Revista Asebir junio 2010

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010

Vol

.15

· N

º1

REVISTA

ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN

Complejo huso meiótico-placa metafásica

ACTUALIDADProteómica del espermatozoide humano.

Metabolómica y reproducción humana.

ARTÍCULOSEfecto del proceso de vitrificación sobre laestructura del huso meiótico y organizacióncromosómica en ovocitos humanos enmetafase II.

Las variantes cromosómicas afectan lacalidad embrionaria.

AULA JOVENRelación entre los patrones pronucleares y lacalidad embrionaria según criterios asebir.

DEBATEEs necesario considerar los intentos previos.

Auditorías para el 100% de los Centros.

Transparencia no siempre es sinónimo dehonestidad.

La nueva vía del Registro de Actividadde la SEF: El aumento de la calidad.

FORMACIÓN CONTINUADAImpronta genómica y reproducción asistida.

AGENDANOTICIASNORMAS DE PUBLICACIÓN

af.cubierta:Maquetaci n 1 22/06/2010 10:29 PÆgina 3

SUMARIO

Í N D I C E

EDITAAsociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción(ASEBIR).

EDITORES Y DIRECTORES CIENTÍFICOS Marga Esbert - BarcelonaJorge Cuadros - Madrid

COMITÉ EDITORIALPresidente:Dr. Manuel Ardoy VilchesHOSPITAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN - Madrid

Vicepresidenta y RRPP: Dra. Carmen Ochoa MarietaCER. CLINICA COTERO - Santander

Secretaría y RRPP:Dra. Montserrat Boada PaláINSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS - Barcelona

Tesorería y Relaciones con la Industria:Dr. Fernando Marina RugeroINSTITUTO DE REPRODUCCION CEFER - Barcelona

Vocalía de Grupos de Interés e Investigación:Dr. Josep Santaló PedroUNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA - Bellaterra

Vocalía de congresos:Dra. María José Torelló YbañezHOSPITAL QUIRÓN BARCELONA - Barcelona

Dra. Yolanda Mínguez RoyoIVI MADRID - Madrid

Vocalía de Docencia y formación continuada:Dr. Ignacio Santiago Álvarez MiguelINST. EXTREMEÑO REPRODUCCIÓN ASISTIDA –IERA -Badajoz

Dr. Josu Franco IriarteCENTRO SANITARIO VIRGEN DEL PILAR - San Sebastian

Dr. Juan Manuel Moreno GarcíaCLINICA VISTAHERMOSA - Alicante

Vocalía Página Web: Dr. Juan Manuel Moreno GarcíaCLINICA VISTAHERMOSA - Alicante

Vocalía de publicaciones: Dr. Jorge Martín Cuadros FernándezCLÍNICA FIV-MADRID - Madrid

Dra. Marga Esbert AlgamIVI BARCELONA - Barcelona

La Revista de ASEBIR (Asociación para el Estudio de la Biologíade la Reproducción) está indexada en la base de datos Latindexy en la base de datos ICYT, de ciencia y tecnología, del ConsejoSuperior de Investigaciones Científicas (CSIC) de España y hasido aceptada para su inclusión en Índice Médico Español(IME), la base de datos de Biomedicina del CSIC.

PUBLICIDAD Y COLABORACIONESSecretaría ASEBIRC/ Cronos 20, Edificio 4, 1º, 6ª28037 Madrid - Tfno: 91 367 89 94www.asebir.com · [email protected]

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EDITORIAL 3Reconocimiento de la Embriología ClínicaCarmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel ArdoyComisión para la Especialidad de Embriología Clínica

ACTUALIDAD 5Proteómica del espermatozoide humanoRafael Oliva Virgili, Josep Maria Estanyol, Sara de Mateo López, Judit Castillo Corullón, José Luis Ballescà Lagarda.

Metabolómica y reproducción humanaImma Sánchez Ribas, Francisco Domínguez, Carlos Simon

ARTÍCULOS 14Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico y organización cromosómica en ovocitos humanosen metafase IICristina Costana Duque, Javier Alfonso, Rita Cervera, Ana Monzó,Vicente Montañana, Miodrag Stojkovic, Alberto Romeu

Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionariaMireia Poveda, Teresa Rubio, Isabel Ochando, Laura Gil, ManuelLloret, José Jesús López-Gálvez, Antonio Urbano, Juan Manuel Moreno, Joaquín Rueda

AULA JOVEN 25Relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria según criterios asebirMarta Brossa, Xènia Blanch, Marta Antich

DEBATE 30Es necesario considerar los intentos previos

Auditorías para el 100% de los Centros

Transparencia no siempre es sinónimo de honestidad

La nueva vía del Registro de Actividad de la SEF: El aumento de la calidad.

FORMACIÓN CONTINUADA 36Impronta genómica y reproducción asistidaCristina Camprubí

AGENDA 42NOTICIAS 43INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES - NORMAS DE PUBLICACIÓN 44

Imágenes de la portada: Configuración normal del complejo huso meiótico-placametafásica en oocitos humanos (Imagen superior) y configuración anormal (Imagenizquierda). Cortesía de Duque et al. pp:14-17.

Junio 2010 Vol. 15 · Nº1

SUMARIO Pág.

af.interior:Maquetaci n 1 22/06/2010 10:31 PÆgina 1

E D I T O R I A L

Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1

RECONOCIMIENTO DE LA EMBRIOLOGÍA CLÍNICA

Han pasado ya más de 30 años desde el nacimiento de Louise Brown. Desde aquellos días hasta hoy, la Reproducción HumanaAsistida, sobre todo la Embriología Clínica, ha experimentado enormes cambios. Han surgido nuevas alternativas, y otras se hanvisto muy modificadas; y lo mejor de todo es que el cambio, la evolución, continúa.

La reproducción humana asistida y, sobre todo, aquello que nos ocupa: la Embriología, ha terminado ocupando un campo decaracterísticas propias y bien definidas dentro del panorama sanitario. Resulta difícil pensar que algún gestor de sanidad de lasdiferentes autonomías pueda dudar de que esta atención sanitaria deba estar incluida en su cartera de servicios.

Muchos son los cambios que han consolidado un campo propio y específico para la Embriología Clínica. Tan sólo por enumeraralgunos:

-Aparición constante de alternativas terapéuticas específicas.

-Desarrollo de diferentes técnicas de diagnóstico. Tanto propias como traídas de otros tipos de laboratorios.

-Consolidación de la gestión del laboratorio de reproducción humana asistida, con características diferenciales del resto delaboratorios.

-Implantación de la reproducción humana asistida en la cartera de servicios habitual del sistema sanitario Español

-Posibilidades docentes propias y de formación práctica, cada vez más asequibles.

-Desarrollo de investigación propia, junto con una gran cantidad de alternativas de intercomunicación científica.

-Existencia de diversas asociaciones científicas exclusivas de este campo.

-Desarrollo legislativo específico de forma habitual, no sólo a nivel nacional

-Un impacto incuestionable en la sociedad: natalidad, partos múltiples, preservación de la fertilidad, parejas homosexuales... Lareproducción humana asistida ha pasado al espectro de lo habitual.

A pesar de todo esto, hay una parcela esencial que se continúa dejando de lado: el reconocimiento específico, propio y oficial deun ejercicio profesional, el de la Embriología Clínica. Consecuencia de este paso sería la definición de responsabilidades y funciones,y por tanto la planificación de esquemas formativos. No cabe duda alguna, el principal beneficiario de tal reconocimiento sería elpropio paciente, tanto por la seguridad como por la calidad asistencial que recibiría.

A muchos nos cuesta pensar qué razones llevan a los responsables del Estado a mantener en una situación de casi parada unreconocimiento que parece tan lógico a los profesionales cercanos a la reproducción humana asistida. Sin embargo, por nuestraparte sí que ha habido un esfuerzo continuado. Podemos hacer un breve resumen.

Uno de los primeros pasos fue la Cualificación de Especialista en Reproducción Asistida Humana, emitida durante un breve periodode tiempo por el COB. Tras el escaso éxito de ésta, y pasado algún tiempo, surgió la posibilidad de que al profesional del Laboratoriode Reproducción Humana Asistida se le reconociera una de las especialidades reguladas en el RD 1163/2002, que afectaba a biólogos,químicos y bioquímicos. La solicitada mayoritariamente fue la de Análisis Clínicos. La respuesta oficial la conocemos todos, unrotundo NO. De esta respuesta hubo dos consecuencias claras:

-Nosotros aprendimos que NO éramos asimilables como parte de una especialidad previa. Por tanto, sin lugar a dudas, elreconocimiento pasaba por algo más exclusivo y específico.

-El ministerio no podía seguir mirando hacia otro lado durante más tiempo. Era demasiado obvio, tenía una enorme cantidad deexpedientes denegados encima de la mesa y todos tenían algo en común, trabajaban en reproducción humana asistida.

Tras esto, empezamos diferentes reuniones con el ministerio. Una de las primeras cosas que quedaron bien claras era laimposibilidad, por el momento, de una especialidad propia. Máxime cuando la intención es disminuir el número de las que hay. Unaopción ofrecida fue la posibilidad de valorar el formar parte de las ramas, troncalidades, que pasarán a formar parte de un troncocomún, el del Laboratorio Clínico. Tal y como pasará con las hasta ahora existentes de forma individual: Análisis Clínico, BioquímicaClínica... Esta opción fue trabajada, y se presentó a la correspondiente Dirección General del Ministerio de Sanidad una propuestade programa formativo de troncalidad en Embriología Clínica. Ésta la podéis obtener en la Web de ASEBIR.

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E D I T O R I A L

Si bien actualmente las troncalidades no se han ultimado, parece complejo que se vayan a incluir más campos del conocimiento quelos ya aceptados como especialidad, aunque seguimos trabajando en ello con el ministerio y con las comunidades autónomas,intentando hacer llegar el asunto al Consejo Interterritorial. Pero el ministerio nos propone una vía alternativa que ayudaría afundamentar pasos ulteriores, un Certificado en Embriología Clínica que fuera valorado y emitido por ASEBIR; máxime cuando esconocedor del proceso de certificación de la ESHRE.

Sin olvidar el resto de los caminos abiertos, la vía principal de evolución por la que se ha optado, y prácticamente la única que elministerio deja como viable a corto-medio plazo, es este certificado. Sabemos que su relevancia dependerá de qué apoyos oreconocimientos oficiales pueda llegar a tener, así como de la consideración personal que se le otorgue. Por el momento, la DirecciónGeneral de Ordenación profesional, Cohesión del SNS y Alta Inspección del Ministerio de Sanidad y Política Social ha dado un vistobueno a un esquema de Certificación en Embriología Clínica de ASEBIR. Éste tiene varias fases, y en la actualidad se está procediendoa su desarrollo y puesta en marcha, tal y como se está informando a los socios.

La apuesta es arriesgada, sobre todo cuando la incertidumbre de saber a qué puerto nos hará llegar es grande. Pero el mensaje esclaro, si algo podemos decir en el presente, es que la Embriología Clínica ha madurado lo suficiente como para reclamar un lugarpropio.

Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel ArdoyComisión para la Especialidad de Embriología Clínica.

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A C T U A L I D A D

LA TRANSICIÓN NUCLEOHISTONA-NUCLEOPROTAMINA Y ORGANIZACIÓN DELDNA EN EL NÚCLEO DEL ESPERMATOZOIDE

La espermatogénesis es uno de losprocesos que conlleva cambios másradicales en la estructura de lacromatina hasta dar lugar alespermatozoide maduro (Mezquita,1985; Oliva and Dixon, 1991). De formaprogresiva primero se desensambla laestructura nucleosómica presente en lasespermatogonias, espermatocitos yespermátidas redondas, y esreemplazada transitoriamente por lasproteínas de transición y por último porlas protaminas (Mezquita, 1985; Olivaand Dixon, 1991; Oliva, 2006; Balhorn,2007) (Fig. 1).

Mientras que la mayor parte del genomade espermatozoide (alrededor de 85-95%) está fuertemente empaquetado enforma de estructuras toroidales,también es importante tener en cuentaque alrededor del 5-15% del DNA de losespermatozoides está organizado porproteínas histonas, muchas de las cualesson variantes específicas delespermatozoide (Fig. 1) (Gatewood etal., 1987; Oliva, 2006; Balhorn, 2007).Se ha propuesto que las estructurastoroidales de la nucleoprotamina, cadauna con aproximadamente 50 kb de ADN,podrían estar ancladas a la matriznuclear a través del DNA entre toroide ytoroide (Shaman et al., 2007).Actualmente se sabe que la distribuciónde los genes en las regiones genómicas

organizados por protamina y en lasregiones genómicas organizadas por lashistonas no es al azar. Estudios recientesbasados en el análisis del genomapaterno asociado a cada uno de estosdominios mediante microarrays, hanpermitido llegar a la conclusión básicade que las regiones asociadas anucleohistona se hallan asociadas conlas regiones reguladoras de genes, loque implica la existencia de marcasepigenéticas con una función potencialen el desarrollo embrionario (Arpanahiet al., 2009). En otro estudio reciente,basado en secuenciación genómicamasiva, se ha detectado que las regionesasociadas a nucleosomas estánsignificativamente enriquecidas en losgenes importantes para el desarrollo,incluidos los genes imprintados, losmicroRNAs, los genes Hox, y lospromotores de la transcripción de genesdel desarrollo y de factores deseñalización (Hammoud et al., 2009).Además, se ha demostrado que lasmodificaciones de histonas (H3K4me2,H3K27me3) se localizan endeterminados loci correspondientes congenes del desarrollo, y que lospromotores asociados a genes deldesarrollo se hallan hipometilados en elespermatozoide, pero son metiladosdurante la maduración (Hammoud et al.,2009).

Además de estas marcas epigenéticasdeterminadas por la distribucióndiferencial de los genes en los dominiosasociados a la nucleohistona y a lanucleoprotamina, hay otros tipos deinformación epigenética potencialmentetransmitida por el núcleo delespermatozoide. Una de las másconocidas y contrastadas es lametilación del DNA (Reik et al., 2001).Más recientemente, la identificación delos RNAs presentes en el espermatozoide

PROTEÓMICA DEL ESPERMATOZOIDE HUMANO

Rafael Oliva Virgili1, Josep Maria Estanyol2, Sara de Mateo López1, Judit Castillo Corullón1, José Luis Ballescà Lagarda3

1Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic de Barcelona, y Laboratorio de GenéticaHumana, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona. 2Unitat de Proteòmica, Serveis de Suport a la Recerca, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona3Institut Clínic de Ginecología Obstetricia i Ginecologia, Hospital Universitari Clínic de Barcelona e-mail: [email protected] recepción: 16 abril 2010Fecha aceptación: 18 abril 2010


Figura 1. Representación esquemática de los cambios de la cromatina que ocurren durante laespermatogénesis. El lado izquierdo de la figura representa los cambios celulares durante laespermatogénesis y primeras fases del desarrollo embrionario. El lado derecho de esta figura representalos cambios de la cromatina que tienen lugar durante la transición nucleohistona a nucleoprotamina en laespermiogénesis y en las fases iniciales del desarrollo embrionario. Los cambios celulares en el ladoizquierdo de esta figura corresponden aproximadamente a las estructuras de la cromatina y actividadesindicadas en el lado derecho. Las histonas están representadas en color rojo y el DNA se marca como líneasazules. Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones.


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Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano.

y la demostración de su transferencia aloocito abren la posibilidad de un papelde éstos en la fecundación (Ostenmeyeret al., 2004). Otra fuente de informaciónepigenética potencial podría ser lapresencia de otras proteínas en el núcleodel espermatozoide, además de lashistonas y de las protaminas (Oliva etal., 2009).

La primera evidencia de la presencia deproteínas en el espermatozoide quepodían resultar cruciales para eldesarrollo del embrión fue el hallazgo deque en los seres humanos y en la mayoríade los mamíferos (con la excepción delratón), el centrosoma se hereda deforma paterna (Chatzimeletiou et al.,2008). También se ha demostrado quevariantes de histonas presentes en elespermatozoide contribuyen a laformación de la cromatina cigótica enhumanos y que los procesosepigenéticos, implementados durante laespermatogénesis, permiten distinguirel pronúcleo paterno en el embrión (vander Heijden et al., 2008; de Mateo et al.,2010). Diversas proteínas adicionalespresentes en los espermatozoidespodrían estar también relacionadas conel desarrollo embrionario (Martínez-Heredia et al., 2006; de Mateo et al.,2007).

