Resolución (HPTLC)”
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD IRAPUATO DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA “Perfil fitoquímico de especies vegetales de Guanajuato y sus alrededores por Cromatografía en Capa Fina de Alta Resolución (HPTLC)” Tesis que presenta: Marissa Rodríguez Galván para obtener el grado de Maestría en Ciencias en la especialidad de Biotecnología de Plantas Director de Tesis: Dr. Jorge Molina Torres Irapuato, Guanajuato Junio de 2018
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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS AVANZADOS
DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD IRAPUATO
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
“Perfil fitoquímico de especies vegetales de Guanajuato y sus
alrededores por Cromatografía en Capa Fina de Alta
Resolución (HPTLC)”
Tesis que presenta:
Marissa Rodríguez Galván
para obtener el grado de
Maestría en Ciencias
en la especialidad de Biotecnología de Plantas
Director de Tesis:
Dr. Jorge Molina Torres
Irapuato, Guanajuato Junio de 2018
El médico verdadero: Un sabio (tlamatimini), da vida.
Conocedor experimental de las cosas:
Que conoce experimentalmente las hierbas,
Las piedras, los árboles, las raíces
Tiene ensayados sus remedios, examina experimenta,
Alivia enfermedades
Da masaje, concierta los huesos.
Purga a la gente, la hace sentir bien…
Fray Bernardino de Sahagún.
Textos nahuas del Códice Matritense de la Real Academia de la
historia.
II
Agradecimientos
A Dios: por permitirme alcanzar este anhelo.
A mi asesor, Dr. Jorge Molina Torres: por aceptarme en su laboratorio, por su
paciencia, por su constante dedicación y por sus consejos durante mi estancia; por
forjar mi carácter y aceptar mis momentos de locura.
Al Consejo Nacional de Ciencia Y Tecnología (CONACYT): por el apoyo otorgado
durante mi estancia.
Al Centro de Investigación de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Unidad
Irapuato, por permitirme estar en este viaje por tan largo tiempo.
A mi comité evaluador, Dr. Robert Winkler y Silvia Valdés Rodríguez: por formar
parte del comité evaluador y por sus aportaciones, comentarios y tiempo
prestados para este trabajo de tesis.
Al M. C. Enrique Ramírez Chávez: por su apoyo incondicional, sus consejos y
aporte de metodologías.
A los doctores John Paúl Dénalo Fier y Alejandro Blanco Labra: por su apoyo y
comprensión durante mi estancia en su laboratorio.
A la Dra. Nayelli March Martínez: por su apoyo y comprensión durante las
rotaciones.
A los integrantes del Laboratorio de Fitobioquímica, Juan Vázquez, Filly, Buity
María Rico, Tona: por sus consejos y apoyo.
A mi club de estudio: por apoyarme en mi preparación profesional, por ayudarme
en las presentaciones, por sacarme de apuros y escucharme durante mis días de
crisis.
Ury, María Rico, Ma, Eulalia, Erika Landa: por convertirse en mi nueva familia.
A Alejandra Hernández Barrera: por su ayuda en la redacción de esta tesis, por
ser mi apoyo, prestarme su casa, su tiempo y conocimiento, durante la escritura
de esta tesis.
A mis padres: por todo su amor durante todo este tiempo, por transmitirme su
deseo de conocimiento, por forjar mi carácter.
III
Dedicatoria:
A mis dos grandes amores, mi esposo Chrystyan y mi
pequeña Sophie: por las horas que estuvieron
esperándome, por el tiempo que no compartí con
ustedes, por soportar mis días de estrés en los que la
locura se apoderó de mí. En este escrito, les entrego
mi amor, dedicación y agradecimiento.
