Indri Kusharyanti, M.Sc., Apt

REVIEW BIOANALISIS

A bioanalytical method consists of two main components:

1. Sample preparation – extraction of the drug from the biological fluid usually including a concentration step to enhance sensitivity of the method

2. Detection of the compound – ususally following chromatographic separation from other components present in the biological extract. The detector of choice is a mass spectrometer.

BIOANALISIS

Secara umum proses analisis minimal mempunyai 5 langkah :1. sampling (pengambilan sampel), 2. preservasi sampel (penyimpanan sampel),3. preparasi sampel (penyiapan sampel),4. analisis (pengukuran), 5. interpretasi data (analisis data), dan6. pembuatan laporan analisis. 

SAMPEL BIOLOGISDARAH

Whole BloodPlasmaSerum

URINESALIVASPUTUMSPERMACAIRAN

SEREBROSPINAL

FESESJARINGAN

LIVERPANKREASBRAINRAMBUTPLACENTA

METHOD VALIDATION

Any method is valid as long as it is validated

Procedures that demonstrate that a method is reliable and reproducible for the intended use.

Types:– Full validation: first time, new drug, or addition of

metabolites– Partial validation: modifications of a validated method– Cross-validation: comparison between methods

PRE-STUDY VALIDATION

Fundamental parameters for validation

Method used for the determination of drugs and/or metabolites should be:

Selective Sensitive

Accurate Precise

Stable

Analysis of drugs and their metabolites in a biological matrix is carried out using samples spiked with calibration (reference) standards and using quality control (QC) samples

The purity of the reference standard used to prepare spiked samples can affect study data

For this reason, an authenticated analytical reference standard of known identity and purity should be used to prepare solutions of known concentrations

Reference standard

The source and lot number, expiration date, certificates of analyses when available, and/or internally or externally generated evidence of identity and purity should be furnished for each reference standard

If possible, the reference standard should be identical to the analyte

When this is not possible, an established chemical form (free base or acid, salt or ester) of known purity can be used

Reference standard

Three types of reference standards are usually used:(1) certified reference standards (e.g., USP

compendial standards);(2) commercially supplied reference standards

obtained from a reputable commercial source;(3) other materials of documented purity

custom-synthesized by an analytical laboratory or other noncommercial establishment

Reference standard

proses yang harus dilakukan untuk menyiapkan sampel sehingga siap untuk dianalisis menggunakan instrumentasi yang sesuai.

Preparasi Sampel

Sample preparation for DNA Extraction

Potential interfering substances in a biological matrix include endogenous matrix components, metabolites, decomposition products, and in the actual study, concomitant medication and other exogenous xenobiotics

14AnFar.S2-08

Metode yang paling umum digunakan :- Pengendapan protein sebagai garam yang tidak larut

Deproteinisasi

Protein

pH rendah ( asam kuat ) pH tinggi ( basa kuat )

muatan positif muatan negatif

16AnFar.S2-08

Pengaturan pH

Sampel (protein) Sampel (protein)

pH larutan < pH larutan >

titik isoelektrik titik isoelektrik

protein sbg kation protein sbg anion

bereaksi dng anion ttt.

membentuk garam tak larut

bereaksi dng kation ttt. membentuk garam tak larut

Precipitating Agents

Anionik Kationik

• pikrat Ion-ion logam berat spt. :

• molibdat• tungstat• sulfosalisila

t• metafosfat• perklorat• trikloroaset

at

-------

seng merkuri Kadmiu

muraniumbesitembag

atimbal

(Zn)(Hg)(Cd)(U)(Fe)(Cu)(Pb)

--

ZnSO4

ZnSO4/Ba(OH)2

Bila sejumlah tertentu air

dihilangkan dari protein

Protein akan mengendap

AnFar.S2-08

Deproteinisasi dgn dehidrasi

SENTRIFUGASI

Deproteinisasi dgn cara dehidrasi

“ Solvent “( suhu rendah )

AsetonitrilAsetonMetanolEtanol

“ Salting out ”( protein pada

titik isoelektrik )+

Garam( Na sulfat, Na

sulfit )

Protein mengendap

20AnFar.S2-08

Untuk menghasilkan supernatan yang jernih dan berisi komponen yang diinginkan.

Pemisahan dilakukan berdasar sifat partikel dalam medan gaya senrifugal.

