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LUCIANA LIMA DE ARAÚJO RESTRIÇÃO ENERGÉTICA PERINATAL: EFEITO SOBRE O CRESCIMENTO SOMÁTICO E PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DE RATOS ADULTOS ALIMENTADOS COM DIETA PALATÁVEL/HIPERLIPÍDICA PÓS- DESMAME RECIFE 2012
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LUCIANA LIMA DE ARAÚJO
RESTRIÇÃO ENERGÉTICA PERINATAL: EFEITO
SOBRE O CRESCIMENTO SOMÁTICO E PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS DE RATOS ADULTOS ALIMENTADOS
COM DIETA PALATÁVEL/HIPERLIPÍDICA PÓS-
DESMAME
RECIFE
2012
LUCIANA LIMA DE ARAÚJO
RESTRIÇÃO ENERGÉTICA PERINATAL: EFEITO
SOBRE O CRESCIMENTO SOMÁTICO E PARÂMETROS
BIOQUÍMICOS DE RATOS ADULTOS ALIMENTADOS
COM DIETA PALATÁVEL/HIPERLIPÍDICA PÓS-
DESMAME
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Nutrição do
Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal de Pernambuco,
para obtenção do título de Mestre em
Nutrição.
Orientadora: Profa. Dr
a. Carol Góis
Leandro, professora adjunta do Núcleo
de Educação Física e Ciências do
Esporte do Centro Acadêmico de
Vitória da Universidade Federal de
Pernambuco.
Co-orientadora: Profa. Dr
a. Elizabeth
Nascimento, professora adjunta do
Departamento de Nutrição da
Universidade Federal de Pernambuco.
RECIFE
2012
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho especialmente ao meu filho Lucca que faz minha
vida renascer a cada dia. Amo muito você, filho!
Ao meu marido e companheiro Emerson que sempre segura minha mão
nos momentos mais difíceis. Você colore minha vida !!!
Aos meus pais, Neucile e Vilma por terem sempre possibilitado a
realização dos meus sonhos. Obrigada pela atenção e amor de sempre.
Vocês significam muito pra mim. Estão sempre comigo, mesmo quando
distante.
As minhas irmãs Marina e Marília, obrigada pelo companheirismo e
pelos incentivos.
Amo vocês de forma especial !!!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pelas oportunidades que me foram dadas na vida,
principalmente por ter colocado pessoas maravilhosas no meu convívio, mas
também por ter vivido fases difíceis, que foram matérias-primas de
aprendizado. Obrigada senhor por ter direcionado meus caminhos.
A minha orientadora Carol Leandro, pela paciência, compreensão e por
todos os incentivos ao longo da elaboração desse trabalho. Por acreditar que
conseguiríamos bons resultados, mesmo com todos os percalços do caminho.
Você me deu força quando estava fraca, alegria quando estava triste e vibrou
junto comigo quando as coisas deram certo. Você me ensinou que somos nós que
decidimos se queremos perder ou vencer, por que a melhor vitória é a que pode
existir dentro de nós mesmos. Você é incrível. Agradeço por sua amizade,
carinho e dedicação.
A minha co-orientadora Elizabeth Nascimento sempre muito atenciosa e
cuidadosa. Mesmo quando distante fez parte do meu aprendizado e contribuiu
para minha formação. Agradeço pela amizade e por ter compartilhado suas
experiências e conhecimentos. Você parece bastante com meu pai. Durona,
perfeccionista e de um coração imenso. Muito obrigada por tudo. Obrigada
mesmo!!
Ao prof. Raul Manhães sempre presente e disposto a ajudar. Obrigada
por ter participado dessa etapa importante em minha vida e bem do fundo do
coração, obrigada pela amizade, ela vale mais que tudo. Você é especial.
Aos meus amigos de laboratório José Antônio, Adriano Bento, Amanda
Marcelino, Gisélia Muniz, Maria Cláudia e Taisy Ferro que compartilharam as
alegrias e dificuldades, estando sempre presentes, formando uma corrente de
boas energias. Vocês foram essenciais em minha jornada. Obrigada por tudo.
Aos meus estagiários Ana Karla e Luiz Bonner que contribuíram para
realização das atividades e colocaram um toque especial a pesquisa através de
suas dúvidas e indagações. Foi muito bom crescer com vocês.
A todos que fazem parte da pós-graduação que contribuíram direta ou
indiretamente para realização desse trabalho. Muito obrigada.
Ao grupo NNI - “Tudo faz crer que, no futuro, realizações
significativas e duradouras virão, não de pessoas extraordinárias, mas de
extraordinárias combinações de pessoas que aprendem a pensar e trabalhar
juntas” (Victor Mirshawka). Desejo muitas vitórias para o grupo. Obrigada
pelos ensinamentos.
“Se você quiser alguém em quem confiar
Confia em si mesmo
Quem acredita, sempre alcança”
(Flávio Venturine)
RESUMO
No presente estudo foram avaliadas as repercussões do consumo de dieta hipocalórica
durante a vida perinatal sobre parâmetros de crescimento somático e bioquímicos de
ratos alimentados ou não com dieta palatável-hiperlipídica do desmame a idade adulta.
Ratas Wistar nulíparas quando confirmada a gestação, formaram dois grupos conforme
a manipulação dietética (n=6/cada): Controle (CL, recebeu dieta normocalórica durante
gestação e lactação [3.6 Kcal/g]) e hipocalórica (HL recebeu dieta hipocalórica durante a
gestação e lactação [2,3 Kcal/g]). Registro de peso e consumo foi acompanhado nas
mães. Ao nascimento, ninhadas foram ajustadas para 8 filhotes mantendo a proporção
de 4:4 (machos:fêmeas) sempre que possível. Ao desmame os machos passaram a
receber dieta padrão Labina® (3,6 Kcal/g) formando os grupos Controle (C+CP, n:12) e
Hipocalórico (H+CP, n:14) ou dieta palatável-hiperlipídica (4,2 Kcal/g) formando os
grupos Controle-Palatável (C+HLP, n:11) e Hipocalórico-Palatável (H+HLP, n:9).
Registro do crescimento somático foi realizado do nascimento aos 120 dias de vida.
Teste de tolerância à glicose (ΔG) foi realizado aos 60, 90 e 120 dias e ao final do
experimento, órgãos foram pesados e o plasma coletado para dosagens bioquímicas. Na
vida adulta, a ingestão alimentar foi registrada durante 10 dias a partir do 110º dias de
vida. Condições padrão de biotério foram mantidas por todo experimento e água e ração
foi ofertada à vontade. A dieta hipocalórica oferecida às mães na gestação e lactação
não alterou o peso, consumo ou variação de peso das mesmas. Igualmente, medidas de
peso e comprimento corporal não diferiram nos filhotes ao nascimento. No entanto, ao
longo da lactação, algumas medidas de crescimento mostraram-se reduzidas nos filhotes
hipocalóricos como peso corporal (CL, 49,99±2,12g; HL, 38,90±3,22g (P<0,001) e
comprimento naso-anal (CL, 117,28±4,38cm; HL, 109,81 ± 2,71cm) (p<0.001). Os
animais que consumiram dieta palatável-hiperlipídica no pós desmame tiveram maior %
de ganho ponderal e isto foi acompanhado por maior deposição de gordura abdominal e
intolerância a glicose, sendo ainda acentuado no grupo que sofreu restrição energética
no período perinatal. O uso de dieta palatável-hiperlipídica pós desmame também
elevou as taxas de triglicérides e colesterol em ambos os grupos na idade adulta, sendo
o VLDL-colesterol mais pronunciado no grupo H+HLP (38,10 ± 3,031 mg/dL-1
) vs
C+HLP (23,34 ± 2,86 mg/dL-1
) (p<0.001) e hipertrigliceridemia em H+HLP (190,54 ±
15,15 mg/dL-1
) visto que este diferiu de C+HLP (116,68 ± 12,25 mg/dL-1
) (p<0.001). Os
resultados demonstram que a restrição de energia no período fetal e neonatal acarreta
danos ao desenvolvimento somático com repercussões na vida adulta afetando medidas
murinométricas indicadoras de sobrepeso. O uso da dieta palatável pós-desmame
alterou o peso relativo de órgãos e mesmo os grupos apresentando menor consumo,
houve maior armazenamento de gordura abdominal. Igualmente causou alterações no
perfil glico-lipídico com maior agravo no grupo H+HLP em determinados parâmetros.
Pode-se inferir portanto, que a restrição energética na vida perinatal pode acarretar
efeitos mais deletérios em longo prazo quando esta for seguida de uma dieta
desequilibrada nas proporções de macronutrientes.
Palavras-chave: Desnutrição, gestação, lactação, dieta hiperlipídica, obesidade, ratos.
ABSTRACT
The present study evaluated the repercussions of a hypocaloric diet during perinatal life
on somatic growth and biochemical parameters in rats fed a palatable hyperlipid diet
from weaning to adulthood. Nulliparous female Wistar rats with confirmed pregnancy
were divided into two groups (n=6/each) based on diet received during gestation and
lactation: Control (CL), receiving a normal caloric diet (3.6 Kcal/g); and hypocaloric
(HL), receiving a low-energy diet (2.3 Kcal/g). Weight and food intake of mothers were
monitored to determine possible alterations. Upon birth, the offspring were adjusted to
eight pups, maintaining a male to female proportion of 4:4. At weaning, males received
either a standard Labina® diet (3.6 Kcal/g), forming a control group (C+CP, n:12) and
hypocaloric group (C+HP, n:14), or a palatable hyperlipid diet (4.2 Kcal/g), forming a
palatable control group (C+HLP, n:11) and a hypocaloric-palatable group (H+HLP, n:9).
Water nd chow were offered ad libitum. Somatic growth was recorded from birth to 120
days of life. The glucose tolerance test (ΔG) was performed at 60, 90 and 120 days. In
adulthood, food intake was recorded during ten days beginning at 108 days of life. At
the end of the experiment, the organs were weighed and plasma was collected for
biochemical analysis. The low-energy diet offered to the mothers during gestation and
lactation did not alter the body weight, food intake or gain of body weight of these
animals. Likewise, body weight and length at birth did not differ among the pups.
However, throughout lactation, some growth measures were reduced in the low-energy
pups, such as body weight (CL: 49.99±2.12g; HL: 38.90±3.22g (p<0.001) and nose-to-
anus length (CL: 117.28±4.38cm; HL: 109.81±2.71cm) (p<0.001). The animals that
consumed the palatable hyperlipid diet after weaning had a greater percentage of body
weight gain, which was accompanied by a greater deposition of abdominal fat and
glucose intolerance; these findings were more accentuated in the group submitted to
low-energy diet in the perinatal period. The use of the palatable hyperlipid diet after
weaning also raised the levels of triglycerides and cholesterol in both groups in
adulthood, with VLDL cholesterol (38.10±3.031 mg/dL-1
vs. 23.34±2.86 mg/dL-1
)
(p<0.001) and hypertriglyceridemia (190.54±15.15 mg/dL-1
vs. 116.68±12.25 mg/dL-1
)
(p<0.001) more pronounced in the H+HLP group in comparison to the C+HLP group.
