međutim kod malog broja ćelija F plazmid može da se ugradi u bakterijski hromosom (episomi) i ovakav tip ćelije naziva se Hfr (high frecvention of reconbination). Replikacija takvih hromosoma obično počinje iza mjesta ugradnje F plazmida. Osobina Hfr ćelija je da pri konjugaciji sa F- ćelijama dolazi do prelaska kopije cijelog hromosoma iz donora u recipijenta. Geni prolaze

kroz konjugacionu cijev sve dok ne dođe do razdvajanja stanica. Budući da je veza krhka obično u recipijenta ne dospije cijela kopija hromosoma donora jer bi za to trebalo oko 90 min tako da F plazmid koji je zadnji uglavnom ne dospije u recipijenta i oni ne ne postaju Hfr.

46

MICROBIOLOGY

47

MICROBIOLOGY

TIPOVI PLAZMIDA

Postoje konjugativni i ne konjugativni plazmidi.Konjugativni nose genetičku informaciju za svoju sobstvenu prenošljivost i zovu se se tra geni (transport). Nekonjugativni sami po sebi nisu prenosivi ali ih mogu učiniti konjugativnim F plazmidi ili neki drugi transfer plazmidi. Col plazmidi- određuju produkciju bakteriocina – biološki aktivni mali proteini koji djeluju letalno na osjetljive bakterije. Bakteriocini se vežu za specifične receptore osjetljive bakterije i ubijaju ih na različite načine (inhibicijom sinteze DNK, cijepanjem RNK, inhibiranjem sinteze proteina, ometanjem transporta kroz membranu) jer mnogi bakteriocini sadrže enzime (mureinaze..)R-plazmid determiniraju otpornost bakterija prema antibioticima, hemioterapeuticima, teškim metalima idr. i takvi plazmidi su nosioci multiple rezistencije, otkriveni su u japanu 1960.g. u sojevima Shigela za vrijeme epidemije bacilarne dezenterija. Bili su otporni na hloronfelikon, tetracinide, streptomicin i sulfanocide, npr. takvi sojevi su zlatni sojevi Stophilococcus aureus. Ti plazmid (tumor inducirajući) nađen kod bakterije Agrobacterium tumefacius, biljni patogen koji dovodi do stvaranja tumora na domačinu. Do transformacije biljnih ćelija dolazi uslijed integracije Ti plazmida unesenog u genom biljke. Segment Ti plazmida koji se integrira na različitim mjestima u hromosom biljne ćelije naziva

48

MICROBIOLOGY se T-DNK i uzrokuje tvorbu tumora. Ti plazmid ima primjenu u genetičkom inžinjersvu.

MOBILNI GENETIČKI ELEMENTI

Mc clintock 1956.g. – radila na kukuruzuIako je bakterijski hromosom stabilna struktura, postoje mobilni genetički elementi. Preskakanje gena s jednog mjesta na drugo zove se transpozicija. Nađena je u eukariota i prokarita i ima značajnu ulogu u genetičkoj varijabilnosti. Takvi elementi na svojim krajevima imaju repetativne elemente. Postoje 2 tipa mobilnih genetičkih elemenata tzv. insercijske sekvence (IS) i transpozoni. IS – najjednostavniji mobilni elementi koji sadrže samo genetičku informaciju za transpoziciju koja im omogučava premještanje na drugu lokaciju a ne sadrže druge gene. Transpozoni pored ovih sekvenci sadrže i neke gene tj. pored genetičke informacije za samu transpoziciju sadrže i druge gene najčešće determinante rezistentnosti na antibiotike. Oni su veće strukture , omeđeni sa dvije insercijske sekvence u čijoj sredini se nalazi bilo koji dio DNK. Najčešće nose gene za enzime koji razgrađuju ili modificiraju antibiotik u njegovu neaktivnu formu.Insercijeske sekvence (IS elementi) široko su rasprostranjeni i mogu se naći u

bakterijskim hromosomima, genomu faga i plasmidima. Dužina im se kreće od oko 750 – 1600 baznih parova. Analiza strukture je pokazala da one nose genetičku informaciju samo za 1-2 enzima (TRANSPOZAZE). I inhibitori koji regulišu proces transpozicije. IS i transpozoni ne priznaju pravila klasične genske rekombinacije pa mogu spajati ragmente DNK koji nisu međusobno homologi. Geni koji se na ovaj način prenose mogu se na novom položaju aktivirati ili inaktivirati. Također, može se desiti isto sa genima ako se u njihovoj blizini

ugradi mobilni genetički element.

GENETIČKO INŽINJERSTVO I BIOTEHNOLOGIJA

Glavni cilj genetičkog poboljšavanja biljaka uključuje sticanje rezistencije biljaka na herbicide , štetne insekte i mikrobna oboljenja.

49

MICROBIOLOGY

1. sojevi Salmonele koji su rezistentni na glitosfate. Takvi plazmidi se pomoču Ti plazmida unose u biljke. Takve biljke normalno rastu ukoliko su poprskane hebicidom

2. genetičkim inžinjerstvom se unose geni za toksične proteine bakterije Bacillus thurigiensis. Proteini su u formi kristala, toksični za biljne uši, komarce i leptire. Toksin je BT

3. biljke duhana i paradajza genetičkim inžinjerstvom se mogu potači i na proizvodnju humanog interferona (u zaštiti biljaka od virusnih infekcija prozivedene su transgene biljke koje imaju gen za proteinski omotač virusa, čime ometaju replikaciju virusnog genoma)

budučnost biljnih tehnolgija je usmjerena na rezistenciju biljaka na sušu i salinitet.

50

MICROBIOLOGY

SPECIFIČNOST SINTEZE PROTEINA PROKARIOTA I SPECIFIČNOST PROKARIOTSKIH RIBOZOMA

Ribosomi su male stanične strukture prisutne kako u eukariotskim stanicama tako i u prokariotskim. Ribosomi su mjesto translacije proteina. Ribosomi su građeni od rRNA i ribozomoalnih proteina, sastavljeni od dvije podjedinice, velika i mala, koje su disocirane kada ribosom nije u funkciji. U prokariotskim ribosomima podjedinice su veličine: mala 30 S ( S – svedbergova jedinica, koeficijent sedimentacije, kada se ribosomi sedimentiraju), velika podjedinica 50 S, a kompletan ribosom 70 S. Ribosomi su ribonukleoproteinski. Molekula r RNK su važne strukturne i katalitičke komponente ribosoma. Mala podjedinica sadrži oko 21 protein i 16 S rRNK dok velika sadrži 2 vrste rRNK označene kao 23S i 5S i oko 34 različita proteina (ukupno oko 55 različitih proteina). Ribosomi se nalaze u citplazmi kao slobodne strkture ili su vezane za plazmamembranu. U stabilizaciji ribosomalne strukture značajnu ulogu imaju joni Mg, Co, Mn. Mala podjedinica ima nepravilan oblik sa dubokim žlijebom u kojem se za vrijeme sinteze proteina tranzitorni pričvršćuje iRNK molekula svojim 5' krajme. Na maloj podjedinici se nalaze 2 vezna mjesta za tRNK, A mjesto (aminoacil) i P mjesto (peptidil). Velika podjedinica je duplo veća od male i ima izgled krune tj. ima neravne površine sa dubokim udubljenjima i ispupčenjima. U funkcionalnom ribosomu velika podjedinica je svojim širim krajem spojena za malu i kroz nju se provlači rastući polipeptidni lanac. Ribosomi se za plazmamembranu vežu slobodnim užim krajem.

51

MICROBIOLOGY

rRNK čine oko 85% sadržaja ukupne bakterijske RNK i do sada su dokazane njihove funkcije u vezivanju iRNK u specifičnih enzima za malu podjedinicu ribosoma pomjeranjem ribosoma niz iRNK i povezivanja aminokiselina u polipeptidni lanac. RNK koje imaju enzimatsku aktivnost nazivaju se ribosomi. Niz ribozoma duž jedne molekule RNK nazivaju se polisomi ili poliribosomi pri čemu udaljenost između ribosoma nemože biti manja od 70 nukleotida. Na svakom od tih ribosoma sintetizira se po jedna nukleotidni lanac i svi lanci če biti identični.

52

MICROBIOLOGY

SPECIFIČNOS TI U SINTEZI PROKARIOTSKIH RIBOSOMA

Specifičnosti transkripcijeGeni prokariota su kontinuirani dok su geni eukariota diskontinuirani tako da se kod eukariota prvo moraju odstraniti nesekvencirajuče komponente – introni prije početka translacije. U prokariota nema dorade iRNK koja podrazumjeva dodavanje kape na 5' kraj i poliadenilne sekvence njenom 3' kraju, niti ima procesa splajsing (eng.prekrajnja) u kome se isjeckaju enzimski ne informacijski odsječci i spajaju informacijski odsječci. U prokariota je primarni transkript ujedno i funkcionalna iRNK tj. direktno služi kao kališ za sintezu proteina, dok je kod eukariota nakon dorade iRNK znatno kraća od primarnog transkripta (primarni transkript je pre iRNK). Informaciona RNK prokariota je policistronska tj. kodira više proteina dok je kod eukariota monocistronska. Budući da nemaju nukleusa procesi transkripcije i translacije u prokariota nisu odvojeni prostorno a ni vremenski, tj. dok traje transkripcija zadnjeg kraja iRNK već počinje translacija njenog prednjeg kraja.

53

MICROBIOLOGY

54

MICROBIOLOGY

Biosinteza proteina

Biosinteza proteina prokariota odvija se u 3 faze:

1. inicijacije,

55

MICROBIOLOGY

2. elongacije, produžuvanje, rast polipeptidnog lanca3. terminacije, završetak sinteze

Na kraju sinteze ribosom diosocira na podjedinice koje se ponovo udružuju pri započinjanju biosinteze novog polipeptinog lanca. Inicijaciji prethodi aktivacija aminokiseline tj. vezivanje odgovarajuće aminokiseline za tRNK , uz utrošak ATP-a pri čemu kao rezultat nastaje aminoacil-tRNK . Početna aminoacil-tRNK kod prokariota je N-formilmetionin-tRNK (dok je kod eukariota metionin).

1. INICIJACIJA - proces nastanka inicijacijskog kompleksa. Na iRNK prokariota se prije START kodona AUG uzvodno nalazi sekvenca duga 3-9 nukleotida koja se naziva Shine – Delgarno sekvenca koje se veže za komplementarnu sekvencu na 16 S rRNK male podjedinice ribosoma. Ova veza omogućava da ribosom nađe inicijacijske kodone u policistronskoj iRNK (kod eukariota mala podjedinica prepoznaje 5' kapu i 1. start kodon i zato ne može translatirati policistronsku rRNK). Inicijacija završva formiranjem inicijacijskog kompleksa za koji se na kraju veže velika podjedinica ribosoma i specifični protein =inicijacijski faktor. Kada se za ovaj kompleks veže velika podjedinica započinje druga faza – elongacije.

2. ELONGAC IJA – izduživanje, produživanje i rast polinukleotida. A mjesto na ribosomu je mjesto gdje se sve aminoacil-tRNK prvo vežu za ribosom osim prve tj. N-formilmetionin-tRNK koja se veže za P mjesto, dok je P mjesto na ribosomu mjesto gdje se rastuči polipeptidni lanac drži tRNK za vrijeme formiranja peptidne veze između dvije aminokiseline. N-formilmetionin-tRNK smještena je u P mjestu dok je druga aminokiselina sa svojom tRNK smještena u A mjestu. Katalitičkim djelovanjem rRNK iz velike podjedinice ribosoma dolazi do formiranja peptidne veze između ove dvije aminokiseline. Ta reakcija naziva se peptidil-transferaza, nakon čega se transportna RNK koja nosi peptid translocira sa mjesta A na mjeato P čime mjesto A ostaje slobodno za novu aminoacil tRNK. Ribosom klizi niz iRNK za jedan kodon kao traka na pisačoj mašini. U fazi elongacije učestvuje nekoliko proteina elongacijskih faktora (EF) i GTP (gvanozin trifosfat).

3. TERMINACIJA – do ove faze dolazi kada ribozom dospije do nekodirajučih kodona, tj . do jednog od 3 stop kodona AUG, UAA i UUA za koje se ne veže ni jedna aminoacil – tRNK pa specifični proteini koji se nazivaju oslobađajući faktori odvajaju zakačeni peptid od tRNK i dolazi do disocijacije ribosoma na podjedinice.

E.coli za sintezu jednog polipeptidnog lanca dužine 150 aminokiselina treba 15-20 sekundi i postoje antibiotici koji inhibitorno djeluju na biosintezu proteina. Tako streptomicini inhibiraju inicijaciju, a hloromfenikol elongaciju.

56

MICROBIOLOGY

57

MICROBIOLOGY

K ONTROLA EKSPRESIJE GENA U PROKARIOTA

Metabolički potencijal bakterijske stanice izuzetno je širok, ali ona u svemu postupa strogo racionalno i fleksibilno. Bakterije posjeduju mehanizam koji mogu ovisno o potrebi i vanjskim uvjetima regulirati ekspresiju bilo kojeg gena tj. pokrenuti (INDUKCIJA) i isključiti funkcije (REPRESIJA) bilo koji metabolički proces. Metabolička jedinica koja regulira ekspresiju bakterijskih gena naziva se OPERON (ovu teoriju su donijela dva francuza , Jacob i Monod 1961.). U bakterija OPERON sadrži sljedeće jedinice:

1. strukturne gene koji kodiraju sintezu sepcifičnih proteina2. operar- fragment DNK duž kojega nema transkripcije u specifičnu DNK za

koje se specifično veže protein represor.3. promotor – je segment DNK koji se ne transkribuje u iRNK, nego predstavlja

mjesto privatanja RNK polimeraze čime se omogučava početak transkripcije gena.

Regulatorni gen je smješten izvan operona, a kodira sintezu proteina represora. Represor je protein koji ragujuči sa operatorom neposredno kontrolira transkripciju strukturnih gena. Kada se represor veže za operator transkripcija je «isključena», a u odsustvu veze između represora i operatora «uključuje» se transkripcija odgovarajučeg struktunog gena. Efektor je niskomolekularna supstanca koja reaguje sa represorom i opredjeljuje njegovu aktivnost u odnosu na operator.Lac – opron, ima 3 strukturna gena: Z gen za laktozu, gen Y za permeazu i gen C- transacetilazu. Bakterija E.col iobično raste na drugim izvorima ugljika tj. rijetko imaju priliku da koriste šećer laktozu, tako da je Lac- operon najčešće neaktivan (reprimiran). Pojava laktoze u okolišu uzrokuje u roku 3 min. nastanak enzima koji su ustanju iskoristiti taj novi izvor ugljika.

Pozitivna kontrola operona – indukcija

Ukoliko je prisutna molekula efektor, a to je obično supstrat za enzime, a to je u ovom slučaju laktoza ta molekula se veže za represor i uzrokuje njegovo odvajanje

od operatora , na taj način je omogučeno RNK polimeraze za promotor i početak transkripcije strukturnih gena. To traje sve dotle dok u okolini ima efektornih molekula (tj. laktoze). Negativna je kada nema efektornih molekula = represija, protein represor u

58

MICROBIOLOGY ovom slučaju se ponovo veže ili ostaje vezan za operator čime je blokirana transkripcija.

RAST I RAZMNOŽAVANJE PROKARIOTA

Actinomycete tvore duge vlaknaste stanice koje se u procesu filamentacije cijepaju u fragmente. Svaki fragment je pojedinačna stanica koja može porasti i stvarati novi filament.Streptomycete (zrakaste bakterije) se razmnožavaju pomoču konidiospora koje kada se otkinu od matične stanice i dospiju u povoljne ekološke uvijete stvaraju novu koloniju bakterija.Mycoplasme povećavaju broj stanica pupanjem, kao npr. Caulobacter.Najveći broj prokariota razmnožava se prostom diobom, cijepanjem ili binarnom fisijom, tj. tvorbom dvije stanice od jedne roditeljske. Period od formiranja nove stanice do sljedeče diobe naziva se «stanični ciklus» koji ne sliči staničnom ciklusu eukariota. Mlada bakterijska stanica kontinuirano raste dok ne udvostruči svoju biomasu tj. svoje komponente. Stanica raste udužinu, a njen promjer ostaje ne promjenjen. Replikacija DNK i dioba stanice su koordinirani procesi. Ako se lijekovima inhibira replikacija blokira se i stanična dioba pri čemu se stanica samo produžuje i tvori dugačak filament. U E.coli replikacija DNK traje oko 40 min, a dioba stanice oko 20 min pri temperaturi 37 °C. Uvijeti potrebni za početak diobe su :

1. završetak replikacije i reparacije DNK,2. particija (razdvajanje) bakterijskih hromosoma,3. postizanje dvostruke dužine bakterija

Dioba započinje formiranjem transferzalnog (poprečnog) septuma (od plasmamembrane i stanične stijenke) u središnjem dijelu stanice koji sve dublje urasta u bakterijsku citoplazmu. Duplicirani hromosomi prikačeni su za plazmamembranu na mjestu početka nove replikacije koje se naziva replikon. Kako septum sve više urasta, a membrana i stijenka izdužuju, hromosomi se sve više udaljavaju ka suprotnim krajevima stanice, to je particija hromosoma. Druge citoplazmatske strukture, npr. ribosomi, inkluzije, plazmidi i dr. nasumično se raspoređuju u dvije buduče stanice. Kada je septum potpuno sintetiziran stanica je podjeljena na dva jednaka dijela. Kod nekih vrsta prokariota razdvajanje stanica je potpuno, a kod drugih prokariota stanice nakon diobe ostaju povezane npr. diplokoki, stafilokoki...

59

MICROBIOLOGY

Rast mikroorganizama

Mikroorganizmi rastu i razmnožavaju se u veoma heterogenim prirodnim uslovima. Istraživanje mikrobnog rasta veoma je značajno kako zbog shvatanja fundamentalnih procesa tako i u svrhe kontrole njihovog rasta (što je neophodno za uništavanje mikroorganizama ali i za podsticanje rasta onih mikroorganizama koje na razne načine iskorištavamo u proizvodnji hrane, lijekova i dr.). Razlikujemo rast pojedinih prokariotskih stanica i rast populacije stanica. Rast stanice rezultira u kvantitativnom povećanju staničnih sastojaka i struktura tj. povećanje njene težine i veličine i on prethodi staničnoj diobi, međutim, u mikrobiologiji kada se govori o rastu podrazumjeva se rast populacije tj. povećanje broja stanica njihovom diobom. Populacija nastala u kontroliranim uvjetima u laboratoriji naziva se kultura. Izolacijom jedinki iste vrste dobija se čista kultura. Postoje brojne metode za dobijanje ćiste kulture, a u osnovi se sve svode na izoliranje organizma iz mješavine prirodne populacije te njegovo održavanje kao i održavanje njegovog potomstva u vještačkim uvjetima sredine u kojima je onemogučen pristup drugim organizmima tj. onemogučena je kontaminacija. Diobom stanice u ili na čvrstoj podlozi nastaju kolonije stanica vidljive golim okom (jedna kolonija ima oko 106 pa i više stanica).

Generacijsko vrijeme je vremenski period potreban da se u standardnim uvjetima broj mikroorganizama u populaciji udvostruči. Kod E.coli u laboratorijskim uvjetima to vrijeme iznosi 30 min, a u probavnom traktu u nepovoljnim uvjetima gdje postoje kompetitorni organizmi ono može biti duže od 12 h.Mycobacterium tuberculosis – generacijsko vrijeme u lab. uvjetima iznosi 12 h, ali je za stvaranje vidljivih kolonija potrebno 6 sedmica. Neki mikroorganizmi mogu se razmnožavati samo u živim tkivima, tako npr. Mycobacterium leprae i Treponema pallidum (Siflis) mogu se proučavati samo u živim organizmima. Infekcijska doza – broj mikroorganizama potrebnih za iniciranje infekcije u domačinu.

Krivulja rasta bakterija

Zasijavanjem bakterijskih stanica u sterilnu hranjivu podlogu i inkubacijom kulture pri optimalnoj temperaturi, pH, conc. O2, u jednom zatvorenom sistemu njihov se rast odvija slijedeči krivulju. Krivulja predstavlja odnos broja živih stanica (y) i vrijeme uzgoja (x), i ona se može upotrijebiti za označavanje stadija u ciklusu rasta mikrobne populacije. Razlikuju se 4 stadija rasta u standardnoj krivulji:

1. LAG – faza suzdržanog rasta,2. LOG faza ili logaritamska faza,3. stacionarna faza rasta4. logaritamska faza odumiranja

60

MICROBIOLOGY

1. LAG fazaTo je prelazni period za bakterije prenesene u novu sredinu tj. to je period adaptacije bakterija na nove uslove. Tokom LAG faze u početku ne dolazi do povećanja broja stanica već one rastu tj. većih su dimenzija s povečanim udjelom proteina, DNK i voema su metabolički aktivne tj. u ovoj fazi se sintetiziraju enzimi , proteini i dr. makromolekule potrebne za rast i razmnožavanje u novoj sredini. Dužina trajanja LAG faze ovisi o statusu zasijanih bakterija, prethodnoj sredini i broju živih stanica u inokulumu.