Más recientemente, el análisisproteómico de las proteínasidentificadas en los espermatozoidesmaduros ha proporcionado algunosresultados inesperados. Por ejemplo,hay factores de transcripción, proteínasde unión al DNA y proteínas implicadasen el metabolismo de la cromatina encélulas que son transcripcionalmenteinactivas (Oliva et al., 2008; 2009). Loscatálogos correspondientes a losproteomas de espermatozoide humanoya están disponibles (Martínez-Herediaet al., 2006; Baker et al., 2007; Oliva etal., 2009). Es notable la presencia de proteínas como la histonaacetiltransferasa y deacetilasa, histonametiltransferasa, metiltransferasa delADN, la topoisomerasa, helicasa, factoresde transcripción, zinc fingers, proteínashomeobox, proteínas cromodominio,proteínas centrosómicas, y la telomerasaen las células que sontranscripcionalmente inertes y quetienen al menos el 85% de su DNAempaquetado por protaminas (Oliva et

al., 2008; 2009). Una cuestión crucial essi estos factores de transcripción y lasproteínas recientemente identificadosen los núcleos representan vestigios delproceso de la espermatogénesis o bienestán marcando algunas regiones delgenoma paterno y poseen una funciónepigenética (Oliva et al., 2008; 2009;Rousseaux et al., 2008).

Anomalías en el contenido de protaminaen pacientes subfértiles fueron yadescritas hace más de 20 años (Balhornet al., 1988). Posteriormente, otrosestudios confirmaron la relación entreun contenido anormal de protaminas yalteraciones en los parámetrosseminales en estos pacientes infértiles(de Yebra et al., 1993; Mengual et al.,2003; Aoki et al., 2005). Una de lascausas potenciales de alteraciones en larelación de protaminas (P1/P2) puedeencontrarse en un procesamientoanormal de protamina 2 e incremento de

los precursores de protamina en unsubconjunto de los pacientes (de Yebraet al., 1998; Bench et al., 1998). Ademásde estos estudios en pacientessubfértiles, la expresión de protaminastambién se ha estudiado en respuesta alestrés térmico y se ha descrito queepisodios de fiebre alta se correlacionancon la aparición de precursores deprotamina P2 y con un aumento en laproporción de las histonas entre los 33 y39 días después de la hipertermia(Evenson et al., 2000).

Los resultados del contenido deprotaminas y de histonas se hancorrelacionado con alteraciones en laintegridad del DNA y con los resultadosde reproducción asistida (Bizarro et al.,1998; Nasr-Esfahani et al., 2005; Aoki etal., 2006; Torregrosa et al., 2006;Domínguez-Fandos et al., 2007; deMateo et al., 2008; Aitken and de Yuliiset al., 2010).

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Figura 2. Estrategias disponibles para el estudio del proteoma del espermatozoide.

La extracción típica de protaminas a partir de espermatozoides consistente en la reducción de los puentesdisulfuro de las protaminas con ditiotritol (DTT) / hidrocloruro de guanidina, seguido de la extracción con0,5 M HCl, precipitación y purificación de las proteínas y su separación mediante electroforesis en gel depoliacrilamida ácido (izquierda). Con esta estrategia es posible visualizar las proteínas nuclearesmayoritarias: una banda proteica prominente correspondiente a la protamina 1 (P1) y un conjunto debandas correspondiente a la familia de la protamina 2 (P2). Para analizar el proteoma total es posiblerecurrir a la electroforesis bidimensional de las proteínas del espermatozoide. Para ello se suele recurrir auna primera dimensión a través de isoelectroenfoque, separando las proteínas atendiendo a su puntoisoeléctrico (pI), seguido de una segunda dimensión a través de electroforesis en gel de poliacrilamida –SDS, que separa a las proteínas por su peso molecular aparente. La identificación de las proteínas se realizaentonces a través de espectrometría de masas. Una última estrategia mucho más robusta consiste en lageneración inicial de péptidos, seguida de su separación mediante cromatografía líquida e identificaciónmediante espectrometría de masas (derecha). Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones.


A C T U A L I D A D


Identificación de proteínas delespermatozoide y de sus alteraciones através de técnicas proteómicas.

Esencialmente se han utilizado dosalternativas diferentes para el estudioproteómico de los espermatozoides através de espectrometría de masas (MS):1) electroforesis bidimensional (2D)seguida de la identificación por MALDI-MS o cromatografía líquida LC-MS/MS, y2) la digestión inicial de proteínas paragenerar péptidos, seguido por suseparación y análisis LC-MS/MS (Oliva etal., 2009; Baker and Aitken et al., 2009).La primera alternativa implicageneralmente la separación de lasproteínas utilizando isoelectroenfoque yes seguida por una electroforesis en gelde poliacrilamida en presencia de SDS(SDS-PAGE) para separar las proteínasen una segunda dimensión en función desu peso molecular (Fig. 2).

Esta alternativa ha sido ampliamenteutilizada en el pasado, permitiendoidentificar muchas proteínas presentesen el espermatozoide (Com et al., 2003;Pixton et al., 2004; Martínez-Heredia etal., 2006; 2009). Pero de las dosalternativas, la capacidad de análisis dela generación inicial de péptidos y suanálisis mediante LC-MS/MS es muysuperior. Por ejemplo, a través de 2D yMALDI-TOF o LC-MS/MS es posibleidentificar hasta unos pocos cientos deproteínas (de Mateo et al., 2007;Martínez-Heredia et al., 2008), mientrasque con la generación inicial de péptidosseguido de LC-MS/MS es posible llegar aidentificar hasta alrededor de 1000proteínas diferentes (Baker et al., 2007;Oliva et al., 2009).

Actualmente el catálogo más amplio delas proteínas presentes en elespermatozoide humano se haconseguido a través de LC-MS/MS con1056 productos génicos identificados yes complementario al obtenidomediante 2D e identificación de lasproteínas (de Mateo et al., 2007; Bakeret al., 2007; Oliva et al., 2009). Ademásde la generación de catálogos de lasproteínas, la proteómica se ha aplicadotambién a la identificación de lapresencia de anomalías en pacientesestériles. Existen diversas estrategiaspara analizar el contenido diferencial deproteínas presentes en dos o más

muestras distintas. Un método es el 2D-DIGE que se basa en el marcadodiferencial utilizando fluorocromos delas proteínas extraídas del control (porejemplo con verde) y de las célulasexperimentales (por ejemplo con rojo).Esto es seguido de su mezcla yseparación en la misma 2D, lo quepermite detectar las proteínasaumentadas o disminuidas observandola desviación de la fluorescencia haciauno de los fluorocromos (Baker et al.,2005; Oliva et al. ,2008). Otraalternativa es la cuantificación ycomparación de la abundancia relativade las distintas proteínas en gelesindependientes. Estrategias másrecientes desarrolladas se basan en elmarcado isotópico no radioactivo de lasmuestras problema y control (Baker etal., 2009; Oliva et al., 2009).

La primera descripción del potencial deanálisis proteómico 2D en el estudio dedefectos en espermatozoides se realizóen un paciente con un fallo reiterado defecundación en técnicas de fecundaciónin vitro (Pixton et al., 2004). Elproteoma de este paciente mostró 20diferencias en comparación con loscontroles y se consiguió identificarvarias proteínas diferenciales.Posteriormente se ha conseguidoidentificar proteínas diferenciales enpacientes astenozoospérmicos,oligozoospérmicos y en pacientes conalteraciones en el contenido deprotaminas o en la integridad del DNA(Baker et al., 2005; de Mateo et al.,2007; Oliva, 2007; Martínez-Heredia etal., 2009; Botta et al., 2009; Siva et al.,2010). La proteómica se ha aplicadotambién al estudio de los antígenosinmunogénicos presentes en losespermatozoides, tanto con el fin decomprender la esterilidad inmunológicacomo para identificar posiblescandidatos inmuno-anticonceptivos(Oliva et al. ,2009).

La aplicación de las técnicas deproteómica en andrología y en biologíareproductiva se halla en sus inicios, perolos datos disponibles hasta la fecha yaindican su enorme potencial. Esprevisible que en un futuro permitan unadisección molecular de las distintascausas de esterilidad masculina,permitiendo tanto la identificación delos mecanismos fisiopatogénicos

implicados, como resultar de utilidad enel diagnóstico, pronóstico, y desarrollode nuevas estrategias terapéuticas.

AGRADECIMIENTOS

Subvencionado en parte gracias alproyecto del Ministerio de Ciencia yTecnología (BFU2009-07118), FondosFEDER a R.O.

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Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano.


INTRODUCCIÓN

Uno de los mayores retos en el campo dela reproducción humana es la selecciónde los embriones más apropiados atransferir. Hasta la fecha, en los ciclosde Fecundación In Vitro, la evaluaciónmorfológica sigue siendo el método deasesoramiento utilizado para escoger elmejor embrión o blastocisto, pero estemétodo de selección es altamentesubjetivo y su modesto poder predictivoy la variabilidad inter- e intra-observador limita su valor.

Además, seleccionar el mejor embrión atransferir no sólo significa escoger elembrión que nos va a dar másposibilidades de embarazo, sino quetambién es crucial escoger aquelembrión que nos va a aumentar la tasade recién nacido vivo en casa.

Actualmente, lo más novedoso en elestudio de la embriogénesis son lastécnicas -Ómicas. Son disciplinas queestudian los eventos e interacciones de lasestructuras celulares y sus procesos, desdeel DNA hasta la función biológica; es decir,desde los genes hasta los metabolitos.Todos los procesos que contribuyen en el

fenotipo pasan a través de este complejosistema, y la Genómica, Transcriptómica,Proteómica y Metabolómica intentancomprender cómo un embrión crece ycuáles son sus indicadores de éxito.

Las tecnologías proteómica ymetabolómica han desarrollado el

análisis cualitativo y cuantitativo deproteínas y metabolitos, respectivamente,en una célula, un organismo o unamuestra bajo distintas condiciones, con lafinalidad de obtener un perfilcomprensible de todas las proteínas ymetabolitos de esa célula, organismo omuestra. Los metabolitos de bajo pesomolecular representan el producto finalde procesos de regulación celular, y por lotanto revela la respuesta de los sistemasbiológicos a una variedad de influenciasgenéticas, nutricionales y ambientales(Singh and Sinclair, 2007)

Aunque la metabolómica es obviamentecomplementaria a la genómica yproteómica, tiene ventajas especiales.La tabla número 1 recoge las ventajasdel estudio del metaboloma encomparación con el del transcriptoma yel proteoma (Dunn and Ellis, 2003).

CAMBIO EN LAS ESTRATEGIAS DEGENERACION DE HIPÓTESIS

Las -Ómicas están transformando elmétodo de investigación. El obtener talgrado de información ha implicado uncambio en el ciclo del conocimiento. En elciclo del conocimiento tradicional, el

conocimiento previo se utilizaba paraconstruir una hipótesis para ser testadaexperimentalmente. El experimentoproducía datos que daban consistencia ono a la hipótesis inicial. Es decir, lahipótesis era el punto de partida. Elacercamiento, por tanto, era hipotético-deductivo.

Sin embargo, con las -Ómicas tenemosuna situación de acercamientoinductivo, donde no hay una hipótesisreal, y la estrategia es generar estahipótesis desde los datos obtenidos,provocando un descubrimiento delconocimiento y pudiendo a posterioritestar estas nuevas hipótesis de la formatradicional. El diseño experimental esmuy importante en el acercamientoinductivo, porque determinará quéexperimentos nos van a dar lainformación que estamos buscando. Laestrategia en la que un algoritmo eligequé experimentos hacer es conocidacomo “aprendizaje activo” y es laestrategia de elección. Para ellodebemos contar con sistemasinformáticos de alta complejidad(Waidyanathan, 2003; Goodacre, 2004)

¿QUÉ ES LA METABOLÓMICA?

Existe un debate activo en la comunidadcientífica sobre la definición exacta demetaboloma. Fue definido por primera vezpor Oliver y cols. (1988) como elcomplemento cuantitativo de todas lasmoléculas de bajo peso molecular que seencuentran en las células en un estadofisiológico particular o de desarrollo. Otradefinición sustenta que el metabolomaconsiste en sólo aquellas moléculaspequeñas y nativas que están participandoen reacciones metabólicas generales y queson requeridas para el mantenimiento,crecimiento y funcionamiento de la célula(Beecher et al., 2003).

En términos generales, pormetabolómica (Nicholson et al., 1999;Fiehn et al., 2002) se entiende laobtención, de una manera simultánea yglobal, de perfiles correspondientes amúltiples concentraciones demetabolitos y de sus fluctuacionessistémicas y celulares en respuesta afármacos, dieta, genética, estilo de vida,entorno y estímulos, de forma que seaposible caracterizar los efectos adversosy beneficiosos de esas interacciones.

La metabolómica busca una descripciónanalítica de muestras biológicas

METABOLÓMICA Y REPRODUCCIÓN HUMANAImma Sánchez Ribas12, Francisco Domínguez2, Carlos Simon3. 1IVI Barcelona, Fundación IVI, Embryomics, 2Embryomics, 3 IVI Valencia, Fundación IVI


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Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana.

complejas, e intenta caracterizar ycuantificar todas las moléculaspequeñas de ese tipo de muestras. Sinembargo, medir el metaboloma es unreto analítico considerable. Esto esdebido a la naturaleza lábil de losmetabolitos, el rango ampliamentedinámico y diverso de muchos de ellos,la complejidad química y heterogénea delos mismos, la falta de técnicasanalíticas automatizadas que puedanmedir cuantitativamente un grannúmero de metabolitos de estructuradesconocida, el rendimiento de lasmediciones y la naturaleza elaborada delos protocolos de extracción (Whitfieldet al., 2004).

PLATAFORMAS DE ANÁLISIS

Todos estos desafíos deben serabordados por la plataforma de análisisempleados. Las plataformas para lasmedidas del metaboloma deben serimparciales, sensibles y con una grancapacidad de análisis de altorendimiento para discriminar un grannúmero de metabolitos. A pesar del granéxito en el desarrollo de la tecnología

metabolómica, aún no es posibleanalizar con una única plataformaanalítica la diversidad de metabolitoscomplejos. La Fig. 1 indica las distintastecnologías para el análisismetabolómico de muestras, así como lascaracterísticas más relevantes de lasmismas. El tipo de muestras que seanaliza mediante estas técnicas sonbiofluidos como orina, plasma o sueroprevia precipitación de proteínas;metabolitos intracelulares de plantas,microbios y animales, previa extracciónmediante solventes polares y no polares;tejidos sin previa o mínima preparacióny huellas metabólicas en secrecionesnaturales de metabolitos intracelulareshacia el volumen extracelular.

De todas ellas, las tecnologías másempleadas para el análisismetabolómico son la espectrometría demasas, que generalmente incluye unpaso de separación cromatográfica, y laespectroscopia de RMN, dado que ambasplataformas proporcionan una ampliainformación estructural yconformacional sobre múltiples clasesquímicas en un procedimiento analíticoúnico. Las dos técnicas poseendiferentes ventajas y desventajas desdeel punto de vista técnico, y suelenofrecer información complementaria(Lenz et al., 2007). Ambos métodosproporcionan información sobre unamplio conjunto de metabolitos, sin tenerque preseleccionar qué analitos deben serdetectados. Esto nos permite diseñarexperimentos basados en elrazonamiento inductivo para generarnuevas hipótesis, siendo una víapotencial de descubrimiento deconocimiento a través del holismo.Además, los dos métodos puedenemplearse para identificar las estructurasde los metabolitos, y para medir lasconcentraciones relativas y absolutas.

OBJETIVOS DE LA METABOLÓMICA

Todos los estudios metabolómicos danlugar a un conjunto de resultadoscomplejo, que requiere un softwareespecífico para su visualización ymétodos quimiométricos ybioinformáticos para su interpretación.El objetivo de estos experimentos esgeneralmente el de obtener huellasbioquímicas que puedan ser útiles desdeun punto de vista diagnóstico o declasificación, y, en un segundo lugar, elde identificar las sustancias quecontribuyen a dicho diagnóstico oclasificación, ya que éstas conforman unconjunto complejo de biomarcadoresque puede ayudar a definir el contexto

biológico o clínico y explicar losmecanismos bioquímicos relacionadoscon los cambios observados, y asíampliar el conocimiento existente.

ESPECTROMETRÍA DE MASAS (EM O MS) YRESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)

Tanto la EM como la RMN se emplean deforma rutinaria en los estudiosmetabolómicos.

La EM es una herramienta de análisismetabólomico muy poderosa, ya queprovee una única mezcla de sensibilidad,rapidez, calidad y análisis potencialmentecuantitativo de una gran cantidad demetabolitos. Puede ser usada sola o encombinación con otras técnicas decromatografía. Los análisis de EMrequieren una preparación exhaustiva dela muestra y una extracción de la mismautilizando solventes orgánicos quepueden provocar la pérdida de algunoscompuestos.

La RMN es una técnica no destructiva, noinvasiva, y que no modifica el equilibriobiológico, y proporciona unainformación detallada sobre lasestructuras moleculares en solución.Además la espectroscopia de RMN es unatécnica muy fiable para las aplicacionesmetabolómicas que requieren un altogrado de reproducibilidad.

Ambas técnicas permiten la detecciónsimultánea de un amplio rango demetabolitos estructuralmente diversos yla detección en bajas concentraciones delos mismos.

Es importante tener en cuenta que, seacual sea el origen de las muestras,deben evitarse fuentes potenciales deartefactos durante el proceso derecogida de las muestras biológicas, conel fin de obtener resultados que poseanuna buena calidad y fiabilidad.