The results demonstrate that energy restriction in the fetal and neonatal period had a
negative effect on somatic development, with repercussions in adulthood, affecting
measures of overweight in rats. The use of the palatable post-weaning diet altered the
relative weight of the organs. Moreover, greater abdominal fat storage was found even
in groups with lower food intake. This diet also caused changes in the glucose/lipid
profile, with a greater impact in the H+HLP group regarding particular parameters. It is
possible to infer that energy restriction in perinatal life can have more harmful long-
term effects when followed by an imbalanced diet with regard to the proportions of
macronutrients.
Keywords: Malnutrition, pregnancy, lactation, high-fat diet, obesity, rats
SUMÁRIO
1. APRESENTAÇÃO................................................................................................... 11
2. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................ 15
Artigo 1: Desnutrição perinatal versus obesidade na vida adulta: papel da
alimentação ocidental..................................................................................................
15
15
3. OBJETIVOS............................................................................................................. 32
4. HIPOTÉSE............................................................................................................... 34
5. MATERIAS E MÉTODOS...................................................................................... 36
5.1 Animais e tratamento........................................................................................ 37
5.2 Composições das dietas.................................................................................... 37
5.3 Avaliações em gestantes e lactantes................................................................. 39
5.4 Avaliações murinométricas na prole................................................................ 39
5.4.1 Peso corporal................................................................................................. 39
5.4.2 Eixos Látero-lateral do crânio e ântero-posterior do crânio.......................... 40
5.4.3 Eixo longitudinal do corpo e comprimento da cauda.................................... 40
5.5 Teste de tolerância à glicose............................................................................. 41
5.6 Consumo alimentar........................................................................................... 41
5.7 Pesagens de órgãos e gordura visceral............................................................. 41
5.8 Dosagens bioquímicas...................................................................................... 42
5.9 Análises estatística............................................................................................ 43
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 46
Artigo 2: Hyperlipidic diet during growth maximizes the adverse effects of a
perinatal low-energy diet on plasma glucose/lipids profile in adult offspring..……..
45
45
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................... 66
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 68
ANEXOS...................................................................................................................... 70
__________________ APRESENTAÇÃO
1. APRESENTAÇÃO
______________________________________________________________________
Estudos experimentais e epidemiológicos demonstram que doenças do adulto podem
ser resultantes de insultos do ambiente intrauterino ou pós-natal. Um estímulo ambiental
durante o período crítico de desenvolvimento pode ter efeito subsequente sobre
estruturas e funções de sistemas orgânicos, conduzindo a um aumento da
susceptibilidade a doenças na vida adulta, tais como obesidade e patologias associadas
(hipertensão, intolerância à glicose, diabetes tipo II, hipercolesterolemia e
hiperinsulinemia). A obesidade é uma patologia que tem crescido até mesmo nos países
em desenvolvimento e configura atualmente como um dos maiores problemas mundial
de saúde pública. No Brasil estudos transversais têm evidenciado transição nutricional e
epidemiológica com declínio da desnutrição e aumento acelerado da obesidade,
afetando inclusive populações jovens de diversas regiões. Concomitante a este
fenômeno, pesquisas de abrangência regional e nacional apontam relevantes mudanças
nos hábitos alimentares da população. As gorduras saturadas, os açúcares simples e os
alimentos industrializados com elevado teor de sódio figuram entre estas alterações.
Evidências experimentais fornecem dados importantes para a identificação dos
processos fisiopatológicos envolvidos no surgimento de doenças crônicas com origem
na infância. Esses dados apontam uma marcante e duradoura participação da nutrição
materna sobre o processo saúde-doença no decorrer da vida. O aporte nutricional
materno inadequado, tanto a falta quanto o excesso de nutrientes, configura como uma
importante alteração ambiental e acarreta modificações metabólicas favorecendo o
surgimento de patologias na idade adulta.
A hipótese do fenótipo “poupador” é fortemente utilizada para interpretar a elevação
da obesidade identificada em diversas populações em desenvolvimento. A privação
nutricional ocorrida durante períodos de elevada diferenciação celular leva o organismo
a adaptações metabólicas, a fim de favorecer a sobrevivência em períodos de “fome”.
Na sociedade ocidental moderna o acesso facilitado a alimentos hiperlipídicos repercute
de forma negativa sobre essas adaptações prévias. Portanto, predispõe o indivíduo a
doenças, como resultante de uma dificuldade de ajuste metabólico em função da
abundância nutricional.
A desnutrição experimental em animais é frequentemente induzida por manipulação
dietética através de modelos de dieta hipoprotéica ou através da restrição de oferta
alimentar. Esses modelos, apesar de consolidados diferem em inúmeros desenhos
metodológicos e nutricionais. O modelo de restrição por acesso limitado à ração
reproduz com mais aproximação à realidade de desnutrição verificada em humanos,
visto que esta é energética ou energética-protéica. No entanto, acarreta estresse
adicional devido os períodos de ausência alimentar e ocasiona distúrbios na expressão
circadiana de genes associados ao metabolismo glicídico e lipídico, bem como o ritmo
do comportamento alimentar.
A restrição de energia na dieta tem sido verificada entre grupos de gestantes, e por
vezes, lactantes, proporcionando o consumo de alimentos de baixo valor energético e de
elevado teor de fibras com o objetivo de evitar ganho ponderal excessivo ou de reduzir
rapidamente o peso corporal pós-natal. Contudo, poucos relatos foram documentados
acerca da adoção desse tipo de conduta sobre a repercussão nos descendentes em curto e
longo prazo.
Por fim, o presente estudo propôs um novo modelo de indução de restrição
energética com base numa dieta hipocalórica sem restrição quantitativa, tentando evitar
o estresse adicional da falta de alimento. O modelo se assemelha aos utilizados na
restrição alimentar em animais, exceto pela oferta ad libitum da ração. Possui também
maior proporção de fibra alimentar e equilibrada distribuição de macronutrientes e
micronutrientes em relação ao valor energético da dieta. O acréscimo de fibra tentou
mimetizar dietas realizadas por grupos de gestantes/lactantes e, por conseguinte o valor
energético da mesma. Em adição, foi utilizada em ratos pós-desmame uma dieta
palatável-hiperlipídica, caracterizada como uma dieta ocidentalizada a fim de reproduzir
a alimentação da atual sociedade ocidental. Sua composição incluiu maior quantidade
de carboidratos simples, gorduras saturadas e sódio. Todos esses componentes em
excesso são associados aos mecanismos envolvidos na sinalização de eventos
metabólicos relacionados à obesidade e síndrome metabólica.
Dessa forma, poucos estudos foram feitos avaliando as repercussões da desnutrição
energética sem restrição quantitativa alimentar, bem como da utilização a posteriori de
dieta palatável-hiperlipídica sobre parâmetros do crescimento e desenvolvimento assim
como indicadores de alteração metabólica na vida adulta. Diante do exposto, a presente
dissertação intitulada Restrição energética perinatal: efeito sobre o crescimento
somático e parâmetros bioquímicos de ratos adultos alimentados com dieta palatável-
hiperlipídica pós-desmame, teve como objetivo avaliar se o consumo de dieta
palatável-hiperlipídica do desmame a idade adulta é capaz de potencializar o surgimento
de alterações no crescimento somático e no perfil bioquímico de ratos previamente
submetidos à desnutrição calórica durante período perinatal.
A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Fisiologia da Nutrição Dra.
Naide Teodósio do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco,
tendo como orientadores a Profa. Dr
a. Carol Virgínia Góis Leandro e a Prof
a. Dr
a.
Elizabeth do Nascimento. O modelo de dieta hipocalórica e de dieta palatável com
características da alimentação ocidental foi desenvolvido pela profa. Elizabeth do
Nascimento no Laboratório de Nutrição Experimental e Dietética.
O estudo está apresentado sob a forma de dois artigos que serão submetidos a
revistas científicas para apreciação e subsequente publicação. O primeiro se refere a
uma revisão e está intitulado: “Desnutrição perinatal versus obesidade na vida adulta:
papel da dieta ocidental” e será submetido para publicação na Revista de Nutrição da
PUCCAMP. Esta revista é classificada com qualis B4 no comitê de Medicina II da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O segundo
artigo é original, apresenta os resultados da pesquisa e foi intitulado: “Hyperlipidic diet
during growth maximizes the adverse effects of a perinatal low-energy diet on plasma
glucose/lipids profile in adult offspring” e deve ser submetido para publicação na
revista Nutrition. Esta revista é classificada com qualis A2 no comitê de Medicina II da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Esta pesquisa recebeu aprovação da Comissão de Ética em Animais de
Experimentação sob processo n° 23076.048926/210-88. Sua realização poderá trazer
contribuições que elucidem se indivíduos expostos a déficits energéticos ou nutricionais
no início da vida podem ser ou não igualmente predispostos ao desenvolvimento de
doenças metabólicas na vida adulta independente da proporção de nutrientes da dieta
consumida. A verificação dessas repercussões pode colaborar com adoção de diretrizes
nutricionais que visam reduzir o risco de doenças crônicas associadas a hábitos
alimentares inadequados.
__________ REVISÃO DE LITERATURA
2.0 REVISÃO DE LITERATURA - ARTIGO DE REVISÃO
______________________________________________________________________
Título: Desnutrição perinatal versus obesidade na vida adulta: papel da
alimentação ocidental
Title: Perinatal undernutrition versus obesity in adult life: the role of ocidental
feed
Autores:
Luciana Lima-Araújo1, Elizabeth Nascimento
1, Carol Góis Leandro
2
1 Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil
2 Departamento de Educação Física e Ciências do Esporte, Centro Acadêmico de
Vitória, Universidade Federal de Pernambuco, Brasil
Contribuição dos autores:
Luciana Lima de Araujo, Elizabeth Nascimento:Consulta a base de dados
Luciana Lima de Araujo, Elizabeth Nascimento: Escrita e revisão do artigo
Carol Góis Leandro, Elizabeth Nascimento: Revisão final do artigo
Endereço para correspondência:
Carol Góis Leandro
Núcleo de Educação Física e Ciências do Esporte – CAV/UFPE
Rua Alto do Reservatório, s/n – CEP: 55608-680 - Bela Vista, Vitória de Santo Antão,
PE – Brasil.
Fone/Fax: (00 55 81) 35233351
E-mail: [email protected]
RESUMO
A nutrição materna tem sido enfatizada por diversos estudos pela crescente
prevalência dos seus distúrbios, e suas implicações para a saúde do indivíduo ao longo
da vida, particularmente, em relação às doenças crônicas não transmissíveis. O objetivo
da presente revisão foi discutir a importância da nutrição materno-fetal e sua relação
com o surgimento de alterações metabólicas ao longo da vida a partir da influência de
um padrão de consumo alimentar ocidental. O levantamento bibliográfico utilizou as
bases de dados Medline, Pubmed, Lilacs e Bireme e os artigos foram selecionados de
acordo com a relevância do estudo. A privação nutricional quando ocorrida em períodos
críticos de desenvolvimento resulta em adaptações metabólicas favoráveis a
sobrevivência do concepto. As adaptações metabólicas existentes no ambiente de
privação nutricional e/ou energética provoca modificações na morfologia e fisiologia de
vários órgãos e sistemas, assegurando sua sobrevivência em um ambiente hostil. Essas
adaptações tornam-se desfavoráveis quando em ambiente de abundância nutricional,
facilitando a instalação de desordens metabólicas que resultam em eventos patológicos.