2. LOG faza – logaritamska fazaKada su u okolišu uvijeti povoljni počinje dijeljenje stanica tj. počinje faza eksponencijalnog rasta. Krivulja u ovom dijelu se penje pod oštrim uglom. Broj stanica se povečava geometrijskom progresijom. Na početku ove faze stanice su povečano osjetljive na različite toksične agense i povišenu temperaturu. Dužina LOG faze ovosi o vrsti mikroorganizama i sastavu hranjive podloge, a prosječno traje 6 -12h.

3. Stacionarna faza rastaU određenom trenutku se brzina rasta bakterijske kulture počinje smanjivati i započinje stacionarna faza. U toj fazi su rast i ugibanje stanica gotovo podjednaki, tj.

61

MICROBIOLOGY jednak je broj živih i mrtvih stanica. Razlog tome je iscrpljivanje bitnih i nagomilavanje toksičnih metabolita u podlozi. Hranjive tvari oslobođene iz mrtvih stanica koriste stanice koje rastu, tako da krivulja rasta u ovoj fazi ne pada naglo. Tokom ove faze sintetiziraju se komercijalno važni biosintetički produkti kao npr. antibiotici i različiti enzimi.

4. LOG faza odumiranjaDaljnje nagomilavanje toksičnih produkata i smanjivanje koncentracije hranjivih tvari uzrokuje ubrzano odumiranje stanica. Broj živih stanica smanjuje se geometrijskom progresijom koja je obrnuta onoj u LOG fazi rasta. Kada broj stanica postane vrlo mali, kultura ulazi u završnu fazu rasta, u kojoj žive stanice mogu ustrajati još neko vrijeme na račun lize mrtvih stanica nakon čega teški uvjeti dovode od nestajanja populacije tj. nestajanje kulture.

Sinhroni rast kulturePrilikom istraživanja određenih svojstava mikroorganizam savremenim metodama (npr. u kojoj fazi ćelijskog ciklusa se sintetiziraju određeni enzimi) neophodno je imati stanice u kulturi koje su iste starosti tj. sve su jedinke u istoj fazi rasta. Kultura u kojoj se sve stanice istovremeno dijele, odnosno sve pripadaju istoj fazi rasta naziva se sinhrona kultura. Sinhrone kulture se mogu dobiti na nekoliko načina:

1. limitiranje hrane ili hlađenje kulture određeno vrijeme nakon čega se kultura vraća na normalnu ishranu i normalnu temperaturu.

2. separiranjem stanica određene starosti u gradijentu gustine saharoze nakon čega se uzme određena frakcija. Populacija na ovaj način sinhronizirani rast može zadržati samo kroz nekoliko generacija.

3. efikasna metoda za dobijanje sinhrone kulture je primjena membranskih filtera. To su specijalni filteri od nitroceluloze. Filtriranjem kulture bakterijske stanice se adsorbuju na filter i nježnim ispiranjem naličja filtera sviježom tečnom hranjivom podlogom stanice prikupljene u kratkom vremenu su u fiziološki sličnom stanju (tek podjeljene stanice) koje če imati sinhroni rast u nekoliko narednih generacija

Kontinuirani rast

Kontinuirana kultura mikroorganizama predstavlja njihov uzgoj u jednom otvorenom sistemu i kontroliranim nepromjenjenim uvjetima sredine. To podrazumjeva stalan dotok hranjivih tvari i odstranjivanje štetnih produkata metabolizma i mrtvih stanica. U kontinuiranoj kulturi održava se konstantna veličina mikrobne populacije u eksponencijalnoj fazi rasta dugi vremenski period. Npr. prirodna kontinuirana kultura je crijevni trakt čovjeka. To se postiže pomoču kemostata tj. aparata koji omogučavaju neprekidan rast mikroorganizama putem neprekidnog dodavanja i uklanjanja medija određenom brzinom. Na ovaj način dobijene kontinuirane kulture primjenjuju se za različita biohemijska, genetička i dr. istraživanja, ali se koriste i kulture određenih mikroorganizama koji imaju primjenu u farmaceutskoj i drugim industrijama.

Metode određivanja broja stanica:1. metoda brojanja stanica

62

MICROBIOLOGY

2. metoda brojanja kolonija3. turbidimetrijski ili nefelometrijski metod

UTICAJ FAKTORA SPOLJAŠNE SREDINE NA RAST MIKROORGANIZAMA

Odnosi mikroorganizama prema molekularnom kisiku (O2)

Mikroorganizmi ispoljavaju velike razlike u sposobnosti iskorištavanja kisika za stanično disanje, koje su odraz razlika u biooksidacijskim enzimskim sistemima prisutnim u različitih vrsta. Dok je za većinu organizama oksigen neophodan faktor

63

MICROBIOLOGY ishrane, za neke organizme je toksičan (letalan). U odnosu na potrebe za slobodnim kisikom mikroorganizme možemo svstati u 5 skupina:

1. aerobi2. mikroaerofili3. obligatni anaerobi4. fakultativni anaerobi5. aerotolerantni anaerobi

Aerobi su mikroorganizmi koji imaju apsolutnu potrebu za kiskom i zahtijevaju kisika na atmosferskoj visini (20 %). Njihovi enzimi upotrebljavaju kisik kao krajnji akceptor elektrona za potpunu oksidativnu razgradnju molekula bogatih energijom (npr. glukoza).Mikroaerofili za rast zahtijevaju kisik ali u nižim koncentracijama od atmosferske (manje od 20%).Striktni (obligatni, obavezni) anaerobi – organizmi koji rastu u odsustvu kisika i ne mogu tolerirati bilo kakvu koncentraciju slobodnog kisika u sredini, tj. i najmanje količine kisika za njih su letalne. Kod tih mikroorganizama prisutnost kisika rezultira tvorbom toksičnih produkata metabolizma – slobodnih oksidativnih radikala, koji reaguju sa biohemijski važnim spojevima. Ovi mikroorganizmi nemaju enzime: superoksid dismutaze i katalaze koji razlažu slobodne radikale na H2O i O2.Fakultativni anaerobi mogu rasti u prisustvu ili odsustvu kisika. U okolini sa malom koncentracijom kisika stanično disanje može se odvijati anaerobnim putem upotrebljavajuči nitrite ili sulfate kao krajnje akceptore elektrona ili koristeći fermentacijski put. Fakultativni anaerobi uključuju organizme koji žive u intestinalnom traktu čovjeka kao npr. E.coli i plijesni.Aerotolerantni anaerobi ne mogu koristiti kisik ali su tolerantni na njega. To su fermentativni mikroorganizmi npr. mliječno – kiselinske fermentacije, koji imaju superoksid dismutaze ili/i katalaze, peroksidaze i ne bivaju ubijeni u prisustvu oksigena.Potrebe mikroorganizama za kisikom se mogu odreditim posmatranjem njihovog rasta u dubokom agaru.

Efekat temperature na rast

Temperatura je veoma značajan faktor spoljašnje sredine koji utiče na rast mikroorganizama. U prirodi mikroorganizmi mogu rasti pri temperaturi od -10 do110 °C. Svaki organizam raste pti odeđenim temperaturama pri čemu je njegov rast

64

MICROBIOLOGY najbolji na optimalnoj temperaturi. Mikroorganizmi se na osnovu sklonosti da rastu u određenom temperaturnom rasponu klasifikuju kao:

1. psihrofili – rastu u granicama od -5 do 20°C. Obitavaju u okeanskim dubinama, na polovima, frižiderima. Npr. Pseudomonas, Serracio, Mycrocooccus, kvasci i dr.

2. mezofili – rastu u granicama od 20 do 50°C. U ovu grupu spada većina mikroorganizama među kojima su patogeni čovjeka i toplokrvnih životinja, njihov optimum je od 35 – 40°C.

3. termofili – rastu u granicama od 50 do 90°C, žive u blizini vulkana, u termalnim vodama, stajskom gnoju. Neke Archaea su hipertermofili, rastu na temperaturi iznad 250°C.

pH vrijednost

Prema kiselosti ili bazičnosti prokarioti mogu biti neutrofili, acidofili i alkalofili (bazofili).Neutrofili rastu najbolje u neutralnoj ili slabo bazičnoj sredini, pH=7 – 8.Acidofili preferiraju kiselije sredine npr. Thiobacillus pH= 2 – 3,5. Alkalofili preferiraju alkalne sredine, Vibrio cholerae pH= 8 – 9. Kisele pH vrijednosti želuca, kože, ženskih polnih organa štite čovjeka od infekcije.

Osmotski pritisak

Osmotski pritisak sredine u kojoj rastu mikroorganizmi zavisi od koncentracije rastvora. Većina bakterija raste u veoma širokim granicama vrijednosti osmotskog pritiska zahvaljujuči staničnoj stijenci i aktivnosti permeaza koje omogučavaju održavanje relativno konstantne koncentracije unutar njihovih stanica sto je veoma značajno za funkcionisanje enzima i drugih makrobioloških molekula u stanici. Sposobnost bakterija da rastu u različitim koncentracijama soli omogučena je intracelularnom akumulacijom K+ jona. Većina bakterija živi u hipotoničnom rastvoru, međutim u slučaju da se drastično poveča koncentracija soli u okolišu, stanica gubi vodu i dolazi do plazmolize. Isto tako iz jako razblaženog rastvora spoljašnje sredine, ulazak vode dovodi do bubrenja stanice i plazmoptize. Mikroorganizmi koji rastu u sredinama s visokim koncentracijama soli nazivaju se halofili npr. Halobacterium halobium.

FAKTORI RASTA

Za rast mikroorganizama kao i drugih organizama neophodne su supstance iz spoljašnje sredine, koje oni koriste za sintezu staničnih sastojaka i za stvaranje energije. Treba istači da ne postoji univerzalna hranjiva podloga na kojoj bi se mogle uzgajati sve vrste bakterija. Neke vrste mikroorganizama imaju posebne hranidbene potrebe, pa se prema hemijskom sastavu njihove stanice može napraviti smjesa uravnoteženih tvari za njihov rast. Pored vode koja čini 80 – 90% ukupne težine stanice, najznačajniji elementi koji ulaze u sastav mikroorganizama su: C, O, N, S, H, Ca, K, Cl, Fe (makrometabolički elementi) , Zn, Co, Mn, Mo (mikrometabolički elementi).

65

MICROBIOLOGY

FIZIOLOGIJA MIKROORGANIZAMABiohemijske aktivnosti prokariota zbivaju se u stanici a dijelom i izvan stanice. Mikroorganizmima su za održavanje osnovnih životnih funkcija neophodne osnovne hranjive tvari i odgovarajuči fizički faktori sredine. Osnovni metabolički putevi veoma su slični kod većine organizama, međutim posebni zahtijevi miroorganizama su veoma raznoliki i razumjevanje tih potreba je nužno za uspješan uzgoj mikroorganizama u laboratorijskim uslovima. U svijetu mikroorganizama postoji izuzetna fiziološka, tj. biohemijska raznolikost. Proces transformacije materija u stanici tj. razmjena materija i energije nazva se metabolizam, on uključuje dvije vrste biohemijskih procesa: anabolizam i katabolizam. Anabolizam predstavlja biosintetičke procese, tj. hemijske reakcije koje povezuju jednostavne spojeve u makromolekule i zahtijevaju energiju u tvorbi novih molekula. Katabolizam podrazumjeva proces razgradnje u kojem se složene molekule cijepaju na jednostavnije i oslobađa energija pohranjena u hemijskim vezama.

ENZIMSKI SISTEMI BAKTERIJA

Različiti mikroorganizmi imaju različite prehrambene zahtijeve i različite enzimske sisteme. Enzimi su organski katalizatori koji stvaraju stanice. Oni ubrzavaju određene reakcije, a da se pri tome sami ne troše i ne mjenjaju. Enzimi su uglavnom proteinske prirode, a nedavno su otkriveni i NK – RNK. Jednostavni enzimi građeni su samo od proteina a konjugovani pored proteinskog dijela (apoenzimi) sadrže prostetičnu grupu (koenzim), zajedno čine holoenzim. Koenzimi su uglavnom vitamini, metalni joni. Prema mjestu djelovanja enzimi bakterija se dijele na egzoenzime i endoenzime. Egzoenzimi se stvaraju unutar stanice mikroorganizama i luče u spoljašnju sredinu gdje ispoljavaju svoje djelovanje. Takvi enzimi su većinom ekstracelularni, ali neki od njih mogu biti vezani za svoju stanicu, npr. za plazmamembranu ili se nalaze u periplazmatskom prostoru. Od ekstracelularnih enzima su najčešće hidrolaze (karbohidraze, proteaze, esteraze, nukleaze . . .). Osnovna ima je uloga hidroliza organskih makromolekula do jednostavnijih molekula koje stanica može iskoristiti. Egzoenzimi nekih bakterija značajno su patogeni kao npr. hijaluronidaza, koagulaza i dr. Egzoenzimi ostaju aktivni i u odsustvu bakterije koja ih je proizvela.Endoenzimi , kada se sintetiziraju ostaju aktivni u bakterijskoj stanici. Ona ih nikada ne izlučuje u okolinu, tu se mogu nači samo ako je stanica dezintegrirana. Ti enzimi djeluju u kataboličkim reakcijama u kojima stanica dobija energiju, a sudjeluju i u sintetičkim procesima.Znatan broj enzima raširen je u prirodi i nalazi se u velikom broju raznovrsnih bakterija dok su drugi enzimi specifični za određenu vrstu bakterije. Buduči da je enzimski sastav karakterisitičan za pojedine skupine bakterija na osnovu raznih biohemijskih reakcija koje kataliziraju enzimi i na osnovu analize tih produkata može se vršiti idnetifikacija i diferencijacija bakterija. Stanice mikroorganizama

66

MICROBIOLOGY sintetiziraju niz enzima bez obzira da li se nalaze u kontaktu sa supstratom. Geni za te enzime se nasljeđuju s generacije na generaciju iste vrste i varijeteta. Takvi enzimi koji čine stalni sastav bakterijskog enzimskog sistema nazivaju se konstitutivni. Pored tih enzima mnoge vrste bakterija raspolažu genima za sintezu enzima kojima stanica ne raspolaže stalno. Enzimi koji se stvaraju pod uticajem određenih supstrata nazivaju se inducibilni ili adaptivni. Ukoliko tog supstrata nema u sredini tada bakterije ne stvaraju enzime potrebne za njihovo iskorištavanje. Geni za sintezu adaptivnih enzima su neaktivni sve do pojave supstrata kada se geni aktiviraju. Sastav enzima u bakterijskoj stanici nije stalan već se mjenja po potrebi.

Usvajanje hranjivih materija od strane bakterija

Bakterije mogu da prihvate samo rastvorenu tečnu hranu jer ne raspolažu probavnim mehanizmom koji može dezintegrirati čvrstu hranu. Bakterije usvajaju hranjive materije rastvorene u vodi cijelom površinom. Osnovne prepreke za slobodno prodiranje hranjivih materija u bakterijsku stanicu su stanična stijenka i plasmamembrana. Buduči da je stijenka mrežasta sadrži pore različite veličine kod različitih bakterija, pa je propusna za veće ili manje molekule. Prava osmotska barijera je plasmamembrana koja je selektivno propusna. Veći dio hranjivih materija je rastvorljiv u vodi, ali postoje i organske materije potrebne mikroorganizmima koje nisu rastvorljive ili daju koloidne rastvore koji ne mogu difundovati kroz plasmamemranu, stoga se nerastvorljive materije podvrgavaju veoma složenim transformacijama do rastvorljivih jedinjenja. Makromolekule kao npr. proteini, NK, polisaharidi i masti se pomoču mikrobnih egzoenzima izvan plasmamembrane razgrađuju do monomera, a potom ulaze u unutrašnjost stanice jednim od transportnih sistema bilo aktivnim ili pasivnim transportom.

METABOLIČKE GRUPE UNUTAR PROKARIOTA

Bakterijska stanica mora obavljati sav onaj rad koji u viših organizama obavljaju milioni drugih stanica. Za rast, razmnožavanje, kretanje i hranjenje bakterijskoj stanici je potrebna ogromna količina energije.

Izvor energijeS obzirom na izvor energije svi mikroorganizmi se mogu svrstati u dvije grupe : fototrofi – koriste sunčevu energiju i hemotrofi – koriste hemijsku energiju cijepanjem veza različitih molekula.

Potrebe mikroorganizam za C

Ugljik je najvažniji strukturni element za sve tipove organizama. Prema načinu dobijanja ugljika mikroorganizmi se dijele na autotrofe i heterotrofe. Autotrofi koriste

67

MICROBIOLOGY anorganska jedinjenja kao izvor ugljika. Prokarioti se s obzirom na način ishrane, izvor ugljika i izvor energije mogu podijeliti u 4 skupine:

1. fotoautotrofi (fotolitotrofi),2. fotoheterotrofi (fotoorganotrofi),3. hemoautotrofi (hemolitotrofi),4. hemoheterofrofi (hemoorganotrofi).

Postoje i mikroorganzimi koji koriste energiju i materije iz živih stanica za svoje potrebe kao što su npr. rikecije i hlamidije i takvi organizmi se nazivaju hipotrofi i paratrofi. Saprofiti su organotrofne bakterije koje koriste neživu organsku materiju. Razgrađuju razna organska jedinjenja i učestvuju u procesu gnjiljenja i truljenja pri čemu čiste zemlju od otpadaka, omogučavaju kruženje elemenata u prirodi i omogučavaju snadbijevanje drugih organizama raznim jedinjenjima.

Paraziti su organizmi koji sve što im je potrebno dobiju iz živih organizama. Razlikujemo striktne (obavezne) i fakultativne parazite. Fakultativni paraziti mogu duže ili kraće vrijeme živjeti u neživoj sredini.Patogeni su parazitski mikroorganizmi koji uzrokuju bolesti:

• Obligatni patogeni uvijek uzrokuju oštečenja u dodiru sa živim organizmima• Uslovni patogeni uzrokuju bolest samo u određenim uslovima npr. E.coli,

Staphylocooccus aureus- normalno se nalazi u ustima.

AUTOTROFIIzvor C anorganaki CO2

HETEROTROFIIzvor C organska jedinjenja

Izvor energije svjetlost

Izvor energijeanorganski spojevi

Izvor energije svjetlost

Izvor energijeorganski spojevi

Fotoautotrofi

Cyanobacteria,Zelene i purpurne sumporne bakterije, alge i biljke

Hemoautotrofi

Nitrofikatori, željezne, vodikove, sumporne bezbojne bakterije, neke Archeae

Fotoheterotrofi

Purpurne nesumporne i zelene nesumporne bakterije

Hemoheterotrofi

Većina bakterija, sve protozoe, gljive, životinje

AUTOTROFI

FOTOSINETSKI PROKARIOTI - FOTOAUTOTROFI

Fototrofija – korištenje svijetlosti kao izvora energije je široko zastupljena među mikroorganizmima i takvi organizmi nazivaju se fotosintetski organizmi. Većina fototrofa su i autotrofi sposobni da koriste CO2 kao jedini izvor ugljika. Svijetlosnu energiju oni koriste za redukciju CO2 do organskih jedinjenja. Međutim postoje i

68

MICROBIOLOGY fotoheterotrofi, koji koriste svijetlost kao izvor energije, a organska jedinjenja kao izvor ugljika. Fotosinteza je jedan od najstarijih i najfundamentalnijih procesa života. Zahvaljujuči tom procesu stvaraju se organske molekule koje iskorištavaju heterotrofi za svoje životne aktivnosti. Život na Zemlji ovisi o recikliranju ugljika i proizvodnji kisika potrebnog za aerobnu respiraciju.Fotosintetski mikroorganizmi su :

I. Cyanobacteria, Prochlorophytes – imaju kiseoničku fotosintezu,II. Zelene bakterije, purpurne bakterije – fototrofne bakterije imaju bezkiseoničku

fotosintezu (bakteriohlorofil a, b, c, d, e, karotenoidi) i Heliobacterium (sporogena bakterija, srodna sa Bacillus subtilis) jedinstvena fiziološka grupa.

III. Ekstremne halofilne Archaea (Halobacterium salinarum) – mogu vršiti fotosintezu bez svijetlosti uz pomoč pigmenta bacteriorodopsin.