IV
ÍNDICE DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1
1.1 Importancia de las plantas ............................................................................ 1
1.2 Biodiversidad ................................................................................................ 2
2. ANTECEDENTES ........................................................................................... 5
2.1 Etnobotánica en México ............................................................................... 5
2.2 Flora de Guanajuato ..................................................................................... 6
2.3Metabolitos secundarios en plantas ............................................................. 10
2.4 Cromatografía............................................................................................. 15
2.5 Cromatografía de capa fina de alta resolución HPTLC ............................... 21
3. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................... 47
4. HIPÓTESIS ................................................................................................... 47
5. OBJETIVO GENERAL ................................................................................. 48
5.1. Objetivos específicos ................................................................................. 48
6. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 49
6.1. Material biológico ....................................................................................... 49
6.2 Equipo ........................................................................................................ 49
6.3 Placas cromatográficas .............................................................................. 51
6.4. Reactivos ................................................................................................... 51
6.5 Colecta, herborización e identificación de las especies. ............................. 53
6.6 Metodología general ................................................................................... 54
6.7 Análisis de alcaloides presentes en Argemone ochroleuca. ....................... 58
6.8 Análisis de fenoles presentes en Cirsium rhaphilepis. ................................ 64
V
6.9 Análisis de terpenos presentes en Montanoa tomentosa. ........................... 67
6.10 Análisis de Alcamidas presentes en Heliopsis longipes ............................ 71
6.11 Análisis de glucósidos cardiotónicos en Thevetia thevetioides ................. 75
7. RESULTADOS. ............................................................................................ 78
7.1 Identificación de especies y herborización .................................................. 78
7.2 Alcaloides presentes en Argemone ochroleuca .......................................... 78
7.3 Análisis de compuestos fenólicos en Cirsium rhaphilepis ........................... 90
7.4 Análisis de terpenos en Montanoa tomentosa ............................................ 96
7.5 Análisis de alcamidas en Heliopsis longipes ............................................. 103
7.6 Análisis de glucósidos cardiotónicos en Thevetia thevetioides ................. 107
8. DISCUSIÓN. ............................................................................................... 114
9. CONCLUSIONES: ...................................................................................... 124
10. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................... 126
VI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación tradicional de metabolitos secundarios. ............................ 12
Figura 2. Distribución Gaussiana. ........................................................................ 20
Figura 3. Resolución entre dos picos. .................................................................. 22
Figura 4. Comparación entre las partículas gel de sílice en TLC& HPTLC. .......... 24
Figura 5. Instrumentación para HPTLC. ............................................................... 27
Figura 6. Evaluación de la fuerza de solvente. ..................................................... 29
Figura 7. Fuerza de solvente de las mezclas en gel de sílice. .............................. 32
Figura 8 Influencia de la saturación de la cámara de desarrollo. .......................... 34
Figura 9. Influencia de la distancia de desarrollo. ................................................. 36
Figura 10.Influencia de la humedad relativa (RH). ............................................... 38
Figura 11. Comparación del perfil con diferente sistema de iluminación. ............. 42
Figura 12.Determinación del Rf de acuerdo con su desplazamiento. ................... 44
Figura 13. Especies seleccionadas para la obtención del perfil fitoquímico.......... 50
Figura 14. Especímenes herborizados. ................................................................ 79
Figura 15. Comparación del perfil de alcaloides en Datura stramonium ............... 80
Figura 16. Perfil de alcaloides presentes en hoja de Argemone ochroleuca. ........ 82
Figura 17. Perfil de alcaloides presentes en hoja de Argemone ochroleuca. ........ 83
Figura 18. Perfil de alcaloides de Argemone ochroleuca, en función del volumen
de aplicación. ....................................................................................................... 84
Figura 19. Perfil de alcaloides en Argemone ochroleuca en función del sistema de
solventes en el desarrollo de la placa. ................................................................ 85
Figura 20.Perfil de alcaloides Argemone ochroleuca en función de los métodos de