Portanto, esta revisão apresenta as proporções desses eventos no desencadeamento do
excesso de peso/obesidade, bem como, de mudanças metabólicas favoráveis ao
surgimento de quadros de doenças crônicas não transmissíveis.
Termos de indexação: Desnutrição, plasticidade durante o desenvolvimento, Gestação,
Lactação, Dieta hipocalórica, Dieta palatável, Obesidade.
ABSTRACT
______________________________________________________________________
Maternal nutrition has been emphasized in a number of studies due to the growing
prevalence of nutritional disorders and the implications for health throughout life,
particularly with regard to chronic non-transmittable diseases. The aim of the present
review was to discuss the importance of maternal-fetal nutrition and its association with
the emergence of metabolic problems throughout life due to the influence of western
eating patterns. A bibliographic survey was carried out using the Medline, Pubmed,
Lilacs and Bireme databases, in which papers were selected based on their relevance to
the study. When occurring in critical periods of development, gestation and lactation,
nutritional and/or energy deprivation induces metabolic adaptations that lead to changes
in the morphology and physiology of different organs and systems, thereby favoring the
survival of the fetus in a hostile environment. However, these adaptations become
unfavorable in an environment of nutritional abundance, favoring the emergence of
metabolic disorders that result in pathologic events. Such events are mainly investigated
in animal models, although initially observed in epidemiological studies. The present
review discusses the proportions of these events in triggering excess weight and obesity
as well as metabolic changes that favor the emergence of non-transmittable chronic
diseases.
Indexing terms: Malnutrition, developmental plasticity, Gestation, Lactation,
Hypocaloric diet, Palatable diet, Obesity
INTRODUÇÃO
A nutrição materna tem sido enfatizada por diversos estudos pela crescente
prevalência dos seus distúrbios, assim como pela importância em implicações para a
saúde do indivíduo ao longo de sua vida, particularmente, em relação às doenças
crônicas não transmissíveis (1, 2)
. Períodos de intenso crescimento e desenvolvimento
como gestação e lactação são altamente sensíveis a agressões ambientais, a exemplo,
das nutricionais. Estes insultos trazem repercussões à saúde, em curto e longo prazo,
podendo aumentar a predisposição do indivíduo em desenvolver doenças como
obesidade, intolerância a glicose, diabetes tipo II (1)
e dislipidemia (3)
.
Na fase intrauterina, o feto interage dinamicamente com o meio a fim de adquirir
vantagens de sobrevivência. Em condições de privação nutricional e/ou energética, o
organismo fetal sofre ajustes metabólicos que permitem sua sobrevivência em um meio
escasso, programando-o para viver em um ambiente de baixa oferta nutricional (4)
. O
acesso ilimitado a alimentos, característico da sociedade ocidental, tornam as
adaptações negativas (5)
, contribuindo para o surgimento de obesidade na idade adulta.
Este episódio advém da dificuldade de ajuste em um meio de abundância nutricional
para o qual o indivíduo não estava programado (6, 7)
. Dietas palatáveis tentam reproduzir
o padrão dietético ocidental e são amplamente utilizadas em estudos experimentais para
reprodução de obesidade e de alterações metabólicas (8)
.
Com base neste panorama, o objetivo do presente estudo foi realizar uma revisão da
literatura acerca da importância da nutrição materno-fetal, sua relação com o surgimento
de alterações metabólicas no decorrer da vida, bem como as consequências do padrão de
consumo alimentar ocidental no desencadeamento da obesidade e alterações
metabólicas correlatas.
O presente estudo se deu com base em levantamento bibliográfico, utilizando-se as
bases de dados Medline, Pubmed, Lilacs e Bireme durante os períodos de agosto de
2011 a fevereiro de 2012. Os termos de indexação utilizados foram: malnutrition, fetal
programming, gestation, lactation, hypocaloric diet, palatable diet e obesity. Os
artigos foram selecionados de acordo com a relevância do estudo.
Importância da Nutrição Materna Perinatal
O período de formação fetal constitui um estado dinâmico, no qual uma série de
adaptações do metabolismo materno se processa no sentido de sustentar o crescimento e
desenvolvimento do feto, mantendo ao mesmo tempo a homeostase orgânica (9)
. O
desenvolvimento fetal é modulado por fatores genéticos, placentários, nutricionais e
hormonais que interagem de maneira sinérgica e estão intimamente ligados às condições
nutricionais maternas (10, 11)
. A limitação do substrato nutricional pode acarretar
hipoxemia e prejudicar o crescimento feto-placentário (11)
através de mecanismos que
ainda despertam interesse, servindo de questionamento, ainda, para diversos estudos.
A nutrição materna desempenha papel importante no fornecimento de substratos
necessários a formação de tecidos materno-fetais (9)
estando diretamente relacionada
com o crescimento e desenvolvimento dos conceptos (12)
. O aporte de nutrientes também
favorece a síntese adequada de hormônios responsáveis pela reestruturação orgânica e
alterações metabólicas que irão apoiar o estado gravídico (9, 11)
e a formação de estoques
nutricionais fundamentais para o fornecimento da elevada demanda energética do
período seguinte de lactação (13)
.
Os hormônios maternos e placentários afetam direta ou indiretamente, a captação e
transferência placentária de nutrientes e, consequentemente, podem induzir uma
resposta fetal mediada pela quantidade de glicose e aminoácidos transportados para o
feto, levando a distúrbios de crescimento (11, 14)
. Os períodos da gestação e lactação são
considerados, portanto, períodos críticos do desenvolvimento (15)
. Estes se caracterizam
pela elevada plasticidade celular e susceptibilidade a interferências de diversos fatores
ambientais (15)
. Dentre esses fatores, a alimentação/nutrição figura como um dos mais
importantes (16)
por interferir em aspectos básicos de desenvolvimento tecidual,
necessários para a estrutura e crescimento celular (citogênese e histogênese) (15)
, ou
ainda por modular alterações permanentes da expressão genética afetando até mesmo
gerações futuras (17)
.
Nos países em desenvolvimento a desnutrição crônica ainda é um dos principais
problemas de saúde causando prejuízos por vezes irreversíveis ao desenvolvimento
orgânico ou mesmo elevando os índices de morbimortalidade em diversas populações
(18), com repercussões a curto e longo prazo que predispõe o indivíduo a patologias na
idade adulta (1, 19, 20)
.
De acordo com dados fornecidos pelo Subsistema de Informação sobre Nascido
Vivo (SISNAC) 8,2% dos nascidos vivos no Brasil no ano de 2004 foram de baixo peso
ao nascer (BPN) (21)
. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), nos países
desenvolvidos cerca de dois terços dos recém-nascidos de baixo peso é prematuro,
enquanto um terço é pequeno para idade gestacional. Porém, nos países em
desenvolvimento a relação se inverte de forma que aproximadamente 75% dos recém-
nascidos de BPN são pequenos para a idade gestacional (22)
. Nesses países, o BPN
quase sempre está fortemente associado às condições de pobreza, má nutrição crônica
materna e consumo alimentar insuficiente (23)
.
Distúrbios Nutricionais Perinatais e Consequências à Saúde
As consequências da desnutrição dependem de fatores como duração, período e
intensidade do insulto nutricional (15)
que irão definir a gravidade das modificações.
Mecanismos de adaptação do feto à falta de nutrientes e de oxigênio incluem
redistribuição do fluxo sanguíneo, redução da utilização de glicose e redução da
velocidade de divisão celular, o que afeta principalmente os tecidos que atravessam o
período crítico de desenvolvimento (24)
. Outras consequências incluem modificações no
padrão da secreção hormonal, na distribuição dos vários tipos de células e,
consequentemente, na estrutura de órgãos. Alterações no comportamento metabólico,
limitando o desenvolvimento de tecidos como o músculo, pâncreas e rins também
ocorrem em função de poupar órgãos nobres como o cérebro e coração, a exemplo de
direcionar o suprimento de glicose para os mesmos (24, 25)
.
Essas adaptações têm papel determinante para sobrevivência (26)
, mas podem
conduzir a alterações permanentes em diversos órgãos e sistemas programando funções
metabólicas (27)
que na idade adulta estão associadas ao surgimento de patologias
crônicas (28-30)
. O termo plasticidade durante o desenvolvimento é utilizado atualmente
para descrever o fenômeno pelo qual um estímulo ocorrido durante o período crítico de
desenvolvimento tem efeito subsequente sobre estruturas e funções orgânicas,
interferindo inclusive sobre o comportamento alimentar. Estudos experimentais e
epidemiológicos tem evidenciado a associação entre baixo peso ao nascer e o
surgimento de doenças crônicas na idade adulta, sobretudo obesidade (19)
e doenças
correlatas, tais como dislipidemia (3)
resistência à insulina e diabetes tipo II (31, 32)
.
Segundo Barker et al. (2009) (33)
, os indivíduos com BPN estão mais vulneráveis às
doenças tardias, essencialmente através de três processos: maior resistência à insulina;
menor capacidade funcional de órgãos chave como o rim e o pâncreas; maior
sensibilidade a condições adversas in útero, que determinam as respostas a posteriores
influências ambientais (34)
.
Modificações resultantes da privação nutricional ocorridas no músculo esquelético
desempenham papel importante para o surgimento de patologias na idade adulta, tais
como resistência à insulina, haja vista a dependência deste tecido à ação da insulina (35)
.
Estas modificações ocorrem, sobretudo quando a desnutrição acontece no período final
da gestação (36)
, pois provavelmente, o maior desenvolvimento do tecido muscular
ocorre nesta fase (37)
. Segundo Loss et al. (2001) (38)
, fatores adversos intrauterinos
podem programar a composição de massa magra, independentemente da influência
genética, determinando déficit em massa magra (39-41)
ou influenciando na composição
das fibras musculares (42)
. Igualmente se associa com a redução da expressão de
receptores GLUT4 e de proteínas sinalizadoras da ação intracelular da insulina no
músculo (43, 44)
.
O tecido adiposo também desempenha papel determinante, visto que indivíduos de
BPN apresentam rápido ganho ponderal pós-natal à custa de massa gorda,
essencialmente de distribuição central (45)
, de forma que a redução da massa muscular
parece contribuir para este processo. Após o nascimento, a sensibilidade à insulina e o
número de receptores no tecido adiposo podem estar aumentados, o que também poderá
contribuir para este rápido ganho de peso (46)
, resistência a insulina (47)
e hiperglicemia.
Adicionalmente estudos em animais que sofreram retardo de crescimento
intrauterino também demonstram uma maior produção de glicose hepática, devido a
alteração em níveis de enzimas favoráveis ao processo de gliconeogênese e diminuição
de enzimas relacionadas ao processo de glicólise. Esta maior produção contribui para o
aumento da resistência a insulina e hiperglicemia plasmática (48)
.