Análisis estadístico multivariable

Los métodos de análisis estadísticomultivariable proporcionan un medio deoptimizar la extracción de la informacióncontenida en los espectros de EM y RMNde mezclas complejas. Una vez realizadostodos los pasos anteriores, lo que se tienees una serie (uno por muestra) de perfilesmultivariable que representan un punto

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Fig 1.


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en un espacio K-dimensional, y cuyaposición (coordinadas) depende de losvalores de cada uno de los descriptores (ometabolitos) que describen el sistema (lamuestra). Cuando se trata de analizar unaserie de perfiles, resulta muy útil laaplicación de lo que se denominanmétodos basados en la proyección. Losmétodos de proyección convierten tablasde datos multidimensionales en modelosde dimensionalidad. Esto permitedetectar además agrupaciones ytendencias, ya que puntos que seencuentran cercanos corresponden aperfiles multivariables relativamentesimilares. De forma opuesta, puntos quese encuentran alejados unos de otrospresentan descriptores muy diferentes.

Un ejemplo de lo explicado podemos verloen la Figura 2, donde puede apreciarse la

utilidad de esta herramienta paracomprender los patrones que subyacenbajo la gran cantidad de informacióngenerada en los estudios metabolómicos.Quedan patentes las relaciones entre lasdistintas muestras, pudiendo describiragrupamientos, tendencias e influencias.

Aunque los métodos de proyeccióndescritos forman la base de los estudiosmetabolómicos, los análisis estadísticosdependen del tipo de estudio que se estédesarrollando. Existe una gran variedadde métodos que pueden emplearse en elanálisis de datos metabolómicos. Laprincipal diferencia entre todos ellos essi se dispone o no de información previasobre la clasificación de muestras enclases distintas, o si se sospecha laexistencia de nuevas clases. Sin dudaalguna, los métodos más empleados deanálisis multivariable son losdenominados PCA (análisis decomponentes principales (Holmes,1998)) y PLS (mínimos cuadradosparciales (Wold et al., 1984)). El PCA esun método no supervisado que se

emplea para revelar la estructura internade un conjunto de datos sin que medieningún tipo de conocimiento previo delsistema. PLS, sin embargo, es un métodosupervisado para regresión. En estecaso, el objetivo es predecir lasrespuestas en un conjunto de datos.Empleando una barrera de corte, PLSpuede emplearse también para análisisbasados en la clasificación ydiscriminación (PLS-DA, “Partial LeastSquares-Discriminant Analysis”).

Identificación de metabolitos

Dependiendo del tipo de análisis que seesté desarrollando, los estudiosmetabolómicos pueden requerir laidentificación de los metabolitospresentes en las muestras biológicasanalizadas. Este objetivo puede

alcanzarse mediante la comparación entrelos desplazamientos químicos obtenidosen los espectros de EM o RMN y aquellosdisponibles en bases de datos como laMMCD (Madison MetabolomicsConsortium Database) (Cui et al., 2008))o la HMDB (Human MetabolomeDataBase) (Wishart et al., 2007).Alternativamente, existen programas(p.ej., “Analysis of MIXtures”, AMIX,Bruker BioSpin) que permiten realizartodas las etapas descritas anteriormente(selección de regiones de interés,segmentación del espectro,normalización, análisis estadístico) y que

contienen módulos (B-Bioref-Code,Bruker BioSpin) que permiten laidentificación y asignación de metabolitospresentes en mezclas complejas. Hay quetener en cuenta que las bibliotecasmetabolómicas no son completas, y queno todos los metabolitos hallados tienenposibilidad de identificación.

ASESORAMIENTO METABOLÓMICO DECALIDAD EMBRIONARIA

El metabolismo es intrínseco a la saluddel embrión, por lo que muchasinvestigaciones se han concentrado endesarrollar marcadores metabólicos noinvasivos de capacidad de desarrollo,como el consumo de oxígeno, reaccionesREDOX, el consumo energético a travésde Na+, K+ y ATPasa o el turnover deaminoácidos (Houghton et al., 2004).

Las últimas investigaciones en lastécnicas moleculares están definiendoperfiles génicos, proteicos ymetabolómicos para intentar detectarcuál es el ovocito o embrión más hábil,entendiendo esta habilidad como sucapacidad para implantar (Katz-Jaffe etal., 2006; Patricio et al., 2007; Brison etal., 2007; Seli et al., 2007)

Actualmente se están desarrollandotécnicas cuantitativas para elasesoramiento no invasivo delmetabolismo embrionario, y es el objetivode investigaciones actuales el determinarsu valor como predictores de viabilidadembrionaria y embarazo (Seli et al., 2007).

Seli y col. publicaron en 2007 el primerestudio con un enfoque metabolómicopara estudiar la viabilidad del embriónhumano. Ellos utilizaron comoplataforma metabolómica de análisis elNear-infrared and Raman spectroscopy,para analizar y comparar el perfilmetabolómico utilizando medioscondicionados provenientes deembriones que implantaron frente a losque no implantaron. Aunque noencontraron marcadores específicos, siobtuvieron distintos espectros entreambos grupos, siendo posible diferenciarfácilmente ambas poblaciones La Fig 3muestra los distintos espectros queobtuvieron de los medios de cultivoembrionario analizados de cada una de lasmuestras utilizadas en el estudio (Seli etal., 2007).

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Fig 2.

Fig 3.


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Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana.

El mismo grupo, en 2008, publica laidentificación de marcadores deviabilidad utilizando análisismetabolómico mediante NMR, en unestudio retrospectivo realizado en 34pacientes. Explican encontrardiferencias significativas enconcentraciones de glutamato entreembriones procedentes de embarazosy/o partos y embriones procedentes defallo de implantación (Seli et al., 2008).

Otra aplicación de la metabolómica en elcampo de la Reproducción Humana es elque estamos llevando en el InstitutoValenciano de Infertilidad, con el apoyode la Fundación IVI. Nuestro objetivo es desarrollar un diagnósticopreimplantacional no invasivo con laayuda de estas nuevas tecnologías.Pretendemos encontrar un perfilmetabolómico embrionario que nospermita discriminar los embrionesnormales de los embriones aneuploides,utilizando el medio de cultivo dondeéstos se desarrollan.

La instrumentación de análisismetabolómico que estamos utilizando esla Espectrometría de Masas asociada aUPLC. El sistema de UPLC ha sidodiseñado para detectar partículaspequeñas (1,7 mm) y encontrar asíperfiles de alta resolución. Por lo tanto,este sistema es óptimo para el análisisde muestras de alta complejidad, comonuestros medios de cultivo, debido alalto poder de separación metabólica yresolución de picos.

En los análisis llevados a cabo hasta lafecha, hemos observado que el perfilmetabólico de los medios de cultivo de los embriones humanos parecediscriminar entre embrionescromosómicamente normales yanormales, aunque existen limitacionesdebidas a la baja cantidad demetabolitos presentes en las muestras.

La Fig 4 es un score-plot donde cada puntorepresenta un medio de cultivoembrionario, lo que nos permite apreciarla relación que hay entre las muestras. Latendencia observada es que muestrasprocedentes de embriones diagnosticadosnormales mediante diagnósticopreimplantacional para screening deaneuploidías (PGD-AS) se concentran enun área del diagrama de coordenadas, y

muestras procedentes de embriones condiagnóstico de aneuploidías se concentranen un área distinta.

DISCUSIÓN

El método de evaluación tradicionalembrionario tiene una capacidad limitadapara seleccionar embriones con desarrollopotencial. Hay una clara necesidad demejora en nuestro trabajo diario;deberíamos ser capaces de aumentar lastasas de gestación y disminuir el riesgo degestación múltiple. Actualmente existennuevas tecnologías en desarrollo paraconseguir este objetivo, pudiendo sertecnologías que utilicemos en un futurocomo herramientas útiles de selecciónembrionaria, así como tecnologías quenos permitan expandir el conocimiento dela fisiología embrionaria con el objetivode aumentar la eficacia de las Técnicas deReproducción Asistida.

La capacidad de evaluar la producción yconsumo metabolómico de un embriónindividual nos llevaría a una mejorcomprensión de la función celular yfisiología en etapas específicas de laembriogénesis. Por otra parte, esteenfoque nos ayudaría a mejorar losmedios de cultivo de embriones ypodríamos identificar las interaccionesentre los embriones y el epitelio uterinomaterno antes de la implantación.


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Fig 4.


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A R T Í C U L O I

INTRODUCCIÓN

La criopreservación de ovocitos permitepreservar la fertilidad en pacientes quepor diversas etiologías puedendesarrollar un Fallo Ovárico Prematuro(FOP). Es el caso de exposición a agentesquimio/radioterápicos, enfermedadesautoinmunes o hematológicas, oprocesos quirúrgicos potencialmenteesterilizantes. La criopreservaciónovocitaria puede emplearse tambiénpara evitar la criopreservación deembriones, para rescatar cicloscomplicados con un síndrome dehiperestimulación ovárica o conausencia de muestra seminal el día de lapunción-aspiración folicular, para evitar

la sincronización donante-receptora enciclos de donación de ovocitos o,simplemente, en mujeres fértiles quedeseen posponer la maternidad.

La criopreservación ovocitaria utilizandola técnica de congelación convencional seconsidera un procedimientoexperimental, debido a las bajas tasas desupervivencia y gestación y al limitadonúmero de recién nacidos logrado (ASRM,2006). Los protocolos dec o n g e l a c i ó n / d e s c o n g e l a c i ó nconvencionales conllevan una reducciónlenta de la temperatura en el tiempo,resultando en el daño de estructurasvitales de los ovocitos.

Los microtúbulos, que conforman elhuso meiótico, y los microfilamentos,localizados en el córtex ovocitario, sonmuy susceptibles a la temperatura deenfriamiento (chilling) y a la exposicióna los crioprotectores (Boiso et al.,2002). Una alteración en estasestructuras podría conducir a unaalineación cromosómica incorrectaprevia a la extrusión del corpúsculopolar, a una segregación cromosómicaalterada, fecundación anómala y/o a unaelevada incidencia de aneuploidías.

La vitrificación combina tasas deenfriamiento del orden de -15.000º C a -30.000º C por minuto (Liebermann et al.,2003) y concentraciones elevadas de

EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURADEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA ENOVOCITOS HUMANOS EN METAFASE IIEFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE AND CHROMOSOMECONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES

Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2

1Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER),Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia.*Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia.e-mail: [email protected] recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010

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RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre laintegridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del husomeiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. Latasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuraciónnormal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica devitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;15(1):14-17.

Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle andchromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh(control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. Theproportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytesshowing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;15(1):14-17.

Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration


A R T Í C U L O I


crioprotectores, aumentando de talmanera su viscosidad que no cristalizasino que forma un estado amorfo similaral vidrio.

La técnica de vitrificación permite burlardos de los factores que limitan el éxitode la criopreservación: por un lado, elproceso conocido como chilling injury(Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro,la formación de cristales de hielo en elinterior de las células (Mazur, 1984). Elprimero se define como el dañoirreversible tras la exposición de lascélulas a bajas temperaturas (de + 15º Ca -5º C) antes de que se produzca laenucleación del hielo. En consecuencia,estructuras celulares como elcitoesqueleto o las membranas celularesse ven claramente afectadas. Elfenómeno del chilling puede minimizarsedurante el proceso de vitrificaciónmediante el empleo de tasas deenfriamiento elevadas (Liebermann etal., 2003). La velocidad de enfriamientode la muestra va a depender del volumende la solución de vitrificación, así, amenor volumen, mayor velocidad deenfriamiento, aumentando éstamediante la inmersión directa ennitrógeno líquido. Para evitar laformación de cristales de hielo, en latécnica de vitrificación se empleanelevadas concentraciones decrioprotectores (Liebermann et al.,2003), sin olvidar su efecto tóxico paralas células. Sin embargo, unacomposición adecuada decrioprotectores puede solventar losefectos tóxicos y osmóticos debidos a laalta concentración de crioprotectores enla solución de vitrificación. La mezcla decrioprotectores más utilizada es laformada por etilenglicol (EG),dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa.

El objetivo de este estudio fue evaluar elefecto de la criopreservación ovocitariamediante la técnica de vitrificación conun sistema cerrado (Cryotip™) sobre laintegridad del huso meiótico y laorganización cromosómica en ovocitoshumanos Metafase II (MII).

MATERIAL Y MÉTODOS

Ovocitos MII:

A todas las pacientes que formaron partedel estudio se les aplicó un protocolo de

hiperestimulación ovárica controladaque incluyó, como frenado hipofisario,agonistas de la GnRH en protocolo largoy como estimulación FSH recombinante.Los ovocitos se recuperaron por puncióntransvaginal ecoguiada, 36-38 horastras la administración de la hCG. Loscomplejos cúmulo-ovocito fueroncultivados en medio IVF (Universal IVFMedium, Medicult, Jyllinge, Denmark)bajo condiciones de cultivo estándar(37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2horas de cultivo in vitro, los ovocitosfueron incubados con 80 IU/mLhialuronidasa (Hyadase, Medicult,Jyllinge, Denmark) y las células delcúmulo fueron eliminadas mediante elpipeteado mecánico de los ovocitos. Losovocitos fueron entonces observadosutilizando un microscopio invertido(x200) y los ovocitos MII se identificaronpor la presencia del primer corpúsculopolar.

Se vitrificaron un total de 12 ovocitos enestadio de MII recuperados de pacientesincluidas en el Programa de Fecundaciónin vitro del Instituto de MedicinaReproductiva (IMER) de Valencia quefirmaron el correspondienteconsentimiento informado. Como grupocontrol (ovocitos MII no vitrificados), seincluyeron 6 ovocitos procedentes depacientes pertenecientes al Programa deFecundación in vitro de la Unidad deReproducción del Hospital Universitariola Fe de Valencia, previa firma delconsentimiento de participación en unProyecto de Investigación desarrollado enel Centro de Investigación Príncipe Felipe(CIPF) de Valencia y con licencia por partedel Instituto de Salud Carlos III.

Protocolo de vitrificación:

Para la vitrificación ovocitaria se utilizóel kit comercial de Irvine Scientific conel Cryotip™ como contenedor. Losovocitos fueron equilibrados en unasolución compuesta por 7.5 % (v/v) deDMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20%suplemento sustitutivo de suero enmedio 199. Posteriormente, fueronexpuestos a la solución de vitrificacióncompuesta por 15 % (v/v) de DMSO +15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa +20% suplemento sustitutivo de suero enmedio 199 y cargados en el Cryotip™.Para la desvitrificación, los ovocitosfueron expuestos a soluciones

compuestas por medio 199 conconcentraciones decrecientes desacarosa (1.0M y 0.5M).

La supervivencia ovocitaria se evaluóinmediatamente tras la desvitrificacióny tras 4 horas de cultivo in vitro,valorándose la integridad de la zonapelúcida, la apariencia del citoplasma yla ausencia de lisis celular.

Fijación y tinción inmunocitoquímica:

La fijación de los ovocitos y tincióninmunocitoquímica del huso meiótico serealizó siguiendo el protocolo descritopor Lin et al. (2008).

Brevemente, los ovocitos MIIdesvitrificados y frescos (grupo control)fueron fijados a 37ºC durante 1 hora enuna solución de formaldehído al 2% ypermeabilizados en una solución deTritón X-100 al 0.5% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Parala tinción de la tubulina, los ovocitos seincubaron durante 90 minutos a 37ºC enuna solución de anticuerpos primariosanti-α y anti-β tubulina (1/400), seguidode 3 lavados y se incubaron durante 120minutos a 37ºC en una solución deanticuerpo secundario Alexa 488(1/200). Para la tinción demicrofilamentos, los ovocitos seincubaron en una solución de rodamina-faloidina durante 60 minutos atemperatura ambiente. Finalmente, losovocitos fueron montados utilizandomedio de montaje con DAPI ymantenidos a 4ºC hasta su evaluación.

Evaluación del huso meiótico:

Para la valoración de los microtúbulos,microfilamentos y cromosomas, seutilizó un microscopio confocal conlasser-scanning (Leica DM IRE 2)equipado con un láser de argón,perteneciente al Servicio de MicroscopíaConfocal del CIPF de Valencia.

RESULTADOS

Se vitrificaron y desvitrificaron 12ovocitos MII. La tasa de supervivenciafue del 91,6% (11/12). Todos losovocitos que sobrevivieron a ladesvitrificación mostraron unaapariencia morfológica normal tras 4horas de cultivo in vitro.

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A R T Í C U L O I

Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico.

Se fijaron para tincióninmunocitoquímica 10 ovocitos MIIdesvitrificados y 6 ovocitos MII frescos.La tasa de ovocitos informativos fue del100% para el grupo control y del 70%para los ovocitos desvitrificados. Estamenor tasa de informatividad paraovocitos desvitrificados fue debida aproblemas acontecidos durante latinción, con independencia de la técnicade vitrificación.