Tingkat pemisahan biasanya: 1. Sel utuh dan pengotor2. Inti sel, kloroplas, mitokondria, lisosom3. Mikrosom, ribosom

SENTRIFUGASI

22AnFar.S2-08

Concentrate analyte(s) to improve limits of detection and/or quantitation

Exchange analyte from a non-compatible environment into one that is compatible with chromatography and mass spectrometric and/or other instrumental analytical techniques

Remove unwanted matrix components that may interfere with the analysis of the desired compound

Perform selective separation of individual components from complex mixtures, if desired

Detect toxins in human system or in environment (air, drinking water, soil)

Identify stereochemical effects in drug activity and/or potency Follow drug binding to proteins Determine stability and/or absorption of drugs and follow their

metabolism in human body

tujuannya

Liquid-Liquid Extraction (LLE)

Partitioning of analytes between water phase and organic phase

Kurang cocok untuk :

- sampel komplek (sampel

biologis)

- presisinya rendah

Cocok untuk :

- water insoluble compound

dalam water-soluble matrix

SPE retains analyte from a flowing liquid sample on solid sorbent, analyte is recovered via elution from the sorbent

Phase types:Reverse phaseNormal phaseIon exchangeAdsorption

Solid Phase Extraction (SPE)

27AnFar.S2-08

The Four Basic Steps of A Solid-Phase Extraction

Nonpolar: Reverse phase C18 (octadecyl bonded

silica) and C8 (octyl bonded silica) are most commonly used for hydrophobic analytes

Polar: Normal phase SPE uses cyanopropyl

bonded, diol bonded, or amino propyl bonded silica (used for polar analytes such as cationic compounds and organic acids)

Electrostatic: Ionic Exchange SPE is based on

electrostatics uses quaternary amine, sulfonic acid, or carboxylic acid bonded silica

Adsorption type SPE uses unmodified materials such as alumina, Florosil, resins

Solid Phase Extraction (SPE)

SPE uses a cartridge or discMay be performed a one time use syringe or a

multiple cartridge unit

Solid Phase Extraction (SPE)

SPE uses a cartridge or disc May be performed a one time use syringe or a multiple

cartridge unit

Solid Phase Extraction (SPE)

31AnFar.S2-08

Various SPE Phases and Conditions

Mekn.pmsh Tipe fase Struktur Eluting solv.Tipe analit Loading solv.

32AnFar.S2-08

A 5 step process Advantages over L-L include: smaller volume solvent used, no emulsions,

automation results in reduced time and cost Based on a solvent-free sorption-desorption process SPME is a fused silica fiber coated with solid adsorbent Organic analytes absorb to the fiber, released by heating in GC port Combines extraction, concentration, and injection in one process

Solid Phase Microextraction (SPME)

34AnFar.S2-08

35AnFar.S2-08

36AnFar.S2-08

37AnFar.S2-08

KhromatografiHPLC, GC, TLC

SpektroskopiUV-Vis, Spektrofluorometri, IR, NMR, MS, AAS

ElektroforesisImmunoassay

EIA, ELISA, Western Blot, Soutern Blot,

Instrumen Bioanalisis

39

Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase)

Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase)

Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak

DKS-09

HPLC

40

Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram

Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak

Untuk analisis kualitatif digunakan informasi tR, sedangkan untuk analisis kuantitatif digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogram

DKS-09

HPLC

41

Metode hplc dipilih bila akan menganalisis senyawa dalam sampel:

- yang tercampur dengan matriks yang sangat komplek

- dengan kadar sangat kecil

Metode hplc dipilih bila akan menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)

DKS-09

HPLC

42

Senyawa polar:- terelusi belakangan (tR panjang)- semakin non-polar fase gerak, tR senyawa

polar makin panjang

Solven: - campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

Eluent strength: - dimodifikasi dengan n-heksanDKS-09

Normal-Phase HPLC[ Fase diam lebih polar dibanding fase

gerak ]

43

Senyawa polar: - terelusi lebih dahulu Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan

Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra- hidrofuran Eluent strength: - dimodifikasi dengan air

(Kellner dkk., 1998)

DKS-09

Reversed-Phase HPLCReversed-Phase HPLC[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]Reversed-Phase HPLC[ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ]