Durante a privação nutricional o feto interage dinamicamente com o meio, a fim de
adquirir vantagens de sobrevivência para o futuro. O intercâmbio com os sinais
maternos prevê o ambiente no qual crescerá, sendo então programado para sobreviver
em ambiente de baixa oferta nutricional(4)
. Singhal Além da insuficiência, o excesso de
nutrientes consumido durante o período perinatal também pode contribuir para o risco
aumentado de obesidade na idade adulta (50)
. Segundo Luo et al., (2006) (51)
e Davidge
et al., (2008) (52)
, a alimentação inadequada acarreta maior vulnerabilidade a danos
oxidativos, levando a uma redução no estado redox dos tecidos fetais susceptíveis,
conduzindo ao estresse oxidativo. O estresse oxidativo pode atuar diretamente através
da modulação da expressão gênica ou indiretamente através dos efeitos adversos na
oxidação de proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, resultando em uma queda da
produção energética mitocondrial. Os períodos pré e pós-natal correspondem à janela
temporal crítica da programação adversa provocada pelo estresse oxidativo (51)
.
Desequilíbrio Nutricional e Incremento da Obesidade
A obesidade é um problema mundial de saúde pública cuja prevalência vem
aumentando até mesmo nos países em desenvolvimento (53, 54)
e em populações jovens
(55, 56). É uma condição multifatorial, em que fatores ambientais, genéticos e biológicos
atuam conjuntamente para o seu surgimento (57)
. A associação entre desnutrição
perinatal e aumento do risco de apresentar obesidade na idade adulta (58)
seja em
humanos ou em animais, vem se consolidando como uma relação de causa e efeito haja
vista os inúmeros trabalhos publicados sobre o tema.
Dentre os sistemas que sofrem influência da desnutrição perinatal figura o
músculo esquelético, que se destaca por representar o tecido de maior contribuição no
peso corporal total, assumindo importante papel modulador na captação de glicose
sanguinea. Além de alterações ocorridas no múculo esquelético, o tecido adiposo
também parece sofrer importantes mudanças no seu metabolismo decorrente da falta de
nutrientes/energia no período perinatal. Neste contexto destaca-se o acelerado ganho de
peso que ocorre em organismos que sofreram carência nutricional e/ou energética na
vida perinatal, resultante de adaptações, a exemplo, supressão da termogênese
programada in útero, em resposta à restrição nutricional (47)
. Este rápido aumento de
incorporação de massa corporal é conhecido como catch-up pós-natal e se caracteriza
predominantemente por aumento de massa gorda, essencialmente de distribuição central
(59-61), que precede alterações metabólicas, tais como a resistência à insulina
(62) e
dislipidemia (3)
. Em adultos com BPN, encontraram-se associações positivas entre os
níveis de insulina e gordura visceral (63)
, o que não se verificou com a gordura
subcutânea (64)
.
A nutrição materna também pode exercer influência no comportamento
alimentar da prole (65, 66)
. Bellinger et al., (2006) mostraram que ratos submetidos à
desnutrição protéica no período fetal apresentaram alterações no comportamento
alimentar aos 18 meses de idade resultando em obesidade (67)
. Bellinger et al., (2009)
observou hiperfagia em ratos alimentados com dita hiperlipídica previamente afetados
por desnutrição protéica fetal. Palou et al., 2011 (68)
também observou hiperfagia em
animais adultos que sofreram desnutrição energética durante o período da lactação e
posteriormente foram alimentados com dieta hiperlipídica.
Menor atividade anorexígena tem sido relatada em ratos desnutridos durante os
períodos críticos de desenvolvimento, levando a um estado de hiperfagia na idade adulta
(67). Estudos têm evidenciado diminuição da ação da leptina
(65), insulina
(69), serotonina
(70) e uma diminuída expressão gênica dos neurônios anorexígenos POMC
(propiomelanorcotina) (65)
, além do aumento para neurônios NPY (71)
.
Adicionalmente há relatos que alimentos palatáveis são capazes de promover
alterações metabólicas relacionadas às moléculas que expressam os sinais de fome e
saciedade, trazendo alterações na razão fisiológica das moléculas
orexígenas/anorexígenas que se relacionam com a utilização de glicose, oxidação dos
ácidos graxos, gasto energético, além do mecanismo de saciedade (72)
. Neste contexto a
dieta palatável-hiperlipídica é bastante utilizada para reprodução de modelos
experimentais de obesidade(71)
.
Estudo realizado por Duarte et al., (2006) (73)
demonstrou que ratos submetidos
à dieta hiperlipídica palatável, apresentam a partir de três semanas aumento na
quantidade tecidos adiposos retroperitoneal (RET) e epididimal (EPI) e tendência a
distúrbios de perfil lipídico (73, 74)
. Essas alterações podem explicar em parte a
interferência dos alimentos palatáveis na regulação do apetite e ingestão alimentar,
contribuindo para o crescimento na obesidade. Segundo Krechowec et al., (2006) (75)
em filhotes desnutridos quando expostos a uma dieta hiperlipídica durante a vida pós-
natal observa-se amplificação da obesidade, hiperleptinemia e resistência a insulina.
Em meados dos anos 70 (século XX), países em desenvolvimento, a exemplo, o
Brasil, demostravam elevados índices de desnutrição infantil, porém hoje se detecta
altas prevalências de sobrepeso/obesidade em todas as faixas etárias. Dados
comparativos de estudos transversais ocorridos nas décadas de 70, 80, 90 (76)
e mais
recentemente na Pesquisa de Orçamento Familiar (POF 2008/2009) (77)
demonstram
transição nutricional referenciada no declínio rápido da prevalência de desnutrição em
crianças e elevação, em ritmo mais acelerado, da prevalência de sobrepeso/obesidade
em adultos (76)
. Em crianças, durante o período de 1980 e 2000, estima-se que a
prevalência de sobrepeso e obesidade aumentou até 5 vezes nos países desenvolvidos e
até 4 vezes naqueles em desenvolvimento (78)
. No, EUA 10% das crianças pré-escolares
são obesas (79)
. No Brasil, a proporção de crianças e adolescentes com excesso de peso
também cresceu de aproximadamente 4,1% nos anos de 1974/1975 para 13,9% nos anos
de 1996/1997 (80)
. O sobrepeso e a obesidade são encontrados com grande frequência, a
partir de 5 anos de idade, em todos os grupos de renda e em todas as regiões brasileiras
(77). Em 2009, uma em cada três criança de 5 a 9 anos estava acima do peso
recomendado pela Organização Mundial de Saúde (77)
.
Em conjunto, podemos observar que tanto a desnutrição perinatal quanto o
desequilíbrio dos nutrientes na dieta possuem importante parcela de contribuição no
recrudescimento do aumento de peso corporal e das desordens metabólicas correlatas,
contribuindo para elevada prevalência da obesidade mundial.
CONCLUSÃO
A privação nutricional ocorrida durante os períodos da gestação e lactação
provoca adaptações/modificações na morfologia e fisiologia de vários órgãos e
sistemas, a fim de assegurar a sobrevivência, mas a exposição na vida pós-natal a
alimentos ricos em lipídios facilita a instalação destas alterações e favorecem o
surgimento de doenças crônicas.
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_____________________ OBJETIVOS
3. OBJETIVOS
______________________________________________________________________
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar em ratos adultos submetidos a uma restrição energética durante período
perinatal, as repercussões do consumo a posteriori de dieta palatável-
hiperlipídica sobre padrões de crescimento somático e bioquímicos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar nas mães:
Ganho ponderal
Consumo alimentar
Consumo energético
Avaliar nos filhotes do nascimento à idade adulta:
Indicadores de crescimento e desenvolvimento somático
Avaliar nos filhotes na idade adulta:
Tolerância à glicose
Consumo alimentar
Consumo energético
Níveis plasmáticos de glicose, colesterol total, LDL-colesterol, HDL-colesterol e
triglicerídeos
Peso de órgãos
Peso da gordura retroperitoneal e epididimal
_____________________ HIPÓTESES
4. HIPÓTESES
______________________________________________________________________
Ratos submetidos à restrição energética durante período perinatal:
Apresentam retardo de crescimento somático ao longo da vida
Apresentam na idade adulta maior consumo alimentar
Apresentam na idade adulta maior predisposição a distúrbios metabólicos, sendo
estas alterações incrementadas quando consomem dieta palatável-hiperlipídica
após o desmame
___________ MATERIAIS E MÉTODOS
5. MATERIAS E MÉTODOS
______________________________________________________________________
O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) do
Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) sob
processo n° 23076.048926/2010-88 (Anexo 1) e seguiu os princípios básicos de
manuseio e cuidado com animais descritos em Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals (BAYNE, 1996).
5.1. Animais e Tratamento
Foram utilizadas 12 ratas albinas Wistar, primíparas com 90 a 120 dias de idade
e 6 machos para acasalamento, provenientes da colônia do biotério de criação do
departamento de nutrição da UFPE. A identificação de células descamativas, muco
gestacional e espermatozoides ao exame microscópico da secreção vaginal diluída em
solução salina morna (Microscópico Zeiss Standard 25, 10x) seguido do incremento de
peso corporal, serviu para diagnóstico do estado de prenhez. Todos os animais foram
mantidos sob as mesmas condições de temperatura 22ºC (± 2ºC), ciclo-claro/escuro de
12 horas e umidade relativa do ar 60%.
Após confirmação da gestação, as ratas foram isoladas em caixas individuais e
divididas aleatoriamente em 2 grupos, formando o grupo Controle (CL, n = 6) e o grupo
Hipocalórico (HL, n= 6) que receberam dieta normocalórica (3,6 Kcal/g) ou hipocalórica
(2,3 Kcal/g ) respectivamente durante todo período da gestação e lactação.
No primeiro dia pós-parto, as ninhadas foram ajustadas para 8 filhotes (4-5
machos:4-3 fêmeas). Após 21 dias, os animais foram desmamados e os filhotes machos
foram subdivididos (2-3 animais por gaiola) de forma que os animais passaram a
receber dieta comercial Labina® (Purina do Brasil, Ltda) (3,6 Kcal/g) formando os
grupos Controle-Controle (C-CP, n=12) e Hipocalórico-Controle (H-CP, n=14) ou
recebiam dieta palatável-hiperlipídica (4,2 Kcal/g) formando os grupos Controle-
Palatável (C-HL, n=11) e Hipocalórico-Palatável (H-HLP, n=9).
Figura 1: Organograma dos grupos experimentais de acordo com a dieta
recebida pela mãe e pelos filhotes após o desmame.