En función de la orientación delcomplejo huso/cromosomas respecto alplano focal, se consideró unaconfiguración normal si: a) cuando alestar orientado de forma paralela alplano focal el huso presenta unaestructura típica en forma de barril conlos polos ligeramente señalados y loscromosomas dispuestos en el ecuador,b) cuando al estar orientado de formaperpendicular al plano focal el husopresenta una estructura circular con loscromosomas orientados en forma decírculo y c) cuando al estar orientado deforma oblicua al plano focal el husopresenta una estructura en forma oval(barril acortado) con los cromosomasalineados en el ecuador. Por otro lado,una configuración anómala del complejohuso/cromosomas quedó representadapor una desorganización parcial ocompleta de los microtúbulos o por unadispersión cromosómica o aparienciacromosómica aberrante o pococondensada. En las Figuras 1 y 2 semuestran una configuración normal yuna anómala del complejohuso/cromosomas, respectivamente.

La proporción de ovocitos con unaconfiguración normal del huso meióticoy una alineación correcta de loscromosomas fue del 100% para losovocitos del grupo control y de 85,7%para los ovocitos desvitrificados, sin quese observaran diferencias significativasentre ambos grupos.

DISCUSIÓN

En este trabajo se evalúa el efecto de latécnica de vitrificación con un sistemacerrado (Cryotip™) sobre laconfiguración del huso meiótico y laorganización cromosómica en ovocitoshumanos en estadio de MII. Laintegridad de este complejo esimprescindible para que se produzca una

correcta segregación cromosómica yevitar así la posible aparición deaneuploidías en el embrión. Aunque sólose observaron anomalías en el husomeiótico/cromosomas en el grupo de ovocitos desvitrificados, las diferencias no fueron estadísticamentesignificativas respecto al grupo control(frescos). Estos resultados son similaresa los descritos en la bibliografía (Li etal., 2006; Cobo et al., 2008).

La vitrificación utilizando el Cryotip™como contenedor permite la vitrificaciónde ovocitos en microvolúmenes (alrededorde 1 μL), incrementando la tasa deenfriamiento y minimizando el efectotóxico de los crioprotectores al disminuirsu concentración. El mantenimiento de laintegridad del huso meiótico y de la placametafásica tras la desvitrificación sugiereque dicha técnica de vitrificación permitepreservar la calidad inicial del ovocito y elpotencial necesario para soportar elposterior desarrollo embrionario.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio ha sido parcialmentefinanciado por el Programa de MedicinaRegenerativa del Instituto de SaludCarlos III.


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Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y,Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocalmicroscopic analysis of the spindle and

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Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica.

Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.


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A R T I C U L O I I

INTRODUCCIÓN

El genoma se divide en dos partesfuncionalmente diferentes y que sepueden visualizar en los cromosomas enforma de eucromatina yheterocromatina. La eucromatina es laparte más activa del genoma y más ricaen genes. La heterocromatina se divideen heterocromatina facultativa, quecontiene información de algunos genes

que no se expresan o que se expresan enalgún momento (como el corpúsculo deBarr) y la heterocromatina constitutiva,formada por secuencias altamenterepetidas y comprimidas como secuenciasatélite, generalmente pobres en genes.Esta heterocromatina es polimórfica,probablemente debido a la intensidaddel ADN satélite.

Estos polimorfismos pueden afectar no

solamente al tamaño, sino también a lalocalización de la heterocromatina;aparentemente no tienen traducciónfenotípica (Mattei et al., 2003) y seconocen como variantes cromosómicas.Las variantes se deben al aumento deheterocromatina constitutiva y suelenser más frecuentes en los cromosomas 1,9, 16 y en los acrocéntricos. Estasvariantes cromosómicas se identifican anivel microscópico y pueden tener

LAS VARIANTES CROMOSÓMICAS AFECTAN LA CALIDADEMBRIONARIACHROMOSOMAL VARIANTS AFFECT EMBRYO QUALITY

Mireia Poveda1, Teresa Rubio2, Isabel Ochando3, Laura Gil1, Manuel Lloret1, José Jesús López-Gálvez1, Antonio Urbano3, Juan Manuel Moreno1,Joaquín Rueda3,4.1Unidad de Reproducción, Hospital Clínica Vistahermosa de Alicante2Unidad de Reproducción, Clínica Virgen de la Vega, Murcia3Unidad de Genética, Hospital Clínica Vistahermosa de Alicante4Área de Biología Celular, Universidad Miguel Hernández, Alicante e-mail: [email protected] · Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 10 mayo 2010


RESUMEN

El objetivo de este estudio es evaluar si la presencia de alguna variante cromosómica en el cariotipo puede afectar a losresultados de los ciclos de ICSI.

Se ha realizado un estudio prospectivo de 81 ciclos de ICSI realizados en nuestro centro en los que algún miembro de la parejapresenta variantes cromosómicas y 169 ciclos de pacientes sometidos a la misma técnica pero con cariotipos normales. Enestos ciclos, se ha obtenido la media de ovocitos recuperados, media de ovocitos maduros, tasa de fecundación, porcentaje defallos de fecundación, porcentaje de embriones de grado A-B transferidos y tasa de gestación y aborto. Los resultados muestranque las variantes más frecuentes son las que afectan al cromosoma 9. Se observa que existen diferencias significativas en lacalidad de los embriones que se transfieren, empeorando en los ciclos con variantes cromosómicas. Los resultados nos sugierenque las variantes cromosómicas pueden tener un efecto sobre la gametogénesis, por lo que los embriones generados en estosciclos de ICSI en los que algún miembro de la pareja presenta variantes cromosómicas son de peor calidad, pero este hecho noafecta a la viabilidad embrionaria. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):19-23.

Palabras clave: infertilidad, variante cromosómica, gametogénesis, calidad embrionaria.

ABSTRACT

The aim of this study is to assess whether the presence of some variant chromosome in the karyotype may affect the outcomeof ICSI cycles.

We performed a prospective study of 81 ICSI cycles performed in our center in which one partner has chromosomal variants and169 cycles of patients undergoing the same technique but with normal karyotypes. In these cycles, we have obtained theaverage of oocytes retrieved, mean mature oocytes, fertilization rate, fertilization failure rate, percentage of A-B gradeembryos transferred and pregnancy rate and abortion.

The results show that the most frequent variants are affecting chromosome 9. It is noted that there are significant differencesin the quality of embryos transferred in cycles with worsening chromosome variants. We suggest that chromosome variantsmay have an effect on gametogenesis, so that the embryos produced in these cycles of ICSI in which a partner has chromosomevariants are worst but this not affect embryonic viability. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):19-23.

Keywords: infertility, chromosomal variation, gametogenesis, embryo quality.


A R T Í C U L O I I

Mireia Poveda et al. Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria.

diferente tamaño, morfología ypropiedades tintoriales, pudiéndosetrasmitir a la descendencia o aparecer denovo, estimándose su incidencia de un3,12% en la población general (Bhasin,2005). Se sabe que muchos de los genesnecesarios para la viabilidadembrionaria y la fertilidad residen en laheterocromatina; es por ello que lapresencia de estas variantes se harelacionado con diferentes procesospatológicos entre los que está lainfertilidad (Madon et al., 2005;Minocherhomji et al., 2009).

Algunos estudios señalan que en casosde abortos espontáneos y en lainfertilidad idiopática, la presencia devariantes cromósomicas en uno o ambosmiembros de la pareja es más frecuente(Dubey et al., 2005). Además, estudiosrecientes han demostrado que existeuna mayor prevalencia de las anomalíascromosómicas numéricas y variantespolimórficas en pacientes sometidos aprocesos de reproducción asistida, talescomo la fecundación in vitro e inyecciónintracitoplasmática de espermatozoides(Minocherhomji et al., 2009), teniendoen estos ciclos menores tasas deembarazo e implantación (Scholtes etal., 1998). El objetivo de nuestro estudioes evaluar si la existencia en el cariotipode alguna variante cromosómica puedeafectar a los resultados de los ciclos deICSI.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ha realizado un estudio prospectivode 250 ciclos de ICSI, de los cuales en 81de ellos al menos un miembro de lapareja presentaba una variantecromosómica en el cariotipo. Losresultados de estos 81 ciclos se hancomparado con 169 ciclos realizadosdesde Junio a Septiembre de 2008 depacientes no seleccionados, sometidos ala misma técnica pero con cariotiposnormales.

De los ciclos estudiados, se excluyeronlos ciclos en los que se ha utilizadosemen procedente de biopsia testiculary ciclos en los que el número de ovocitosrecuperados es menor a 3, eliminandoasí tanto el factor masculino severocomo las bajas respondedoras, en losque los fallos de fecundación son másfrecuentes.

En todos estos ciclos se han obtenido lossiguientes datos: media de ovocitosrecuperados, media de ovocitosmaduros, tasa de fecundación,porcentaje de fallos de fecundación,porcentaje de embriones de buenacalidad (grado A-B) transferidos y tasasde gestación clínica y aborto.

Se ha comparado también la presenciade variantes por sexos, con el fin deobservar si la presencia de las variantescromosómicas tiene el mismo efectosobre los ciclos de ICSI, si se presenta enel cariotipo del hombre o en el de lamujer.

Procedimiento FIV-ICSI

A todas las mujeres se les aplicó unprotocolo de hiperestimulación ováricacontrolada (HOC), siguiendo losprotocolos de estimulación largo conagonistas, con antagonistas o corto,dependiendo de la indicaciónginecológica. En todos ellos se utilizópara la estimulación ovárica medicaciónrecombinante. La ovulación fue inducidacon 10.000 UI de hCG, que se administrócuando los folículos alcanzaron undiámetro igual o mayor de 18 mm. Lapunción folicular se efectuó por víatransvaginal ecoguiada a las 36 horas dela inyección de hCG. La fase lútea fueapoyada con progesterona vía vaginal uoral, comenzando el mismo día de lapunción.

Los ovocitos recuperados fueronfecundados siguiendo el protocoloestándar, utilizando los medios decultivo comerciales Vitrolife®. Lafecundación de los ovocitos se confirmócon la presencia de dos pronúcleos y doscuerpos polares entre las 16-19 horastras la inseminación. A los embrionesprocedentes de estos ciclos, se lesrealizó un seguimiento de su evolución yaspecto morfológico desde el día de lapunción hasta el día de su transferencia(67-71 horas post-ICSI). Dependiendode su morfología y desarrollo, estosembriones fueron catalogados en cuatrocategorías siguiendo los criterios devaloración morfológica de ASEBIR(Ardoy et al., 2007).

La transferencia se realizó mediantecontrol ecográfico y dos semanasdespués se solicitó una ß-hCG para

confirmar el embarazo. Se considerógestación clínica cuando se visualizólatido cardiaco fetal.

Estudio citogenético

El estudio del cariotipo se llevó a cabo enlinfocitos de sangre periférica,cultivados a 37º C durante 72 horas endos cultivos paralelos con Chromosome(Genycell Biotech) y RPMI suplementadocon suero fetal y fitohemaglutinina.

Se analizaron un mínimo de 20metafases y se cariotiparon al menos 3metafases por caso, teñidas con bandasG (Seabright, 1971), según lasdirectrices de la ECA (EuropeanCytogeneticists Association) (Hastingset al., 2007).

Análisis estadístico

Se utilizó el test de la Chi-cuadrado dePearson para calcular la significaciónestadística de los datos y analizar lacorrelación, si la hay, entre las variablesde los grupos con variante y sin variantecromosómica. Para ello, se utilizó elprograma SPSS. Se ha considerado queexisten diferencias significativamenteestadísticas cuando p<0,05.

RESULTADOS

De los 250 ciclos de ICSI estudiados a losque se les realizó un estudiocitogenético, se encontró algunavariante polimórfica del cariotipo en 81ciclos; en tres de estos ciclos ambosmiembros de la pareja presentabanalgún tipo de variante. En éstos seobservó que las variantes cromosómicasmás frecuentes fueron las que afectan alcromosoma 9, presente en un 73% de loscasos (el 37% de los ciclos en mujeres yel 36% en hombres), siendo la variante9qh+ la que se presentó con másfrecuencia, en un 65% de los casos. Lavariante 21ps+ se presenta en un 14,3%de los ciclos en mujeres y en un 7,14% delos ciclos en hombres. El resto devariantes está en un porcentaje inferioral 10%. La distribución de los pacientesportadores de algún tipo de variantecromosómica se muestra en la Tabla I, yen la Figura 1 se identifica algunoscromosomas con variantes cromatínicas.

Los resultados de los ciclos de ICSI en

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ambos grupos, en los que hemosexcluido las bajas respondedoras y losciclos con biopsias testiculares, seobservan en la Tabla II. Estos resultadosmuestran que no existen diferenciasentre los dos grupos en cuanto a

promedio en la edad de la mujer. Lamedia de ovocitos maduros recuperadostras la punción no es significativamentemayor en los ciclos con variantescromosómicas que en los ciclos sinvariantes. A pesar de que la tasa de

fecundación es muy similar en ambosgrupos, el porcentaje de fallos defecundación es mayor, pero nosignificativo, en los ciclos en los quealguno de los miembros de la parejatiene alguna variante de la normalidadque en los ciclos con cariotiposnormales. Se observan diferenciasestadísticamente significativas en lacantidad de embriones de buena calidadtransferidos en día 3 de cultivo, de formaque los embriones obtenidos en los ciclosdonde algún miembro de la pareja tieneun cariotipo con variante cromosómicason significativamente de peor calidadque los embriones obtenidos en los ciclosdonde los progenitores tienen cariotiposnormales.

Las tasas de embarazo y aborto fueronmuy similares en ambos grupos, sinpresentar diferencias estadísticamentesignificativas.

En cuanto a los resultados obtenidos sicomparamos el efecto de las variantespor sexos, no observamos diferenciassignificativas en ningún parámetro(Tabla III).

DISCUSIÓN

El resultado más importante delpresente trabajo es que las variantescromosómicas tienen relación directacon la calidad embrionaria, si bien estehecho parece no afectar a la viabilidaddel embrión.

Se sabe que los factores genéticos tienenun papel muy importante en laesterilidad (Matzuk et al., 2008). Lasrazones genéticas de la infertilidad soncomplejas y tienen distintasconsecuencias. Estas causas pueden sercromosómicas, monogénicas omultifactoriales, y pueden afectar acualquier etapa del desarrolloembrionario (Shah et al., 2003).

Está bien establecido el papel que lasalteraciones cromosómicas juegan en lainfertilidad, y su diagnóstico (Duzcan etal., 2003); sin embargo, el efecto de lasvariantes cromosómicas está lejos deaclararse, habiéndose convertido en uncampo de controversia en citogenéticaclínica reproductiva (Madon et al.,2005). Existen autores que concluyenque las variantes cromosómicas no

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Figura 1. Diferentes tipos de variantes que implican a distintos cromosomas.

Tabla I. Distribución de los pacientes portadores de variantes cromosómicas.

Tabla II. Resultado de los ciclos de ICSI. En ambos grupos se han eliminado bajas respondedoras (menos de3 ovocitos recuperados) y ciclos con sémenes de biopsias.*P<0.05



Mireia Poveda et al. Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria.

tienen efectos fenotípicos y, por otrolado, también hay un númeroconsiderable de publicaciones queaportan datos en sentido contrario(Madon et al., 2005; Gardner et al.,2004; Wyandt et al., 2004).

En los últimos años, varios estudios hananalizado la relación de las alteracionescromosómicas y la infertilidad(Nakamura et al., 2001). En alguno deestos estudios se ha visto que lasvariantes cromosómicas se encuentranen una frecuencia más elevada enpacientes infértiles que en la poblacióngeneral (Yakin et al., 2005; Madon et al.,2005; Rueda et al., 2007). De hecho, ennuestro medio hemos observado quesobre un 12% de los pacientes queacuden a consulta de reproducción porfallo reproductivo presentan algún tipode variante cromosómica (Rueda et al.,2007). Se ha observado que lasvariantes polimórficas en loscromosomas 1, 9, 16, y en el cromosomaY son más frecuentes en la personasinfértiles que en la población general(Madon et al., 2005), habiéndosesugerido que la presencia de estasvariantes en uno o ambos miembros dela pareja podría incrementar lafrecuencia de abortos de repetición einfertilidad idiopática (Dubey et al.,2005). La mayor parte de datos indicanque la variante cromosómica másfrecuente, con gran diferencia, afecta alcromosoma 9, como así observamos

también en el presente estudio.

Se sabe que la región pericéntrica delcromosoma 9 situada entre las regiones9p11-12 y 9q11-12/13 es rica enheterocromatina en la que abundanrepeticiones de DNA satélite. Lasecuenciación del DNA y la cartografíadel cromosoma 9 ha permitidodemostrar, recientemente, que estecromosoma es estructuralmente muypolimórfico y contiene la región máslarga de heterocromatina que hay en losseres humanos (Humphray et al., 2004).Es necesario analizar estudiosmoleculares genéticos y análisisepigenéticos de las regionesheterocromáticas para ver si puedenafectar a genes vecinos implicados eninfertilidad.