Fotosintetski membranski sistemi i pigmenti prokariota (iskopirano)

HEMOAUTOTROFI (HEMOLITOTROFI)

To su nefotosintetski mikroorganizmi koji energiju dobijaju oksidacijom anorganskih jedinjenja, a kao izvor C koriste CO2, taj proces sinteze šećera naziva se hemosinteza. Većina ih je sposobna za autotrofan rast, fiksirajući CO2 u kalvinovom ciklusu. ATP nastaje oksidativnom fosforilacijom kao i u hemoheterotrofa, s tim što su donori elektrona anorganska jedinjenja (H2, H2S, NH4, nitriti, jedinjenja sa Fe) i posjeduju specifičan transportni lanac elektrona. Elektroni oslobođeni iz donora se transportuju niz ETS (elektron transportni sistem, ili lanac), a energija oslobođena u ovim reakcijama koristi se za sintezu ATP – a oksidativnom fosforilacijom. Budući da je redukcijski potencijal anorganskih donora (osim H2) više pozitivan u odnosu na NAD+ (H2 = -0,41 , NAD+ = -0,32, NO3

+= +0,43, citohrom C = +0, 23) većina hemoautotrofa za fiksiranje CO2 mora trošiti energiju (protonske sile ili ATP) za uspostavljanje reverznog toka elektrona. Elektroni osolobođeni od anorganskih donora uključuju se u ETS na nivou citohroma i uz utrošak energije usmjeravaju nasuprot gradijentu električnog potencijala do akceptora NAD+ ili NADP+, to je reverzni tok elektrona. Buduči da je energetski bilans hemoautotrofa veoma nizak oni moraju oksidovati velike količine anorganskih jedinjenja za produkciju energije potrebne za rast. Ti mikroorganizmi nemaju kompetitora u okolišu, npr. termanlna vrela na dnu okeana gdje je obilje anorganskih jedinjenja, a pri tome omogučavaju život drugim simbiotskim oblicima i zato su ekološki korisni.

Vodikove (vodik oksidirajuče) bakterijeHidrogen (vodik) je čest produkt metabolizma mikroorganizama, koje hemoautotrofi koriste kao izvor energije zahvaljujuči enzimu hidrogenaza, npr. Hydrogenomonas,

69

MICROBIOLOGY Pseudomonas, Alkaliogenesi, H2 = 2H+ + 2e- iako većina vodikovih bakterija može rasti hemoheterotrofno. Kada rastu hemoautotrofno ovi mikroorganizmi fiksiraju CO2

u kalvinovom ciklusu 6 H2 + 2O2 +CO2 = CH2O +5H2O, ove bakterije ne koriste reverzni ETS jer je vodik donor elektrona. E.coli može oksidirati H2 kao izvor energije, ali ne koristi CO2 već organske komponente kao izvor C, takvi mikroorganizmi su miksotrofi. Reverzni tok elektrona karakterističan je za fotoheterotrofe tj. za purpurne i zelene bakterije.Sumporne bakterijeBezbojne sumporne bakterije oksiduju elementarni sumpor, H2S, tiosulfat (S2O3

2-) i druga redukovana sumporna jedinjenja. Konačni produkt oksidacije u većini slučajeva su sulfati (SO4

2-).

NitrifikatoriNajbolje istraženi hemoautotrofi su bakterije nitrifikatori, to su zemljišne i akvatične bakterije koje predstavljaju značajnu kariku u kruženju azota u prirodi. Nitrifikatori obogačuju tlo nitratima koje koriste biljke u sintezi aminokiselina. Amonijak se u tlu oksidira do nitrata združenim dijelovanjem dva roda nitrifikatora:

I. Korak je oksidacija NH4 do nitrita pomoču vrste roda Nitrosomonas

NH4 + 1/2O2 = NO3

II. Korak je oksidacija nitrita do nitrata djelovanjem bakterija iz roda Nitrobacter NO2

- + 1/2O2 = NO3-

Željezne (Fe - oksidirajuče) bakterijeOve bakterije dobijaju energiju aerobnom oksidacijom željeza iz fero (Fe2+) u feri (Fe3+) stanje, Galionela, Siderocapsa. Feri joni formiraju nerastvorljiv talog feri hidroksida u vodi. Thyobacillus ferroxidans raste autotrofno koristeči fero jone ili redukovana sumporna jedinjenja kao izvor elektrona (željezno sumporne bakterije). Željezne bakterije našle su primjenu u rudnicima metala, produkti metabolizma stupaju u reakciju sa Cu ili uranijem u stijenama, stvaraju rastvorljive forme koje je lahko izdvojiti iz rude. Razvijene su slične tehnike u rudnicima Au i Ag. Fe i S bakterije koriste se i u desulfarizaciji ugljena.

HETEROTROFINe posjeduju hlorofil i energiju dobijaju oksidacijama organskih i anorganskih jedinjenja. Dijele se na dvije grupe: hemoautotrofi i hemoheterotrofi.

FOTOHETEROTROFI, FOTOORGANOTROFI

70

MICROBIOLOGY Koriste svijetlost kao izvor energije, ali im kao primarni izvor ugljika ne služi CO2 već različita organska jedinjenja od kojih najčešće alkoholi, masne kiseline, organske kiseline ili ugljikohidrati. U aerobnim uslovima su nalik hemoheterotrofima, međutim kada se koriste fotosintetskim procesima za dobijanje energije moraju biti osigurani anaerobni uslovi, kod npr. Rhodospirillum, Rhodopseudomonas (purpurne nesumporne bakterije) i Chlorophleksus (zelena nesumporna). Kreču se klizanjem i žive u vručim izvorima sa Cyanobacteria.

HEMOHETEROTROFI

Za razliku od drugih ovi organizmi kao izvor energije i izvor karbona obično koriste jedno isto organsko jedinjenje npr. šečer glukozu. U hemoheterotrofe spada najveći dio bakterija, sve gljive, protozoe i životinje

ENERGETSKI METABOLIZAM PROKARIOTA

Kada atom, molekula ili jon izgube više elektrona u nekoj reakciji, taj proces se naziva oksidacija. Oslobođeni elektroni su reaktivni i odmah se vežu za drugu molekulu , koja prihvata jedan ili više elektrona, i taj proces označava se kao redukcija. U biološkim sistemima te reakcije su udružene, pa se nazivaju oksidacijsko – redukcijske reakcije. U biološkim oksidacijama organskih molekula, istovremeno se uklanjaju 2 elektrona i 2 protona, pa je dehidrogenacija sinonim za oksidaciju.

ATP

71

MICROBIOLOGY

Adenosine TriphosphateU molekuli ATP-a , adenosin se sastoji od adenina, jedinjenja koje sadrži nitrogen i riboze, petougljičnog šećera. Tri fosfatne jedinice (trifosfat), svaka sastavljena od jednog atoma fosfora i četiri atoma oksigena su vezana za ribozu. Dvije veze između 3 fosfatne skupine su visoko energetske veze.

Energija koja se oslobađa u procesima bioloških oksidacija supstrata vezuje se u fosfatnu vezu bogatu energijom (~) dajuči jedinjenja sa visokim energetskim potencijalom koja služe za čuvanje i prenošenje energije. Najznačajnije od svih energetskih jedinjenja je ATP zahvaljujuči energetski bogatim vezama između 1. i 2. i 2.i3. fosfatne skupine , iz kojih se hidrolizom oslobađa energija. Te veze omogučuju ATP-u da ima mnogo više energije nego ostala energetska jedinjenja. Pored ATP-a postoje i dr.: GTP, UTP, CoA. U procesu nastanka ATP –a tj. fosforilacije, sudjeluju ADP i anorganski fosfat. ATP se stvara na tri načina:

1. fosforilacijom supstrata (to se dešava tokom glikolize),2. oksidativna fosforilacija (tokom ćelijskog disanja),3. fotofosforilacija ( u procesu fotosinteze)

Fosforilacija supstrata je proces u kome se u toku oksidacije organskog supstrata, npr. glicer-aldehid trifosfata u prisustvu NAD i neorganskog fosfata stvara fosfatna veza veoma bogata energijom, koja se u daljoj razradnji prenosi na ADP i dolazi do sinteze ATP.Oksidativna fosforilacija je proces sinteze ATP-a u toku transporta elektrona sa NADPH2 na O2 preko niza katalitičkih posrednika tzv. elektron transportni sistem.Fosforilacija je sinteza ATP-a u toku svijetle faze fotosinteze.

OSNOVNI PUTEVI ZA POROIZVODNJU ENERGIJE

72

MICROBIOLOGY

KATABOLIZAMPrva faza u katabolizmu organskih materija je razgradnja složenih makromolekula u jednostavnije. Tokom oksidacije takvih organskih makromolekula mikroorganizmi proizvode energiju aerobnom respiracijom ili anaerobnom, tj. vrenjem (fermentacijom).

AEROBNA RESPIRACIJA

AEROBNA RESPIRACIJA – niz reakcija katalizirianih enzimima u kojima se elektroni transportuju od organskih molekula (glukoze) do kisika kao krajnjeg akceptora elektrona. To je glavni metabolički put aerobnih heterotrofa u kojem se obezbjeđuje energija u vidu ATP i međuprodukti za mnoge sintetičke puteve u procesu sinteze lipida, proteina i ugljičnih hidrata.

C6H12O6 + 38ADP + 38 Pi (anorganski P) = 6CO2 + 6H2O + 38ATP

73

MICROBIOLOGY

PUTEVI RAZGRADNJE GLUKOZE

Glukoza je najviše istraživan izvor energije u stanicama. Prvi stadij razgradnje glukoze zajednički je za proces fermentacije i respiratorne oksidacije. To je proces oksidacije glukoze do pirogrožđane kiseline. Tri glavna puta razgradnje šećera su:

1. glikoliza, tj. EMP (Embden – Meyerhof – Parnasov put) put2. ED put (Entner – Doudroffov put)3. pentozo – fosfatni put

Prvi i treči put nađeni su i kod prokariota i eukariota, dok je ED put nađen samo kod nekih vrsta bakterija. U svim putevima razlaganja glukoza se najprije fosforilizira, pomoču enzima heksokinaze pri čemu je donor fosfata ATP. Nastali glukozo – 6 – fosfat je početno jedinjenje razgradnje za sva tri puta.

Figure 16.1. Some Fates of Glucose.

Glikoliza ili EMP put

To je najčešći glikolitički put nađen u svih mikroorganizama, ovaj anaerobni proces se odvija u citoplazmi stanice. Glikoliza je serija kataboličkih reakcija u kojima se jedna molekula glukoze razlaže na dvije molekule pirogrožđane kiseline od koje nastaju 2 molekule ATP –a (supstratna fosforilacija) i 2 NADH. Ona se odvija u 10 reakcija, a svaka reakcija je katalizirana posebnim enzimima. Tokom glikolize dolazi do četiri značajna događaja:

1. fosforilacija glukoze2. cijepanje 6- karbonske glukoze na dvije 3 – karbonske molekule, jedna je

dihidroksiaceton fosfat, a druga je gliceraldehid 3 – fosfat3. transfer elektrona na coenzim NAD4. pohranjivanje energije u molekul ATP

Piruvat je glavno intermedijerno jedinjenje koje može fermentirati anaerobno do nekoliko produkata. Može potpuno oksidovati do CO2 i H2O u Krebsovom ciklusu u

74

MICROBIOLOGY elektron transportnom sistemu. Piruvat može poslužiti kao sirovina za sintezu aminokiselina i ugljikohidrata.

Pentozo – fosfatni putPentozo – fosfatni put predstavlja dopunski put u kojem nastaju važna jedinjenja za biosintezu kao što je npr. ribozo 5 fosfat, prekursor NK, kao i redukovane frome NADPH. Najvjerovatnije je osnovna funkcija ovog puta snadbijevanje stanice pentozama kao NADPH. U snadbijevanju energijom ovaj put je manje efikasan, dobije se samo jedna molekula ATP-a. Većina bakterija ima glikolizu i pentoza – fosfatni put, dok je kod neki umjesto glikolize ED put.

Entner – Doudorffov put (ED put)Osnovni glikolitički put nekih aerobnih G- bakterija iz rodova Pseudomonas, Rhizobium, Azotobakter i Agrobacterium, i smatra se posebnim pravcem u evoluciji. Ovaj put razgradnje glukoze nije nađen kod G+ bakterija. U toku razgradnje glukoze ovim putem dobije se jedna molekula ATP-a, 1 NADH i 1 NADPH.

75

MICROBIOLOGY

76

MICROBIOLOGY

KREBSOV CIKLUS

Krebsov ciklus se kod eukariota odvija u matriksu mitohondrija , kod prokariota u citoplazmi. Molekule piruvata bogate energijom a nastale glikolizom ili u drugom putu uključuju se u Krebsov ciklus (ciklus limunske kiseline, citratni ili TCA - ciklus trikarbonskih kiselina). Započinje sa oksalsirčetnom kiselinom i završava sa njom. Prije nego se uključi u ciklus piruvat se dekarboksilira tj. enzimski se uklanja CO2 i nastali spoj acetil grupa se veže za CoA i tvori kompleks acetil – CoA. Devet reakcija u ciklusu mogu se poredati u tri stadija: 1. pripremni, 2. stadij oslobađanja energije, 3. regeneracija počene tvari.

I. Pripremni stadij. Acetil – CoA3 uključuje se u Krebsov ciklus i acetil grupu prenosi na oksalsirčetnu kiselinu (4C atoma) i nastaje limunska kiselina (6C atoma), oslobođeni CoA ponovo veže neku drugu acetal grupu i uključuje se u novi k. ciklus. U sljedečim reakcijama premještanjem OH grupe nastaje izocitrat(6C).

II. Stadij oslobađanja energije, sastoji se od četiri reakcije. U prvoj reakciji dva elektrona reduciraju NAD+ u NADH što uzrokuje dekarboksilaciju izocitrata i nastanak α – ketoglutarne kiseline (5C). Ta kiselina se oksidativno dekarboksilizira i u rekaciji sa CoA nastaje jedinjenje bogato energijom sukcinil – CoA, a par elektrona reducira NAD+ u NADH. U sljedećoj reakciji cijepa se energetska veza, a otpuštena energija uzrokuje fosforilaciju GDP u GTP, nastaje sukcinat (čilibarna kiselina 4C). Čilibarna kiselina oksidira u mravlju (fumarat) kiselinu (4C), kao akceptor elektorna sudjeluje FAD+ i nastaje FADH2.

III. Regenracija početne tvari, čine je 2 reakcije: molekuli mravlje kiseline dodaje se H2O i nastaje jabučna kiselina (malat). Ta molekula biva oksidirana i ponovo nastaje oksalacetat. Na taj način ciklus može ponovo započeti povezivanjem oksalacetata sa novom molekulom acetil – CoA.

Najvažniji produkti pored niza međuprodukata su redukovana forma NAD i FAD jer sadrže energiju koja je izvorno bila pohranjena u glukozi, a zatim u pirogrožđanoj kiselini, i ta energija se prenosi do transportnog lanca elektrona.

3 Acetil – CoA – nastaje katabolizmom ugljičnih hidrata, lipida i proteina77

MICROBIOLOGY

78

MICROBIOLOGY

79

MICROBIOLOGY

ELEKTRON-TRANSPORTNI SISTEM (ETS)

ETS se sastoji od niza nosača elektrona (elektron akceptora) koji imaju sposobnost da se naizmjenično oksiduju i redukuju. Prenošenjem elektrona duž lanca postepeno se oslobađa energija i ATP se sintetizira od ADP i fosfatne grupe. U aerobnoj respiraciji krajnji primalac elektrona je oksigen. ETS uključuje nekoliko molekula nosača smještenih u plasmamembrani prokariota: FP – flavo proteini (sadrže derivate riboflavina, vitamin B2), Fe – S proteini (željezno – sumporni), i citohromi, a neproteinski kinoni (CoQ). ETS različitih bakterija su sastavom raznovrsni, tj. razlikuju se međusobno u sastavu molekula nosača (enzima) svrstanih u 4 kompleksa:Enzim iz kompleksa I prima elektrone od NADH (Krebsov ciklus i glikoliza su porijeklo elektrona) dok enzim iz kompleksa II prima elektrone od FADH (iz Krebsovog ciklusa) i prenosi ih do sljedečeg proteina (nosača) tj. nosača u komleksu III, a potom do nosača kompleksa IV. Elektroni se od jednog do drugog kompleksa prenose citohromom C i ubikvnionom (CoQ). Krečući se od jednog do drugog enzima u respiratornom lancu, elektroni kaskadno gube energiju i na kraju se vežu za kisk. Krajnji prodkut reakcije je voda.

2H + 2e- + 1/2O2 = H2O

80

MICROBIOLOGY

OKSIDATIVNA FOSFORILACIJA

Tokom transporta elektrona niz ETS producira se ATP oksidativnom fosforilacijom. Produkcija ATP je u direktnoj vezi sa obrazovanjem gradijenta protona (H+) kroz membranu. U ETS se na nekoliko mjesta izbacuju protoni iz citosola kroz membranu u periplazmatski prostor. Za pumpanje protona koristi se energija koju elektroni gube u svom kaskadnom transportu. Na taj način formira se elektrohemijski gradijent protona. Uslijed nastale razlike u koncentraciji (1000x: pH 5,5 i pH 8,5), protoni se velikom brzinom vračaju pasivno u citoplazmu. Buduči da je membrana nepropusna za protone jedini put kroz koji se mogu vratiti u citoplazmu je specijalni kanal u ATP-sintazi. Nastala protonska sila, tj. energija koju tom prilikom oslobađa ATP – sintaza koristi se za sintezu ATP-a od ADP-a i fosfora (P). Takav proces nastanka ATP-a zove se oksidativna fosforilacija.Iz jedne molekule glukoze u aerobnoj respiraciji nastaje 38 molekula ATP-a, glikolizom u anaerobnim uvjetima od 1 molekule glukoze nastaje 2 ATP-a.

81

MICROBIOLOGY

ANAEROBNA RESPIRACIJA

Oksidacijsko – redukcijskim procesima organskih i anorganskij jedinjenja mikrobi se snadbijevaju energijom. Uporedo sa tim procesima vrši se sinteza ATP-a. Krajnji akceptor elektrona je kisik ili druga anorganska jedinjenja i to je respiracija. Ukoliko je krajnji akceptor elektrona organsko jedinjenje onda je to fermentacija. Bakterije koje u energetskom metabolizmu ne koriste kisik kao krajnji akceptor elektrona već druga anorganska jedinjenja kao nitrate, karbonate i sulfate imaju anaerobnu respiraciju. U ovim procesima učestvuje ETS – i, analogni onim u aerobnoj respiraciji. Anaerobnu respiraciju imaju striktni anaerobi (redukuju sulfate i karbonate) i fakultativni anaerobi (denitrifikatori , E.coli). Kod fakultativnih anaeroba se u ovisnosti o prisustvu kisika u okolini mjenja aerobna respiracija sa anaerobnom, iako je proces anaerobne respiracije manje efikasan on omogučava respiraciju bakterija. U sredinama gdje nema oksigena takvi mikroorganizmi imaju ekološki i industrijski značaj.

Redukcija nitrataNitrati su čest akceptor elektrona u anaerobnoj respiraciji. Za korištenje nitrata (NO3) potreban je enzim nitrat – reduktaza (koji u molekuli ima molibden i vezan je za plazmamembranu bakterija – enzim). On katalizira redukciju nitrata do nitrita u anaerobnim uslovima, dok u aerobnim imaju aerobnu respiraciju. Najbolje je proučen redukcijski sistem E.coli. NO3 - + H2 = NO2

- + H2ONagomilavanje nitrita može biti toksično za mikroorganizme. Neke aerobne vrste iz rodova Bacillus i Pseudomonas mogu u anaerobnim uvjetima vršiti denitrifikaciju tj. reducirati nitrite do molekularnog N2. Denitrifikacija se odvija u tlu i ti procesi su važni za kruženje azota u biosferi. Međutim za većinu organizama elementarni azot nije pogodan izvor azota već su nitrati pa sa agronomskog stanovišta denitrifikacija nije koristan proces.

Redukcija sulfataKrajnji produkt je H2S, vodonik sulfid, značajan u mnogim biohemijskim procesima. Buduči da je za redukciju sulfata potreban ATP taj proces nije energetski efikasan. Donori elektrona za redukciju sulfata su vodik i različita organska jedinjenja od kojih su najčešći laktat (mliječna kis) i acetat. Buduči da su najčešća oksidirana forma sumpora i jedna od glavnih anjona u morskoj vodi njih iskorištavaju specifične bakterije koje su široko rasprostranjene u prirodi, npr. Desulfovibrio desulfuricans i obligatni anaerobi koji koriste sulfat kao krajnji akceptor elektrona i reduciraju ga do sulfida. SO4 + 8 e- + 8 H+ = S2- + 4H2OMnoge sulfat reducirajuče bakterije poznate su po tome što koriste acetat kao jedini izvor energije, one reduciraju sulfate do sulfida i oksidiraju acetat do CO2, ti mikrobi koriste modifikovani Krebsov ciklus za oksidaciju acetata.Acetat + SO4

2- + 3H+ = 2CO2 + H2S + 2H2O

Redukcija karbonata

82

MICROBIOLOGY CO2 je često jedinjenje i glavni je produkt metabolizma hemoheterotrofa. Nekoliko grupa prokariota koristi CO2 u anaerobnoj respiraciji kao krajnji akceptor elektrona. Metanogene arheje koriste CO2 kao krajnji akceptor elektrona i produciraju metan pri čemu im kao donor elektrona služi hidrogen. CO2 + 8e- + 8H+ = CH4 + H2OOvi striktni anaerobi žive u rumenu preživara (jedna krava producira 60L CH4) i u mulju bara, jezera kao i na otpadu gdje dolazi do dekonpozicije.