5.2. Composição das Dietas
As dietas utilizadas durante os períodos da gestação e lactação foram elaboradas
à base de caseína, com alterações no conteúdo energético. Dessa forma, a normocalórica
forneceu 3,6 kcal/g e a hipocalórica 2,3 kcal/g. Ambas foram baseadas na AIN-93G
para roedores (REEVES, 1997). Na dieta hipocalórica a quantidade de fibras solúveis e
insolúveis foi incrementada a fim de reduzir o fornecimento energético. Após o
desmame, ambos os grupos controle e hipocalórico passaram a receber dieta padrão de
biotério (Labina, Purina do Brasil) ou dieta palatável-hiperlipídica. A dieta palatável-
hiperlipídica baseou-se no padrão de ingestão de maior teor de açúcar, gordura total e
saturada, sendo caracterizada como uma dieta mista contendo ingredientes
semipurificados e naturais. A distribuição de macronutrientes, concentrações de açúcar
e ácidos graxos se baseou em dados da Pesquisa de Orçamento Familiar do Brasil (POF,
2002-2003) (BRASIL, 2006). Na tabela 1 encontra-se sumarizado o total de energia e a
contribuição percentual dos macronutrientes em relação ao valor energético total das
dietas e na tabela 2, a composição centesimal.
As dietas, exceto a Labina®, foram preparadas artesanalmente no Laboratório de
Nutrição Experimental e Dietética (LNED) da UFPE. Todos os grupos receberam dieta
e água ad libitum até fase final do experimento de 120 dias.
Tabela 1. Composição de macronutrientes das dietas segundo o Valor
Energético Total (VET).
Dieta Proteína
(% kcal VET)
Carboidrato
(% kcal VET)
Lipídio
(% kcal VET)
VET
(kcal/g)
Hipocalórica** 18,6 63,3 18,1 2,3
Normocalorica** 19,0 63,0 18,0 3,6
Padrão para roedores* 26,0 63,0 11,0 3,6
Hiperlipídica** 20,8 47,0 32,2 4,3
* Informação nutricional obtida do Instituto Adolfo Lutz, 1985.
** Informação nutricional obtida da análise de composição centesimal do Laboratório
de Experimentação e Análise de Alimentos (LEAAL) do Departamento de Nutrição da
UFPE.
Tabela 2. Composição centesimal das dietas normocalóricas e hipocalóricas ofertadas
durante os períodos da gestação e lactação, e da dieta hiperlipídica ofertada após o
desmame.
Ingredientes Normocalórica
(g/100g) *
Hipocalórica
(g/100g) **
Hiperlipídica
(g/100g) §
Amido de milho (88% carboidrato) 51,70 30,00 13,10
Farinha de soja 0,00 0,00 8,50
Farinha de trigo 0,00 0,00 13,00
Biscoito de maisena 0,00 0,00 8,00
Caseina (80% proteína) 21,25 13,00 13,00
Goma Guar 0,00 3,50 0,10
Sacarose 10,00 9,90 21,00
Concentrado solúvel de sacarose a 30% 0,00 33,00 0,00
Óleo de soja 7,00 4,50 4,00
Banha animal 0,00 0,00 5,60
Margarina (65% lipídio) 0,00 0,00 3,50
Creme de leite (20% lipídio) 0,00 0,00 6,00
Celulose 5,00 12,00 0,30
Mix mineral (AIN-93G) 3,50 2,80 2,50
Mix vitamínico (AIN-93G) 1,00 0,80 0,70
DL-Metionina 0,30 0,20 0,20
Bitartarato de colina (41,1% choline) 0,25 0,25 0,25
Tert-Butylhydroquinone (TBHQ), mg 0,014 0,014 0,014
NaCl (39,34% de Na) 0,00 0,00 0,36
Calorias (g/100g) 3,60 2,30 4,20
Fonte: * (REEVES, 1997)** Adaptado de Reeves et al (1997), § Adaptado de Reeves et
al (1997) e da Pesquisa de Orçamento Familiar (POF 2002-2003) (BRASIL, 2006). Os
cálculos da composição centesimal foram baseados nas informações nutricionais
enviadas pela empresa fornecedora dos produtos, na Tabela Brasileira de Composição
de Alimentos (TACO) e a análise realizada no LEAAL.
5.3 Avaliações das Gestantes e Lactantes
5.3.1 Peso Corporal e Consumo Alimentar
Foram verificados diariamente peso corporal (g) e consumo alimentar (g) das
ratas durante os períodos de gestação e lactação, com utilização de balança eletrônica
digital (Marte®, S-400, com sensibilidade de 0,1g, MG- Brasil). O consumo alimentar
foi obtido pela subtração do peso da dieta ofertada e o peso da dieta restante após 24h,
de acordo com a seguinte fórmula: Consumo alimentar = Peso da ração (g) - Peso da
ração do dia anterior (g) (LOPES de SOUZA et al., 2008). Após quantificação da
ração ingerida foi calculado o consumo calórico relativo, de acordo com a seguinte
fórmula: [Quantidade de ração consumida x quantidade de Kcal da ração ingerida]
/Peso do animal em gramas.
5.4. Avaliações Murinométrica da Prole
5.4.1. Peso Corporal
Os filhotes foram pesados diariamente em balança digital do 1° ao 21° dia de
vida. Posteriormente foi obtido o peso no 30° dia de vida e a cada 15 dias sendo
acompanhado até a idade adulta de 120 dias. O % de ganho ponderal foi calculado na
idade de 30, 60, 90 e 120 dias, segundo a fórmula: % ganho ponderal = [peso do dia (g)
x 100/ peso ao desmame (g)] – 100 (BAYOL et al., 2004). (BAYOL, JONES et al.,
2004).
5.4.2 Eixo Látero-lateral do Crânio (ELLC) e Eixo Ântero-posterior do Crânio
(EAPC)
O ELLC (mm) que corresponde à linha perpendicular ao eixo longitudinal do
crânio a qual divide ao meio os pavilhões auriculares e o EAPC (mm), que corresponde
à linha média da extremidade do focinho à região externa occipital, foram mensurados
diariamente com utilização do paquímetro digital (Starrett® com acurácia de 0,01 mm)
do 1º aos 21 dias de vida (Figura 2) (SILVA et al., 2005). (SILVA HJ, 2005).
5.4.3 Eixo Longitudinal do Corpo (EL) e Comprimento da Cauda (CC)
O EL (cm) que corresponde à distância entre a extremidade do focinho à
extremidade posterior do corpo e o CC (cm) que corresponde à distância entre a
extremidade posterior do corpo à extremidade da cauda foram verificados com
utilização de fita métrica do 1º dia ao 21º dia de vida (Figura 2). Posteriormente, o EL
foi também mensurado aos 30, 60, 90 e 120 dias de vida (NOVELLI et al., 2007).
(NOVELLI, DINIZ et al., 2007).
Figura 2. Procedimento de avaliação dos eixos corporais e do comprimento da
cauda de ratos neonatos. Fonte: Barros (1999).
.5.5 Teste de Tolerância à Glicose
O teste foi realizado aos 60, 90 e 120 dias de idade. Após jejum de 12 horas, foi
feita a primeira coleta de sangue (tempo 0), através de corte na extremidade da cauda do
animal, para retirada de uma alíquota de 10 μL, sendo utilizado para medição o medidor
de glicemias e tiras-teste Accu-Chek Performa, Rocha®, Chile (Figura 4). Em seguida,
foi administrada, por via intraperitonial, uma solução de glicose a 50% (Equiplex
Indústria Farmacêutica Ltda., Aparecida de Goiânia, GO, Brasil) na dose de 1mg/1g de
peso do animal, e outras amostras de sangue foram coletadas nos tempos 15, 30, 45, 60
e 120 minutos. Foi calculada a área sob a curva de glicose (ΔG), obtida pelos valores de
glicemia nos tempos 0, 30, 60 e 120 minutos, por meio do método trapezoidal (LE
FLOCH et al., 1990; MATHEWS et al., 1990). (LE FLOCH, ESCUYER et al., 1990;
MATTHEWS, ALTMAN et al., 1990).
5.6 Consumo Alimentar
Aos 110 dias de vida os animais foram mantidos em gaiolas individuais por um
período de 10 dias. Após 5 dias (período de adaptação) foi verificado o consumo
alimentar diário (LOPES DE SOUZA et al., 2008), bem como o consumo calórico
relativo. Foram verificados diariamente peso corporal (g) e consumo alimentar (g) dos
ratos durante os períodos de 5 dias, com utilização de balança eletrônica digital
(Marte®, S-400, com sensibilidade de 0,1g, MG- Brasil). O consumo alimentar foi
obtido pela subtração do peso da dieta ofertada e o peso da dieta restante após 24h, de
acordo com a seguinte fórmula: Consumo alimentar = Peso da ração (g) - Peso da
ração do dia anterior (g) (LOPES de SOUZA et al., 2008). Após quantificação da
ração ingerida foi calculado o consumo calórico relativo, de acordo com a seguinte
fórmula: [Quantidade de ração consumida x quantidade de Kcal da ração ingerida]
/Peso do animal em gramas.
5.7 Pesagens de Órgãos e Gordura Visceral
Aos 120 dias de idade, os animais foram sacrificados por decapitação e procedeu-se
à abertura da cavidade abdominal e torácica através de ampla incisão mediana. Os
animais tiveram o coração, fígado, estômago, baço, rins e adrenais retirados, limpos e
rapidamente pesados. Procedeu-se posteriormente a retirada das gorduras das regiões
retroperitoneal e epididimal servindo de parâmetro para avaliação das reservas de
gordura visceral. Os valores obtidos foram utilizados para cálculos dos pesos relativos.
Foi utilizada balança eletrônica digital (Marte AL 500, sensibilidade 0,001g, MG-
Brasil).
5.8 Dosagens Bioquímicas
Após sacrifício foi coletado 5 mL de sangue em tubos de ensaio através de
exsanguinamento cervical. Após a coleta, as amostras de sangue foram imediatamente
centrifugadas (4.000 rpm, 10 min, 4°C). O Soro foi armazenado em tubos eppendorf e
estocado a – 80oC, pra serem avaliados posteriormente em laboratório da UFPE.
As análises de glicose, colesterol total e triglicerídeos (mg/dL) foram realizadas
através de ensaio colorimétrico de ponto final, utilizando-se o KIT de Glicose,
Colesterol e de Triglicérides Liquiform (Labtest, Lago Santa-MG, Brasil). A análise das
frações de HDL (mg/dL) foi obtida através do método de ensaio direto para colesterol
HDL, utilizando-se o kit HDL Liquiform (Labtest, Lago Santa-MG, Brasil).
As frações LDL-colesterol (mg/dL) foram determinadas mediante a utilização
das seguintes equações, segundo FRIEDEWALD, (1972). (FRIEDEWALD W.T., 1972)
• VLDL-colesterol (mg/dL) = triglicerídeos / 5
• LDL-colesterol (mg/dL) = colesterol total – VLDL-colesterol – HDLcolesterol
A figura 6 resume o desenho experimental compreendendo as análises realizadas
nas mães durante os períodos da gestação e lactação, bem como as avaliações realizadas
na prole do pós-desmame a idade adulta.
Fig. 6: Desenho experimental segundo as fases do experimento
5.9 Análise Estatística
As análises foram realizadas no programa estatístico Graphpad Prisma® (versão
4.0). A normalidade das medidas foi avaliada através do teste de Kolmogorov Smimov.
Utilizou-se o teste t de Student para comparar dois grupos independentes e os testes two-
way ANOVA para mais de dois grupos seguido do pós-teste Bonferroni. Durante a
lactação, cada grupo de machos da mesma ninhada foi considerado como sendo uma
amostra. Foi utilizado o coeficiente de Pearson para correlacionar ganho de peso na
gestação com número de filhotes nascidos por mãe. Adotou-se nível de significância de
5%.