Al comparar los ciclos de ICSI en los queal menos un miembro de la parejapresentaba alguna variantecromosómica en el cariotipo con losciclos en los que los cariotipos de ambosprogenitores son normales, observamosque no existen diferencias significativasentre los dos grupos en cuanto a la tasade fecundación y los fallos defecundación. Tampoco hay diferencias enla tasa de embarazo, pero, sin embargo,la calidad de los embriones que setransfieren empeora en los ciclos convariantes cromosómicas, y, a pesar deque la tasa de aborto no essignificativamente mayor en los ciclos

con variantes, si hay una tendencia aque ésta sea mayor cuando los cariotiposestán alterados. El empeoramiento de lacalidad embrionaria cuando algúnmiembro de la pareja presenta variantespolimórficas en el cariotipo nos lleva apensar en la presencia de algunaalteración en los gametos y, de hecho,un número significativo de los varonescon variantes cromosómicas tienen unascifras de aneuploidias por encima de lonormal (Rueda et al., 2007), lo quesugiere que las variantes cromosómicaspodrían tener un efecto sobre la meiosis.Varios estudios han demostrado que lapresencia de variantes cromosómicasestá relacionada con la alteración de laespermatogénesis (Kayhan et al., 2005),observándose que estas variantes sonmás frecuentes en pacientes conoligozoospermia severa o azoospermiaque en pacientes con oligozoospermialeve o normozoospermia (Riccaboni etal., 2008).

A pesar de la alta incidencia de variantescromosómicas en pacientes infértiles,está lejos de dilucidarse su mecanismode acción. Es más, el presente estudiopone de manifiesto que cuando losgametos de los portadores de variantesse emplean para ICSI, a pesar de la peorcalidad embrionaria, no hay efectossobre la viabilidad del embrión.

Recientemente, se ha demostrado quelas variantes cromosómicas no tienenrelación con los abortos de repetición,pero sí con la infertilidad primaria(Minocherhomji et al., 2009). Datos denuestro grupo indican que las parejascon algún miembro con cariotipoportador de variante del cromosoma 9tienen peores tasas de fecundación quelos pacientes con cariotipos normalescuando se hace IA (Ochando et al.,2007), hecho que no ocurre cuando es laICSI la técnica empleada.

Parece pues, que los pacientesportadores de variantes cromosómicasoriginan una mayor tasa de gametos conanomalías posiblemente implicadas enel reconocimiento celular pero que, unavez producida la fecundación, laafectación sobre la viabilidad delembrión sería mínima. La conclusiónprincipal de nuestro trabajo es que losportadores de variantes cromosómicas,se beneficiarían de la técnica ICSI; por

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Tabla III.Resultados de los ciclos de ICSI. Distribución por sexos.




ello, es fundamental destacar laimportancia del estudio citogenéticocomo parte del diagnóstico de la parejacon fallo reproductivo, y de los donantesde gametos.


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A U L A J O V E N

INTRODUCCIÓN

La valoración del desarrollo de un ciclode fecundación in vitro empieza ya el díade la punción ovocitaria, con ladeterminación de la calidad de losgametos para predecir el devenir delciclo y aumentar las probabilidades deéxito. Cada vez se desarrollan nuevos

elementos para permitirnos conseguirembriones de mejor calidad y, enconsecuencia, con mayor potencialimplantatorio. La valoración exhaustivade dicho potencial en los embrionesobtenidos de FIV – ICSI es un tema al quededicamos mucha atención en loslaboratorios, observándolos en todossus estadios, desde el día de la punción

hasta el momento de la transferencia. Enla bibliografía podemos encontrar variascaracterísticas a observar, tanto engametos como en zigotos y embriones(Senn et al., 2006; Balaban et al., 2001;Wittemer et al., 2000; Tesarik and Greco,1999; Tesarik et al., 2000; Scott et al.,2000; Gámiz et al., 2003), que secorrelacionan con la obtención de

RELACIÓN ENTRE LOS PATRONES PRONUCLEARES Y LA CALIDADEMBRIONARIA SEGÚN CRITERIOS ASEBIRRELATION BETWEEN PRONUCLEAR PATTERN AND EMBRYO QUALITY IN ACCORDANCE TOASEBIR CRITERIA

Marta Brossa, Xènia Blanch, Marta AntichFertiLAB – Institut Català de Fertilitat · Alta Gironella 58, Bajos. 08017 [email protected] · Fecha recepción: 23 abril 2010 · Fecha aceptación: 26 abril 2010


RESUMEN

La observación del patrón pronuclear en estadio de zigoto se ha propuesto en varios estudios como una de las característicaspredictivas del desarrollo embrionario y la capacidad implantatoria. En este estudio hemos observado de forma retrospectiva3424 embriones procedentes de 619 ciclos de FIV-ICSI realizados en nuestro centro entre 2008 y 2009, para establecer si existíaalguna relación entre el patrón pronuclear observado el día de la fecundación, a partir de cuatro grupos de clasificación(patrones GI, GII, GIII y GIV) y la calidad embrionaria observada en estadio celular (día 2, día 3) según los criterios propuestospor ASEBIR. Hemos comprobado con significancia estadística que, en nuestro estudio, la distribución de calidades en funcióndel patrón pronuclear no se da de forma aleatoria, apreciándose diferencias sobre todo en el desarrollo de los embrionesprocedentes de zigotos GI (mayor porcentaje de embriones con desarrollo de calidad A: 35,6% vs. el 31,1% general) y enembriones procedentes de zigotos GIII (mayor probabilidad de desarrollo de embriones de calidad D: 47,1% vs. 38,0% general)para día 3.

Dado que la clasificación del patrón pronuclear se realiza simultáneamente a la valoración de la fecundación y con ello, elaumento del estrés al que se somete el embrión en dicha valoración no es significativo, consideramos que merece la penaseguir contando con este dato como uno más de los elementos a tener en cuenta a la hora de decidir cuál o cuáles son losmejores embriones para transferir. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):25-28.

Palabras clave: patrón pronuclear, calidad embrionaria, criterios ASEBIR.

ABSTRACT

The observation of pronuclear pattern of zygote stage has been proposed in several studies as one of the predictivecharacteristics of embryo development and implantation capacity. In this study, we have observed retrospectively 3424embryos from 619 IVF-ICSI cycles performed in our centre between 2008 and 2009, to establish whether there was anyrelationship between pronuclear pattern observed on the day of fertilization, from four groups of classification (pattern GI,GII, GIII and GIV) and embryo quality observed in cell stage (day 2, day 3) according to the criteria proposed by ASEBIR. Wechecked with statistical significance that, in our study, the distribution of qualities based on pronuclear pattern does notoccur randomly, appreciating differences particularly in the development of embryos from zygotes GI (greater percentage ofembryos with development of quality A: 35.6% vs. 31.1% overall) and in embryos from zygotes GIII (greater chance ofdeveloping embryos of quality D: 47.1% vs. 38.0% overall) for day 3.

Since pronuclear pattern classification is performed simultaneously to the assessment of fertilization and thus the increaseof stress to the embryo in that evaluation is not significant, we believe that it is worth to continue taking this as one more ofall the elements to take into account when deciding what are the best embryos to transfer. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):25-28.

Key words: nuclear pattern, embryo quality, ASEBIR criteria.


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Marta Brossa et al. Relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria según criterios asebir.

embriones de mejor calidad. Todaobservación realizada es interesantepero a la vez conlleva un mayor estréspara el embrión, dado que cadadeterminación se acompaña de un mayortiempo de observación y, por tanto,generalmente, de exposición fuera delos incubadores. Cada centro deberíadeterminar qué características lepermiten una mayor y mejor valoraciónde la calidad embrionaria en relación asus resultados, puesto que no todoscoinciden en hallar las mismascorrelaciones (James et al., 2006).

En nuestro laboratorio realizamos uncultivo individualizado de losembriones, observando el patrón depronúcleos (PN) que presentan en día 1(Gámiz et al., 2005) (ver Figuras 1 y 2) ysu evolución y calidad (según criteriosASEBIR) hasta el día de la transferencia(día 2 o día 3). Dado que, como ya se ha

dicho, la determinación del patrón depronúcleos conlleva un mayor tiempo deobservación y, por tanto, de exposiciónde los zigotos fuera de los incubadoresy, teniendo en cuenta que en otroslaboratorios se observa la fecundaciónsin determinar el patrón pronuclear,obteniendo también muy buenosresultados, decidimos estudiar si, ennuestro centro, hallábamos una relaciónentre el patrón pronuclear y la calidadembrionaria, para decidir si merecía lapena seguir con la valoración de dichospatrones.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se ha realizado un estudio retrospectivo,comparando la relación entre los patronespronucleares y la calidad embrionaria de3424 zigotos obtenidos en 619 ciclos deFIV-ICSI, tanto propios como de recepciónovocitaria (edad media 32,0 años –edad

mínima 19; edad máxima 47–, tomando laedad de la persona a quien se realiza lapunción, es decir, la donante en los ciclosde recepción y la paciente en los ciclospropios) realizados en nuestro centrodurante los años 2008 – 2009.

Se han excluido del estudio aquelloszigotos en los que, a pesar de observarsela presencia de 2PN, estos aparecíantenues y no quedaba bien definido quépatrón pronuclear les correspondía.

Del total de embriones, 1335 fueronobservados hasta día 2 y 2089 hasta día 3.

Los patrones pronucleares dereferencia se muestran en la Figura 1,agrupándose en cuatro grupos (GI, GII,GIII, GIV) y la clasificación de calidadessigue la propuesta por ASEBIR(calidades A, B, C y D).

Los ovocitos maduros fueronmicroinyectados o inseminados. Tras lamicroinyección, se pasaron a gotas de 20microlitros de G1 plus v.5 en placasFalcon embriotestadas 60 x 15, para sucultivo individualizado. Los ovocitosinseminados se pasaron a microgotas deG1 a las 3 – 5 horas post-inseminación.

Se valoraron los pronúcleos en microscopioinvertido (Nikon Eclipse TE200) a las 18hpost ICSI o post inseminación.Seguidamente, los zigotos fueroncambiados a placas de G1 nuevas,manteniendo su posición de cultivo. Seobservó su desarrollo hasta día 2 o día 3,anotando las características de cadaembrión (número de células, grado desimetría entre ellas, porcentaje defragmentos, presencia de multinucleación)para poder clasificarlos según la calidadASEBIR correspondiente (A, B, C o D).

Para estudiar si se hallaba relación entrela observación de un patrón pronucleardeterminado y la calidad ASEBIR, seconstruyeron tablas de contingenciatanto para día 2 como para día 3, y seaplicó un test chi-cuadrado (mediante elpaquete estadístico SPSS v. 17.0).

RESULTADOS

La frecuencia general de patronespronucleares observados en nuestrolaboratorio es la siguiente: 28,2% GI;42,1% GII; 6,0% GIII; 23,8% GIV.

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Figura 2: Imágenes ejemplo de los cuatro tipos de patrones pronucleares: GI (a), GII (b), GIII (c), GIV (d).Las imágenes a, b, d, proceden de zigotos obtenidos en nuestro centro; la imagen c procede de “An atlas ofhuman blastocysts” (Lucinda L. Veeck, Nikica Zaninovic).

Fig. 1: Clasificación esquemática de los cuatro grupos de zigotos en función del patrón pronuclear.


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En embriones cultivados hasta día 2, ladistribución general de frecuencias decalidades observadas fue la siguiente:39,1% calidad A; 20,6% calidad B;19,6% calidad C; 20,6% calidad D. Paradía 3, la distribución general observada

fue: 31,1% calidad A; 14,1% calidad B;16,8% calidad C; 38,0% calidad D.

Si no hubiera correlación entre el patrónpronuclear observado en día 1 y lacalidad embrionaria durante el cultivo

(día 2, día 3), sería de esperar unadistribución similar de las frecuenciasanteriores cuando se analizara la calidadembrionaria a partir de cada grupo depatrones por separado. Para comprobarsi la relación existía se estudiaron lastablas de contingencia para patrónpronuclear vs calidad ASEBIR, las cualesmostraron significación estadística enambos casos (ver Tablas I y II). Así pues,en nuestro caso, hallamos una relaciónentre la calidad embrionaria obtenida yel patrón pronuclear.

Del estudio más detallado de las tablasse observa, en los embrionesprocedentes de zigotos GIII, unatendencia al aumento de la calidad C(27,5% vs. el 19,6% general) endetrimento de la calidad A (27,9% vs. el39,1% general) para día 2.

Por otro lado, para día 3, se observamayor proporción de embriones decalidad A (35,6% vs. el 31,1% general),así como de buena calidad (A+B) (52,1%vs. 45,2%), derivados del patrónpronuclear GI, en contraste con elaumento de calidades D derivadas delpatrón GIII (47,1% vs. 38,0% general).

De los cuatro grupos de patronespronucleares, éstos dos son los quemuestran una mayor desviación respectoa los valores generales.

DISCUSIÓN

La observación del patrón pronuclear enestadio de zigoto se ha propuesto envarios estudios previos como una de lascaracterísticas predictivas del desarrolloembrionario y de la capacidadimplantatoria (Senn et al., 2006;Balaban et al., 2001; Wittemer et al.,2000, Tesarik and Greco, 1999; Tesarik etal., 2000; Scott et al., 2000; Gámiz et al.,2003), a pesar de que no siempre se hayahallado dicha relación (James et al.,2006).

En nuestro centro, los grupos depatrones pronucleares utilizados paraclasificar los zigotos nos permitenpredecir de manera significativa unadistribución distinta de la calidad delembrión celular (día 2, día 3),especialmente en los que derivan depatrones GI (mayor tasa de desarrollo deembriones de calidad óptima) y GIII

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Tabla I: Tabla de contingencia Patrón PN * Score ASEBIR Día 2

Tabla II: Tabla de contingencia Patrón PN * Score ASEBIR Día 3


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Marta Brossa et al. Relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria según criterios asebir.

(mayor probabilidad de desarrolloembrionario de calidad D).

Dado que la valoración del patrónpronuclear en nuestro laboratorio serealiza simultáneamente a la valoraciónde la fecundación (observación delnúmero de PN y de CP a las 18h post-inseminación o ICSI), y por ello nosupone un aumento significativo deltiempo de exposición del embrión fueradel incubador, y, ya que nos permiteestablecer un pronóstico del desarrollo,sobretodo en el caso de los grupos GI yGIII, consideramos interesante seguirmanteniendo este criterio de valoracióncomo otro de los utilizados en la elecciónde los mejores embriones paratransferir.

A pesar de todo, y a diferencia de otrosestudios publicados, no se ha valoradola capacidad implantatoria de losembriones derivados de cada grupo depatrones pronucleares, por tratarse deun estudio retrospectivo en el que, a lahora de transferir, no se utilizó el patrónpronuclear como criterio de selección.Un estudio más detallado y dirigido a lapredicción de la capacidad implantatoriade un embrión a partir del patrónpronuclear observado sería necesario ennuestro caso.

Otra conclusión que se desprende de laobservación de los resultados en elanálisis realizado, es que en día 2 seobserva mayor porcentaje de embrionesde buena calidad (A+B) que en día 3.Esto se debe sobre todo a que, en loscasos de transferencias en día 2, losmejores embriones se seleccionan ya seapara transferir, ya sea para sucriopreservación, pero no siguen elcultivo hasta día 3. De todos modos, hayotro grupo nada menospreciable deembriones que, siendo de calidadóptima en día 2, no dividen o lo hacen enun grado muy bajo (sólo una división)entre día 2 y día 3, pasando a calidad D.Es posible que esto sea consecuencia deuna mala activación del genomaembrionario, que empieza amanifestarse en este momento deldesarrollo (en las primeras divisiones elembrión depende del material genéticodel ovocito). Por esta razón, nuestraelección inicial sería la de transferenciaen día 3, pues nos permite seleccionarmejor los embriones.

AGRADECIMIENTOS

A todas las compañeras que hancolaborado en este estudio y que, congran esfuerzo, recopilan los datosnecesarios para desarrollar proyectoscomo éste.

A Lluís Bassas, por su ayudadesinteresada en el tratamientoestadístico de los datos.


ASEBIR – Asociación para el estudio de labiología de la reproducción. II Cuaderno deEmbriología Clínica “Criterios de ValoraciónMorfológicos de Oocitos, Embrionestempranos y Blastocistos Humanos”. 2ªedición, 2008.

Balaban B; Urman B; Isiklar A; Alatas C;Aksoy S; Mercan R et al. The effect ofpronuclear morphology on embryo qualityparameters and blastocyst transferoutcome. Hum Reprod 2001; 16: 2357 - 2361.

Gámiz P; Romero JL; Zulategui JF; Gadea B;Albert C; de los Santos MJ. Valoración de lafecundación. En: Remohí J., Cobo A., RomeroJL., Pellicer A., Simón C. Manual práctico deesterilidad y reproducción humana. 2ºedición. McGraw-Hill Interamericana; 2005.p. 392 – 402.

Gámiz P; Rubio C; de los Santos MJ; MercaderA; Simón C; Remohí J et al. The effect ofpronuclear morphology on earlydevelopment and chromosomalabnormalities in cleavage-stage embryos.Hum Reprod 2003; 18: 2413 - 2419.