FERMENTACIJA

Pirogrožđana kiselina nastala razgradnjom glukoze može se koristiti u procesu respiracije ili u nekoj od fermentacija. Vrenja nastala djelovanjem mikroorganizama su procesi koji se stalno odvijaju u prirodi. Od davnina se koriste za dobijanje alkohola, u preradi mlijeka, duhana, konoplje, lana i dr. Paster je prvi objasnio da vrenje nastaje djelovanjem mikroorganizama, a do tada se smatralo da je vrenje proces čisto hemijske prirode. Fermentacije su procesi u kojima su organska jedinjenja i donori i krajnji akceptori elektrona. U zavisnosti od vrste supstrata stvaraju se i krajnji produkti fermentacije. Jedan isti supstrat može u toku fermentacije dati različite produkte u različitih mikroorganizama. Broj nastalih produkata fermentacije zavisi od vrste mikroorganizma i uvjeta sredine. Proces fermentacije ne zahtijeva kisik, ali se ponekada može odvijati u prisustvu kisika. Količina enenrgije koja se stvara u procesima vrenja je mala (1 ili 2 molekula ATP),

tj. ograničena na energiju nastalu tokom glikolize. Za ove procese nije potreban Krebsov ciklus i ETS. Konačni produkti vrenja koriste se u identifikaciji mikroorganizama. Dva tipa mikroorganizama: homofermentativni mikroorganizmi – reduciraju piruvat do mliječne kiseline (Bacillus, Lactobacillus, Streptocooccus), dok heterofermentativni oblici osim laktata proizvode sirčetnu , mravlju kiselinu, etanol, te ostale alkohole i aceton (kvasci i ostale gljivice, Streptocooccus, Clostridium i neke G- bakterije). Heterofermentativni oblici često koriste pentoza- fosfatni put katabolizma ugljikohidrata. Fermentacija ugljikohidrata počinje glikolizom (kao i respiracija). Ako mikroorganizmi koriste EMP put, kao rezultat nastaju 2 molekule ATP, 2 piruvata i 2 NADH, i po jedna molekula glukoze. To je kompletna energija nastala u procesu fermentacije. U nastanku fermentacijskog puta dolazi do ponovne oksidacije koenzima NADH u NAD+. Različiti mikroorganizmi imaju

83

MICROBIOLOGY različite puteve za iskorištavanje piruvata za ponovnu oksidaciju NADH, zbog čega i nastaju različiti krajnji produkti fermentacije. Prema produktu koji nastaje fermentacije su dobile svoje nazive: alkoholna, mliječna, propionska i dr. Osim ugljikohidrata fermentacija se može odvijati s aminokiselinama, organskim kiselinama, purinima i pirimidinima.

Alkoholna fermentacija

Tokom alkoholne fermentacije piruvat se pretvara u alkohol i CO2. Ta je reakcija povezana s oksidacijom NADH u NAD+. Katabolizam glukoze se odvija po EMP putu.

C6H12O6 + 2ADP + 2 Pi = 2C2H5OH (etanol) + 2CO2 + 2ATP

Alkoholna fermentacija je poznata u velikog broja kvasaca, ali u malog broja bakterija. Ima veliki ekonomski značaj jer se široko primjenjuje u pekarstvu i za dobijanje vina, rakije, piva, etanola. Najširu primjenu ima pekarski kvasac Saccharomyces cervisae, koji podiže tijesto zahvaljujuči izdvajanju CO2 u toku alkoholne fermentacije.

Mliječno – kiselinska fermentacija

Ima veliki ekonomski značaj jer se primjenjuje u proizvodnji sira i ostalih mliječnih proizvoda. Ovaj fermentacijski put se izvodi pomoču bakterija mliječne kiseline. Razlikuju se dva tipa: homo i heterofermentativni. Mikrobna flora novorođnečeta: dominiraju mliječno-kiselinske bakterije u želucu, zatim varenje u ustima (razaranje zubne gleđi produkt je mliječne kiseline). Ovaj put je naročito značajan u mljekarstvu, jer se na taj način ukiseljava mlijeko, proizvodi sir, jogurt. Karakterističan je za vrste Streptocooccus, Pediococu i neke vrste Lactobacilus. Streptokoki u usnoj šupljini razaraju zubnu gleđ, laktobacili u probavnom traktu pospješuju probavu mlijeka (acidofilno mlijeko). U heterofermentativnom putu razgradnje glukoze mikroorganizmi koriste uglavnom pentoza- fosfatni put glikolize. Konačni produkt su mliječna kiselina, etanol i CO2.

C6H12O6 + 2ADP + 2 Pi = mliječna kis + 2C2H5OH (etanol) + 2CO2 + 2ATP Ovaj tip fermentacije prozivode vrste iz roda Leuconostoc (proizvodnja kiselog kupusa) i neke vrste Lactobacillus.

84

MICROBIOLOGY

Propionska fermentacija

Ovdje iz glukoze nastaje propionska kiselina. Bakterije iz roda Propionbacterium počinju fermenaciju s mliječnom kiselinom kao supstratom. Te vrste bakterija započinju fermentaciju teka kada se mlijeko zgruša, kada bakterije mliječne kiseline završe fermentaciju. Propinobacterium prerađuje nastalu mliječnu kiselinu u propionsku kiselinu i CO2. U ovoj naknadnoj fermentaciji oslobođeni CO2 otvara šupljine u polučvrstoj masi švajcarskog sira, a propionska kiselina daje mu karakterističan oksu.

Mješovita fermentacija

Dobila je naziv po tome što se kao konačan produkt dobiva čitva niz različitih jedinjenja. Odvija se pomoču raznih fakultativnih anaerobnih bakterija iz porodice Enterobacteriaceae. U tom fermentativnom putu se piruvat dobiven glikolizom pretvara u različite produkte: etanol, acetat, sukcinat, vodonik, karbon dioksid i dr. ovisno o vrsti mikroorganizma. Mješovito kiselinsko vrenje može se odrediti pomoču metil crvenog (MC) testa koji je jedan od testova za identifikaciju bakterija kao sto je E.coli.

Butandiolna fermentacija

Voges – Proskenrov test se primjenjuje zajedno sa MC testom za razlikovanje E.coli od Enterobacter aerogens. E.coli je indikator fekalnog zagađenja vode za piće. Tim pokusom određuje se aceton koji nastaje kao produkt (međuprodukt) u butandiolnoj fermentaciji. Neke vrste Klebsiela obavljaju i ovu i mješovitu fermentaciju.

Butanolna fermentacija

Predstavnici iz roda Clostridium obavljaju ovo vrenje koje je poznato kao put buterne kiseline. Različite vrste klostridija tvore različite konačne produkte tokom ove fermentacije (aceton i CO2, buterna kiselina, butanol, aceton se koristi u proizvodnji laka za nokte).

85

MICROBIOLOGY

SPECIFIČNI ANABOLIČKI PROCESI U MIKROORGANIZAMA

Posebni procesi katabolizma jedinsveni za mikroorganizme su ED put (Entner-Dudroff) razgradnje glukoze, razgradnja aromatičnih jedinjenja, anaerobna respiracija, fermentacija. Postoje i specifični anabolički procesi kao npr. poznati proces sinteze peptidoglikana, glikosilatni ciklus i proces fikacije azota.

GLIKOSILATNI CIKLUS

Ovaj ciklus predstvalja modificirani Krebsov ciklus i može se koristiti kao biosintetički put glukoze od acetilkoenzima A. Neki mikroorganizmi pomoču glikosilatnog ciklusa iskorištavaju acetat kao izvor ugljika (acetat ima 2 C atoma). Krebsov ciklus ne može koristit 2-ugljične karbonske kiseline u kome nastaju 4C intermedijeri koji se mogu koristiti za glikoneogenezu i za druge biosintetičke puteve. Dva enzima jedinstvena su za glikosilatnu kiselinu: isocitrat liaza i malat sintaza. Od acetata pomoču enzima acetat tiokinaze nastaje acetil CoA. Od isocitrata djelovanjem isocitrat liaze nastaju glikosilat i sukcinat (čilibarna kiselina). Sukcinat se uključuje u Krebsov ciklus dok od glikosilata i CoA pomoču malat-sintaze nastaje malat koji može služiti kao prekursor u glikoneogenezi.

86

MICROBIOLOGY

FIKSIRANJE AZOTA

Neke grupe prokariota imaju sposobnost da fiksiraju elementarni azot i redukuju do NH3 pomoču enzimatskog sistema nitrogenaza. Nitrogenaza sistem je složen iz 2 enzima: dintrogenaza i dinitrogenaza reduktaze. Ovi enzimi sadrže Molibden, Vanadij ili Fe kao kofaktor.Poseban transportni sistem elektrona koji se sastoji od feredoksina , flavodoksina i dr. koristi se za redukciju azota. Za redukciju jedne molekule N2 u NH3 potrebno je 6 elektrona uz utrošak 3 molekule ATP-a. Enzimski sistem nitrogenaza je veoma osjetljiv na prisutnost O2 i nepovratno se inhibira niskom koncentracijom O2 i visokom koncentracijom ATP-a. (pogledati iz vježbi razlike između simbiotskih i asimbiotskih prokariota). Neki od tih azotofiksirajučih organizama, slobodni: azotobakter, cijanobakterije, clostridium, crvene i zelene sumporne bakterije i metanogene arheje. Kod cijanobakterija fiksacija N2 se odvija u heterocistama. U sam proces azotofiksacije uključeno je mnogo proteina i oko 30 različitih gena i taj set gena se zove NIH REGULON. Biljka usvaja azot u formi nitrata i taj proces se naziva nitrifikacija (NH3 se reducira do nitrita , a ovaj do nitrata NO3 i NO2).

87

MICROBIOLOGY

Figure 16.24. Pathway of Gluconeogenesis.

88

MICROBIOLOGY

TOKSINI PROKARIOTA

Neke bakterije i gljivice u toku svog metabolizma produkuju otrovne supstance koje predstavljaju antitijela. Ta tijela su sekundarni metaboliti, (primarni metaboliti su neophodni za rast i razvoj dok sekundarni nisu). Bakterijski toksini se sintetiziraju u bakterijskoj ćeliji i prema načinu oslobađanja dijele se na egzotoksine i endotoksine. Egzotoksini su solubilni proteini koje neke patogene bakterije izlučuju u vanjsku sredinu a putem krvotoka mogu dospijeti u bilo koji dio čovječijeg tijela. Glavni su faktori virulencije u patogenezi bolesti kao npr. tetanus, difterija, gasna dandreja, dizenterija i dr. Egzogene toksine luče vrste rod Clostridium, Bacillusi, Staphilococcus, Corinebacterium difteriae, Shygella disenteriae, Pseudomonas aengunosa. Egzotoksini su najjači poznati otrovi, npr. jedan od najjačih toksina je Clostridium botulinum (oko 200 g ovog otrova može ubiti cijelo čovječanstvo). Egzotoksini imaju specifičan afinitet prema pojedinim tkivima: neurotropni, kardiotropni, nefrotropni i zbog toga imaju specifične simptome bolesti. Npr. egzotoksin C.tetani (tetanus) luči se u trenutku klijanja endospore u vegetativnu stanicu, napada motorne nerve i uzrokuje izuzetno snažne nevoljne grčeve muskulature. Enterotoksini su egzotoksini koji napadaju crijevni sistem, i uzrokuju dijareje čime omogučavaju kolonizaciju bakterija (E.coli. Sallmonela tifi, Vibrio chollerae). Endotoksini su sastvni dio bakterijske stanice , tj. lipid A koji je komponenta lipopolisaharidnog kompleksa u staničnoj stijeni G- bakterija. Njih bakterije ne mogu izlučivati u vanjsku sredinu , oni se oslobađaju iz bakterijske stanice samo ako se ona razori. To su mnogo slabiji otrovi od egzotoksina i ne pokazuju izraziti afinitet prema pojedinim vrstama tkiva. Svi endotoksini izazivaju iste ili slične simptome tj. stanica domačina kao odgovor na endotoksin luči pirogene supstance koje uzrokuju groznicu i bol na mjestu infekcije.

MYCOTOKSINI - toksini gljivica i plijesni

AFLA TOKSINI su toksični metaboliti koji proizvode neke vrste iz roda Aspergillus (Aspergilus flavus- Afla). Otkriveni tek 60-tih godina u SAD. Afla toksini se opisuju kao uzročnici velikog broja bolesti, izazvanih konzumiranjem pljesnivih namirnica. Ti se toksini povezuju sa karcinogenešču i hroničnim trovanjem ljudi, npr. povezanost unošenja afla toksina B1 hranom i karcinom jetre, istraživano u tropskim područijima Afrike i Azije. Istraživanja načina djelovanja afla toksina B1 otkrila su njegov inhibitorni učinak na replikaciju DNK i sintezu RNK i proteina kao i na plasmamembranu i put oksidativne fosforilacije.Balkanska nefropatija – endemska bolest za koju se smatra da je odgovoran OHRATOKSIN, mykotoksin Aspergilus ochraeus.

89

MICROBIOLOGY

PRIMJENA MIKROORGANIZAMA U ZAŠTITI ŽIVOTNE SREDINE

Rezistencija prirodnih organskih jedinjenja i ksenobiotika na mikrobnu razgradnju

Većina prirodnih materijala podložna je razgradnji pomoču mikroorganizama. Izuzetno su rijetka organska jedinjenja koja nisu podložna anaerobnom katabolizmu. To su lignin i alifatski ugljikovodici (npr. oktadekan i heksadekan). Lignin je polimer jednostavnih fenolnih alkohola koji sekundarnoj staničnoj stijenci daje čvrstoču i krutost. U anaerobnim uslovima izuzetno je stabilan, tj. ne služi kao supstrat za fermentaciju, međutim u aerobnim uvjetima ta jedinjenja veoma brzo razgrađuju mikroorganizmi. Proces bioremedijacije tj. čišćenja okoline od zagađivača primjenom živih organizama (mikroorganizmi i neke biljke) koji oksidiraju ugljikovodike su glavni agensi za razgradnju ulja i drugih produkata. Mikrobi učestvuju u uklanjanju naftnih mrlja tako što oksidiraju ulje do CO2 koji je isparljiv. Različiti mikrobi mogu degradirati petrolej kao npr vrste iz fam: Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae , Mycobacteriaceae, neki kvasci.

KsenobioticiProblem rezistencije sintetičkih polimera na mikrobnu razgradnju. U prirodi osim prirodnih jedinjenja postoje i sintetička jedinjenja uglavnom proizvedena u industriji, neka su slična prirodnim ali neka se veoma razlikuju od prirodnih proizvoda. Mnogi hemijski produkti kao što su pesticidi, plastika i dr., posebno su mikrobiološki interesantni jer nisu postojali u prirodi, zajdenički naziv za njih su ksenobiotici. Oni opstaju u okolišu jer mikrobi koji bi ih razgradili najvjerovatnije ne postoje u prirodi tj. nisu evoluirali. Mada če takvi mikrobi vremenom možda evoluirati poželjno je koristiti materijale koji su biorazgradivi. Neki od najrasprostranjenijih su pesticidi, koji su toksične komponente otpada. Pesticidi su dijelovi herbicida, fungicida i insektcida. Opsežnim mikrobiološkim studijama se pokazalo da ovi ksenobiotici mogu biti razgrađeni samo putem uključivanja odabranom kulturom a ne čistom kulturom mikroba – mikrobni konzorcij.

Suzbijanje štetnih insekata pomoču mikroorganizama

Veliki broj hemijskih insekticida kao što je DDT ne mogu se lahko razgraditi pomoču mikroorganizama i u tlu zaostaju kao toksični onečišćivači. Ispiranjem tla i kišom ti se insekticidi prenose u rijeke, jezera i mogu biti uključeni u lanac ishrane (ribe, školjke, račići i dr.), osim toga, mnogi insekticidi se moraju dodavati u većim količinama jer su nove generacije insekata sve otpornije na njihovo djelovanje.

90

MICROBIOLOGY Primjenom mikrobiološkog umjesto hemijskog načina suzbijanja insekata mogu se izbječi štete u okolišu. Različite vrste bakterija i gljivica dansa se upotebljavaju za suzbijanje štetnih insekata npr. Bacillus thuringiensis koristi se u SAD-u radi spriječavanja štetnih gusjenica na djetelnini, crva u zrnima kukuruza, onih koji napadaju kupus, listove duhana i vočaka. Ta vrsta bakterija tokom sporulacije sintetizira proteinske kristale, otrovne za probavni sistem insekata, BT toksin (uzgoji se velika količina bakterija, potom se osuši i rasprši na zrnje koje insekti napadaju). Insekti do sada nisu stekli otpornost prema mikrobnim insekticidima.

Mikrobna plastika

Gomilanje čvrstog otpada, među kojima je i plastika je problem današnje civilizacije. Savremena zaštita je usmjerena na traženje alternativnih supstrata koje če biti biološki razgradivi i koji če zamjeniti sintetičke polimere koji nisu biorazgradljivi. To znači nači takve sintetičke polimere koje če mikroorganizmi uspješno razgrađivati. Ono što je do danas postignuto je to da su dobiveni:

1. fotorazgradljiva plastika (koja je od materijala čije se polimerične strukture izmjene djelovanjem UV radijacije Sunca i nastaju modifikovani polimeri podložni razgradnji).

2. škrobom povezana plastika (ugrađivanjem škroba koji međusobno povezuje kratke fragmete polimera, takva plastika je biorazgradljiva, jer bakterije tla koje razgrađuju škrob u tlu razgrađivače škrob i u plastici i time osloboditi fragmente polimera koje če dalje razgraditi drugi organizmi).

3. mikrobna plastika – novo područje istratraživanja u kojem se kao sirovina za poizvodnju plastične ambalaže koriste prirodno sintetizirani bakterijski polimeri poput rezervnih lipida (poli – β – hidroksi buterna kiselina, PBH). Istraživanja su pokazala da se priroda izvedenog polimera može kontrolirati primjenom supstrata za rast mikroba. Ova plastika ima znatnu prednost u odnosu na prethodno spomenute jer se brzo razgrađuje i u aerobnim i anaerobnim uslovima. Bakterija iz koje se dobija mikrobna plastika naziva se Alakaligenes eutrophus, a britanska kompanija Chemical Industries plasirala je prije nekoliko godina proizvod BIPOL.

Proteini jednoćelijskih organizam ( single cell protein –SCP)

Zahtjev za sve većom količinom hrane u rastučoj svijetskoj populaciji neprekidno se povećava. Stoga naučnici istražuju nove izvore hrane. Jedan od takvih izvora su proteini jednoćelijskih organizama i ostale hranjive tvari proizvedene pomoču mikroorganizama uzgojenih na industrijskim otpadima. Prednost jednostaničnih proteina pred žitaricama je u tome što mikroorganizmi veoma brzo rastu i mogu proizvesti veliki prirast proteina, koji je 15x veći od prinosa svoje mase ili 50x veći od prinosa kukuruza, npr. 500 kg kvasca može u toku jednog dana proizvesti 50 tona proteina. Oni nisu osobito ukusni i zahtijevaju dodavanje tvari za poboljšanje ukusa , kao i dodatak esencijalnih aminokiselina. Iz tog razloga se oni prvenstveno koriste kao dodatak stočnoj hrani.

91

MICROBIOLOGY

Mikroorganzimi kao izvor energije

Istraživanja su na početku, ispituju se mogučnosti za dobijanje prirodnih izvora energije koristeči otpadne materije organskih jedinjenja. Striktno anaerobne metanogene arheje tj. one koje stvaraju CH4 (bioplin) kao krajnji produkt kompleksne serije u koji su uključeni različite mikrobe, nekoliko hiljada koristi kao male bioreaktore za proizvodnju bioplina za kuhanje i osvijetljenje razgradnjom otpadnog materijala iz štala i sanitarnih uređaja. Prečišćeni otpadni materijal završi kao đubrivo.