44DKS-09

HPLC

45DKS-09

wadah untuk sampel yang siap diinjeksikan[ jumlah kecil ]

46

Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor senyawa berkromofor)

Meningkatkan daya deteksinya (senyawa berkromofor UV senyawa berkromofor fluorescensi)

DKS-09

Tujuan Derivatisasi

metode pemisahan yang mendasarkan partisi cuplikan antara fase gerak dan fase diam

mempunyai kecepatan yang tetap dan aliran fase gerak ( gas ) sangat terkontrol,

sangat mudah terjadi pencampuran uap sampel ke dalam aliran fase gerak,

pemisahan fisik terjadi di dalam kolom yang jenisnya banyak sekali, panjang dan temperaturnya dapat diatur.

mempunyai banyak macam detektor yang dapat dipakai dan tanggap detektor (proporsional dengan jumlah tiap komponen yang keluar dari kolom),

kemudahan kromatografi gas yang digabungkan dengan instrumen fisiko kimia yang lainnya seperti GC-MS, GC-FTIR.

Gas Chromatography

DKS-09 48

DERIVATISASI

DKS-09 49

DERIVATISASI

Jenis Dasar Penggunaan Utama

Spektrofotometri UV-Vis

Perpindahan energi dari elektron luar yg terikat maupun tidak dlm molekul

Analisa biokimiawi kualitatif & kuantitatif secara rutin lewat uji kolorimetri, uji enzim dari kinetika reaksi

Spektrofluorometri Radiasi yang terserap dipancarkan lagi dalam gelombang yg lebih panjang

Analisis kuntitatif rutin, analisa enzim dan kinetika dan perubahan konformasi protein. Lebih peka dr Spek.UV-Vis

Spektrofotometri infra-merah (IR)

Vibrasi Atom karena perbedaan gerak dua kutub

Analisa kualitatif pengenalan molekul murni dengan ukuran sedang. Dipakai dlm penelitian.

TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI

Jenis Dasar Penggunaan Utama

Spektrofotometri Nyala (pancaran & serapan, AAS)

Perubahan energi dari elektron terluar suatu atom setelah penguapan menjadi nyala

Analisa kualitatif & kuantitatif untuk metal, biasanya dlm biokimiawi klinis.

Spektrometri magnet inti

Penentuan tenaga magnetis yang berhubungan dengan proton ganjil pada inti atom

Penelitian struktur molekul organik dengan berat molekul kurang dari 20.000 dalton

Spektrometri massa (MS)

Penentuan jumlah molekul dan pecahannya yang terionisasi bermuatan positif

Analisa kualitatif denagn bahan sedikit (10-4 – 10-6 g), dapat dihubungkan dengan GC.

TEKNIK-TEKNIK SPEKTROSKOPI

ELISA (Enzyme-linked immuno-sorbent assay)

antigens are immobilized on a solid support, either coated directly or through specific capture antibodies. Primary detection antibodies are then applied, forming a complex with the antigen. If conjugated with an enzyme, the detection antibody can directly be used to quantify the antigen, or can itself be quantified by another enzyme-conjugated secondary antibody

•DNASouthern Blot

•RNANorthen Blot

•PROTEINWestern Blot

Blotting

Terminologies..A Southern blot is a method routinely used in

molecular biology for detection of a specific DNA sequence in DNA samples.

The northern blot is a technique used in molecular biology research to study gene expression by detection of RNA.

The Western blot (alternatively, protein immunoblot) is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Southwestern blotting, based along the lines of Southern blotting (which was created by Edwin Southern) and first described by B. Bowen and colleagues in 1980, is a lab technique which involves identifying and characterizing DNA-binding proteins (proteins that bind to DNA).

..Western Blot

Kebutuhan metode yang cepat & biaya ekonomis.Pengetahuan dasar komposisi bahan yang akan

dianalisis sehingga dpt dipilih metode dan cara penyiapan yg tepat.

Tingkat ketelitian yang dikehendaki Jika metode yg singkat dan biaya rendah sdh cukup

memadai, tidak perlu melakukan metode yg rumit dg tingkat ketelitian yg tinggi.

Berapa banyak sampel yang tersedia Jika sampel sedikit, sulit didapat & mahal, maka

perlu dipilih metode yg mampu mendeteksi sampel yg sedikit

PEMILIHAN METODE BIOANALISIS

etBon COURAGE