James, AN; Hennessy S; Reggio B; Wiemer K;Larsen F and Cohen J. The limitedimportance of pronuclear scoring of humanzygotes. Hum Reprod 2006; 21: 1599 - 1604.

Scott L; Alvero R; Leondires M and Miller B.The morphology of human pronuclearembryos is positively related to blastocystdevelopment and implantation. Hum Reprod2000; 15: 2394 - 2403.

Senn A; Urner F; Chanson A; Primi M-P;Wirthner D and Germond M. Morphologicalscoring of human pronuclear zygotes forprediction of pregnancy outcome. HumReprod 2006; 21: 234 - 239.

Tesarik J and Greco E. The probability of

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Tesarik J; Junca AM; Hazout A; Aubriot FX;Nathan C; Cohen-Bacrie P et al. Embryoswith high implantation potential afterintracytoplasmic sperm injection can berecognized by a simple, non-invasiveexamination of pronuclear morphology.Hum Reprod 2000; 15: 1396 - 1399.

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D E B A T E

Desde el Instituto de Fertilidad ClínicaRincón, agradecemos el esfuerzo queestá desarrollando la Sociedad Españolade Fertilidad (SEF) para elaborar y poneren marcha este proyecto, en el quenosotros venimos colaborando desdehace algunos años. Nuestracolaboración parte de nuestro propiointerés por mantener un registro único,y con ello una excelente referencia conla que marcar la evolución de nuestrostratamientos y técnicas de laboratorio.Consideramos que el registro cumple unpapel fundamental de autocontrol parala gran mayoría de centros, y por ello lopercibimos como una labor propia deuna sociedad científica como es la SEF.Por esta razón mostramos nuestrointerés en continuar con dichacolaboración, de ningún modo por elhecho de hacerse público nos vamos aretractar de esta decisión yaprovechamos para animar al resto decentros para que continúen haciéndolo.

Por otro lado y sin olvidar lasconsecuencias de que aumente elimpacto de la publicación, queremoslanzar fundamentalmente unapropuesta de mejora que consideramosmuy necesaria, para que se puedavalorar objetivamente los resultados decada centro. De no ser así por causasajenas a la buena práctica de unidades ycentros, pueden ocasionarseimportantes perjuicios económicos quepueden influir en la participación de loscentros al registro. Percibimos quetradicionalmente el número de intentosprevios en otros centros no se ha tenidoen cuenta, probablemente porque notuviese mucha relevancia o impacto, yahora ante la nueva condición sí lo tienepor lo que consideramos que debieraurgentemente solventarse. Es muyimportante incluir los resultados enfunción de intentos previos en otroscentros y en el mismo centro, se haceineludible cuando consideramos de

forma conjunta el ámbito privado y elpúblico teniendo una cobertura muydistinta por factores tan diversos comoson la edad, económicos, social ofamiliar y cualquier otro de los motivosque afecten. Con lo que queremos hacerresaltar la importancia de evitar lacreación de un ranking de centros quepueda afectar negativamente sobre laactividad profesional que desarrollamos.Por otro lado queremos recordar laimportancia de que se agilice la creacióndel ya anunciado registro unificado dedonantes, que también puede influirdirecta o indirectamente en latransparencia de los resultadosemitidos. Somos conscientes delimpacto que generará la publicación denuestros resultados y por ello nospreocupamos de que al menos seaprovechoso el cambio sin perjuicio deuna interpretación errónea de losresultados.

El debate del presente número es“Registro SEF 2008”. Las modificacionesrecientes a la manera de presentar losresultados de los centros, y lapublicación de estos resultados, de loscentros que así lo decidan, han generado

una serie de controversias, algunas delas cuales se presentan a continuación.El debate está servido.

En el próximo número de Diciembre, eltema de debate será: “Vitrificación de

oocitos para retrasar la maternidad”.

Os recordamos que los temas de debateson permanentes, con lo cual, podéisopinar sobre ellos en cualquiera de losnúmeros.

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ES NECESARIO CONSIDERAR LOS INTENTOS PREVIOSDolores Pascual Llopis, Francisco Martínez Díaz, Arturo Reyes Palomares, Eva Cogollos Úbeda, Elena del Mar Martín Díaz, Ana Gallego López.Instituto de Fertilidad Clínica Rincón, Málaga.

En nuestra opinión la idea de apostarpor la transparencia en el registro de laSEF nos parece muy correcta y acertadaya que todos hemos visto tasas deembarazo en congresos o en páginasWeb completamente maquilladas.

En cuanto a que una auditoria externapueda comprobar los datos que sepresentan, pensamos que es necesario.Es más, nos parece poco que solo un 10%de los centros sean auditados y no nosparece bien que si se detecta algún erroren la auditoria, simplemente no sepubliquen los datos de este centro.

Pensamos que en este caso,obligatoriamente, se deberían depublicar los datos una vez corregidos.

Otro tema relacionado con latransparencia es la identificación de cadacentro participante con su nombre ydirección, aquí es donde se arma elrevuelo. Creemos compartir nuestraopinión con la de otros centros privados,que este hecho nos puede afectareconómicamente y por tanto entendemosque la Dirección de cada centro, cuyamisión es asegurar su continuidad, quieraeliminar este peligro.

Todos sabemos que hay una ciertavariabilidad con los resultados y si unaño tus resultados son peores que los deun centro cercano, podrías notar undecrecimiento en el acceso de pacientes.Es más, habrás conseguido una “fama”que costará trabajo subsanar.

Por tanto en nuestra opinión: Auditoriassí, cuantas más mejor, a ser posible el100% e identificación de los centrosparticipantes mediante un código.

AUDITORÍAS PARA EL 100% DE LOS CENTROSMª Josepa Mulet MallafrèBIOGEST. Centre de Reproducció Humana, Tarragona.


D E B A T E

ANACER

La Asociación Nacional de Clínicas deReproducción Asistida (ANACER), queagrupa a 25 clínicas privadasdistribuidas por todo el territorionacional, a través de un comunicado,expresaba su preocupación y rechazohacia la forma en que la SEF ha abordadoel tema del REGISTRO este año.

Nosotros como asociados de ASEBIR,también queremos hacernos eco de esapreocupación, utilizando este espaciopara hacer llegar nuestras inquietudessobre el Registro SEF 2008.

Los abajo firmantes pensamos que latrascendencia que tiene la llamada“transparencia” del registro, tendría quehaber llevado a la Junta Directiva de laSEF a presentarla, discutirla y aprobarlaen una Asamblea General de Sociosantes de proponerla al Ministerio.

Por otro lado, nos llama la atención, quedespués de tantos años esforzándonosen enviar de forma voluntaria nuestrosresultados, de pronto, su impulsor, laSEF, sospeche de la veracidad de losmismos. De hecho, se atreve a apoyar loque piensan otros de nuestro quehacerprofesional al decir que “los Registroseuropeo y mundial prefieren menosciclos recogidos en España pero de máscalidad”. ¿Es que la SEF no tiene nadaque decir al respecto de su registro o esque piensa también que los datosobtenidos y publicados hasta ahora noson correctos? ¿Cómo pueden pensarque unas técnicas que venimosdesarrollando desde hace décadas congran prestigio en todo el mundo sepongan ahora en entredicho?

Si piensan que hay Centros realizandouna publicidad engañosa de sus datos,que sea el Ministerio o la Consejería deSanidad de su Comunidad Autónoma, laque se encargue de comprobarlo y nouna sociedad científica, la cual debeestar preocupada por otros temas másimportantes como podrían ser elpromover las transferencias únicas, elseguimiento de los niños nacidos porTRA, entre otros muchos.

Es curioso como la SEF se escuda al decirque estamos practicando una medicinapaternalista, al indicarles la dificultadque van a tener los pacientes para poderentender adecuadamente los resultadosque se les van a ofrecer, cuando todossabemos que de la información querecibirán sólo se fijarán en un dato, latasa de embarazo.

La consecuencia de esto será queCentros que están trabajandocorrectamente, con indicaciones nosiempre favorables; malasrespondedoras, fallos de implantación,factores masculinos severos, etc, y quelógicamente sus tasas de embarazo/ciclo van a ser menores, verán tambiéndisminuidos sus ciclos en el próximo añoe incluso con pérdida de puestos detrabajo porque, se supone, embarazanmenos. Esto es lo más preocupante ytrascendente de la “transparencia” delRegistro, que los centros, por el temor a“poner en peligro sus resultados”puedan verse inducidos a no aceptareste tipo de pacientes, incluso transferirun mayor número de embriones que losque vienen transfiriendo hasta ahora, loque presumiblemente llevará a unaumento de embarazos múltiples eincluso de reducciones embrionarias.

En cuanto a la posibilidad del fraude,siempre fue y será una posibilidad más,pero ahora sí tendrá trascendencia. Esdifícil de aceptar que solo se audite a un10% de los Centros. ¿Cómo se puedeasegurar a los socios, que los Centrosque presentan los ciclos son todos losciclos que realizan y no solo los que leslleven a tener los “resultadosóptimos”?¿Cómo el auditor va a llegar aesa conclusión si solo va a auditar losdatos que se le presenten? A estaspreguntas se contestó en el Workshopsobre el Registro, “que había que confiaren la honradez del científico” Realmentesi se piensa en la honradez, no hacíafalta esa auditoría.

En el nuevo registro, nos piden, entreotros datos, el nº de ciclos de pacientesextranjeras que realizamos. ¿Cuál es elfin? Podemos deducir, que esto tieneotros intereses diferentes a los queproponen y seguramente habrá más deun país extranjero esperando sabercuántas de sus pacientes se facturan enEspaña para buscar la forma derescatarlas.

En definitiva, nos adherimos a la opiniónexpresada por ANACER. Queremos unRegistro honesto pero, por lo expuestoanteriormente, pensamos quetransparencia no siempre es sinónimo dehonestidad. Deseamos un Registro SEFdonde podamos comparar nuestrosresultados como veníamos haciendohasta ahora sin falta que nos fiscalicen.A nuestro juicio, nos hemos cargado unRegistro del que empezábamos a estarorgullosos.

TRANSPARENCIA NO SIEMPRE ES SINÓNIMO DE HONESTIDAD

Adoración Rodríguez Arnedo, Ana Mª Fabregat Reolid, Anna Rabanal, Antonio Urbano Carrillo, Arantza Farreres, Arturo Brassesco Macazzaga,Barbara Freijomil, Belén Lledó Bosch, Belén Murillo Guibert, Carlos García-Ochoa del Fresno, Carmen Calatayud Lliso, Carmen Puyo Gómez,Carolina Castelló, Cristina Puche, Elsi Suárez Álvarez, Empar Ferrer Robles, Esther Velilla, Felipe del Rio Bueno, Florentino Garrido González,Francisco Avila Suarez, Francisco de Asís Vergara Alcaide, Gemma López Granollers, Ignacio Santiago Alvarez Miguel, Jaime Guerrero Villena,Joan Massó, Jorge Ten Morro, José Ramón Ortiz de Galisteo, Juan Manuel Moreno García, Laia Echevarría, Lara Mencía, Laura Gil Aliaga, LauraJimenez Díez, Luz M.Rodriguez Menes, Mª Ángeles Carracedo Caballero, Mª Dolores Casasús Bernabeu, Mª Dolores Pérez Izquierdo, MargaridaGelabert Altayó, María Vila Marqués, Mario Brassesco Macazzaga, Marta Asensio, Marta Sala, Marta Valiente, Meritxell Rafael Palou, Miguel RuizJorro, Minerva Ferrer i Buitrago, Mireia Dominguez Vega, Mireia Poveda García, Natalia Perez Vallés, Nieves Toledo Riera, Nuria Fosas Saenz,Nuria García Potrony, Olga Cairó Doncos, Paloma Duque Alvarez, Paula Fernández , Pilar Martin Talavera, Rafael Lafuente Varea, Ruth AlcoleaBelloso, Ruth Morales Sabater, Sara González García, Sergi Rovira Fontanals, Silvia Fernández, Sonia Gili Bonet, Sonsoles Rodriguez Fiestas,Teresa Rubio Asensio, Víctor Masedo García.



D E B A T E

Los cambios que el Registro de laSociedad Española de Fertilidad (SEF)ha sufrido en la edición 2008 son,quizás, los más trascendentes que haexperimentado hasta ahora. Esto sedebe a la entrada de un nuevo“colaborador” en escena: el Ministeriode Salud y Política Social.

El acuerdo suscrito con el Ministeriosupone que los datos del Registro seseguirán enviando al ministerio deforma agregada, sin distinguir porcentros, tal y como hasta ahora se veníahaciendo, pero, y ésta es la novedad, seentregará un resumen detallado centropor centro de los datos de actividad másrelevantes, que se harán públicos en lapágina de la Comisión Nacional deReproducción Humana Asistida(CNRHA). Es decir, por primera vez en lahistoria del Registro, se harán públicosalgunos datos de cada centro, siempre ycuando éstos lo autoricen. Lacontroversia está servida, pero creemosque esto es sumamente positivo y haredundado en un aumento significativoen la calidad del registro.

En años anteriores, y durante el periodoen el que el registro estaba abierto alenvío de datos, ningún miembro delComité del Registro podía conocer losdatos que los centros remitían de formaindividual. Tan sólo se entregaba elinforme anual de datos agregados. Estehecho ha cambiado en la presenteedición, y sí ha sido factible conocer losdatos de cada centro, siempre y cuandose hubiera marcado la casillaaceptándolo. El objeto de acceder a losdatos ha sido evitar que pasen al registroerrores involuntarios. A este proceso lollamamos “filtración” y a él fueronsometidos la totalidad de los centros quedieron su conformidad para participar.

La totalidad de los centros implica larevisión de la totalidad de los cuadernosde recogida de datos enviados. Loscentros fueron informados de los erroreshallados para que hicieran lasmodificaciones oportunas. Esto noocurría en ediciones previas. Ha sidoaquí donde se ha comenzado a percibircuan positivo puede ser la supervisióndel envío de resultados. Es aquí donde serefleja, ya, el aumento en la calidad delregistro. Pero, además, se ha dado unpaso más: la monitorización “in situ”.

El acuerdo suscrito con el Ministeriosupone comprobar la veracidad de losdatos de, al menos, el 10% de los centrosque hayan suministrado previamente losdatos de actividad. Se ha hecho en el17%. A este proceso se le hadenominado Monitorización y ha sidorealizado por una monitora de ensayos clínicos cualificada. Lasmonitorizaciones han consistido envisitas presenciales realizadas en elpropio centro, para verificar el máximode historias clínicas, atendiendoespecialmente a los ciclos cancelados, alas gestaciones y a los partos.

En la presente edición han participado119 centros, 104 de IU y 97 en FIV/ICSI.Tres centros de FIV/ICSI fueroneliminados antes de la aleatorización,por aportar datos no válidos. Seseleccionaron de forma aleatoria para lamonitorización 16. De estos 16, en 2 nose pudo realizar la monitorización, porlo que fueron también eliminados delRegistro de este año. Finalmente, sevisitaron 14 centros. En uno de ellos lamonitorización no fue satisfactoria, porlo que tampoco será incluido en elRegistro 2008. Quedaron 91 centros, delos que uno se eliminó por dar datosagrupados de varios centros. En esta

segunda fase se han eliminado datosque, de no haber sido revisados, habríansido admitidos como probablementehaya ocurrido en ocasiones anteriores.¿No es obvio que la calidad de lo que secomputa es mayor?

Pero no sólo creemos que los cambiosintroducidos aumentan la validez delRegistro, sino que además:

1. Al poner al servicio de las parejas unregistro público, estamos facilitando sutoma de decisiones, ya que, al contrarioque en otras parcelas de la medicina, lamayoría de las pacientes que se sometena técnicas de reproducción asistidadeben escoger centro para tratarse puespertenecen al sector privado.

2. Se pone de manifiesto la voluntad dela SEF de colaborar plenamente con lasadministraciones sanitarias en laelaboración de un registro oficialpúblico validado.

3. Se aumenta la credibilidad de loscentros participantes ante pacientes,organismos, e instituciones nacionales einternacionales.

4. Un registro transparente permitirátener datos válidos para conocer laeficacia de los tratamientos y controlaraquellos procedimientos que conllevenun aumento de la morbilidad de losrecién nacidos (embarazos múltiples).

5. Adelantarnos a otras instituciones ocolectivos en esta demanda social, quetarde o temprano llegará, especialmenteen una sociedad de la información comola actual, nos permitirá marcar la pautay ganar experiencia en la gestión de estetipo de registros.