Mikrobi mulja i otpadnih voda

Potiču iz dva izvora: kanalizacija i industrijskih procesa. Zbog zdravlja ljudi, ekonomskih i estetskih razloga ne bi trebali biti bez prethodnog tretmana odloženi u jezera i rijeke. Nepoželjni efekti, toksični materijali, eutrifikacija tj. velika koncentracija organskih materija, prisutnost gline, blata, prisutnost patogenih mikroba. Tretiranje otpadnih voda je višestupnjevito, uključuje fizičke i biološke procese 3 vrste: primarni, sekundarni i tercijarni.

Primarni procesi– fizičko odstranjivanje krupnijeg otpada pomoču serije višetkastih filtera, a zatim se efluenti (ono što teče s vodom) talože više sati, da se istalože suspendirane čestice u vodi.

Sekundarni procesi – najvažniji i bitno vezani za mikrobiološke procese. Tu su uključni brojni i raznovrsni sistemi mikrobioloških kultura koji te organske materije mulja potpuno razlaže do CH4 i CO2, u obradi mulja koriste se i anaerobni (anoksični) i aerobni (oksični) procesi. Anoksični procesi : org.materija = CH4, a oksični: org.materija=CO2 Aerobni: nekoliko koraka od kojih su najznačajniji aktivacija mulja i filtriranje tj. prokapljavanje otpadne vode u velikim tankovima sa sluzavim bakterijama, zoogleja koje obrazuju masu na površini tanka a povremeno su prisutne filamentozne bakterije i gljive.

Tercijerni, fizičko – hemijski procesi uključuju i brzu redukciju anorganskih tvari, posebno fosfata i nitrata. U mnogim slučajevima nakon obrade dobije se voda visokog kvaliteta koja se može koristiti kao tehnička voda, a aktivni mulj tj. blato se nakon sušenja skuplja i dobiveni pepeo se koristi kao đubrivo.

92

MICROBIOLOGY

BIOGEOHEMIJSKI CIKLUS ELEMENATA

Biogeohemijski ciklus ugljika

C se uključuje u lanac ishrane kada fotosintetički organizmi konvertiraju CO2 do organskih karbonskih jedinjenja. Procesom disanja CO2 se vrača u atmosferu i njegova je koncentracija konstantna u atmosferi pomoču respiracije. Ovo kretanje C između anorganskih i organskih formi zove se ugljični ciklus. Godišnje se oko 80 milijardi tona anorganskog C pretvara u organsku materiju. Više od 50% konverguju fotosintetski organizmi u okeanu, a ostalo suhozemni organizmi = primarni producenti. Dvije su sudbine primarnih producenata: ugibanje u šumama (razlažu se djelovanjem mikroorganizama razlagača), a druga konzumiranje od strane potrošaća (npr. životinja). U oba slučaja većina C se oksidira u procesu respiracije pri čemu se oslobađa karbon dioksid. Jedan dio C se inkorporira u ćelije konzumenta, ali i on na kraju izlazi bilo ekskrecijom bilo raznim ostacima ili završe u tijelu predatora, na kraju razlagači koriste uginule materije za svoj rast i putem respiracije vračaju u atmosferu karbon dioksid.Izvjesne arheje produciraju CH4 od CO2 tj. koriste alternativni put za metabolizam C, ali postoje i mikroorganizmi koji mogu oksidirati CH4 do CO2 koji se ponovno vrača u atmosferu = metanooksidacija. Jedino fosilna goriva predstavljaju deponiju C ispod zemljine površine koje mogu osloboditi CO2 sagorjevanjem.

93

MICROBIOLOGY

Ciklus N

To je najkompleksniji biogeohemijski ciklus zbog značaja nitrogena u staničnom metabolizmu, raznolikosti tipova metabolizma nitrogena kao i postojanja ovog elementa u različitim formama. Prokarioti su uključeni u nekoliko procesa. U rumenu preživara žive metanogene arheje, kao i u rudnicima i na deponijama smeća, gdje se oslobađa metan koji odlazi u atmosferu.

Fikacija azotaIskorištavanje atmosferskog N2 kao izvora azota naziva se azotofiksacija. Tu sposobnost imaju neke bakterije i arheje. Azotofiksatori slobodno žive u aerobnim i anaerobnim uslovima ili u simbiozi sa specifičnim biljnim domačinom. Azotofiksatori su mikroorganizmi koji vrše fiksaciju azota. Fiksacija azota u simbiozi odvija se kada su bakterije prisutne u nodulama korijena biljnih domačina. Još uvijek nema podataka da neki eukarioti fiksiraju azot. U procesu fiksacije azot se reducira do amonijaka, a potom se amonijak konvertira u organsku formu. Redukcioni procesi su katalizirani enzimskim kompleksom nitrogenaza koji se sastoji od dva proteina: dinitrogenaza i dinitrogenaza reduktaza. Obje komponente sadrže Fe, dok dinitrogenaza sadrži i Mo.Neke azotofiksirajuče bakterije mogu sintetizirati više od jedne nitrogenaze u nekim uvjetima rasta koje se nazivaju alternativne itrogenaze.One ne sadrže Mo već umjesto njega sadrže vanadij ili samo Fe. Alternativne nitorgenaze se ne sintetiziraju kada ima dovoljno Mo. Vjerovatno služe kao pomočni mehanizmi u fiksaciji N2, sve dok su vrijednosti Mo ograničene u okolišu. Molibdenska nitrogenaza je opčenito glavna nitrogenaza u stanici. N2 = NH3

Nitrifikacija je proces oksidacije amonijaka do nitrita pomoču bakterija nitrifikatora (Nitrosomonas, Nitrobacter i dr.). Nitrati se najpristupačnija forma azota za biljke. Nitrifikacija se obavlja u 2 faze pomoču specifičnih bakterija:

1. oksidacija amonijaka do nitrita NH3 = NO2

2. oksidacija nitrita do nitrata NO2 = NO3

Asimilacija azota od strane organizma obično je u formi nitrata do amino grupe ili amonijaka.

Denitrifikacija – proces suprotan nitrifikaciji. To je transformacija nitrata do molekularnog azota ili azotnih oksida. Bakterije denitrifikatori su: Thyobacillus denitrificans, Micrococcus denitrificans, te neke vrste rodova Pseudomonas, Bacillus i Serratia. To su aerobi koji u slučaju nedostatka kisika za respiraciju imaju alternativnu anaerbnu respiraciju. Reakcije denitrifikacije azotnih organskih jedinjenja do amonijaka se odvijaju uglavnom u procesu dezaminacije pomoču mikroorganizama.

Amonifikacija je produkcija amonijaka pomoču mikroorganizama iz različitih bjelančevinastih materija. Amonijak nastaje u procesu deaminacije produkata hidrolize proteina. Sudbina nastalog NH3 je različita:

1. dio se fiksira u zemljištu2. drugi dio iskorištavaju mikroorganizmi3. dio se oksidira do nitrata

94

MICROBIOLOGY

4. dio se oslobađa u atmosferi.

Amonofiksatori: Bacillus cereus, Bacillus micoides...

Ciklus SSumpor ulazi u sastav nekih vitamina, esencijalnih metabolita i 2 amino kiseline (cistein i metionin). Mikroorganizmi mogu transformirati od najviše oksidovane forme sulfata SO4 do najviše redukovane forme sulfata H2S. Dvije grupe prokariota oksidiraju H2S do S i S do SO4 ,anoksigenične fotosintetske purpurne i sumporne bakterije i bezbojne sumporne bakterije i arheje.Budući da SO4 i S mogu biti akceptori elektrona u respiraciji, sulfat reducirajuče bakterije produciraju H2S tokom anaerobne respiracije. Bakterije i biljke asimiliraju S u formi SO4 i koriste ga i reduciraju do sulfida. Životinje i bakterije mogu koristiti kao izvor S sulfidne grupe proteina tokom njihove razgradnje.

SO4 = H2SH2S =SS = SO4

95

MICROBIOLOGY

KLASIFIKACIJA PROKARIOTA

Heckel je 1866. god svrstao mikroorganizme u carstvo Protista koje je odvojeno od biljnog i životinjskog carstva. Još uvijek neki mikrobi kao što su protozoe, alge i gljivice se klasificiraju po konvencijama za biljke i životinje. Takav pristup ne odgovara klasifikaciji prokariota. Klasifikacija prokariota znatno je kompliciranija od klasifikacije eukariota zbog prirode organizama:

1. to su jednostanični organizmi koji se morfološki razlikuju po malo detalja npr. postoje stotine bakterija koje imaju ista morfološka obilježja.

2. kriterij za definiranje vrste, buduči da se vrsta definira kao populacija organizama čiji pripadnici razmjenjuju genetički materijal i daju plodno potomstvo. To podrazumjeva spolno razmnožavanje. Takva definicija vrste nije adekvatna za prokariote buduči da se oni ne razmnožavaju spolno. Vrsta je u bakteriologiji definira kao skup sličnih sojeva ili klonova koji se značajno razlikuju od drugih grupa klonova. Soj je u bakteriologiji sistematska kategorija, soj je populacija genetički istovjetnih staica koje vode porijeklo od jedne stanice, tj. sojevi su podgrupe unutar vrste koji imaju ista biohemijska, morfološka i serološka svojstva i stupanj infektivnosti. Soj =izolat.

Nomenklatura – imenovanje vrste, klasifikacijaU klasifikaciji Prokariota se primjenjuje kombinacija klasičnih morfoloških kriterija i molekularnih kriterija koji odražavaju genetičku i evolutivnu srodnost - filogenetska (molekularna klasifikacija).

1. Numerička klasifikacija podrazumjeva oblik, veličinu, bojenje po Gramu, prisutnost endospora i broj, broj flageluma, biohemijska svojstva i serološka svojstva. U novije vrijeme se koristi genetička metoda, procenat G+C baza koji može biti 25 – 75% u DNK.

2. Molekularne klasifikacije – kada govorimo o ovim metodama one se baziraju na molekulskim analizama bioloških makromolekula u stanici: homologija molekula DNK – ispituje se metodom molekularne hibridizacije nukleinskih kiselina. Izoliraju se 2 DNK, one se hibridiziraju i ako se spoji više od 75% baza 2 DNK, one u hibridu su srodne.

Analiza ribozomalne RNK – sekvenciranje bakterijskog hromosoma je zahtijevan, skup i dugotrajan posao, stoga za većinu prokariota nisu poznate sekvence kompletnog genoma. Jednostavniji put je sekvenciranje kračih segmenata DNK. Danas se koristi gen za 16 S ribozomalnu RNK koja se nalazi u sastavu male ribozomalne podjedinice jer je prisutna u svim ćelijama i veoma je pogodna za sekvenciranje zbog dužine (1 500) i dosta je konzervirana (malo se mjenja), njen ekvivalent kod eukariota je 18 S. RNK je starija od DNK. Danas se umjesto komparativnog analiziranja 16 RNK sekvence sve više koristi ribotipiziranje. To je metoda u kojoj se izolovana DNK tretira restriktivnim enzimima (endonukleaza prepoznaje mjesto na molekuli DNK i sjece ga). Nastali fragmenti DNK se hibrifiziriaju sa genima 16S rRNK. U gelu se nakn toga dobiju tzv. molekularni otisci koji su jedinstveni za bakterijsku vrstu pa čak i soj.

96

MICROBIOLOGY Analiza lipida, tj. masnih kiselina, to se naziva FAME predstavlja

karakteriziranje tipova i zastupljenost masnih kiselina u plasmamembrani ili u vanjskoj membrani G- bakterija.

97

MICROBIOLOGY

Molekularna filogenija prokariota

U predloženom filogenetskom stablu koje je predložio Woese 1987, 1991, postoje tri pravca stanćne evolucije: Bacteria, Archaea i Eucarya, na osnovu sekvenci 16S (18S) rRNK jedinstvenih za svaku grupu – signature sekvence. Na osnovu toga danas se predlaže revizija Whittakerovog petocarstvenog klasifikacijskog sistema stanćnjaka. Prema Woesu svi organizmi mogu se svrstati u tri domena, od koji 2 imaju prokariotsku organizaciju stanice. Unatoč morfološkoj i fiziološkoj raznolikosti bakterija, sve se mogu svrstati u 17 različitih grupa. Najprimitivniji su: Aquiflex, Thermotoga, najodvedenije su: Proteobacteria, G+ bakterije čine jedan evolutivni pravac a G- bakterije su podjeljene u različite skupine, Cyanobactria, Cytofage, Sumporne i dr.Myoplazme nemaju ćelijsku stijenku i srodne su G- bakterijama i to pripadnicima roda Bacillus, E.coli i pripadnicima Klebsiella.Unutar arheja kada se genetički analiziraju razlikuju se 2 carstva: Crenarheota i Euryarcehota.Ukoliko neka 2 prokariota imaju 20-60% homolognih sekvenci DNK smatra se da su pripadnici istog roda, a ukoliko imaju preko 70% homolognih sekvenci DNK ukazuje da su pripadnici iste vrste. Do sada je opisano oko 4,5 hiljada vrsta, a kultivirano je 1% postoječih mikroba. ATCC (American Type Culture Colection) – čuvaju tipične kulture svake opisane vrste ili soja. Deponuju se u međunarodno priznatim kolekcijama ATCC – američka i DSMZ – njemačka, na veoma niskim temeraturama od -80°C do -196°C ili biofilizirni. Deponovani soj postaje tipičan soj i predstavlja standard sa kojim se upoređuju svi sojevi za koje smatramo da su isti.

Praktična klasifikacija prokariota

Glavna svrha klasifikacije prokariota je da obezbijedi praktičan sistem za identifikaciju tih organizama. Iako ne postoji opće prihvaćena klasifikacija danas je najšire korištena klasifikacijska šema Berdžejev (Bergeyev) priručnik determinativne bakteriologije i Berdžejev priručnik sistematske bakteriologije. Prvo determinativno izdanje 1923. god, a zadnje 1994. god u kojem su prokarioti svrstani u 35 grupa (sekcija), od kojih je 30 sekcija eubacteria i 5 arheja. Berdžijev priručnik sistematske bakteriologije izdat je u 4 volumena. Prvi volumen je izdat 1984. god, a zadnji 1989. god, u kojemu su osnovni kriteriji bili morfološki uz dodatak procenta baza G+C. Drugo izdanje koje se još uvijek prodaje, a poćelo se publicitovati 2001, je u 5 tomova, od kojih je 1. tom arheje a u ostala 4 su bakteriju, i u njemu su napredni koncepti proizišli iz istraživanja sekvence rRNK, zajedno sa klasičnim taksonomskim informacijama, tako da su tom izdanju dodani novi taksoni (nove kategorije), dok su veliki kompleksni rodovi, npr. Pseudomonas, Streptococcus, Bacillus podjeljeni u više rodova.

98

MICROBIOLOGY

NEOBIČNE SKUPINE PROKARIOTA

Archaea

• Imaju prokariotsku organizaciju ćelije. Njihova stanična stijenka ne sadrži peptidoglikan i razlikuje se po strukturi od bakterijske stijenke. Građena je od pseudomureina, polisaharida, glikoproteina, proteina ili je uopče nemaju - nikada nemaju peptidoglikan.

• Membranski lipidi se razlikuju od lipida drugih stanćnjaka. Dugi granati lanci ugljikovodika vezani su za glicerol esterskom vezom.

• Enzim RNK-polimeraza (vrši sintezu RNK na lancu DNK). RNK polimeraza bakterija je građena od 4 različita proteina, dok je kod Achaeae i Eucaryota nekoliko tipova, građenih od 8 -12 podjedinica kod Archaea, a kod Eucaryota 3 tipa RNK polimeraze građene od 12-14 podjedinica.

• Histonski proteini su prisutni kod Archaea a bakterije ih nemaju.• Ribosomi su 70S kao kod bakterija, ali su ribosomalni proteini sličniji

eukariotskim.• Toksin difterije dijeluje inhibitorno na njihovu sintezu proteina kao i kod

Eucaryota, dok ne djeluje na bakterije. Mnogi antibiotici koji djeluju inhibitorno na sintezu proteina bakterija ne djeluju inhibitorno na arheje i eukariote (npr. streptomicin ne djeluje na arheje).

• Inicijator tRNK je metionin kao i kod eukariota, a ne formilmetionin kao kod bakterija.

• Specifični metabolički putevi: metanogeneza, bezhlorofilna fotosinteza i dr.• Sposobnosta rasta u sredinama koje su ekstremno nepristupačne za druge

organizme.Uobičajno je da se Archaea klasificiraju metabolički, tj. fiziološki:1. Metanogene Archaea - strkitni anaerobi koji razgrađuju organske molekule do

metana, nalaze se u močvarama, mulju, jezerskom i morskom sedimentu, rumenu preživara, endosimbionti Protozoa.

99

MICROBIOLOGY

2. ekstremno halofilne Archaea – obligatni aerobi koji naseljavaju izuzetno slana staništa, (preko 36% NaCl,) slana jezera, bazeni za dobijanje morske soli, Mrtvo more, površine usoljene hrane.

3. ekstremno hipertermofilne Archaea – naseljavaju jedinstvene ekološke niše, optimum preko 89°C, termalni izvori, hidrotermalna vrela na dnu okeana, okolica vulkana.

Rikettsia

Obligatni intracelularni paraziti koji se ne mogu izolirati na vještačkim hranilištima, već samo u živoj stanici (to je osobina virusa). To su izuzetno mali, G- stapičasti, kokoidni, pleomorfni mikroorganizmi koji žive u citoplazmi stanice domačina, smatra se da su produkt degenrativne evolucije bakterija. Buduči da imaju permeabilnu plasmamembranu mogu opstati samo unutar citoplazme domačina koja im omogučava stabilnost. One su endoparaziti različitih Athropoda kao što su uši, buhe, krpelji, grinje koje žive kao ektoparaziti različtih sisara, pri čemu su neke rikecije patogene za sisare. Za humanu medicinu je interesantrna samo jedna Rikettsia –

Rikettsia prowazekii, uzrokuje pjegavi tifus, a prenosi se ušima.

Rod Coxiella (blizak rodu Rikettsia), čiji se pripadnici mogu uzgojiti na hranilištima. Coxiella burnetti – uzročnik Q groznice.

100

MICROBIOLOGY

Chlamydia

Obligatni intracelularni paraziti sisara i ptica (ne prenose se Arthropodama). To su G-, nepokretne bakterije koje se umnožavaju u citoplazmi stanice domačina i nemaju sposobnost sinteze ATP –a , nemaju floroproteina i citohoroma (koriste ATP domačina). Imaju najmanji genom među prokariotima. Razvojni ciklus je komplikovan – počinje tako što se stvara mala čestica koja se zove elementarno tjelašce i ono fagocitozom dospijeva u ćeliju domačina. U citoplazmi stanice mala stanica u vezikuli se preobrača u veliku stanicu koja predstavlja vegetativnu formu za razmnožavanje Chlamydia i naziva se veliko tjelašce. Višekratnim cijepanjem vakouola se ispuni sa više elementarnih tjelašaca koja se nakon prskanja stanice oslobađaju i inficiraju nove stanice. Chlamydia psittaci – uzročnik ornitoze, papagajska gripa, bolest ptica koja se može prenijeti na ljude.

Mycoplasma , mikoplazme

To su bakterije koje nemaju stanćnu stijenku tokom svog života. Manje su veličine od bakterija i pleomorfne su jer nemaju stanćnu stijenku (zid). Njihova plasmamembrana sadrži sterole pa je otporna na lizu, (za razliku od bakterija koje ih nemaju) pa im je za uzgoj potrebna podloga bogata sterolima i serumatskim proteinima. Na čvrstoj podlozi formiraju transparentne kolonije koje pod mikrosokopm podsječaju na jaje pečeno na oko. Razmnožavaju se fragmentacijom filamentoznih stanica koje sadrže nekoliko kopija DNK. Prva poznata mikoplazma

bila je uzročnik pleuropneumonije goveda, pa su se ranije mikoplazme nazivale PPLO. Za humanu medicinu značajna je Mycoplasma pneumoniae – uzročnik pneumonije, upale pluča.

101

MICROBIOLOGY

Kolonija

Prokarioti se dijele na 4 divizije (razdijela):

I. Gracilicutes: G- bakterije,II. Firmicutes : G+ bakterije,

III. Tenericutes: Mycoplasma,IV. Mendosicutes:

Archaebacteria

102

MICROBIOLOGY

Vrsta: Treponema pallidum (uzročnik sifilisa),Rod: TreponemaFam: SpirochaetaceaeRed: SpirochaetalesKlasa: ScotobacteriaDivizija: GracilicutesCarstvo: Procariota

VIROLOGIJA

Termin virologija potiče od riječi virus, a sama riječ virus izvedena je od lat.riječi viri = otrovna tvar. Sve do početka 20-tog stolječa svaka otrovna tvar je nosila ovaj naziv. Virusi su submikroskopske strukture, a strukture manje od virusa : viroidi, satelitske RNK , prioni. Virusi inficiraju sve staničnjake domena Archaea, Eubacteria, Eucaryota. Nema tipa stanice koju ne napadaju virusi, a bolesti koje uzrokuju su viroze : SIDA, velike boginje, hepatitis.....