detección. ............................................................................................................ 87
VII
Figura 21. Perfil fitoquímico de alcaloides en inflorescencia, tallo, hoja y raíz de
Argemone ochroleuca (A) y Argemone platyceras (B). ......................................... 88
Figura 22. Argemone ochroleuca identificación de alcaloides. ............................. 89
Figura 23. Perfil de fenoles presentes en Cirsium rhaphilepis. ............................. 91
Figura24.perfil de fenoles en Cirsium rhaphilepis en función del sistema de
solventes. ............................................................................................................. 92
Figura 25. Perfil fitoquímico de tallo, hoja, inflorescencia de Cirsium rhaphilepis . 94
Figura 26. Identificación de fenoles en Cirsium rhaphilepis. ................................. 95
Figura 27.Perfil de terpenos presentes en Montanoa tomentosa en función del
método de extracción, así como el sistema de solventes. .................................... 97
Figura 28. Perfil de terpenos en Montanoa tomentosa en función del volumen de
aplicación. ............................................................................................................ 98
Figura 29. Perfil fitoquímico de terpenos presentes en hoja e inflorescencia de
Montanoa tomentosa. .......................................................................................... 99
Figura 30.Montanoa tomentosa identificación de terpenos. ............................... 102
Figura 31. Perfil de alcamidas presentes en raíz de Heliopsis longipes. ............ 104
Figura 32. Perfil fitoquímico de raíz y semilla de Heliopsis longipes. .................. 105
Figura 33. Identificación de alcamidas presentes en Heliopsis longipes. ........... 106
Figura 34. Perfil de glucósidos cardiotónicos en semilla de Thevetia thevetioides.
........................................................................................................................... 108
Figura 35. Perfil de Thevetia thevetioides, en función del volumen de aplicación.
........................................................................................................................... 109
Figura 36. Perfil de glucósidos cardiotónicos en semilla de Thevetia thevetioides
en función del método de detección. .................................................................. 110
VIII
Figura 37. Perfil fitoquímico de semilla inmadura y madura de Thevetia
thevetioides. ....................................................................................................... 112
Figura 38. Identificación de glucósidos cardiotónicos en Thevetia thevetioides. 113
IX
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Biodiversidad en los países Megadiversos. .............................................. 4
Tabla 2. Clasificación de los métodos Cromatografícos ....................................... 17
Tabla 3. Fases estacionarias ............................................................................... 25
Tabla 4. Serie eluotrópica para disolventes puros sobre gel de sílice .................. 31
Tabla 5. Condiciones de aplicación de los extractos en placas de HPTLC........... 55
Tabla 6. Métodos cromatográficos seleccionados para la obtención del perfil
fitoquímico ........................................................................................................... 57
Tabla 7. Métodos de extracción para alcaloides en hoja fresca de D. stramonium..
............................................................................................................................ .59
Tabla 8. Peso de los órganos de A. ochroleuca ................................................... 61
Tabla 9. Peso de los órganos de C. rhaphilepis. .................................................. 66
Tabla 10. Peso de los órganos de M. tomentosa ................................................. 69
Tabla 11. Peso de los órganos de H. longipes. .................................................... 72
Tabla 12. Peso de las semillas de T. thevetioides. ............................................... 76
Tabla 13. Compuestos presentes en el extracto de M. tomentosa ..................... 101
X
RESUMEN
El perfil fitoquímico de las especies vegetales mexicanas permite generar
información que puede utilizarse como herramienta para certificar el uso o
consumo de estas especies. En este trabajo se estandarizó la técnica de
Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución (HPTLC, por sus siglas en inglés),
para la obtención del perfil fitoquímico de cinco especies de plantas mexicanas
correspondientes al Bajío Guanajuatense y regiones adyacentes: Argemone
ochroleuca conocida como chicalote; Cirsium rhaphilepis o cardo santo; Montanoa
tomentosa o zoapatle; Heliopsis longipes o chilcuague y Thevetia thevetioides o
yoyote. En cada especie, se analizaron los órganos que contienen los compuestos
bioactivos, los cuales presentan un potencial farmacológico. Se comparó el perfil
fitoquímico entre dos especies del mismo género: Argemone ochroleuca y
Argemone platyceras. También se comparó el perfil de dos etapas de maduración
de la semilla de Thevetia thevetioides. Los resultados permiten observar
diferencias en el perfil fitoquímico de los órganos, así como en las etapas de
maduración de las semillas. En este estudio se desarrollaron métodos repetibles y
estandarizados, para obtener los perfiles fitoquímicos de las 5 especies antes
mencionadas, con un bajo costo. El perfil fitoquímico de estas especies puede
servir como referencia a las autoridades, en la regulación del comercio de estas
plantas, en tés, infusiones, bebidas herbales o suplementos alimenticios.