_________ RESULTADOS E DISCUSÃO
Title: Hyperlipidic diet during growth maximizes the effects adverced of a perinatal
low-energy diet on plasma glucose/lipids profile in adult offspring.
Short-Title: Periantal low-energy diet and hyperlipidic diet during growth.
Authors: Luciana Lima-Araújo1, Maria Cláudia Alheiros-Lira
1, Luiz Bonner
1, Ana
Carla França Silva1, Raul Manhães de Castro
1, Elizabeth Nascimento
1, Carol Góis
Leandro2
1 Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco, Brazil
2 Department of Physical Education and Sports Science, Centro Acadêmico de Vitória
(CAV), Federal University of Pernambuco, Brazil
Complete mailing address for the corresponding author:
Carol Góis Leandro
Rua Prof Moraes Rego, 1235 – CEP: 50670-901 – Departamento de Nutrição - Cidade
Universitária - Recife, PE – Brasil.
Phone:00 55 (81) 21268463. Fax: 00 55 (81) 21268473
E-mail: [email protected]
Abstract
______________________________________________________________________
In this study, it was to evaluate the effects of a post-weaning hyperlipidic diet on growth
and metabolic parameters of adult offspring submitted to a perinatal low-energy diet.
Male Wistar rats were divided in two groups according to their mother diet during
gestation and lactation: Control (CL, received normocaloric diet), low-energy diet
during gestation and lactation (LEL, received low-energy diet). At weaning, half of the
number of animals of each group was divided in two more groups according to their
diet: control (C+Cp, n=12), control and submitted to hyperlipidic diet (C+HLp, n=11),
low-energy diet (LE+Cp, n=14), and low-energy diet and submitted to hyperlipidic diet
(LE+HLp, n=9). Mother´s body weight, food intake, and energy intake were daily
recorded. In offspring, it was evaluated birth weight, growth rate and physical features,.
At 120 d, relative food intake, glucose tolerance test (GTT), biochemical profile and
weight of organs were evaluated. During gestation and lactation, there was no difference
in terms of body weight and food intake when dams groups were compared. In
offspring, litters from LE mothers showed a deficit in physical features. The effect of
hyperlipidic diet on visceral fat weight, GTT and hypercholesterolemia was more
pronounced in animals submitted to a perinatal low-energy diet. Low-energy diet
offspring show significant discernable effects on glucose/lipid profiles that are more
pronounced when submitted to a hyperlipidic diet throughout the life-spam. In
conclusion, our observations extend the evidence that mismatched early developmental
and mature environments determine a higher susceptibility to obesity development.
Key-words: Developmental plasticity, high-fat diet, obesity, low-energy diet, rats
Introduction
Maternal low-protein diet model during gestation and/or lactation is one of the
most extensively studied animal models of developmental plasticity [1]. Feeding a low-
protein diet (8% casein) during gestation and lactation is associated with growth
restriction, age-dependent loss of glucose tolerance, insulin resistance, hypertension and
dislipidemia, even when the offspring are weaned onto a control diet [1]. Regimens of
total food restriction or maternal calorie restriction have been also studied as a model of
experimental perinatal undernutrition. Moderate nutritional deprivation (30% of ad
libitum intake ) in the pregnant rat leads to changes in postnatal growth patterns, to
delayed catch-up growth, and to elevated blood pressure in adulthood [2]. Adult
offspring exposed to a 50% maternal food restriction in late gestation and lactation have
an increased food intakes, glucose intolerance, and alteration in hypothalamus-pituitary-
adrenal axis compared to control offspring [3-5]. Indeed, variations in the quality and
quantity of the intra-uterine and post-natal environment are linked with later risk of
cardiovascular and metabolic disease [6-7]. This phenomenon, termed “developmental
plasticity” or metabolic programming, refers to the property of a given genotype to
produce different phenotypes in response to distinct environmental conditions [8].
Our previous study was developed a new perinatal undernutrition experimental
model based on a low-energy diet (35% energetic reduction of the normocaloric diet)
without quantitative restriction and balanced in terms of micro and macro-nutrients
(Alheiros-Lira et al, 2012). The low-energy diet was developed in order to minimize the
impact of maternal food restriction which is related to high level of stress of starving
caused by meal-feeding behavior once rats consume all their food within a short period
of time [9]. Maternal non-restricted low-energy diet during gestation and lactation did
not affect offspring in short-term, but there is a more deleterious effect on later somatic
growth and structural parameters (Alheiros-Lira et al, 2012). In human, previous studies
have shown that energetic-proteic undernutrition, mainly due energetic deficit, is the
most prevalent problem of public health in poor regions [10-11].
There is increasing evidence that post weaning palatable hyperlipidic diet
amplify the risk of metabolic disorders in adult life of offspring submitted to maternal
undernutrition [12-14]. When perinatal undernourished offspring (30% of ad libitum
intake) are exposed to a high-fat diet during growth, increased visceral fatness, and
resulting obesity development, and diabetes type 2 are seen [13]. Similarly, previous
study demonstrated that the interaction between prenatal undernutrition and postnatal
high-fat nutrition may be mediated by food behavior gene expression together with
elevations in circulating levels of both plasma leptin and insulin [15]. In fact, increased
susceptibility to diet-induced obesity develops if a mismatch between the anticipated
and the actual conditions are encountered [16].
In order to test the interaction between perinatal low-energy diet and adult
hyperlipidic diet, the main goal of the present study was to evaluate the effects of a
post-weaning hyperlipidic diet on growth and metabolic parameters of adult offspring
submitted to a non-restricted low-energy diet during gestation and lactation. Our
hypothesis is that post-weaning palatable hyperlipidic diet amplifies the effects of a
non-restricted low-energy diet with more pronounced consequences in terms of
metabolic parameters.
Material and Methods
The experimental protocol was approved by the Ethics Committee of the
Biological Sciences Center (protocol number 23076.048926/2010-88) from Federal
University of Pernambuco, Recife, PE, Brazil, and we followed the Guidelines for the
Care and Use of Laboratory Animals.
Animals
Virgin female albino Wistar rats (Rattus norvegicus) were obtained from the
Department of Nutrition, Federal University of Pernambuco. The female rats were 90-
120 days old, 220-260g weight, when they mated. The day on which spermatozoa were
present in a vaginal smear, followed by body weight gain was designated as the day of
conception, day 0 of pregnancy. Pregnant rats were then transferred to individual cages
and they were maintained at a room temperature of 22 ± 1ºC with a controlled light–
dark cycle (light 06.00–18.00 hours). Pregnant rats were randomly divided in two
groups (n=6/each): control (C, received normocaloric diet during gestation and lactation
[3.6 Kcal/g]) and low-energy diet (LE, received low-energy diet during gestation and
lactation [2.3 Kcal/g]). At the time of delivery, the litter size and pups’ birth weights
were recorded. On the first day after birth (24 hours after delivery), litters were
standardised to eight pups, and during the suckling period, their mothers continued to be
provided with either normocaloric or low-energy diet (CL and LEL). The litters of eight
pups represent the sample that was evaluated during lactation. At weaning (on the 22nd
day of age), only three or four randomly chosen male pups from each mother were used.
Thus, animals of each group were divided in two other groups according to their
diet after weaning: control (C+Cp, n=12), control and submitted to hyperlipidic diet post
warning (C+HLp, n=11), low-energy diet (LE+Cp, n=14), and low-energy diet and
submitted to hyperlipidic diet (LE+HLp, n=9). Water and chow were given ad libitum.
Female pups were used in another experiment. Percentage of caloric contribution of
macronutrients in the diets according to the total energetic value (TEV) and chemical
composition of the experimental diets offered to animals are described in Tables 1 and
2.
Table 1: Percentage of caloric contribution of macronutrients in the diets according to
the total energetic value (TEV).
Diet Protein
(% kcal TEV)
Carbohydrates
(% kcal TEV)
Lipids
(% kcal TEV)
TEV
(kcal/g)
Low-energy* 18.59 63.88 18.1 2.3
Normocaloric* 19 63 18 3.51
Labina** 26 63 11 3.58
Hyperlipic** 20.8 47.0 32.2 4.2
*The calculations of chemical composition of macronutrients were based in nutritional
information provided by products’ suppliers and in the Brazilian Table of Food
Composition (TACO).
**Nutritional information obtained from Adolfo Lutz Institute, 1985.
Table 2. Chemical composition of the experimental diets offered to animals.
Ingredients AIN-93G
(g/100g)*
Low-energy
(g/100g)**
Hyperlipic
(g/100g) §
Corn starch (88% carbohydrates) 51.70 30.00 13.10
Soy flour - - 8.50
Wheat flour - - 13.50
Cookie cornstark - - 8.0
Casein (80% protein) 21.25 13.00 13.00
Guar gum - 3.50 0.10
Sucrose 10.00 9.900 21.0
Concentrated soluble sucrose to 30% - 33.00 -
Soybean oil 7.00 4.50 4,00
Animal lard - - 5.6
Cellulose 5.00 12.00 0.3
Margarine (65% lipids) - - 3.5
Milk Cream (20% lipids) - - 6.0
Mineral mixture (AIN-93G) 3.50 2.80 2,50
Vitamin mixture (AIN-93G) 1.00 0.80 0,70
DL-Met 0.30 0.20 0,20
Choline bitartrate (41.1% choline) 0.25 0.25 0,25
Tert-Butylhydroquinone (TBHQ). mg 14.00 14.00 0.014
NaCl (39,34% Na) - - 0.36
Calories (g/100g) 3.51 2.30 4.20
* Source: Reeves et al [17]. The calculations of chemical composition of macronutrients
were based in nutritional information provided by products’ manufacturer and in the
Brazilian Table of Food Composition (TACO).
**Nutritional information obtained from Adolfo Lutz Institute, 1985.
Mother´s Body Weight, Food Intake and Energy Intake Assessment
The mother’s body weight was recorded daily during gestation and lactation for
calculation of the range of body weight percentage. Daily food intake was determined
by the difference between the amount (weight, in grams) of food provided at 08 a.m.
and the amount (weight, in grams) of food remaining 24 h later [19]. Body weight was
recorded with a Marte Scale (XL-500, II class) with a 0.001g accuracy. The energy
intake was calculated by multiplying the amount of food intake during gestation and
lactation by the energetic value of both hypocaloric and normocaloric diets.
Pup´s Assessment
Somatic growth
Somatic growth was assessed in terms of body weight, tail length, and
laterolateral and anteroposterior head axis measurements performed from the first to 21st
postnatal day between 13.00 and 15.00 hours as follows: body weight of the pups was
recorded at 3rd
, 12th
, 21st, 30
th, 45
th, 60
th, 75
th, 90
th, 105
th and 120
th throughout the
experiment with a Marte scale with 100 mg precision. Body weight gain was calculated
as follows: Percentage weight gain = [body weight (g) × 100/birth weight (g)] − 100.