Virologija je dosta mlada grana znanosti. Godine 1892. otkriven je prvi virus, TMV- tobaco mosaic virus, mozaični virus duhana. Za sve viruse se ne koristi binominalna nomenklatura, njihova imena su vezana za bolest koju izazivaju. Iako su otkriveni tek krajem 19. stolječa , postoje brojni opisi bolesti koje su kolale drevnim civilizacijama, npr. iz starih kineskih crteža opisana je bolest koja je ličila velikim boginjama, drugi primjeri su bar reljefi iz starih

egipatskih dinastija koji su oslikavali neke bolesti kao npr. diječiju paralizu. Jedan od mogučih uzroka propadanja rimskog carstva tumači se epidemijom ospica i velikih boginja. Također, epidemija tipa velikih boginja uzrokovala je umiranje Osteka i na taj način su španci lakše osvojili Južnu Aemriku.

103

Smallpox VaccinationThis drawing shows a doctor administering the smallpox vaccine, first discovered in 1796 by British physician Edward Jenner. Jenner found that infecting a patient with cowpox, a minor disease, produced immunity to smallpox, which can cause disfigurement or death. His discoveries won him worldwide renown.

MICROBIOLOGY

Prvi napredak u zaštiti od virusnih bolesti učinjen je godinama prije otkriča uzročnika tih bolesti. Početkom 18. stolječa gospođa Montagu zaštitila je svoju djecu od velikih boginja vakcinacijom koja se več tada provodila u Turskoj. Prvi britanac potkraj 18. stolječa Edward Jenner 1796. godine je dječaku ucijepio sadržaj mjehurića iz ruke žene koja je imala kravlje boginje i na taj način ga zaštitio od velikih boginja, te nakon 2 godine objavio rezultate o uspješnoj zaštiti 20 osoba od te bolesti, a u čast krave = vacca, postoji današnji naziv vakcina.

Otkriče porculanskog filtra omogučilo je otkrivanje čestica koje se danas nazivaju virusi. Prvi čovjek koji je koristio porculanske filtre bio je Adolf Majer, i on je opisao mozaičnu bolest duhana, čiji su se simptomi dosta razlikovali od do tada poznatih gljivičnih bolesti biljaka. On je filtrirao sok zaraženih biljaka duhana kroz dvostruki filter papir. Gljivice nije pronašao ni u filtratu ni u filter papiru , i došao je do zaključka da je u filtratu vjerovatno neka bakterije koja je uspjela proči kroz filter papir.

Dimitrij Ivanovski, 1892 – početak virologije. On je bio upoznat sa radovima Majera i nije otkrio bakterije, nakon toga izvodi pokus, filtrira sok bolesnih biljaka i utrljava u listove zdravih. Nakon nekoliko dana na listovima su se počeli pojavljivati simptomi. To je ponavljao i došao do zaključka da u bolesnim biljkama duhana postoji nešto sitnije od bakterija. On je saopštio svoje rezultate , u kojima je naveo da je otkrio filtrabilnu infektivnost.

Loeffler i Froch (1898) otkrili su ozročnike odgovorne za bolesti slinavke i šap. Iste godine kada je Ivanovski otkrio virus, holandski istraživač Bežerink

(Biejerink) izvodi iste pokuse i objavljuje da je otkrio novi tip infektivnog uzročnika – contagium vivum fluidum.

Godine 1935. Stanly prvi put uspijeva dobiti virus u čistom stanju , a nakon toga je ubrzo uslijedilo otkriče da u građi TMV-a osim proteina učestvuju i NK.

Godine 1939. zahvaljujući razvoju elektrosnkog mikrsoskopa, načinjen je prvi elektron-mikroskopski snimak TMV-a. ( Ruska i saradnici).

Savremena istraživanja u virologiji su usko povezana sa razvojem tehnika molekularne biologije. Budući da su jednostvanog građeni, virusi su pogodni modeli

u fundamentalnim biološkim istraživanjima, npr. reverzna transkriptaza- otkrivena istraživanjem virusa. Virusi su vektori u genetičkom inžinjerstvu.

© The Nobel FoundationErnst Ruska

104

MICROBIOLOGY German electrical engineer Ernst Ruska won the 1986 Nobel Prize in physics. His efforts in building the first electron microscope and other contributions in electron optics won him the award.

© The Nobel FoundationWendell StanleyAmerican biochemist Wendell Stanley won the 1946 Nobel Prize in chemistry. Stanley did extensive work on the chemical makeup of viruses, isolating their components and proving that viruses can cause cancer.

Kermani/Liaison AgencyStanley B. PrusinerAmerican neurologist Stanley B. Prusiner was awarded the 1997 Nobel Prize in physiology or medicine for his discovery of a class of proteins called prions. Prions are implicated in several degenerative brain diseases of mammals, including bovine spongiform encephalopathy, commonly known as mad cow disease.

GRAĐA VIRUSA

Virusi su obligatni intracelularni paraziti koji se mogu razmnožavati samo unutar žive stanice. To su bezstanični oblici građeni od proteinskog omotača – KAPSIDE i genetičkog materijala – GENOMA koji je upakovan unutar kapside. Neki virusi mogu imati ovoj – PEPLOS (ENVELOPE). Genom virusa su sve NK sadržane unutar virusne čestice, ili NK upakovane u populaciji virusnih čestica.

Kapsida je građena od proteinskih podjedinica = PROTOMERE, koje mogu biti kopije jednog proteina ili kapsidu gradi uglavnom manji broj različitih proteina, što govori o ekonomici virusnog genoma (za veči broj proteina bio bi potreban i veči broj gena koje se ne bi mogli upakovati unutar kapside). Jednom nastale protomere se udružuju međusobno tj. specifično se povezuju tvoreći kapsidu. U tvorbi kapside nema pomoči iz vana pa se proces njenog nastanka naziva samoudruživanje ili samosastavljanje (slično nastanku bakterijskog flageluma). Zahvaljujući strukturi i organizaciji svojih podjedinica, kapsida izvanredno štiti virusni genom, pomaže njegovom prenosu među stanicama domačina, nosilac je antigena. Iako su virusi

105

MICROBIOLOGY obligatni paraziti slično nekim bakterijama kao što su rikecije, hlamidije i mikoplazme, oni se od navedenih intracelularnih parazita bitno razlikuju u pogledu :

1. strukturne organizacije,2. hemijskog sastava3. fiziološki4. domačina5. načina parazitizma

1. STRUKTURNO Za razliku od njih virusi su acelularni oblici i ne pripadaju prokariotima. Vrlo su

jednostavne građe i dugo se mislilo da su najjednostavnije građeni patogeni, danas su poznati oblici građeni jednostavnije od virusa (viroidi, sateliti virusa, virusne RNK, prioni). Zbog opće građe virusa uopšte je prihvačen naziv za tijelo virusa – virusna čestica ili partikula.

2. HEMIJSKI Virusi i po hemijskoj građi pokazuju osebujnost i razlikuju se od celularnih

patogena. Svi celularni organizmi imaju obje vrste NK, međutim virusi imaju samo jednu, ili RNK ili DNK.

3. FIZIOLOŠKI Virusi su paraziti koji nemaju sopstveni metabolizam te nemogu rasti i

razmnožavati se kao ostali organizmi. Dok se mikroorganizmi razmnožavaju diobom stanica, umnožavanje virusa, tj. propagacija – multiplikacija, provodi se genetički progamiranom sintezom virusnih komponenti i njihovim udruživanjem. Nakon prodiranja u stanicu virusna NK se oslobađa proteinskog omotača i koristeći stanični sintetički aparat sintetizira nove virusne partikule (prisiljava stanicu domačina).

4. DOMAČIN Opče karakteristike parazita su da su njihovi domačini biljke, životinje ili čovjek,

međutim neki virusni patogeni biljaka razvijaju se na domačinima biljnog i životinjskog svijeta. Takvi virusi nazivaju se perzistentnim, PROPAGATIVNI tj. cirkulatorni virusi, oni se prenose insektnim vektorima na biljke domačine. Prema tome, podjela virusa na biljne i animalne nije korektna.

5. PARAZITIZAM Svi intracelularni paraziti koriste stanicu domačina kao izvor potrebnih materija

koje uključuju u sopstveni metabolizam i na taj način obezbjeđuju vlastite životne funkcije. Naprotiv, virusi svojim prisustvom mjenjaju metabolizam stanice i usmjeravaju ga u pravcu sinteze sopstvenih virusnih partikula, što može imati različite posljedice za stanicu domačina, do fatalnih. Parazitizam virusa je poistvoječen sa multiplikacijom virusa, što predstavlja novi kvalitativni oblik parazitizma. Sve što im je potrebno za replikaciju virusi uzimaju od stanice domačina, npr. energiju, enzime, nukleotide i dr.

Virion – virusna čestica koja je potpuna i koja se može umnožavati, tj. uzrokovati infekciju (zrela infektivna čestica). Ako je nepotpuna čestica u bilo kojem smislu, onda ona nije virion.

106

MICROBIOLOGY

Iako danas postojie brojne definicije virusa sve one sadže sljedeče karakteristike:1. virusi sadrže 1 tip NK2. virusi se repliciraju unutar stanice3. oni su obligatni paraziti

Viral Structure

MORFOLOGIJA VIRUSA

Većina virusnih čestica mjeri se nm. Njihove dimenzije kreču se od 20 – 300 nm. Najmanji virusi su biljni satelit virusa nekroze duhana promjera 17 nm, a od animalnih virus slinavke i šapa promjera 20 nm. Od biljnih virusa največi su klostero

107

MICROBIOLOGY virusi dugi 2000 nm, a od animalnih največi su pox virusi koji su na granici vidljivosti svijetlosnog mikroskopa.

Virusne su komponente molekule sastavljene od vezanih atoma čije vrijednosti izražavamo molekulskom težinom.

Smallpox VirusesA colored-transmission electron micrograph

shows a group of Orthopoxvirus variola, the virus that causes smallpox. Once greatly feared for its ability to kill or disable its victims, smallpox was eradicated by 1979 through a worldwide vaccination campaign.

Prema morfologiji kapside na osnovu elektronsko-mikrsokopskih pretraga virusi se mogu klasificirati u nekoliko morfoloških tipova:

• produženi virusi (izometrični ili poliedrični),• polimorfni,• kompleksno građeni virusi• multikomponentni virusiProduženi virusi liče dugom štapiću, a mogu biti kruti ili fleksibilni. Oblik krutog

štapića ima TMV ili bakteriofag MB, a fleksibilnog štapića poti virusi ili npr.clostero- virus.

Izometrični (poliedrični) virusi su više ili manje loptastog oblika i njihove dimenzije mijere se prečnikom, tu spadaju različiti virusi – HIV, rota virus, herpes virus. Od izometričnih virusa treba spomenuti gemini viruse ili blizance čije se čestice javljaju u parovima.

Polimorfni virusi pored kapside posjeduju i ovojnicu. Postoje produženi i izometrični, a imaju pleomorfan oblik iz razloga što im ovojnica nije rigidna tj. kruta. Primjer za produžene viruse sa ovojnicom jeste virus gripe ili influence ili ebola virus, dok su herpes virus ili HIV primjer za izometrične viruse sa ovojnicom. U skupini komleksno građenih virusa spadaju neki bakteriofagi i pox virusi. Vakcinija virusi je virus kravljih boginja, spada među animalne viruse a ima oblik lepne.

Rabdovirusi imaju poseban oblik , oblik puščanog zrna, čiji je jedan kraj ravan a drugi zaobljen.

Od multikomponentnih virusa , poznat je virus mozaika lucerke i virus šuštavosti duhana. Virus mozaika lucerke u populaciji ima 5 tipova čestica, 4 baciloformne i jedna okrugla, a kod virusa sušenosti duhana dvije.

108

MICROBIOLOGY

bakteriofag

109

MICROBIOLOGY

VIRUSNI PROTEINI

Virusne čestice su izgrađene od dvaju spojeva, proteina i nukleinskih kiselina. U česticama virusa mogu se nači organski i anorganski joni te znatne količine vode. Malo je virusa koji osim dvije osnovne komponente sadrže još lipide, ugljične hidrate i poliamine. To su virusi sa ovojnicom i neki bakteriofagi. Proteini se nalaze na površini virusne čestice, a genom unutar čestice. Proteinsku komponentu čini proteinski omotač virusa tj. kapsidu. Nukleinska komponenta sa proteinskom se naziva nukleinska kapsida ili virusni proteina. Največi dio virusne čestice otpada na protein.

Kod TMV – a protein čini 95%, a NK 5% mase čestice, dok kod virusa sa ovojnicom na protein otpada najmanje 20% njihove mase. Informaciju za sintezu virusnih proteina nosi virusni genom. Virusni proteini mogu biti strukturni tj. gradivni, i nestrukturni tj. funkcionalni. Strukturni proteini su proteini kapside i proteini ovojnice. Neki biljni virusi, npr. poti virusi osim proteina koji dolaze u čestici stvaraju i druge strukturne proteine koji grade submikroskopske cilindrične inkluzije ili vrtuljci. Strukturni proteini daju simteriju virusnoj čestici, a njihova funkcija je:

1. zaštita virusnog genoma od različitih spoljašnih uticaja i djelovanja nukleaza,2. adsorpcija virusa na specifične receptore stanice domačina

110

MICROBIOLOGY

3. virusni proteini su uglavnom nosioci antigenih svojstava pojedinih virusa tj. nusioci su grupne ili tipske specifičnosti.

Virusima inficiran organizam reaguje imunim odgovorom na njihove strukturne proteine. Pošto imaju antigenska svojstva oni mogu poslužiti u izradi antivirusnih vakcina. Svaka skupina virusa posjeduje specefičan broj strukturnih proteina.

U nestrukturne virusne proteine spadaju virusni enzimi koji im omogučavaju replikaciju kao i promjenu metaboličkih aktivnosti inficiranih stanica; i trasnportni proteini koji omogučavaju širenje virusnih čestica kroz npr. plazmodeziju.Virusi tokom razvojnog ciklusa kontroliraju sintezu specifičnih enzima. Sve te enzime možemo svrstati u dvije grupe:

1. enzimi koji razaraju stijenku tj. membrnu domačina, npr. lizozim bakteriofaga, ili neuraminodaza influenca virusa,

2. replikacijski enzimi koji kataliziraju sintezu virusnih nukleinskih kiselina, među njima postoje enzimi koji ne ulaze u sastav viriona kao npr. RNA plimeraza TMV –a , ali i enzimi koji su integralni dio partikule npr. reo – virusa, kod kojih genom sam po sebi nije infektivan.

Enzimi upakovani u virusnu česticu nazivaju se transkriptaze ili replikaze, npr. reverzna transkriptaza HIV-a. Veliki broj virusa ima kapsidu građenu od jedne vrste proteinskih jedinica, dok složenije građeni virusi sadrže više tipova. Kapsida se sastoji od večeg broja najčešće istovrsnih proteinskih molekula nazvanih proteinske (strukturne) podjedinice tj. protomere. Za virus je takva građa kapside najekonomičnija (1 gen). Malo je virusa, kao npr. homo virus čija kapsida je građena od dvije vrste po veličini različitih proteinskih molekula; ili nekih biljnih rabdo virusa koji sadrže 4 tipa polipeptida; ili kompleksnih virusa koji mogu imati 30 strukturnih proteina od kojih su 1 ili više njih glikozilirani i oni su uglavnom na površini, obično u vezi sa lipidnim slojem ovojnice.

111

MICROBIOLOGY

Sastav virusnog proteina može se odrediti hidrolizom pažljivo purificiranog proteina, različitim sredstvima i metodama. Iz tog razloga je neophodno prvo virus purificirati, tj. odvojiti ga od staničnih komponenata i dobiti ga u čistom stanju, a zatim odvojiti protin od NK i drugih virusnih komponenti. Virusna partikula je relativno stabilna mada proteinske podjedinice nisu međusobno vezane kovalentnim vezama, več nekovalentnim koje se lahko kidaju, a te veze mogu biti polarne S – H, ili vodonične veze H – H, i nepolarnim vezama kao što su hidrofobne i vandervalsove sile. Virusni protein može se odvojiti od NK pomoču pufera različitog aciditeta, alkalijama, kiselinama, fenolom, ureom, deterđentom i dr. Protein virusa može egzistirati in vitro u formi podjedinica samo pri niskim temperaturama, niskoj koncentraciji, maloj jonskoj moči i visokom pH rastvora. Postoje posebne metode za dobijanje virusnih NK i proteina.

Agregiranje proteinskih podjedinica (PP) naziva se samoudruživanje ili samosastavljanje. U klasičnom eksperimentu rekonstitucije Frenkel Konrant i Williams su 1955 god pokazali da je informacija potrebna za sastavljanje virusne čestice sadržana u strukturnim komponentama virusa. Oni su uspjeli dobiti kompletne čestice TMV-a in vitro mješanjem purificirane virusne RNA i proteinskih podjedinica. U mnogih virusa taj proces potpomažu molekularni šaperoni tj. proteini koji pomažu u savijanju i polimerizaciji proteina, a sami ne ulaze u sastav čestice. Sile koje povezuju virusni protein i virusnu NK su uglavnom elektronske, te se veze uspostavljaju između bazičnih aminokiselina kapside koje imaju pozitivan naboj i fosfatnih grupa u sastavu NK koje imaju negativan naboj. Te se veze kidaju

112

MICROBIOLOGY dodatkom raznih soli . u nekih virusa se veze između proteina i NK temelje na hidrfobnim vezama koje nisu osjetljive na soli, ali se kidaju dodatkom deterđenata.

Virusni protein obično je sastavljen od 150 – 600 aminokiselina, koje se po sastavu i obliku ne razlikuju od drugih proteina, mada mogu sadržavati malo više aminokiseline serina i treonina. Neobična karaktieristika virusnog proteina je da je kod većine biljnih virusa N-kraj acetiliran. Kompletna aminokiselinska sekvenca polipeptidnog lanca prvi put je utvrđena kod TMV – a 1960. god, a kapsida je građena od jednog tipa proteina, i to od 2130 proteinskih podjedinica (PP). Svaka PP je građena od jednog polipeptidnog lanca kojeg čini 158 aminokiselina, a u sastavu polipeptida učestvuje 16 različitih aminokiselina. Na N (amino) kraju polipeptida nalazi se aminokiselina serin, koja je acetilizirana a na C (karboksilnom) kraju je aminokis. treonin (primarna struktura). Sekundarnu strukturu polipeptida čini uglavnom α – heliks. Tercijarna struktura nije poznata u nijednog virusa pa ni u TMV-a, ali se zna da postoji. Kvarterna struktura obezbjeđuje stabilnost proteinskog omotača i maskira osjetljiva mjesta polipeptidnog lanca, te se na taj način virus štiti od djelovanja enzima i drugih nepovoljnih agenasa. Kvarterna struktura određuje antigena svojstva virusa.

Na površini virusne čestice postoje EPITOPI koji određuju antigensku specifičnost virusa. Oni su nastali nakon povezivanja proteinske podjedinice u kapsidni protein. Pojedinačna proteinska podjedinica kada nije u sastavu kapside ima druge skrivene epitope ili kriptotope. Polimerizacijom PP u kapsidu njihovi epitopi prelaze u kriptotope, a kapsida dobije nove epitope, ovi se zovu neotopi. Iz tog razloga imuni serumi priređen protiv odvojenih PP obično ne reagira sa cjelovitom virusnom česticom i obratno.

Lipidi u ugljični hidrati u virusnoj česticiSadrže ih virusi koji imaju ovojnicu ili PEPLOS, koja je građena od proteina,

ugljičnih hidrata i lipida. Lipidi čine oko 20% mase lipidne čestice. Ugljični hidrati su najčešće zastupljeni u obliku glikoproteina tj. polisaharidi su za protein vezani preko aminokiselinskog ostatka serina, treonina i asparagina. Šećeri se također nalaze i u sastavu nukleinskih kiselina virusa.

Katjoni i vodaIznos katjona u virusnoj čestici je 1% , od anorganskih katjona mogu se nači

katjoni Fe, Mg, Cu, Al, a od organski poliamini. Oni se vežu za negativno nabijene fosfatne grupe NK i time vjerovatno pomažu pakovanje genoma u unutrašnjost kapside virusa. Prilikom iskazivanja hemijskog sastava virusa najčešćše se govori o njihovim čvrstim komponentama. Kada je virus otopljen u vodi tada na vodu otpada 50 – 70 %.