XI
ABSTRACT
The phytochemical profile of the Mexican plant species allows generating
information that can be used as a tool to certify the use or consumption of these
species. In this work, the High Resolution Thin Layer Chromatography (HPTLC)
technique was standardized to obtain the phytochemical profile of five species of
Mexican plants corresponding to the Guanajuato region: Argemone ochroleuca
known as chicalote; Cirsium rhaphilepis or holy thistle; Montanoa tomentosa or
zoapatle; Heliopsis longipes or chilcuague and Thevetia thevetioides or yoyote. In
each species, it was pointed out that the organs that compose them, present
bioactive compounds, which represent a pharmacological potential. The
phytochemical profile was compared between species of the same genus:
Argemone ochroleuca and Argemone platyceras. The profile at different maturation
stages of the Thevetia thevetioides seed was also compared. The results indicate
differences in the phytochemical profile of the organs, as well as in the stages of
maturation of the seeds. In this study, repeatable and standardized methods were
developed to obtain the phytochemical profiles of the five species mentioned
above, with a low cost. The phytochemical profile of these species can serve as a
reference to the authorities, in the regulation of the marketing of these plants, in
infusions, herbal drinks or food supplements.
1. INTRODUCCIÓN
En los últimos años se ha observado un incremento en el consumo de los
productos de origen vegetal: tés o bebidas herbales, el café, la yerba mate y
algunas especias. Países como la India, China, Brasil, los Estados Unidos de
América y los miembros de la Unión Europea han incursionado en este mercado,
que les permite generar un mayor crecimiento económico (Blumenthal et al.,
2016).
México debería ocupar uno de los primeros lugares como productor en el mercado
herbolario, por su gran diversidad vegetal y por su riqueza cultural, principalmente
en el uso de las plantas en el campo de la medicina tradicional (Estrada-Lugo,
1995).
Sin embargo, en México la industria herbolaria se enfrenta a grandes retos, debido
a que la normatividad mexicana es muy estricta con respecto a las especies que
se pueden utilizar porque se desconocen muchos de los compuestos bioactivos
presentes en las especies vegetales de origen nacional. (Toche, 2016)
1.1 IMPORTANCIA DE LAS PLANTAS
Las plantas han sido y son fundamentales para la existencia de la humanidad,
pues no sólo son fuente de oxígeno, también son utilizadas como alimento, abrigo,
para la construcción de viviendas, muebles y utensilios del hogar, para obtener
colorantes, fármacos, cosméticos, entre otras cosas (Balick & Cox, 1996).
En México, desde la época prehispánica los habitantes de la región fueron
seleccionando aquellas especies que les proporcionaban algún beneficio. Así fue
como aprendieron a propagar las diferentes especies y entonces surgió la
agricultura (Estrada-Lugo, 1995). En esa época los habitantes de Mesoamérica
utilizaban una gran cantidad de plantas con fines medicinales(Balick & Cox, 1996).
Posteriormentese identificaron los compuestos químicos presentes en algunas
plantas con actividad terapéutica (Palacios-Lozada, 2004). El aislamiento de estos
2
compuestos o su obtención mediante síntesis química generaron la industria
farmacéutica. Todavía en el siglo pasado el 25% de los medicamentos provenían
de las plantas(Balick & Cox, 1996).
Hoy día, en la búsqueda de su bienestar, el hombre está retomando nuevamente
el uso de las plantas para mejorar su salud, por lo que se ha incrementado el
consumo de extractos de plantas con propiedades medicinales (Blumenthal et al.,
2016).