Tail length (distance from tail tip to tail base), length of the latero-lateral skull axis
(distance between the ear holes) and length of the antero-posterior axis of the head
(distance between snout and head-neck articulation) were measured with a digital
caliper (Starrett®, Series 799, São Paulo, Brazil) with a 0.01-mm precision.
Food intake and energetic
On the day 110 to 120, pups were housed individually for 10 days in a metabolic
cage. The first five days were designed for adaptation to the cage. Next, the animal’s
daily food consumption was determined by the difference between the amount of food
provided (50 g) at the onset of the light cycle and the amount of food remaining 24 h
later. Body and food weights were recorded by a Marte Scale (AS-1000), in increments
of 0.01g [19].
Glucose tolerance test (GTT) of offspring
The GTT was performed at 60, 90 and 120 d in the animals fasted overnight.
The blood sample collections were performed by cutting the tip of the tail to remove
approximately 10 µL of blood. The first blood sample was collected (time zero) before
the injection of glucose. In the GTT, a glucose solution 50% (Equiplex Pharmaceutical
Ltd., GO, Brazil) at a dose of 1 mg/g of body weight was administered intraperitoneally.
Blood samples were then collected at 15, 30, 45, 60 and 120 minutes after
administration. The area under the glucose curve was obtained by blood glucose values
at 0, 30, 60 and 120 minutes using the trapezoidal method [20].
Biochemical assessment
At 120 day old, and after fasting (12 h), serum glucose, total cholesterol, high-
density-lipoprotein cholesterol (HDL-c) and triglyceride (TG) levels were determined
with commercially available kits (BioSystems, Spain - A 25 Clinical Chemistry
Analyse®
). Very low-density-lipoprotein cholesterol (VLDL-c) was obtained using
Friedwald calculations [21].
Weight of organs
After the sacrifice, liver, heart, right and left kidney, right and left adrenal,
stomach, fat (epididymal and retroperitoneal) and spleen were removed and weighted to
calculate absolute and relative organs weight.
Statistical Analyses
Values are presented as means ± standard deviation (S.D.). Intra-litter analyses
were performed and found not to be significant. Each litter of eight pups was considered
one sample during lactation, and statistical analyses were performed using Student’s t-
test to compare the mean values of each litter. Pearson’s correlation coefficient was
used to correlate the number of pups that were born and the mother´s body weight gain
during gestation. For statistical analysis, a two-way ANOVA and Bonferroni’s post hoc
test were used. Significance was set at P <0·05. Data analysis was performed using the
statistical program Graphpad Prism 5® (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).
Results
During gestation and lactation, there was no difference in terms of body weight
and food intake when dams groups were compared (Fig 1A and B). Data were adjusted
for the number of pups born from each dam [C, 11.0 (9–12) and LE, 10.0 (8–13)];
values expressed as median (minimum and maximum)]. Pearson’s correlation
coefficient between number of pups and body weight gain of the mother was not
significant (r2 = 0.13). However, intra-group comparison showed an increased body
weight at 21st d when compared to 7
th d during gestation only for control animals.
During lactation, low-energy dams showed an increased relative food intake at 14th
and
21st d when compared to 7
th d. During gestation and lactation, relative caloric intake was
lower in mothers fed a low-energy diet than control, except for the 21st d of gestation
(Fig 1C). Conversely, control animals showed a high relative caloric intake at 14th
and
21st d when compare with 7
th d of lactation (Fig 1C).
7th 14th 21st 7th 14th 21st 200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
CL LEL
1 th
Gestation Lactation
Delievery
/ /
A
Days Days
a
c
cBody W
eig
ht
(g)
7th 14th 21st 7th 14th 21st0
5
10
15
20
25 CL
LEL
B
Gestation Lactation
Days Days
a
a,b
Re
lative
fo
od
in
take
du
rin
g
ge
sta
tio
n a
nd
la
cta
tio
n
[(g
/g b
od
y w
eig
ht)
]x1
00
7th 14th 21st 7th 14th 21st0
20
40
60
80
100 CL
LEL
Gestation Lactation
C
* *
*
*
*
Day Day
a
b
Re
lative
ca
lori
c in
take
du
rin
g
ge
sta
tio
n a
nd
la
cta
tio
n
[(K
ca
l/g
bo
dy w
eig
ht)
]x1
00
Figure 1. Body weight and food intake and energetic during gestation and lactation by
dams fed either a normocaloric diet (control, n = 6) or a hypocaloric diet (n = 6). Body
weight during (A); relative food intake expressed in g/g of body weight x 100 (B);
relative caloric intake (C) were evaluated during gestation and lactation. The values are
presented as means + S.D. ∗P < 0.05 vs control. For intra-groups analysis, a
P < 0.05 vs
7th
d, bP < 0.05 vs 14
th d, and
cP < 0.05 vs 21
th d. Two-way ANOVA and Bonferroni’s
post hoc test for statiscal analysis.
Birth weight was not different when groups were compared. At 21st d, litters
from LE mothers showed a deficit in the body weight, tail length, laterolateral skull axis
and anteroposterior axis of the head when compared with litters from control group
(Table 3).
Table 3. Indicators of somatic growth during lactation of litters (8 pups per litters in
each group).
Offspring´s day of life
3rd 12th 21st
Groups Mean ± S.D Mean ± S.D Mean ± S.D
Body weight (g) CL 7,69 ± 0,87 26,44 ± 2,11 49,99 ± 2,12
LEL 7,34 ± 0,58 22,98 ± 2,74* 38,90 ± 3,22 *
Tail length (mm) CL 21,03 ± 2,42 44,32 ± 3,90 71,54 ± 6,12
LEL 19,39 ± 1,41 40,32 ± 3,24 63,42 ± 6,32*
Longitudinal axis (mm) CL 57,76 ± 3,34 85,91 ± 3,52 117,28 ± 4,38
LEL 55,91 ± 2,91 83,85 ± 2,19 109,81 ± 2,71*
Laterolateral skull axis (mm) CL 11,34 ± 0,33 15,62 ± 1,01 17,79 ± 0,78
LEL 10,99 ± 0,45 15,29 ± 0,12 16,84 ± 0,29*
Anteroposterior axis of the head (mm) CL 19,84 ± 0,81 30,06 ± 1,57 36,81 ± 0,98
LEL 19,77 ± 0,64 29,48 ± 0,52 35,32 ± 0,63 *
During gestation and lactation, the dams were submitted to either hypocaloric
diet or normocaloric diet. The pups into each litter were evaluated during lactation.
Groups: low-energy (LEL, n=6) and normocaloric diet (CL, n=6). The values are
presented as means + S.D. ∗P < 0.05 using Test-T .
At weaning, half of the number of pups from each group was submitted to a
hyperlipidic diet. There were no effects of a hyperlipidic diet on body weight during
growth to adult life when groups were compared, except at 90 d old pups (Figure 1A).
Similarly, the effects of a hyperlipidic diet on longitudinal axis during growth to adult
life were seen at 90 d and 120 d. At 120th
d, body weight gain, relative food intake and
caloric intake were not different between LE-Cp and LE-HLp (Figure 1C, D and E).
However, both groups submitted to a hyperlipic diet, showed a high body weight gain,
and a reduced relative food intake and caloric intake when compared to their respective
controls (Figure 1C, D and E).
30 45 60 75 90 105 1200
100
200
300
400
500
C-Cp LE-Cp
C-HLp LE-HLp
*
A
Days of Life
Body w
eig
ht
(g)
30th
60th
90th
120th
10
15
20
25
C-Cp
LE-Cp
C-HLp
LE-HLp
**
B
Day of Life
Longitu
din
al A
xis
(C
m)
0
500
1000
1500
C-Cp
LE-Cp
C-HLp
LE-HLp
p<0.05
C
120 Days
Body w
eig
ht
gain
(%
)
0
2
4
6
8
C-Cp
LE-Cp
C-HLp
LE-HLp
* &
D
120 Days
Re
lativ
e f
oo
d in
take
[(g
/g b
od
y w
eig
ht)
]x1
00
0
10
20
30
C-Cp
LE-Cp
C-HLp
LE-HLp
E
*
120 Days
Re
lative
ca
lori
c in
take
[(K
ca
l/g
bo
dy w
eig
ht)
]x1
00
&
Figure 2. Body weight in grams from 30 to 120 d (A). At 120 d old, longitudinal axis
(B), percentage of body weight gain (C), relative food intake (D), and relative caloric
intake (E) of offspring from mothers submitted a normocaloric diet (control C-Cp,
n=12), control and submitted to hyperlipidic diet (C-HLp, n=11), low-energy diet (LE-
Cp, n=14), and low-energy diet and submitted to hyperlipidic diet (LE+HLp, n=9). The
values are presented as means ± S.D. *P<0.05 vs C-CP and &
P<0,05 vs LE-CP using
two-way ANOVA and Bonferroni’s post hoc test.
At 60, 90 and 120 d, pups were submitted to glucose tolerance test (GTT). At 90
and 120 d, pups from dams submitted to a perinatal low-energy diet showed an increase
in the area under the glycaemia curve when compared with pups from control dams.
Hyperlipidic diet potentiated this effect in all ages in both control (C-HLp) and low
energy diet (LE-HLp) (Figure 2).
60th
90th
120th
0
10
20
30
C-Cp
LE-Cp
C-HLp
LE-HLp
*G
** *
**
Days of Life
Figure 3. Area under glycaemic curve (ΔG) of offspring from mothers submitted during
gestation and lactation, respectively to a normocaloric diet (control C-Cp, n=12), low-
energy diet (LE-Cp, n=14), control and submitted to hyperlipidic diet post-wearning (C-
HLp, n=11), and low-energy diet and submitted to hyperlipidic diet post-wearning (LE-
HLp, n=9). The values are presented as means ± S.D. *P<0.05 vs their respective
controls (LE-HLP vs HE-Cp and C-HLP vs C-CP) Ψ P<0.05 vs C-Cp using two-way
ANOVA and Bonferroni’s post hoc test.
At 120 d, hyperlipidic diet induced an increase in body weight and visceral fat
weight and a reduction in the weight of the stomach [Table 4]. The effect of hyperlipidic
diet on visceral fat weight (absolute and relative) was more pronounced in animals
submitted to a perinatal low-energy diet (LE-HLp vs C-HLp, p < 0.05).
Table 4. Organs weight (absolute and relative) of offspring at 120 d old whose mothers
were submitted to either a normocaloric diet (C-Cp) or a low-energy diet (LE-Cp).
From weaning on, pups were fed a hyperlipidic diet (C-HLp and LE-HLp) or
normocaloric diet (C-Cp and LE-Cp).