FINA GRAĐA TMV-A

Čestica TMV-a je štapić promjera 18 nm a dužine 300nm, oblika pravilnog valjka. Njegov genom je lančana RNA koja se nalazi unutar kapside. Proteinska podjedinica duga je 7 nm, a njena molekulska masa iznosi 17500 D. Oko RNA PP su poredane u blagoj spirali i nalaze se u slojevima tj. diskovima naslaganim jedan iznad drugog

113

MICROBIOLOGY kojih ima 130. u središtu čestice nalazi se centralna čupljina promjera 4 nm. RNA se ne nalazi u središnjoj šupljini nego u udubinama PP (ti žlijebovi se nalaze na 1/3 dužine proteinske podjedinice). Svaka PP je u dodiru sa 3 nukleotida u virusnoj RNA.

SIMETRIJA VIRUSNIH ČESTICA

Morfološka organizacija virusne čestice određena je strukturom njene kapside tj. rasporedom njenih podjedinica. Postoje 2 tipa virusne simetrije: spiralna i kubična.

Virusi spiralne simetrije su produženi, imaju spiralan raspored podjedinica kapside koje omotavaju centralno položenu NK u obliku spirale (heliksa). Prema obliku kapside, takve virusne čestice imaju valjkast ili cilindričan oblik. Većina biljnih virusa ima takvu simetriju, npr. TMV, karla virusi, postero virusi, poti virusi i dr. Ne postoje animalni virusi ove simetrije tj. spirlni a da nemaju ovojnicu.

Kubična simetrija se nalazi u poliedričnih virusa čije je kapsida izometrična. Najpoznatiji je ikozaiedar koji susrečemo kod životinjskih virusa npr. herpes i dr. Kod takvih virusa površina viriona je sastavljena od 20 istostranilnih trogulova i ima 12 vrhova i 30 ivica. Kroz središte tog geometrijskog tijela mogu se povuči 3 ose rotacijske simetrije:

1. jedna kroz svih 12 vrhova2. druga kroz središte od 20 ravni trokita3. treča sredinom svakog od 30 bridova (ivica)

Rotacijom jednom od 3 ose simetrije slika ikozaiedra se pojavljue redom 5, kroz drugu 3 i kroz treču 2 puta. Po obliku kapside virusi imaju poliedričnu formu. Buduči da proteinske molekule nemaju oblik istostraničnog trougla, u najjednostavnijih kapsida su dovoljne 3 identične PP za izradu 1 trokuta, a kod 20 –straničnog 30 PP. Viši stupnjevi organizacije ikozaiedra nastaju daljom diobom površinskog trokuta, to je tzv. triangulacijski broj koji označava koliko je manjih trokuta nastalo od izvorog trokuta.

114

MICROBIOLOGY

Proteinske ili strukturne podjedinice izometričnih virusa mogu se skupljati u veče tvorbe koje su sastvljene od više protomera i nazivaju se KAPSOMERE – morfološke podjedinice. Npr. 60 pomenutih protomera može se u kapsidi nekih virusa rasporediti tako da se po 5 njih skupi na svaku od 12 vrhova ikozaiedra. Takvu građu ima npr. čestica satelitskog virusa uz virus nekroze duhana koja ima 12 pentamera. Kompleksno građeni virusi bakteriofaga imaju glavu kubične a rep spiralne simetrije. Mnogi virusi imaju kompleksnu ovojnicu koja okružuje nukleo – kapsidu. Ovojnica je građena od lipidnog dvosloja u koju su uloženi glikoproteidi. Lipidi potiču od membrane stanice domačina dok glikoproteine kodira virusni genom. Simetrija virusa sa ovojnicom određuje se na osnovu nukleokapside koja se nalazi unutar ovojnice. U viruse sa ovojnicom spadaju poznati virusi iz familije ortomiksoviride, paramiksoviride, rabdoviride, a kubične simetrije fam. Retroviride u koju spada HIV.

115

MICROBIOLOGY

RAZVOJNI (INFEKTIVNI) CIKLUS VIRUSA

Proces virusne infekcije je razvojni proces virusa. Taj ciklus počinje prihvatanjem virusa na osjetljivu stanicu domačina nakon čega kompletan virus ili samo genom prodire u stanicu. Kada se NK virusa nađe u stanici, počinje multiplikacija virusa u citoplazmi ili jedru ili u oboje. Ako je u ćelije dospjela kompletna virusna čestica multiplikaciji prehodi deproteinizacija u smislu oslobađanja virusnog genoma od

116

MICROBIOLOGY proteinskog omotaća. Genetička informacija koju nose NK funkcionira preko istih mehanizama koji su operativni u stanici. Doprinos stanica domačina u sintezi virusnih komponenti je dvojak:

1. u snadbijevanju gradivnim blokovima tj. aminokiselinama i nukleotidima koji polimeriziraju u virusni protein i NK,

2. za sintezu virusnih proteina koriste se stanični ribosomi, tRNK, razni enzimi, ATP, mada se neke tRNK i enzimi sintetiziraju pod kontrolom virusa.

Virusne NK i proteini se akomuliraju do kritične koncentracije, nakon čega slijedi njihovo povezivanje što se naziva sazrijevanje virusne partikule potomaka. Spajanje virusnog proteina sa NK može biti spontano ili pod kontrolom enzima i na kraju se virioni iz stanice oslobađaju na različite načine da bi započeli ciklus infekcije.

Razvojni ciklus virusa se može uslovno podijeliti na nekoliko faza:

1. prihvatanje (adsorpcija) virusa za stanicu domačina,

2. penetracija (prodiranje) virusa u stanicu,

3. multiplikacija (replikacija) virusnog genoma i sinteza proteina,

4. sjedinjanjavenje virusnih komponenti tj. zrioba virusa,

5. oslobađanje (liberacija) novoformiranih virusnih partikula iz stanice.

I. PRIHVATANJE (ADSORPCIJA) VIRUSA U STANICU

Način prihvatanja i ulazak virusa različit je kod različitih virusa. Virus če se prihvatiti za stanicu samo ako postoji strukturna ili elektrostatska komplementarnost

117

MICROBIOLOGY između stanice domačina i virusa. Bez adsorpcije u animalnih i bakterijskih virusa nema infekcije. Strukture receptora u bakterija su toliko selektivne da je moguče razlikovati tipove unutar sojeva bakterija što se naziva fagotipizacija. Afinitet virusa prema određenim tkivima naziva se tropizam (tako su rabies virusi neurotropni, zatim papiloma virusi dermatotropni), a virusi koji ne pokazuju afinitet prema vrsti tkiva su pantropni. Na svojoj površini virusi imaju jedan ili više tipova receptora, koje nazivamo antireceptori, a i stanice imaju vlastite receptore, glikoproteinske prirode, za određeni virus. Uspostavljena veza između ćelije i virusa može biti reverzibilna ili ireverzibilna, pri čemu može doći ili nemora doći do promjena na oba receptorska sistema. Ovojnica virusa može posjedovati karakteristične izdanke tj. peplomere pomoču kojih se virus veže za sepecifičan receptor stanice domačina, tako npr. virus HIV ima izdanke GP 120 ili 104.

II. PRODIRANJE (PENETRACIJA) VIRUSA

Prodiranje virusa odvija se veoma brzo po adsorpciji virusa i za taj proces je potrebna energija. Postoje tri glavna načina penetracije:

• Translokacijom kompletne virusne čestice kroz plazmamembranu ćelije, što je rijedak proces koji nije dovoljno istražen, a odvija se pomoču proteina u virusnoj kapsidi i specifičnih membranskih receptora.

• Fuzijom virusne ovojnice sa plasmamembranom direktno ili nakon endocitoze. Ovaj način je karakterističan za viruse sa ovojnico i zahtijeva prisutnost sepcifičnih fuzijskih proteina u ovojnici npr. hemaglutinin u virusa gripe.

• Treči način je endocitozom virusa i obrazovanjem obložene vezikule. To je najčešći način ulaženja virusa u stanicu. Kod T-faga nakon prihvatanja za stanicu bakterije pomoču enzima lizozima smještenog u kapsidi repa razgrađuje se stanična stijenka bakterije, a potom kontrakcijom repnog dijela poput igle iz glavenog dijela ubacije svoju NK. Drugi fagi, npr. FD – fag ubacuje svoju NK kroz pile bakterija.

Buduči da biljna ćelija ima staničnu stijenku iznad membrane biljni virusi ulaze direktno u stanicu putem oštečenja stanice ili vektorom bez receptora. Virusne partikule mogu biti dijelimično razgrađene u procesu prodiranja na plasmamembrani ili unutar fagosoma, endosoma ili endolisosoma. Ukoliko kompletan virus uđe u stanicu slijedi dekapsidacija tj. oslobađanje NK od proteinskog omotača u stanici ili jedru domačina. U ovoj fazi dolazi do potpune ili dijelomične razgradnje virusne kapside najčešće u lisosomima (zahvaljujući pH vrijednosti lisosoma), a oslobođena NK izlazi kroz membranski kanal lisosoma u citoplazmi.

118

MICROBIOLOGY

III. MULTIPLIKACIJA VIRUSA

U ovom periodu odvijaju se dva fundamentalna procesa:• Translacija iRNK u virusne proteine na staničnim ribosomima, i• Replikacija virusnog genoma.

Najprije se u proteine prevodi bar dio virusne NK, to su tzv rani proteini, a potom slijedi replikacija genoma. Npr. kod TMV – a tako se sintetiziraju 2 proteina od 126 kD (kilo daltona) i 183 kD koji se povezuju sa proteinima stanice domačina te tako stvaraju aktivnu replikazu. Način replikacije genoma u različitih grupa virusa je različit (klasifikacija po Baltiomoru), ova faza se još naziva faza EKLIPSE, a podrazumjeva dio infektivnog ciklusa u toku kojeg se komponente virusnih potomaka počinju sintetizirati ˝de novo˝. Sjedinjavanje virusnih čestiva unutar stanice domačina označava završetak faze eklipse i početak perioda zriobe.

IV. ZRIOBA (MATURIRANJE) VIRUSA

Zrioba (maturiranje) virusa podrazumjeva agregiranje svih komponenti neophodnih za formiranje zrelog viriona u određenom području stanice. Proces se odvija sponatano i poznat je kao samosastavljanje (samoagregiranje, samoudruživanje) virusnih komponenti. Smatra se da do njega dolazi kada rastuči intracelularni nivo novosintetiziranih virusnih proteina i molekula genoma dosegne određenu kritičnu koncentraciju tzv. inkluzije u svjetlosonom mikroskopu. U mnogim slučajevima virusni proteini su usidreni u staničnim membranama. Samosastavljanje može biti realtivno jednostavno i bazirano isključivo na interakcijama proteinskih podjedinica i pravilima simetrije, ili kompleksno kada su uključeni šaperoni. Inkapsidacija virusnog genoma može se dovijati od početka sastavljanja partikule ili kasnije kada se genom upakira u skoro kompletnu kapsidu.

V. OSLOBAĐANJE (LIBERACIJA) NOVOFORMIRANE VIRUSNE ČESTICE

Oslobađanje novoformirane virusne čestice za litičke viruse (većina virusa bez ovojnice) je jednostavan proces. Usljed destrukcije zaražene stanice dolazi do oslobađanja virusnih čestica. Virusi s ovojnicom se oslobađaju iz stanice procesom pupanja kroz staničnu membranu pri čemu stiču ovojnicu. Virusna nukleokapsida spaja se sa specifičnim proteinima matriksa koji se nalaze na citoslonoj strani plasmamembrane, što dovodi do njihove integracije i oslobađanja. Biljni virusi kodiraju specifične proteine koji se zovu virusni transportni proteini (MP – mouvement), koji modificiraju plasmodezmije držeči ih otvorenim i na taj način virusi prelaze iz stanice u stanicu, dok se putem floema u sistemičnoj infekciji šire kroz cijelu biljku.

119

MICROBIOLOGY

120

MICROBIOLOGY

VIRUSNE NUKLEINSKE KISELINE

Nukleinske kiseline su sastavni dio virusnih partikula, virusi sadrže samo jedan tip nukleinskih kiselina, samo RNK ili DNK. Različiti virusi sadrže u čestici različite iznose NK, koje se kod produženih virusa kreče od 1 – 6%, a kod poliedričnih 15 – 45%. Nukleinske kiseline virusa predstavljaju genom virusa. Genom je skup gena jednog organizma sadržanog u haploidnoj hromosomskoj garnituri. Za razliku od celularnih organizama kod virusa i RNK može biti nosilac genetičke informacije, pa se razlikuju RNK – virusi i DNK – virusi. Genom virusa može biti dvolančana ili jednolančana DNK i RNK:

• ds DNK (double stranded – dvolančana DNK)• ss DNK (single stranded – jednolančna DNK)• ds RNK (double stranded – dvolančana RNK)• ss RNK (single stranded – jednolančna RNK)

Genom virusa može biti cijelovita NK koja može biti različitog oblika – linearna i cirkularna (prstenasta). Genom virusa može biti i fragmentiran tj. podijeljen na 2 do 12 odsječaka. Takvi virusi se zovu virusi sa podjeljenim genomom i kod njih segmenti mogu doći zajedno u jednoj čestici npr. influenca virus (kod njih postoji 8 segmenata RNK) ili reoviride (unutar jedne čestice ima 10 – 12 segmenata), ili segmenti mogu doći u zasebnim česticama, i takvi virusi se nazivaju multikomponentni virusi, npr. virus šišavosti duhana u kojem su dva fragmenta genoma upakovana u zasebne čestice. Drugi primjer je ss RNK virusa mozaika lucerke čiji je genom građen iz 4 odsječka, a za infekciju je potreban kompletan genom. U jednolančanih RNK virusa (ss RNK) genom se može u procesu replikacije dvojako ponašati, pa prema tome su i označene kao ss RNK+ - pozitivna i ss RNK - – negativna.

Virusni genom je RNK+ kada se u procesu replikacije ponaša kao iRNK (informaciona RNK). RNK+ nakon oslobađanja proteina kapside u stanici se veže za poliribosome i započinje sintezu ranih proteina tj. enzima koji če katalizirati sintezu virusnih genoma potomaka.

RNK- genom imaju oni virusi čiji je genom komlementaran informacionoj RNK, tj. za aktiviranje genoma neophodan je enzim RNK transkritptaza ugrađen u kapsidi koji če omogučiti transkripciju RNK- u iRNK tj. RNK+. S obzirom na način sinteze iRNK, američki virolog Baltimor (otkrio reverznu transkriptazu) svrstao je sve viruse u 6 skupina:

1. ds DNK virusi2. ss DNK virusi,3. ds RNK virusi4. RNK +5. RNK-6. reverzno transkribirajuči virusi

121

MICROBIOLOGY

Najviše biljnih virusa ima RNK+.Virusne NK purificiramo pomoču fenola ili hloroforma, pri čemu se kidaju

sekundarne veze, ali ne i kovalentne veze, te na taj način odvajanmo NK od virusnog omotača. Dugi polinukleotidni lanci se cijepaju restriktivnim nukleazama - prepoznaje se slijed GAATTC ili HIND III (Hemophylus influence) prepoznaje slijed AACCTT i potom se sekvenciraju.

Danas je poznata nukleotidna sekvenca tj. primarna struktura mnogih virusa. Prvi puta je sekvenciran kopletan genom 1976., i to bakteriofaga MS2 , koji se sastoji od 3596 nukleotida. Genom faga MS2 sadrži tri gena, jedan nosi informaciju za A protein, drugi gen za strukturni protein kapside i 3. gen za RNK replikazu. Interesantna je struktura jednolančanog genoma gemini virusa (tj. blizanci) koja ima dvije molekule DNK slične dužine ali različite sekvence. DNK I ima 2779 nukleotida, a DNK II je duga 2724 nukleotida i svaka partikula blizanaca nosi samo jednu molekulu genoma, pa se takav genom naziva bipartitni (tj. dvodijelni) genom. Sekvenca genoma virusa HIV prvi put je određena 1985. god. , on je predstavljen sa dvije kopije ss RNK, tj. virion nosi dvije kopije genoma a nije poznato koja od njih je funkcionalna. Virusne NK sadrže uobičajne baze, a neki bakteriofagi umjesto citozina imaju 5 – hidroksi metil citozin tj. 5 hidroksi – metil uracil, a umjesto timina 5 –

hidroksipenil uracil.

TRI TIPA GRAĐE 5´ KRAJA SS RNK+

I. Na 5' kraju može biti kapa tj. 7 – metil gvanozin kao u iRNK eukariota. RNK sa kapom bolje se veže na ribosome i otpornija je na nukleaze.

II. Kod drugih virusa na 5' kraju može biti virusni protein G (Vp G) koji je kovalentno vezan na 5' kraj RNK, postoji mišljenje da ima ulogu inicijatora replikacije.III. Kod nekih virusa 5' kraj može završavati sa 2-3 fosfatne grupe.

DVA TIPA GRAĐE 3' KRAJA RNK+

122

MICROBIOLOGY

I. Kod nekih se nalazi poliadenilna sekvenca (20 – 50 adenilnih nukleotida),II. 3' kraj završava OH grupom i takav kraj obično ima sekundarnu strukturu

sličnu tRNK koja može vezati specifičnu amino kiselinu. Npr. kod TMV-a AK histidin.

SEPCIFIČNOSTI U GRAĐI LAMDA (λ) FAGA

Genom faga je ds DNK sa jednolančanim krajevima (12 baza) i nazivaju se ljepljivi krajevi jer su međusobno komplementarni te od linearnog genoma formiraju genom prstenastog oblika, sa kovalentno povezanim krajevima.

Genom TMV-a je molekularne mase 2 x 106, sadrži oko 6395 nukleotida. Spirala RNK je smještena oko središnje supljine čestice i uvlači se proteinski omotač zahvatajuči na taj način 1/3 dužine proteinskih podjedinica. Na jednu protomeru dolaze oko 3 nukleotida, a na 3 zavoja spirale 49 proteinskih podjedinica. Rastojanje između zavoja spirale iznosi 3,3 nm.

TIPOVI VIRUSNOG GENOMA

ds DNK genom:• animalni virusi : Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, te

virus nuklearne polidroze (virus insekata), Iridoviridae (virus insekata i vertebrata).• Biljni virusi: Caulimovirusi sa tipičnim članom – virus mozaika karfiola.• Od bakteriofaga: T fagi i λ fagi.

ss DNK genom:• Animalni virusi: Parvoviridae (picornavirus),• Biljni virusi: Geminiviridae,• Bakteriofagi: fd (produženi, fleksibilni), Φx 174

ss RNK genom:• Animalni virusi: Paramyxoviridae (pneumovirusi, virusi zaušnjaka, ospiva..),

Orthomyxoviridae (virus gripa), Rhabdoviridae (virus bjesnila), Retroviridae (virus leukemije HTLV I i HTLV II, HIV),

• Biljni virusi: većina biljnih virusa ima ss RNK genom: Bromoviridae, Potyviridae, Tombusviridae, Comoviridae i dr.),

• Bakteriofag: MS2.

ds RNK genom:• Porodica Reoviridae – biljni i animalni virusi,• Bakterifag Q6.

123

MICROBIOLOGY

REPLIKACIJA VIRUSNOG GENOMA

1. Replikacija virusa ss RNK+ genoma - takav genom imaju brojni biljni virusi. ss RNK+ nakon oslobađanja virusne kapside ponaša se u stanici domačina kao iRNK, tj. veže se za poliribosome i daje informaciju za sintezu ranih proteina. Najprije se prevode geni bliži 5' kraju virusne RNK. Npr. kod TMV-a translacijom virusne RNK na njenom 5' kraju nastaju 2 proteina, jedan protein je 126kD, a drugi 183 kD, koji se povezuju sa jednim ili više proteina stanice domačina i tako stvaraju aktivan enzim = repliakzu (ovdje se replikaza naziva RNK- ovisna polimeraza). Replikaza se veže na 3' kraju virusne RNK+ koja tako postaje kalup za sintezu komplementarnog minus lanca = RNK-. Nastala dvolančana RNK je prelazni oblik koji se naziva replikativna forma (RF).

124

MICROBIOLOGY

Drugi prelazni oblik je replikativni intermedijer (RI) koji se sastoji od komplementarnog RNK- lanca na kojem se nalazi nekoliko kračih RNK+ lanaca različite veličine, tj. nastali minus lanci služe kao kalup novih RNK+ lanaca. Neke od nastalih RNK+ molekula djeluju kao iRNK za sintezu kasnih proteina – strukturnih proteina kapside. Novonastali pozitivni lanci mogu da služe kao genomi virusnih potomaka ili mogu služiti kao kalup za kontinuiranu multiplikaciju RNK.

2. Replikacija ss RNK- - ovakav genom imaju Rhabdovirusi, Orthomyxovirusi, Paramyxovirusi, i dr., oni sadrže enzim RNK polimerazu tj. transkriptazu u svom proteinskom omotaču. Sam genom RNK- virusa nije infektivan. Na osnovi RNK- kao kalupa javlja se najprije komplementarna RNK+, a zatim se na temelju te RNK+ sintetizira virusna RNK-. Još nije poznat mehanizam koji određuje koji određuje koje če RNK- postati genomske, a koje če služiti kao kalup za sintezu

virusne iRNK. Čini se da to regulira kapsidni protein.