LA NUEVA VÍA DEL REGISTRO DE ACTIVIDAD DE LA SEF: EL AUMENTODE LA CALIDAD

José Luis Gómez Palomares1, Yolanda Cabello2, Juana Hernández3, Sylvia Fernandez-Shaw4, Esther Vidal5, Julio Herrero6, Francisca Luceño7,Javier Marqueta8, José Antonio Castilla9, Buenaventura Coroleu10

1FivMadrid, 2Fiv Recoletos Madrid, 3Hospital San Millán, Logroño, 4Unidad de Reproducción Humana García del Real de Madrid, 5Hospital UniversitariClínic de Barcelona, 6Centro de Reproducción Asistida Sagrada Familia de Barcelona, 7Centro de Reproducción Humana de Granada, 8Instituto Balearde Infertilidad, Ginecología y Reproducción, 9Hospital Universitario Virgen de la Nieves, 10Institut Universitari Dexeus, Barcelona.

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D E B A T E


6. El poner a disposición de nuestrospacientes un registro transparente nospermitirá abrir canales de comunicacióncon el público en general e iniciar unaserie de medidas encaminadas a unaadecuada interpretación de resultados delas técnicas de RA, que evitará lasconfusiones actuales en la interpretaciónde los resultados.

Pero los cambios introducidos tambiénhan supuesto un coste. El más evidenteha sido el descenso del número de ciclosregistrados. La disminución ha sido del23,9% en FIV/ICSI (26.246 ciclos en2008 frente a 34499 en 2007) y del19,2% en inseminación (23.295 en 2008frente a 28.834 en 2007). Menos datospero de más calidad. Una disminuciónque, seguro, se reducirá en la próximaedición.

El esfuerzo que la SEF y, en concreto, elComité del Registro, ha realizado ha sidoenorme. Pero todo es susceptible demejora. El comité del Registro está abiertoa cualquier sugerencia a través de su web(www.registrosef.com) y su blog(http://registrosef.wordpress.com/).

Se puede dar el primer paso de otraforma, pero no con mejor intención. Poreso, apoyos tan importantesconseguidos como el de diferentessociedades científicas (ASEBIR, ASESA,SEGO), respaldando todas lasactuaciones que el Comité del Registroha llevado a cabo, no hacen más quereconocer la validez de esta nueva víahacia conseguir el definitivo registrooficial de técnicas de reproducciónasistida.

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F O R M A C I Ó N C O N T I N U A D A

Desde el nacimiento de Louise Brown afinales de los años 70, el desarrollo yaplicación de técnicas de reproducciónasistida (TRA) ha permitido superarmuchos casos de infertilidad. Sinembargo, considerando su impactosocial, cabe plantearse si lainvestigación básica asociada a las TRAavanza de forma sincrónica a suaplicación, con el objetivo deincrementar el conocimiento de labiología de gametos y embrionesprocedentes de la población infértil,aportando así información de granrelevancia que permita, tanto mejorar eléxito del ciclo de reproducción, comogarantizar la seguridad para ladescendencia.

En el área de la genética humana se haobservado un incremento de individuosportadores de anomalías cromosómicasconstitucionales (de Braekeleer and Dao,1991), de anomalías meióticas (Egozcue et al., 1983) o de gametos

cromosómicamente desequilibrados(Arán et al., 1999; Vegetti et al., 2000;Rubio et al., 2001) en poblaciones deindividuos con problemas de fertilidad.El estudio del cariotipo de la pareja, eldiagnóstico genético preimplantacionaly estudios citogenéticos en célulasgerminales, permiten ofrecer consejogenético y acotar el riesgo de que ladescendencia pueda heredar anomalíascromosómicas o genéticas, en el caso deque alguno de los progenitores seaportador de anomalías cromosómicas omonogénicas, en casos de abortos derepetición o edad avanzada, o en casosen los que existe un bloqueo meióticocausado por un incremento de anomalíascromosómicas en las células germinales.

Mientras que los riesgos genéticos cadavez están más acotados, en la actualidadla investigación también se centra enelucidar si existen riesgos epigenéticosasociados a la aplicación de TRA.

Epigenética e impronta genómica.

El término epigenética se refiere acambios heredables que no implicanvariaciones en la secuencia denucleótidos en la molécula de DNA, perosí regulan la expresión génica. Estoscambios incluyen la metilación del DNAen el carbono 5 de las bases citosina endinucleótidos CpG y modificacionespostraduccionales en los extremos N-terminales de las histonas. Estasmodificaciones covalentes actúanconjuntamente modificando laconformación de la cromatina. El DNA decélulas eucariotas se encuentraempaquetado mediante la formación denucleosomas que consisten en 146 paresde bases de la molécula de DNA,organizadas alrededor de un octámerode 4 proteinas histonas (H2A, H2B, H3 yH4). Dependiendo del estado demetilación del DNA, así como demodificaciones represoras o activadorasde las proteínas histonas

IMPRONTA GENÓMICA Y REPRODUCCIÓN ASISTIDAIMPRINTING AND ASSISTED REPRODUCTION

Cristina CamprubíGrupo de Investigación Impronta genómica y Cáncer · Programa de Epigenética y Biología del Cáncer (PEBC)Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL)E-mail: [email protected]

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RESUMEN

La impronta genómica es una marca epigenética específica de alelo que regula la expresión de determinados genes del genomaen función de su origen parental, conllevando su expresión monoalélica. El término epigenética hace referencia a cambiosheredables que no implican modificaciones en la secuencia del DNA. Estos cambios corresponden a la metilación del DNA y amodificaciones de las proteínas histonas. La impronta genómica se establece durante la gametogénesis y debe mantenersedespués de la fecundación para el correcto desarrollo embrionario. En los últimos años, numerosos trabajos han correlacionadoanomalías en la impronta genómica con la aplicación de técnicas de reproducción asistida o con la infertilidad. Profundizar eneste área de conocimiento contribuirá en mejorar tanto el éxito como la seguridad de estas técnicas. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;15(1):36-41.

Palabras clave: Impronta genómica, Epigenética, Reproducción asistida

ABSTRACT

Imprinting is an allelic-specific epigenetic mark that controls certain genes expression on the basis of the parental originresulting in monoallelic expression. Epigenetics reffers to heritable changes that do not involve modifications in the DNAsequence. These changes correspond to DNA methylation and histone modifications. Imprinting is established duringgametogenesis and it must be maintained after fertilization for proper embryo development. In the last years several reportscorrelate imprinting abnormalities with assisted reproduction techniques or with infertility itself. The increase of knowledgeof this field will contribute to improve the success and safety of these technologies. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):36-41.

Key words: Imprinting, Epigenetics, Assisted reproduction




(principalmente metilaciones yacetilaciones en aminoácidos lisina), lacromatina adopta una conformacióncerrada (heterocromatina) o abierta(eucromatina) (Figura 1). Laconformación de la cromatina en formade heterocromatina se asocia a represióngénica, dado que el DNA es inaccesible ala maquinaria de transcripción, mientrasque la conformación en forma deeucromatina se asocia a expresióngénica.

El término epigenética engloba laimpronta genómica, un sistema deregulación de la expresión génica,presente en especies de gestaciónintrauterina (Das et al., 2009), queconsiste en marcar diferencialmente,mediante modificaciones epigenéticas,determinados genes en función de suorigen parental, de manera que sólo seexpresa el alelo materno o paterno.Considerando el comportamientodiferencial de alelo de estos genes, laimpronta genómica es, junto con loscaracteres ligados a los cromosomassexuales y a los genes mitocondriales,una de las excepciones al principiomendeliano básico de equivalencia, elcual describe la inexistencia dediferencias en el comportamiento de losgenes de origen paterno y materno.

Las primeras evidencias de la existenciade impronta genómica surgieron de losresultados obtenidos en experimentosde transferencia nuclear. En 1984,

Surani y colaboradores y McGrath ySolter crearon embriones murinosginogenéticos y androgenéticos, esdecir, embriones con dos pronúcleos ogenomas maternos o con dos pronúcleoso genomas paternos, respectivamente(Surani et al., 1984; McGrath and Solter,1984). La presencia del genoma maternoy paterno implica el desarrollo de unembrión y tejidos trofoblásticosnormales. En cambio, los embrionesginogenéticos crecen relativamente

bien, pero los tejidos trofoblásticos (laplacenta) son atróficos. En el caso de losandrogenéticos, los embriones apenasse desarrollan aunque las placentas sonde gran tamaño (Surani et al., 1984;McGrath and Solter, 1984). Laconclusión inmediata frente a estosresultados es que la contribucióngenética paterna es primordial para eldesarrollo de la placenta y la materna loes para el correcto desarrolloembrionario.

Otra evidencia de la existencia deimpronta genómica proviene del hechode que disomías uniparentales (DUP) deciertos cromosomas tengan comoconsecuencia el desarrollo de síndromeso anomalías del crecimiento. Este es elcaso de los síndromes de Prader-Willi yAngelman, que pueden ser originadospor DUP materna o paterna delcromosoma 15, respectivamente(Cassidy and Schwartz, 1998; Cassidy etal., 2000) y de los síndromes de

Beckwith-Wiedemann y de Silver-Russell, que pueden ser causados porDUP paterna del cromosoma 11 y DUPmaterna del cromosoma 7,respectivamente (Eggermann et al.,2008). Es también ampliamenteconocido que DUP del cromosoma 14causa diferentes fenotipos decrecimiento anómalo, dependiendo delorigen de la DUP (Murphy et al., 2003).

En resumen, determinadas anomalíasfenotípicas pueden ser causadas por laherencia de dos copias maternas opaternas de determinados genes,manifestando la presencia de genes conun comportamiento específico de aleloy su relevancia en el desarrollo. Ademásde DUP, anomalías epigenéticas queconllevan la expresión bialélica(ausencia de metilación en ambascopias) o no expresión (presencia demetilación en ambas copias) de genesregulados por impronta genómica,pueden resultar no sólo en el desarrollode síndromes y anomalías delcrecimiento, sino también en eldesarrollo de cáncer, diabetes neonataltransitoria (Temple, 2007) ypseudohipoparatiroidismo (Bastepe,2008), dependiendo del gen o genesafectados. Considerando la función dedeterminados genes regulados porimpronta genómica en el desarrollocerebral y fetal, la etiología del autismoy de la esquizofrenia (Badcock andCrespi, 2006) así como la preeclampsia(Enquobahrie et al., 2008), larestricción del crecimiento intrauterino(McMinn et al., 2006; Diplas et al., 2009)y el bajo desarrollo para la edadgestacional (Guo et al., 2008) han sidorelacionados con anomalías en laimpronta genómica.

Actualmente se conocenaproximadamente 60 genes reguladospor impronta genómica en humanos,mapados en diversos cromosomas. Cabecomentar que los genes regulados porimpronta genómica suelen encontrarseagrupados en dominios cromosómicosformando un cluster de genes. Laexpresión monoalélica de todos losgenes agrupados en un determinadodominio, se encuentra bajo el control deuna única región, denominada centroregulador de la impronta (ImprintingControl Region; ICR). Las ICR del genomase corresponden con lo que se conoce

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Figura 1. Esquema de las modificaciones epigenéticas en el DNA y en las proteinas histonas relacionadascon el estado de la cromatina en forma de eucromatina o heterocromatina.



Cristina Camprubí. Impronta genómica y reproducción asistida.

como región diferencialmente metilada(Differentially DNA-Methylated Region;DMR). Estas regiones del genomacontienen islas CpG (regiones con unalto contenido de CpG) y son en las quese establece la metilación del DNA y lasmodificaciones represoras de histonasque conllevan la heterocromatinizaciónde toda la región de forma específica dealelo.

Herencia epigenética y de la improntagenómica

Después de la fecundación, el zigotoresultante hereda la copia materna ypaterna de todos los genes del genoma,los cuales deben transmitirse de formafiel a lo largo de la posteriorproliferación celular, asegurando quetodas las células del organismocompartan la misma informacióngenética. Para el desarrollo es tambiénimprescindible la diferenciación celular.Del hecho de que células genéticamenteidénticas sean tan diferentes funcional ymorfológicamente, es responsable laepigenética, la cual regula la expresióno represión de unos u otros genes delgenoma en función del tipo celular. Porello, después de la fecundación ydurante las primeras etapas deldesarrollo embrionario, los patronesepigenéticos específicos de ovocito yespermatozoide son eliminadosmediante una desmetilación global deambos genomas. En el estadio deblastocisto, emergen los patronesepigenéticos específicos de cada tipocelular (Figura 2A). Estos patronesdeben ser transmitidos a través de lamitosis, para conservar el estado dediferenciación y funcionalidad en lascélulas hijas.

A pesar de la flexibilidad epigenética,que permite la diferenciación celular, lospatrones epigenéticos que controlan laexpresión monoalélica de genesregulados por impronta genómica son,en términos generales, comunes entodos los tipos celulares, y esespecialmente crucial que se mantengandesde la fecundación y a lo largo de lasprimeras etapas de la embriogénesis,para el correcto desarrollo del embrión,de los tejidos extraembrionarios y parael correcto desarrollo neurológico(Figura 2A). Por lo tanto, la metilacióndiferencial de alelo de los genes

regulados por impronta genómica debeser heredada de ovocitos yespermatozoides, y debe mantenerse oprotegerse frente a la desmetilaciónglobal que permite la reprogramaciónepigenética del genoma. Para asegurarla transmisión de la metilaciónmonoalélica de estos genes, existe elmecanismo de reprogramación de laimpronta genómica en la línea germinal(Figura 2B). Este ciclo dereprogramación evita que el 50% de losgametos haploides, procedentes de lascélulas germinales primordialesdiploides, sean portadores de la copiametilada y el otro 50% sean portadoresde la no metilada. Frente a estasituación, un ovocito portador de lacopia metilada de un determinado genregulado por impronta genómica, podríaser fecundado por un espermatozoidetambién portador de la copia metilada,de modo que el zigoto resultante seríaportador de una anomalía en laimpronta genómica dado que ambascopias del gen se encontrarían inactivaso silenciadas, conllevando a posiblesanomalías del desarrollo. Del mismomodo, si un ovocito portador de la copiano metilada fuera fecundado por unespermatozoide también portador de lacopia no metilada, el zigoto resultanteexpresaría ambas copias del gen, hechoque también se correlaciona con unaanomalía en la impronta genómica, con

consecuencias fenotípicas. Para evitaresta situación, en las células germinalesprimordiales la impronta genómica seborra, y se establecen los patrones demetilación específicos de alelo de losgenes regulados por impronta genómicadurante la gametogénesis, en funcióndel sexo. Así, aquellos genes en los quesu patrón de impronta se correlacionacon metilación materna, establecerándicha metilación durante la ovogénesisen todos los ovocitos. El establecimientode la impronta materna se realizadurante la maduración ovocitaria (Satoet al., 2007), habiéndose consideradopor algunos autores que ésta no secompleta hasta el momento de lafecundación o justo después de ésta (El-Maarri et al., 2001). En el caso de losgenes en los que su patrón de improntase correlaciona con metilación paterna,ésta se establecerá durante laespermatogénesis, siendo completa enlas espermatogonias del individuo adulto(Kerjean et al., 2000). De este modo,todos los ovocitos y espermatozoidesserán portadores de la improntaespecífica de alelo para cada uno de losgenes regulados por impronta genómica,asegurando la herencia de un patrónnormal de metilación de una de las doscopias de estos genes, y, por ende,asegurando su posterior expresiónmonoalélica durante el desarrollo.

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Figura 2. Reprogramación epigenética durante los primeros estadios del desarrollo embrionario (A) y de laimpronta genómica en la línea germinal (B). En negro se indican los niveles de metilación global del genomay en gris los niveles de metilación de los genes regulados por impronta genómica.



Impronta genómica y técnicas dereproducción asistida

Tanto la metilación del DNA como lasmodificaciones en las proteínas histonasson susceptibles de presentaralteraciones que pueden serconsecuencia de: factores genéticos(anomalías en los genes que codificanfactores implicados en elestablecimiento y/o mantenimiento dela metilación) (Zetterberg et al., 2003;Park et al., 2005; Lee et al., 2006; Zogelet al., 2006; Kobayashi et al., 2009);factores ambientales intrauterinos (Limet al., 2010); exposición a toxinas(Anway and Skinner, 2008);tratamientos hormonales (Pathak et al.,2008, 2010); diferencias dietéticas(Chmurzynska, 2010).

El conocimiento sobre los mecanismos ylas etapas de establecimiento de laimpronta genómica, junto con laaparición de datos epidemiológicos querelacionan un moderado incremento enel riesgo del desarrollo de síndromesrelacionados con anomalías en laimpronta genómica en la población deniños concebidos mediantereproducción asistida (Cox et al., 2002;Ørstavik et al., 2003; Maher et al., 2003;Gicquel et al., 2003; DeBaun et al.,2003), ha focalizado la atención deespecialistas en epigenética e improntagenómica en la investigaciónrelacionada con la reproducciónasistida. En todos los casos descritos enestos estudios epidemiológicos, la causadel síndrome es la pérdida de metilación(Loss of Imprinting -LOI-) en el alelomaterno.