De acuerdo con el estudio realizado en Estados Unidos de América por el
American Botanical Council en 2016, en colaboración con las empresas de estudio
de mercado SPINS, la venta de plantas medicinales se incrementó 7.7% en el
2016, con un total de ventas de más de 7,000 millones de dólares. Las principales
plantas comercializadas fueron las siguientes: Marrubio vulgare, Vaccinium
macrocarpon o arándano, Equinácea purpurea y Camellia sinensis o té verde
(Smith et al., 2017).
Sin embargo, aun cuando en México también ha aumentado el consumo de
plantas medicinales, hace falta un mayor conocimiento de los componentes
químicos de estos materiales, sobre todo sabiendo que nuestro país es
megadiverso. Este trabajo tuvo como objetivo generar y estandarizar una técnica
rápida y económica para la obtención del perfil fitoquímico de cinco especies de
plantas mexicanas que crecen en la región de Guanajuato: Argemone ochroleuca,
Cirsium rhaphilepsis, Montanoa tomentosa, Heliopsis longipes y Thevetia
thevetioides. De cada una de estas plantas se analizaron diferentes grupos de
compuestos en diferentes órganos.
1.2 BIODIVERSIDAD
El término diversidad biológica se refiere al número de especies por unidad de
superficie. La definición abarca la medición de las especies biológicas en un
tiempo y espacio específicos. Existen distintas formas de evaluar la diversidad
3
biológica como: la diversidad genética, la diversidad específica, la diversidad
estructural, la diversidad ambiental y la diversidad de ecosistemas en que crecen
estas especies (Toledo-Manzur, 1994).
La diversidad biológica depende de factores como: la superficie, la variedad de
climas, la topografía y los ecosistemas, entre otros. Por lo tanto, ésta varía en
cada país, región o espacio. El 70% de esta diversidad se encuentra distribuida en
pocos países que son conocidos como megadiversos (Mittermeier & de
Mittermeier, 1997).
México se encuentra dentro de los principales países megadiversos; en este
sentido, comparte una categoría especial con Brasil, China, Colombia, e Indonesia
(Tabla 1). También cuenta con un alto número de especies que son endémicas.
Por ejemplo, del total de especies de Pinus del planeta, el 48% se encuentra en
México y el 85% de éstas son endémicas en nuestro país. Las cactáceas son otro
grupo de especies a mencionar, pues tan sólo de las 800 especies identificadas en
el siglo pasado 715 son endémicas de los desiertos de México (Mittermeier & de
Mittermeier, 1997).
Tanto la diversidad biológica como la riqueza cultural que existieron en la época
prehispánica permitieron a México ser un centro importante de la domesticación
de diversas especies de importancia agrícola como: maíz, chile, calabaza,
algodón, frijol, entre otras. Esta diversidad biológica ha sido un factor importante
en el desarrollo de las civilizaciones en México y en el mundo entero(Hernandez-
Xolocotzi, 1988).
4
Tabla 1. Biodiversidad en los países Megadiversos.
Países y número de especies
Especies/Lugar que ocupa
Primero Segundo Tercero Cuarto Quinto
Plantas Brasil
55,000
Colombia
45, 000
China
30,000
México
26,000
Australia
25,000
Anfibios Brasil
5,016
Colombia
407
Ecuador
358
México
282
Indonesia
270
Reptiles México
707
Australia
597
Indonesia
529
Brasil
462
India
433
Mamíferos Indonesia
519
México
439
Brasil
421
China
410
Zaire
409
(Mittermeier & de Mittermeier, 1997)
5
2. ANTECEDENTES
2.1 ETNOBOTÁNICA EN MÉXICO
La etnobotánica es una disciplina que se encarga de estudiar la interacción directa
de los humanos con las plantas, se enfoca principalmente en los pueblos
indígenas y rurales, donde la relación es directa. A pesar de que tanto en las
civilizaciones prehispánicas como en las poscolombinas se realizaba
etnobotánica, no fue sino hasta la década de los setenta que se introdujo este
término, con los trabajos de Efraín Hernández-Xolocotzi y de Javier Lozoya. Estos
investigadores estudiaron los usos y costumbres de los pueblos indígenas tanto en
la parte agrícola como en lo referente a la medicina tradicional.