3. replikacija virusne ds RNK - takav genom imaju pripadnici familije Reoviridae, njihova dvolančana RNK je segmentirana u od 10 do 12 segmenata. Genom je obavijen dvostrukom kapsidom. Unutrašnja kapsida sa genomom naziva se srž ili jezgro virusa i u njoj se nalazi enzim RNK transkriptaza. Replikacija segmenata zbiva se na konzervativan način. Nakon adsorpcije virion ulazi u stanicu endocitozom, a endocitotičke vezikule fuzioniraju sa lizozomima. Hidrolitički enzimi u lisosomima odstranjuju vanjsku kapsidu i aktiviraju RNK transkriptazu. Unutar intaktne (nedirnute) unutrašnje kapside dolazi do istovremene transkripcije svih

125

MICROBIOLOGY segmenata molekula RNK. Transkripcija je asimetrična tj. prepisuje se samo RNK- lanac i novonastali RNK+ se istiskuje iz nukleoproteinske srži na posebnim mjestima. Te RNK+ se prvobitno ponašaju kao iRNK i translatiraju se u polipeptide uključujući i enzim transkriptazu. Nadalje, neke od nastalih RNK+ se preobračaju u ds RNK, tako što se na njima kao kalupu sintetiziraju minus lanci, dok druge dalje imaju ulogu iRNK. Replikacija ds RNK se odvija u području citoplazme tzv. viroplazmi. Kopletni novi virioni se oslobađaju iz stanice bez pupanja.

4. REPLIKACIJA RETROVIRUSA

Prvi slučaj AIDS- a ( sindrom stečene imunodeficijencije) je opisan 1981. god. Virus je prvi put izoliran u Francuskoj 1983. god. gdje je dobio naziv LAV, a nekoliko mjeseci kasnije u Americi HTLV, da bi međunarodni komitet za taksonomiju virusa dao ovom virusu naziv HIV (human immunodefinciency virus). Čestica HIV –a je izometrična, promjera oko 100 nm, ima nukleokapsidu i lipidnu ovojnicu. Na ovojnici se nalaze 72 glikoproteinska izdanka koji su građeni od dva dijela, vanjski dio strši iz ovojnice (GP 120), dok je unutrašnji dio izdanka (GP 41) utisnut u ovojnicu. U središnjem dijelu virusa nalazi se 4 proteina nukleokapside označena kao P24, P17, P9 i P7 od kojih je P24 glavna komponenta unutrašnjeg dijela kapside.

Genom HIV –a čine dvije kopije ss RNK za koje je vezan enzim reverzna transkriptaza. Na krajevima genoma nalazi se LTR sekvenca (Long Terminal Receptor) koje učestvuju u regulaciji i aktivaciji virusnih gena. Retrovirusi se umnožavaju djelovanjem 3 glavna strukturna gena: gen GAG (grupni antigen) – kodira sintezu proteina nukleo kapside, koji nastaju proteolitičkim cijepanjem proteina prekursora teškog 53

kD.

Drugi gen je ENV (envelope) koji kodira sintezu virusnih enzima – reverzne transkriptaze. HIV u svom genomu ima još najmanje šest gena koji kodiraju

126

MICROBIOLOGY regulacijske proteine. Infekcija počinje prihvatanjem glikoproteina virusne ovojnice GP120 za CD4 receptro stanice domačina, iza čega slijedi fuzija virusne čestice i površine stanice.

Replikacija počinje u citoplazmi stanice domačina prepisivanjem ssRNK u ss DNK pomoču RT (reverzne transkriptaze), nakon čega virusnu RNK razgrađuje ribonukleaza H koja je komponenta RT. Prethodno nastali lanac RNK se udvostručuje i tvori dsDNK koja je prelazni oblik, potom se komplex ds DNK i enzima integraza premješta u jedro stanice gdje se nakon serije složenih događaja kataliziranih integrazom ugrađuje u staničnu DNK, takva DNK virusa označava se kao provirus. Ugrađeni provirus može ostati pritajen tj. latentan. Na integriranoj DNK tj. provirusu uz pomoč stanične polimeraze se transkribuju kompletni lanci virusnke RNK i nekoliko RNK čijom translacijom nastaju virusni proteini. U citoplazmi stanice domačina u blizini plasmamembrane dolazi do spajanja virusne RNK sa kapsidom i na kraju oslobađanja virusnih čestica pupanjem kroz plasmamembranu pri čemu virus stiče ovojnicu (GP virusni, a lipidi od stanice domačina). RNK virusi su varijabilniji od DNK virusa.

127

MICROBIOLOGY

5. Replikacija virusa sa ds DNK genomom

Takav genom imaju herpes, pox virusi... oni se repliciraju u nukleusu stanice domačina nakon oslobađanja u citoplazmi. Transkripcijom dijela genoma, tj. ranih gena i njihovom translacijom sintetiziraju se enzimi neophodni za replikaciju virusne DNK. U največem broju DNK virusa transkripciju

128

MICROBIOLOGY započinje pomoču DNK polimeraze dok pox virusi sadrže sopstveni enzim. Transkripcijom kasnih gena sintetizira se kapsidni protein u citoplazmi, a potom migrira u nukleus gdje se odvija sjedinjavanje virusnog genoma i proteina kapside do forme kompletnog virusa. Neki virusi sa ds DNK genomom kao npr. mozaični virus karfiola i virus hepatitisa B. Najprije se virusna DNK transkribuje u RNK+ lanac (predgenom) pomoču transkriptaze domačina i upakuje u sazrelu jezgru u kojoj se pomoču virusne reverzne transkriptaze ,na osnovu predgenomske RNK, stvara DNK- lanac i degradira predgenom, a zatim slijedi sinteza DNK+ naca i formiranje zrelih virusnih partikula.

6. Replikacija virusnog ss DNK genoma

Virus Φx174 (fiiks) i FD bakteriofag, biljni gemini virusi, a od animalni i parvovirus. Genom virusa Φx174 je prstenastog oblika, nakon prodiranja u stanicu ss DNK+ prvo sintetizira komplementaran minus lanac i to se naziva replikativnim oblikom (formom) – RF. Na minus lancu kao kalupu sintetizira se iRNK koja nosi informaciju za sintezu enzima koji če obezbijediti replikaciju brojnih kopija replikativnih oblika tj. ds DNK koje imaju dvojnu ulogu: služe za transkripciju iRNK i

kao mustra za sintezu DNK+ lanca. Novonastali potomci bakteriofaga se oslobađaju iz stanice domačina razgradnjom stanćne stijenke pomoču kasnog enzima – lizozoma.

129

MICROBIOLOGY

TIPOVI VIRUSNE INFEKCIJE

Dva su osnovna tipa virusne infekcije: vegetativni i virogeni

I. VEGETATIVNI (produktivni) tip u kome virus potpuni ostvaruje svoj razvojni ciklus tako da od jedne virusne čestice nastaju brojne virusne čestice koje potom mogu zaraziti nove stanice. Tu se razlikuju litički i perzistentni ciklus. U litičkom ciklusu virus ubija stanicu domačina uzrokujuči njeno raspadanje, a novonastale virusne čestice izlaze iz nje (poho virusi,virusi prehlade i brojni bakteriofagi). U perzistentnom ciklusu virus se u inficiranoj ćeliji umnožava i izlazi iz nje, a da pri tome ne uništava ćeliju. Inficirana ćelija se kontinuirano dijeli i oslobađa nove viruse (svi biljni virusi i virus hepatitisa B).

II. VIROGENI tip – riječ je o latentnoj infekciji koju uzrokuju neki animalni virusi i bakteriofagi – u tom slučaju se naziva lizogeni ciklus. U lizogenom tipu infekcije

130

MICROBIOLOGY virus se nakon ulaska u stanicu domačina ne umnožava već se njegova NK ugrađuje u genom domačina – profag. Ona postaje sastavni dio ćelijske DNK, koja se dalje kopira i prenosi diobom u potomačke stanice. Pod određenim uvjetima ugrađena virusna NK može opet postati slobodna istupajuči veze sa genomom domačina i može se replicirati i stvarati nove virusne čestice, te može preči iz tzv. blage ili umjerene infekcije u litičku infekciju. Kod nekih virusa za replikaciju njihove NK nije nužno da provirus istupi iz genoma domačina. Ovakav tip infekcije imaju retrovirusi, DNK fagi, DNK animalnih virusa i bakteriofagi.

PROMJENE UNUTAR ĆELIJE INFICIRANE VIRUSOM

Mogu se pojaviti nakupine virusnih čestica koje se nazivaju virusne inkluzije (uklopine). Znakovi virusnih čestica otkrivaju se mikroskopski, ili makroskopski – promjene poznate kao citopatogeni efekat. Pojava CPE (citoplazmatski efekat u staničnim kulturama) direktan je dokaz prisutnosti nekog virusa, a njegov izgled je karakterističan za određeni virus ( citomegalo virusi uzrokuju povečanje stanice). Virusna infekcija može završiti i smrču napadnute stanice – citocidna infekcija. Oštečenje stanice rezultat je jednog ili više učinaka:

1. mnogi virusi, a osobito citocidni (herpes, adeno virusi) inhibiraju sintezu ćelijske NK i proteina,

2. oštečeni lisosomi oslobađaju litičke enzime koji razgrađuju dijelove ćelije,3. ćelije inficirane onkogenim virusima nemoraju biti razorene.

Onkogeni virusi

U genomu čovjeka i životinja postoje onkogeni virusi , od grč. riječi onko =tumor, koji uzrokuju rak. U zdravog čovjeka normalni stanični geni koji reguliraju staničnu diobu i rast nazivamo ih proto – onkogeni; smatra se da su aktivni tokom rasta fetusa, kasnije se zaustavljaju. Postavlja se pitanje kako proto – onkogen koji ima značajnu ulogu u zdravim stanicama postaje onkogen. Virusi pored uzroka mnogih bolesti mogu biti odgovorni za pojavu tumora. Prisustvo virusnog genoma može da izazove transforamciju normalne stanice što rezultira njenim nekontrolisanim rastom.

Raus je 1911. god otkrio virusnu etiologiju zločudnog tumora mišića u peradi, po njemu je taj virus dobio naziv Rausov sarcoma virus.

Onkogeni mogu biti porijeklom od same stanice ili mogu biti virusnog porijekla. Iako je več dokazana virusna etiologija nekih virusa u životinja, danas je teško dokazati direktnu uzročnu povezanost virusa i humanih tumora (indirektnim metodama). Prisutnost mogučih onkogenih virusa u tumorskim stanicama ispituje se elektronski mikrsokopom, u staničnoj kulturi, imunološkim, enzimskim i molekularno – biološkim istraživanjima. Za sada se virus čvrsto povezuje sa genezom nekoliko humanih karcinoma:

1. Epstein – Barrov (čitaj: epštajn – barov) virus, povezuje se sa pojavom nazofaringijelnog karcinoma, mononukleoza ( u virocitima),

2. virus hepatitsa B sa hepatocelularnim karcinomom,3. određeni tipovi humanih papiloma virusa koji se povezuju sa zločudnim

tumorima grliča materice,131

MICROBIOLOGY

4. dva retrovirusa, HTLV1 i HTLV2 koji mogu uzrokovati leukemije, napadaju T-limfocite.

Virusi na različite načine mogu uzrokovati tvorbu tumora. Jedan od načina je direktno unošenje onkogena u stanicu, npr. kod rausovog karcinoma nađen je gen – SRC koji nosi informaciju za sintezu enzima tirozin kinaze. Ovaj enzim je prisutan u plasmamembrani stanice, a fosforilizira aminokiselinu tirozin koja se nalazi u sastavu različitih staničnih proteina. Kao što je poznato fosforilacija je jedan od načina regulacije proteina. Neki onkogeni virusi poticu gene odgovorne za rast stanice dok drugi uklanjaju mehanizam inhibicije rasta, npr. papiloma virusi kodiraju sintezu proteina koji inaktiviraju stanične regulacijske proteine rasta. Inhibicija staničnih kočnica rasta ima za posljedicu nekontrolirani rast stanice, dok npr. Epstein – Barr virus uzrokuje besmrtnost limfocita B stimulacijom njihovog rasta i aktivacijom staničnog onokogena BCL koji zaustavlja apoptozu (programiranu smrt stanice).

Kontrola virusne infekcije

Postoje izvjesne teškoče u kontroli virusne infekcije iz razloga što su virusi obligatni intracelularni paraziti te je teško preparatima provesti inhibiciju umnožavanja virusa a da se istovremeno upotpunosti zaobiče toksični učinak na stanice domačina. Zbog toga razvoj antivirusne terapije zaostaje za razvojem antibakterijske terapije. Još uvijek možemo reči da nemamo efikasnih virusnih hemoterapeutika, mada se danas uspiješno liječe neke virusne infekcije: herpes simplex, varicella zoster, citomegalovirus, virus influence A i dr.

Potencijalni ciljevi protivvirusnih lijekova su pojedine faze u razvojnom ciklusu virusa kao što su npr. spriječavanje adsorpcije virusa, onemogučavanje penetracije u stanicu, te ometanje transkripcije ili translacije. Kao antivirusni lijek u hemoterapiji pokušavaju se koristiti strukturni analozi purinskih i pirimidinskih nukleozida, npr. acikloviz, za razliku od gvanozin nukleozda ima acikličan bočni lanac umjesto riboze ili dezoksiriboze, i koristi se za liječenje herpes virusa. Lijek amantodin ometa penetraciju virusa u stanicu i koristi se za liječenje virusa influence A. U profilatičku (zaštitnu) svrhu koristi se vakcina, to je specifičan način zaštite aktivnom imunizacijom od virusne infekcije.

- Jenner 1796,- Paster 1885 god. vakcina protiv bjesnila,- 1934 u SAD proizvedena vakcina protiv poliomijelitisa (dječija paraliza),

postoje 2 vakcine: salkova vakcina – prvo je umnožen virus u stanicam bubrega majmuna, a nakon toga virus je uništen formaldehidom i sabinova sačinjena od živih oslabljenih (atenuiranih) virusa.

Interferon

132

MICROBIOLOGY

Godine 1957. Isacs and Lindenmann su otkrili da stanice zaražene virusom influence izlučuju interferon. Interferoni su relativno mali glikoproteini i do sad je izolovano 5 interferona humanih virusa: α, β, ω, τ. Kada virus napadne stanicu interferoni se oslobađaju i spajaju na interferonske receptore susjdenih stanica u kojima započinje sinteza dva važna enzima: oligo (A) sintetaze i posebne proteinske kinaze. Tokom sinteze tih enzima stanica je dovedena u protu – virusno stanje koje traje 2 -3 dana. U suštini takve stanice ne formiraju viruse iz dva razloga:

1. razlog- oliga (A) sintetaze induciraju aktivnost endoribonukleaza koje razgrađuju virusnu RNK,

2. enzim protein kinaza fosforilizira i razgrađuje inicijacijski faktor potreban za sintezu NK.

Treba istači da interferoni posjeduju antiproliferativnu aktivnost tj. inhibiraju rast nekih zločudnih stanica kao npr. nekih vrsta leukemije, bubrežnih karcinoma, što je predmet intenzivnih kliničkih istraživanja.

τ (tau) – interferon inhibira reverznu transkriptazu virusa.

133

MICROBIOLOGY

KLASIFIKACIJA I NOMENKLATURA VIRUSA

Za razliku od klasifikacije eukariota klasifikacija virusa se često mijenjala, dopunjavala i još uvijek nije u potpunosti zadovoljavajuča. Virusi su se pokušavali svrstati u grupe na osnovu tipa bolesti npr. virus mišije groznice, virus hepatitisa, potom prema domačinu: animalni, biljni, bakterijski virus ili prema ciljnim organskim sistemima : virus probavnog sistema, virus disjanog sistema itd. Bilo je klasifikacija prema vektoru, npr. arbovirus ( prenosioci arthropode). U imenovanju virusa korišteni su neki termini koji opisuju osobine virusa npr. piko RNK (piko – mali, RNK- tip NK), toga virus (toga – omotač) , papova virus (od početnih riječi pa – papiloma, po – poliom, va – vacuola), tj. od najvažnijih patoloških simptoma, retrovirusi – prema reverznoj trankriptazi, koksaki virusi – prema mjestu u SAD. Biljni virusi najčešće dobijaju ime po biljci domačinu i simptomima koje uzrokuju , npt. TMV.

Tokom vremena definirali su se kladifikacijski kriteriji:• vrsta NK,• broj lanaca• molekulsna težina NK,• % NK u virusnoj čestici• oblik virusne čestice• oblik nukleokapside• domačin• vektor

Virususne osobine moguče je označiti formulom koja se naziva kriptogram, npr:TMV R/1 : 2/5 : E/E : S/OR – tip NK, tj. RNK virus (R), a 1 – jedna lanac, tj. da je ss (single stranded),2 – molekularna težina 2 miliona5 - postotak RNKE/E – elongeted virus, pošto nema ovojnice produžen / produženS – napada sjemenjačeO – nema vektora

POLIOMIJELITIS R/1 : 2,5/30 : S/S : V/O [1,0]S/S –sferičanV – vertebrata,O – nema vektora [1,0] – može se prenositi ingestijom [1] i dodirom [0].

U Moskvi je 1966. god. osnovan međunarodni odbor za taksonomiju virusa, a 1981. god. odbor je predložio klasifikaciju prema kojoj se virusi na temelju osobina svrstavaju u porodice sa sufiksom -viridae, npr. Retroviridae, potporodice -virinae, rod -virus i vrste. Još uvijek je veliki broj novootkrivenih virusa nesvrstanih zbog nepotpunih podataka o njihovim virološkim, fizičkim i hemijskim osobinama.

134

MICROBIOLOGY

Međunarodni komitet za taksonomiju virusa – ICNV (International Committee on Nomenclature of Viruses ).

SUBVIRALNI PATOGENI – SUBVIRALNE INFEKTIVNE MOLEKULE

1. VIROIDI2. PRIONI3. SATELITI VIRUSA4. SATELITNE RNK

VIROIDIViroidi su kratke male lančane RNK, do 400 nukleotida duge, bez omotača, pa se

označavaju kao gole infektivne RNK. Njihovi krajevi su kovalentno vezani tako da imaju uslijed komplementarnog uparivanja baza intramolekulski sekundarnu strukturu prstena. Otkriveni su 1971. g., otkrio ih je Diner koji je tvrdio da su viroidi čista RNK, on ima je dao naziv viroid. Najpoznatiji je viroid vretenastog gomolja.

PRIONIDrugi tip patogena su prioni, otkrio ih je ( Stanley B. Prusiner)Pruziner, 1996.

god, je dobio nobelovu nagradu. Prioni su proteinske infektivne čestice, to su glikoproteini koji mogu biti infektivni. Takvi proteini nalaze se u plasmamembrani normalnih stanica i još uvijek im se nezna uloga, prisutni su stanicama nervnog tikiva označeni su kao PrPc, oni koji uzrokuju bolest označeni su kao PrPsc (sc- scrapie). Prioni su uzročnici bolesti ludih krava [bovine spongiform encephalopathy (BSE)], zatim nasljedne krojcfeld – jakobsonove bolseti (Creutzfeldt-Jakob disease), kod ljudoždrea - kuru. Primarna struktura dobrog i loseg proteina tj. priona je ista, a razlikuju se u sekundarnoj strukturi.

Bolest prelazne spongiformne encefalopatije – spužvasti izgled mozga oboljelog, počinje ludilom a završava potpunom paralizom

SATELITI VIRUSANeki biljni virusi ne mogu se razmnožavati samostalno, zbog toga u prirodi uz

njih uvijek dolazi virus pomagač. Odnos između satelitnog virusa i virusa pomagača (helper virusa) strogo je specifičan. Najpoznatiji je satelitni virus koji dolazi uz virus nekroze duhana. Satelitni virusi nemogu se samostalno razmnožavati ali mogu stvoriti vlastiti proteinski omotač, tj. njihova RNK dolazi u zasebnim česticama.

SATELITNE RNKPosotoji i druga vrsta satelita koja nema vlastitu kapsidu tj. u virusnim česticama

su nađene strane ss RNK koje nisu dio virusnog genoma. One se također nemogu samostalno replicirati, tj. bez pomoči virusa pomagača. To su satelitne RNK koje

135

MICROBIOLOGY nemogu stvarati vlastiti proteinski omotač več dolaze unutar kapside virusa pomagača npr. carna satelitna RNK virusa mozaika krastavca.

Evolucija virusaTeorije: Regresivna,Progresivna,Koevolucijska

136