Cultivo in vitro de embriones,hiperestimulación ovárica y maduraciónin vitro de ovocitos

La aplicación de TRA implicamayoritariamente la fecundación y eldesarrollo embrionario temprano encondiciones in vitro, siendo omitido delproceso el ambiente uterino. Existenmúltiples datos experimentalesobtenidos de modelos animales, queavalan una relación entre el cultivo invitro de embriones, así como lacomposición de los medios de cultivo yla transferencia embrionaria encondiciones de asincronía con el estadouterino, y el desarrollo del síndrome de

sobrecrecimiento, conocido como Largeoffspring syndrome (LOS) y causado poranomalías en genes regulados porimpronta genómica (Young et al., 1998;Sinclair et al., 2000; Young et al., 2001;Mann et al., 2004; Li et al., 2005).Además de los efectos fenotípicosinmediatos, debe considerarse laposibilidad de que el cultivo in vitropueda tener efectos a largo plazo. Eneste contexto, se ha descrito unarelación entre el desarrollo de obesidad,ansiedad y déficit de memoria asociadosa anomalías en la impronta, endescendencia obtenida mediante cultivoin vitro en el modelo murino(Fernández-Gonzalez et al., 2007).

Cabe mencionar que en embrionesmurinos obtenidos por transferenciaintrauterina de zigotos obtenidos invivo, también se han descrito LOI,concretamente en tejidosextraembrionarios. Estas anomalías seintensifican y están presentes, no soloen los tejidos extraembrionarios sinotambién en el embrión, cuando losembriones son cultivados in vitro antesde su transferencia (Rivera et al., 2008).Este hecho plantea que, así como lamanipulación de embriones previa a suimplantación puede tener un efectodeletéreo sobre el mantenimiento de laimpronta genómica per se, la prácticametodológica común en ambos casos esla hiperestimulación ovárica.

En la práctica habitual de técnicas dereproducción asistida, es complicadoaislar la exposición a hormonas, que a suvez conlleva la maduración de múltiplesovocitos inducida por el tratamientohormonal, y el posterior cultivoembrionario. Considerando que elperíodo de establecimiento de laimpronta genómica materna escoincidente con la maduración de losovocitos, es lógico plantearse que tantola hiperestimulación ovárica como lamaduración in vitro de ovocitos tambiénpuedan influir en la impronta, en estecaso en su establecimiento. En el año2007, Sato y colaboradores presentaronun estudio de metilación de diversosgenes regulados por improntagenómica, realizado en ovocitos deratón y humanos en diferentes estadosde maduración y en ovocitos maduradosin vitro. En el caso de los ovocitoshumanos, los autores analizaron tanto

ovocitos inmaduros procedentes deexámenes laparoscópicos de población,así como ovocitos en diferentes estadosde maduración obtenidos mediantehiperestimulación de pacientesinfértiles (Sato et al., 2007). Susresultados apuntan de formaconsistente la presencia de LOI dediversos genes regulados por impronta,que correlacionan tanto con lahiperestimulación ovárica como con lamaduración in vitro de ovocitos.Además, en un estudio reciente delefecto de la hiperestimulación en laimpronta genómica, realizado enmodelo murino, se ha descrito un efectodosis-dependiente sobre la metilacióndel DNA, no sólo en forma de pérdida demetilación sino también por la presenciade metilación aberrante en el alelomaterno en genes en los que lametilación se establece en el paterno(Market-Velker et al., 2010). A pesar deser resultados concluyentes y que enmodelo murino queda excluido elcomponente infértil, éste no debe serexcluido en humanos comoconsecuencia de la presencia deanomalías en la impronta genómica.

Infertilidad y anomalías en la improntagenómica

Del mismo modo en que anomalíasgenéticas o cromosómicas explicancasos de bloqueo meiótico, anomalías enla impronta genómica pueden explicarcasos de infertilidad idiopática.

Este planteamiento no puede serdemostrado experimentalmente en elcaso de la meiosis femenina, por lalimitación de obtener ovocitos sinhiperestimulación. Aún así, a partir dedatos epidemiológicos obtenidos demadres de pacientes con síndrome deAngelman, causado por ausencia demetilación materna, Ludwig ycolaboradores demostraron unacorrelación entre infertilidad y lapresencia de estas anomalías (Ludwig etal., 2005). En el caso de la meiosismasculina, han sido publicadosmúltiples trabajos experimentalesconfirmando la relación entre lapresencia de anomalías en la impronta yoligo-, terato- y astenozoospermia(Marques et al., 2004; Kobayashi et al.,2007; Marques et al., 2008, 2009;Kobayashi et al., 2009; Boissonnas et




Cristina Camprubí. Impronta genómica y reproducción asistida.

al., 2009; Poplinsky et al., 2009;Hammoud et al., 2009). Cabe apuntarque, a pesar de que los resultados deestos trabajos avalan con claridad lapresencia de anomalías en la impronta einfertilidad, en la mayoría de ellos no seincluyen poblaciones control dereferencia, por lo que dicha relaciónpodría tener una menor incidencia quela descrita hasta la actualidad en laliteratura. Si la presencia de este tipo deanomalías en espermatozoides deindividuos infértiles fuera tan elevadacomo la sugerida en estos trabajos,cabría esperar una mayor incidencia desíndromes causados por anomalías en laimpronta paterna en la descendenciaconcebida mediante técnicas dereproducción asistida. Contrariamente, noexisten datos epidemiológicos queapunten a un incremento en la incidenciade estos síndromes causados poranomalías paternas, a diferencia de losdatos que sí apuntan a un incrementomoderado de síndromes causados poranomalías maternas. Sin embargo, y teniendo en cuenta que los genespaternos contribuyen mayoritariamenteal desarrollo de tejidosextraembrionarios, resulta atractivoplantear la hipótesis de que las anomalíaspresentes en espermatozoides deindividuos infértiles puedan ser, o bienmás deletéreas para la implantación y/ogestación, o bien puedan quedarconfinadas a la placenta y verse reflejadasen una mayor incidencia de restricción delcrecimiento uterino, consecuencia de unatransferencia limitada o anómala denutrientes de la madre al feto. Seráinteresante aportar datos experimentalesque contribuyan a confirmar o rehusaresta hipótesis.


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A G E N D A

V CURSO ESHRE DE ANÁLISIS BÁSICO DE SEMENFundació Puigvert

20-23 Septiembre 2010

Barcelona

MÁSTER EN BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN Y TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN HUMANA ASISTIDADel 4 de octubre de 2010 al 30 de septiembre de 2011

Institut Universitari Dexeus y Unitat de Biologia Cel·lular

de la Universitat Autònoma de Barcelona.

http://www.uab.es/postgrau/

http://www.dexeus.com/es_ES/profesionales-02-0.aspx

ASRM 2010American Society for Reproductive Medicine

66th Annual Meeting

October 23-27, 2010

Colorado Convention Center

Denver, Colorado

IV SIMPOSIO INTERNACIONAL REPRODUCCIÓN ASISTIDAFundación Tambre

1-3 de diciembre de 2010, Madrid

Palacio de Congresos de Madrid

2ND BIOGENESI CONFERENCEIN VITRO MATURATION OF HUMAN OOCYTES: BIOLOGICAL FOUNDATIONS FOR A BREAKTHROUGH.

2-4 December 2010

Milan, Italy

ESHRE 201127TH ANNUAL MEETING OF THE EUROPEAN SOCIETY OF HUMAN REPRODUCTION & EMBRYOLOGY

3 to 6 July 2011

Stockholm, Sweden

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N O T I C I A S


INDEXACIÓN DE LA REVISTA ASEBIR

Después de varios años publicandoartículos de alta calidad científica,demostrando que es una buenaalternativa para la publicación de lostrabajos tanto de los embriólogosclínicos como de los investigadores en labiología del desarrollo en general, laRevista ASEBIR ha sido indexada en labase de datos Latindex, muy utilizada eniberoamérica, y en la base de datos deciencia y tecnología (ICYT) del ConsejoSuperior de Investigaciones Científicas(CSIC) de España. También ha sidoaceptada para su inclusión en el ÍndiceMédico Español (IME), la base de datosde Biomedicina del CSIC. En estemomento, seguimos gestionando lainclusión de la Revista ASEBIR en otrasbases de datos, de tal manera quenuestra repercusión sea cada vez mayor.Este logro, que fue uno de los objetivosprioritarios de la nueva Junta Directiva,y una aspiración de todos los socios deASEBIR, se ha conseguido gracias alesfuerzo especial de nuestra compañerade la Vocalía de Publicaciones, MargaEsbert, así como a la colaboración directade nuestro Presidente, Manuel Ardoy.

VI CONGRESO ASEBIR, GIRONA 2011

Los preparativos para nuestro VICongreso en Girona 2011 van viento enpopa. Tanto la organización local comola Vocalía de Congresos están trabajandoa marchas forzadas, para que nuestro VICongreso tenga el mismo éxito, osuperior, al alcanzado por el V Congresode Valencia. En la última página de estenúmero, podéis ver ya el primer anunciodel Congreso ASEBIR de Girona, como unavance de lo que esperamos sea, una vezmás, un momento de reunión y reflexióncientífica (y lúdica) que nos sirva paraestrechar aún más los lazos entre losembriólogos clínicos, y, en general,entre los biólogos de la reproducción.

Como siempre, la base de ese éxito serála colaboración y participación denuestros socios, lo cual damos pordescontado.

UN LOGRO MÁS PARA EL DIAGNÓSTICOGENÉTICO PREIMPLANTACIONAL

El pasado mes de Marzo, los mediosrecogieron la noticia del nacimiento de

una niña libre de una distrofia muscularque padece su padre, por primera vez enEspaña, gracias a la utilización delDiagnóstico Genético Preimplantacionalpor el equipo del Hospital Quirón deBarcelona, con la colaboración deReprogenetics. Así, se demuestra unavez más la utilidad de esta técnica paraque las parejas que tengan un riesgogenético elevado puedan conseguir elsueño de concebir un niño sano.

CERTIFICACIÓN ASEBIR DE EMBRIÓLOGOCLÍNICO

Como se ha anunciado ya en la últimaAsamblea de ASEBIR en el marco delCongreso de la SEF de Valencia 2010, elpasado Mayo, el proyecto deCertificación de Embriología Clínica deASEBIR, está en marcha. En un primermomento, habrá una etapa detransición, en la cual se certificará a losembriólogos que ya poseen laCertificación de Embriólogo ClínicoSenior de la ESHRE, así como a losembriólogos que acrediten unaexperiencia determinada. De los avancesde este proceso, se os informaráoportunamente a través del correoelectrónico, la página web, y nuestrarevista.

RENOVACIÓN DE LA PÁGINA WEB

Nuestra página web está sufriendo unaremodelación profunda, de tal maneraque, en breve, podréis contar con unapágina más atractiva, manejable einteractiva.

Estamos seguros de que esta renovaciónpermitirá a los socios, y al público engeneral, una navegación más cómoda yamigable que pondrá a nuestro alcanceuna información relevante y de graninterés para todos nosotros.

¿SE CRUZARON NUESTROS ANCESTROSCON LOS NEANDERTALES?

Aunque nos toque tangencialmente,también resulta interesante para laBiología de la Reproducción. El 7 deMayo, la revista Science publicó unartículo firmado por prestigiososinvestigadores de diversasnacionalidades, entre ellos variosinvestigadores españoles, donde sedemostraría como los humanos

modernos no sólo coincidieron con losneandertales, sino que compartieroncon ellos algo más que las cuevas(http://www.sciencemag.org/cgi/reprint/328/5979/710.pdf). Los europeos ylos asiáticos, y por supuesto toda sudescendencia, tenemos entre un 1-4%de DNA neandertal; no así los africanos,por lo que el “encuentro” debe haberocurrido al salir los primeros humanosmodernos de África, probablemente enel medio oriente. Algunos de los fósiles,cuya recuperación fue fruto de untrabajo exhaustivo de los investigadoresespañoles, determinante para estehallazgo, fueron obtenidos de la cuevade El Sidrón, en Asturias. Losinvestigadores españoles diseñarontodo un protocolo para la recuperaciónde los fósiles, evitando la contaminacióndel DNA neandertal con el de los propiosinvestigadores.

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I N F O R M A C I Ó N P A R A L O S A U T O R E S

Normas de publicación.

NORMAS DE PUBLICACIÓN

La Revista ASEBIR es una publicación delámbito de la Biología de laReproducción, abierta a considerarcuantos trabajos afines a esta área deconocimiento puedan adaptarse a unode los siguientes apartados: Artículosoriginales, Temas de Actualidad yDebate.

Además, la Revista ASEBIR también dacabida a la actualidad en sus seccionesde Noticias y Agenda. Por otra parte, laRevista ASEBIR cuenta con un apartadode Formación Continuada, y un AulaJoven, en la que los embriólogos jóvenespueden publicar sus primeros trabajos.

La Revista ASEBIR se publicasemestralmente, por lo que esindispensable que los escritos seanenviados antes del 31 de Marzo, para elprimer número del año (Junio) y antesdel 30 de Septiembre, para el segundonúmero del año (Diciembre). Losartículos originales serán sometidos a laevaluación de dos revisores externos ydeberán ser acompañados de una cartaen la que se declare que el artículo no hasido publicado con anterioridad en otromedio, y donde se ceda los derechos depublicación a ASEBIR. El formulario paraesta carta se puede descargar desde lapágina web de ASEBIR. Para lareproducción de material ya editado esnecesaria la autorización expresa de lospropietarios del copyright.

Los originales deberán ser enviados a la dirección de correo electrónico de la Secretaría de ASEBIR([email protected]).

Los manuscritos deberán ser remitidosen formato DOC (Times New Roman 12p,a doble espacio), acompañado deldocumento correspondiente en PDF.Para los artículos en general se sugiereuna extensión no superior a las trecehojas a 30 líneas, con no más de seisfiguras y seis tablas.

Los Artículos Originales, Aula Joven yFormación Continuada deben estaracompañados de un Resumen y Palabras

Claves, en Español e Inglés (Summaryand Key Words), así como de latraducción del Título al Inglés. El ordensugerido para estos artículos es: Títuloen Español; Título en Inglés; Nombre yApellidos de cada uno de los autores;Nombre completo del Centro, con ladirección para la correspondencia,incluido el correo electrónico del autorresponsable; Resumen y Palabras Clave,en Español e Inglés; Introducción;Material y Métodos; Resultados;Discusión; Agradecimientos; ReferenciasBibliográficas; Tablas y Figuras. Lastablas se numerarán con númerosromanos y las figuras con númerosarábigos. Los pies de figura deberán serlistados en una hoja aparte, al final delartículo, y cada figura llevará escrita sunumeración.

Las citas bibliográficas deben serdirectas, consignándose en el texto elnombre del autor o de los dos autores yel año, p. ej. (Smith, 1993) o bien (Smithand Michigan, 1997); y si son más de dosautores, consignándose el primeroseguido de “et al.,”, p. ej. (Smith et al.,1998). Para agrupar varias citas, seencadenarán con “;”, p. ej. (Smith andMichigan, 1997; Smith et al., 1998).

Las referencias se presentarán en lasección Referencias Bibliográficas pororden alfabético, siguiendo las normasdel International Committee of MedicalJournal Editors 5th Edition (dichasnormas se pueden consultar en JAMA1997; 277:927-934).

Los nombres de las revistas seabreviarán de acuerdo con el estilousado en el Index Medicus (que se puedeconsultar en la List of Journals Indexedque se incluye todos los años en elnúmero de Enero).

A continuación se da un ejemplo deformato de citas bibliográficas:

A) Artículo de revista con menos de seisautores:

Lewis SE, Moohan JM, Thompson W.Effects of pentoxifylline on humansperm motility in normospermic

individuals using computer-assistedanalysis. Fertil Steril 1993; 59:418-423.

B) Artículo de revista con más de seisautores

Marrama P, Baraghini GF, Carani C, CelanMF, Giovenco P, Grande F, et al. Furtherstudies on the effects of pentoxifyllineon sperm count and sperm motility inpatients with idiopathic oligo-asthenozoospermia. Andrologia 1985;17:612-616.

C) Libro completo

Colson JH, Armour WJ. Spermatogenesis.2º ed. Londres:Delmar Publishers;1996.

D) Capítulo de libro

Siracusa G, Felici M, Salustri A. Meioticmaturation of the mammalian oocyte.En: Ach RH, Balmaceda JP, Johnston I,editors. Gamete Physiology. 2º ed. NewYork:Raven Press; 1990. p.129-144.

E) Comunicación a congreso

Bengston S. Hatching assisted. XXIIMeeting of European Society of HumanReproduction and Embryology; 1997Junio 20-23; Roma, Italia. p. 1561-1562.

Para la sección de Debate, se aceptarántextos de no más de dos hojas a 30líneas, incluidas un máximo de cincoreferencias bibliográficas y dos figurassi las hubiere, que reflejen la opinión delos firmantes sobre el tema de discusión,que se propondrá en el número anteriorde la revista.

Para las secciones de Noticias y Agenda,se aceptarán escritos que informen decongresos u otros eventos o novedadesrelacionados con la Biología de laReproducción o la actividad asociativade ASEBIR, siempre que identifiquen demanera clara los organizadores de losmismos.

NORMAS DE PUBLICACIÓN44


[email protected] | www.asebir.com

ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN


Revista Asebir junio 2010

Health & Medicine

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