C-Cp C-HLp LE-Cp LE-HLp
Mean ± S.D Mean ± S. D Mean ± S. D Mean ± S. D
Heart (g) 1.39 ± 008 1.29 ± 0.15 1.33 ± 0.12 1.28 ± 0.43
Relative Weight of Heart [( heart
weight/body weight)x100]
0.35 ± 0.04 0.30 ± 0.03 0.33 ± 0.02 0.29 ± 0.10
Liver (g) 12.57 ±2.14 11.77 ± 2.03 11.59 ± 1.51 11.25 ±3.83
Relative Weight of liver [( liver
weight/body weight)x100]
3.15 ±0.39 2.72 ±0.39 2.85 ±0.34 2.58 ±0.86
Stomach (g) 2.05 ± 0.18 1.47 ± 0.13*
1.83 ± 0.37 1.44 ± 0.48*
Relative Weight of Stomach [(
Stomach weight/body weight)x100]
0.52 ± 0.07 0.34 ± 0.03* 0.45 ± 0.10 0.33 ± 0.11
*
Visceral Fat (g) 12.57 ± 3.73 20.07 ± 5.01* 13.15 ± 3.32 23.37 ± 9.04
*§
Relative Weight Visceral Fat [(fat
weight/body weight)x100]
3.12 ±0.65 4.68 ± 1.25* 3.22 ±0.70 5.36 ± 2.08
*§
Offspring from mothers submitted a normocaloric diet (control C-Cp, n=12), control and
submitted to hyperlipidic diet (C-HLp, n=11), low-energy diet (LE-Cp, n=14), and low-
energy diet and submitted to hyperlipidic diet (LE+HLp, n=9). The values are presented
as means ± S.D. *P<0.05 vs their respective control (C-HLP vs C-CP and LE-HLP vs C-
HLP). §
P<0.05 vs LE-Cp group. Two-way ANOVA and Bonferroni’s post hoc test were
used for statiscal analysis.
Hyperlipidic diet induced an increase in plasma biochemical parameters in both
C-HLp and LE-HLp animals, except for HDL-cholesterol (Table 5). Animals submitted
to a perinatal low-energy diet showed an increased triglycerides, total cholesterol and
VLDL-cholesterol when compared to control animals. These effects were potentiated in
animals submitted to a hyperlipidic diet (LE-HLp) [Table 5].
Table 5. Plasma biochemical parameters of offspring at 120 d old whose mothers were
submitted to either a normocaloric diet (C-Cp) or a low-energy diet (LE-Cp). From
weaning on, pups were fed a hyperlipidic diet (C-HLp and LE-HLp).
C-CP C-HLp LE-CP LE-HLP
Mean ± S.D Mean ± S. D Mean ± S. D Mean ± S. D
Glucose (mg.dL-1
) 117,62 ± 11,84 130,62 ± 18,01* 101,17 ± 17,74 150,12 ± 16,33*
§
Triglycerides (mg.dL-1
) 87,05 ± 8,45 116,68 ± 12,25* 162,24 ± 14,3
* 190,54 ± 15,15
*§
Total Cholesterol (mg.dL-1
) 77,83 ± 10,48 94,46 ± 10,24* 92,25 ± 10,78
* 106,95 ± 9,76
*§
LDL – Cholesterol (mg.dL-1
) 21,07 ± 8,22 34,01 ± 11,07* 19,11 ± 3,65 27,35 ± 3,64
*
VLDL – Cholesterol (mg.dL-1
) 17,41 ± 1,69 23,34 ± 2,86* 32,44 ± 2,86
* 38,10 ± 3,031
*§
HDL – Cholesterol (mg.dL-1
) 39,34 ± 9,24 37,11 ± 4,14 45,70 ± 9,42 41,49 ± 14,43
Offspring from mothers submitted a normocaloric diet (control C-Cp, n=9), control and
submitted to hyperlipidic diet (C-HLp, n=9), low-energy diet (LE-Cp, n=9), and low-
energy diet and submitted to hyperlipidic diet (LE+HLp, n=8). The values are presented
as means ± S.D. *P<0.05 vs their respective control (C-HLP vs C-CP and LE-HLP vs C-
HLP). § P<0.05 vs LE-Cp group. Two-way ANOVA and Bonferroni’s post hoc test
were used for statiscal analysis.
Discussion
Epidemiological and experimental studies have shown that variations in the
quality and quantity of the nutrition intra-uterine and post-natal environment are linked
with later risk of cardiovascular and metabolic disease [6-7]. In the present study, it was
investigated the interactions between perinatal maternal low-energy diet and postnatal
and hyperlipidic diet on growth, food intake, and plasma biochemical parameters in rats.
Low-energy diet did not induced changes in the body weight and food intake in mothers
during gestation and lactation. Our results demonstrated the efficiency of this model diet
once the relative caloric intake was reduced in undernourished dams. These findings are
in accordance with previous study that used the same experimental model to induce
maternal undernutrition (Alheiros-Lira et al, 2012). Low-energy diet is rich in dietary
fiber and it can be related to similar food intake seen in the groups. Fiber decreases
energy density and sometimes diminishes the palatability of foods, increases chewing,
and delays gastric emptying, and therefore increases gastric volume which activates
satiation [22]. Thus, in the present study, animals consumed the same amount of food
with a low content of energy.
Pups from mothers fed a low-energy diet showed a deficit in the body weight,
tail length, laterolateral skull axis and anteroposterior axis of the head when compared
with litters from control group. Our data showed that low-energy diet is associated with
low stores of maternal nutrients and, subsequently, less transfer of nutrients to the
offspring, which is related with reduced postnatal growth as seen in the same model
(Alheiros-Lira et al, 2012) and other models of perinatal undernutrition [7, 23-24].
The main goal of the present study was to test the hypothesis that hyperlipidic
diet proved ad libitum to offspring since weaning to adult life maximizes the effects of a
perinatal low-energy diet. Both groups submitted to maternal low-energy diet showed a
high body weight gain, but a reduced relative food intake and caloric intake when
compared to their respective controls. However, a hyperlipidic diet did not affect the
body weight gain, relative food intake and caloric intake of adult pups from mothers
submitted to a low-energy diet. In contrast, previous studies have reported that high-fat
diet post-weaning is associated with high body weight gain and body length in maternal
restricted caloric diet (30% of ad libitum of control diet) [13, 15]. The different models
to induce maternal undernutrition can justify the contrasting results. Despite the lack of
effects on low-energy diet, hyperlipidic diet increased the gain of body weight even
with the reduction observed in food intake. This increase can be associated with
accumulation of adipose tissue once this is a well established model to induce obesity
[15].
It is well established that early offspring undergo a greater age-dependent loss of
glucose tolerance [25]. In fact, our results showed that, at 90 and 120 d, the area under
the glycaemia curve was high in pups from dams submitted to a perinatal low-energy
diet. Hyperlipidic diet potentiated this effect in all ages in both control (C-HLp) and low
energy diet (LE-HLp). Similarly, Thompson et al (2007) have observed that a maternal
caloric restriction (70% of ad libitum diet of control) followed by a high fat diet
increases fasting serum glucose with a probable changes in its metabolism in skeletal
muscle and liver [13]. In agreement with previous findings [26-27], rats fed a high-fat
diet developed glucose resistance and a decrease in the glucose metabolism regardless
of perinatal nutritional history.
In the present study, perinatal low-energy diet did not affect the visceral fat
weight of adult offspring, however, when submitted to a hyperlipidic diet, offspring
showed an increased body weight and visceral fat weight. In contrast, previous studies
have demonstrated that a hyperlipidic diet is able to increase the amount of adipose
tissue independently of early environment conditions [26-27]. Our results showed that
perinatal low-energy diet influences on susceptibility to hyperlipidic diet-induced
obesity by a mechanism that include a significant increase in total fat mass. Previous
study has demonstrated that this adipogenesis is associated to plasma concentration of
insulin and leptin, as well as, to altered neuroendocrine gene expression that control the
adult food behaviour [15].
As expected, perinatal low-energy diet induced a deleterious profile of plasma
dyslipidemia such as increased triglycerides, total cholesterol and VLDL-cholesterol in
adult animals. It was interesting to note that the hyperlipidic diet amplified the effects of
a perinatal low-energy diet. Perinatal nutrition-induced hypercholesterolemia has been
previously described in animal models, and the offspring’s susceptibility to
programmed obesity risk has been shown to be dependent on the timing and severity of
diet manipulation [3]. According to previous studies using different models of perinatal
undernutrition [13-15], and to the predictive adaptive response hypothesis, a developing
organism adjusts its physiology to be appropriate for its predicted mature environmental
range, such that a mismatch between the developmental and the adult environment may
lead to an increased risk of disease development [28]. Our data support this hypothesis
and propose that changes in the amount of energy early in life may be key pathways that
modify susceptibility to obesity development.
Conclusion
Most models have used caloric restriction as a stimulus for developmental
plasticity, and relatively few studies have seen the effects of a low-energy diet ad
libitum during gestation and lactation. In this regard, we have presented data that
confirm our hypothesis by demonstrating that a low-energy diet offspring show
significant discernible effects on glucose/lipid profiles that are more pronounced when
submitted to a hyperlipidic diet throughout the life-spam. In conclusion, our
observations extend the evidence that mismatched early developmental and mature
environments determine a higher susceptibility to obesity development.
Acknowledgments
The authors are indebted for the technical assistance of Lucia Pires, and Edeones
França. This research was supported by Foundation for Support the Science and
Research in Pernambuco State - Brazil (FACEPE) and National Council for Research -
Brazil (CNPq).
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__________ CONSIDERAÇÕES FINAIS
6.0 Considerações Finais
______________________________________________________________________
A sociedade global vem convivendo há alguns anos com a crescente epidemia de
obesidade e doenças crônicas correlatas que acometem indistintamente as diversas
classes socioeconômicas, etnia, sexo e idade. Esta temática tem sido o cerne de
pesquisas epidemiológicas e experimentais. Neste contexto, o desequilíbrio nutricional
por déficit ou excesso tem sido alvo incessante da ciência da nutrição por estar
diretamente implicado na gênese dessas patologias. Foi observado neste estudo que a
restrição energética na vida perinatal aumenta a susceptibilidade dos descendentes a
distúrbios no crescimento e metabolismo. A partir das medidas de dimensões corporais
murinométricas observou-se significantes indícios do acúmulo de peso em regiões
especificas do corpo de ratos previamente expostos à restrição de energia. Estes foram
corroborados pelas medidas de gordura visceral e alterações bioquímicas glicêmicas e
lipídicas. Contudo, vale destacar que o uso de um modelo dietético pós-desmame que
retrata de forma mais próxima o atual perfil de consumo de alimentos de populações
ocidentais, exacerbou essas alterações, sobretudo quando aplicado aos grupos que
previamente foram expostos a uma restrição energética.
Portanto, os resultados obtidos nos permitem considerar que o uso de dieta
hipocalórica sem restrição quantitativa mostrou-se um modelo alternativo ao modelo de
restrição alimentar para o estudo da desnutrição energética. Adicionalmente, ratificamos
a hipótese que a oferta de dieta hipocalórica seguida do consumo de dieta palatável-
hiperlipídica do pós-desmame a idade adulta agrava a susceptibilidade dos grupos
restritos a desenvolverem desordens do metabolismo da glicose e ácidos graxos com
acúmulo de gordura central. Evidenciamos também que a desproporção de nutrientes,
mesmo na ausência de uma maior ingestão energética, pode ser um fator determinante
de sinais relacionados à síndrome metabólica.
______REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
REFERÊNCIAS
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________________________ ANEXO
ANEXO – PARECER DO COMITÊ DE ÉTICA E PESQUISA