En México, los pueblos mesoamericanos cultivaban chile, algodón y calabaza
2,500 años a.C. Los aztecas utilizaban una gran diversidad de plantas con fines
medicinales, además contaban con sistemas de cultivo sofisticados y de
clasificación botánica(Hernandez-Xolocotzi, 1988).
Gran parte del conocimiento de las culturas precolombinas se perdió tras la
llegada de los españoles. Sin embargo, durante la colonia se realizaron trabajos
en los que se registraron las plantas que para ellos eran nuevas, así como su uso
en la medicina tradicional. Algunas de estas obras son: El códice de la Cruz-
Badiano, Libellus de medicinalibus indorum herbis (1552), de Martín de la Cruz y
Juan Badiano; El códice florentino (1555), de Bernardino de Sahagún; el Primer
tratado de las plantas medicinales de la Nueva España (1569), de Monardes; entre
otros (Gómez-Pompa, 1993).
En la actualidad, el Dr. Jerzy Rzendowski ha elaborado trabajos muy destacados.
Sus principales obras son: Vegetación de México (1971); Flora Fanerogámica del
Valle de México (1979) y Flora del Bajío y de Regiones Adyacentes, que inició en
1991 y aún no termina. Paralelamente, en el año de 1977, Abigail Aguilar fundó el
6
primer herbario de plantas medicinales de México, conocido como Herbario del
IMSS, el cual cuenta con más de 14,000 ejemplares (Didier-Brutus, 1995).
2.2 FLORA DE GUANAJUATO
El Bajío es la región geográfica del centro y occidente de México, que abarca
desde las llanuras del estado de Guanajuato, la ciudad de Querétaro hasta los
valles de Morelia, La Piedad hasta el lago de Chapala, Jalisco (Batallon-Claude,
1993).
Ahora bien, en Guanajuato confluyen tres de las provincias fisiográficas de
México: la Altiplanicie Mexicana; el Eje Neovolcánico y la Sierra Madre, cada una
con particularidades geológicas, climáticas e históricas que las hacen poseedoras
de una flora particular, por lo que aportan diferentes conjuntos de plantas que
enriquecen la flora estatal (Carranza-González, 2005).
De acuerdo con el Instituto de Ecología A. C. Centro Regional del Bajío (IEB), en
la publicación de Flora del Bajío y de Regiones Adyacentes, se han reportado
2,274 especies con flores o angiospermas, distribuidas en 182 familias y 904
géneros, hasta el 2005. Sin embargo, aún existen zonas del Bajío que no han sido
exploradas en su totalidad (Carranza-González, 2005).
Las especies que se encuentran en esta región en su mayoría crecen en
diferentes ambientes (Rzedowskiet al., 1996). Las condiciones climáticas y de
suelo en Guanajuato favorecen el desarrollo de la agricultura, la cual genera un
alto grado de perturbación de las especies vegetales y favorece el crecimiento de
malezas, que aumentan la diversidad (Carranza-González, 2005).
Algunas de estas malezas son: la aceitilla o Bidens pilosa; acahual amarillo o
Simsia amplexicaulis; chicalote o Argemone ochroleuca; epazote o Chenopodium
ambrosioides; toloache o Datura stramonium, zarza o Sicyos microphyllus entre
muchas otras. También se encuentran una gran cantidad de especies silvestres
7
que se pueden utilizar como alimento, como plantas ornamentales o como
remedios por sus propiedades medicinales (Rzedowski et al., 1996). A
continuación se describen algunas especies que se localizan en la zona y que se
analizarán, posteriormente, en este trabajo.
Argemone ochroleuca Sweet
Es una especie mexicana perteneciente a la familia Papaveraceae. Es una planta
herbácea, con ciclo de vida corto, se le conoce como chicalote, o checamote,
cimarrón, chichillón, tlixate e incluso cardo santo. Se encuentra ampliamente
distribuida sobre toda la Altiplanicie mexicana(Rzedowski-Calderón de, 1991).
Esta planta contiene látex amarillo o anaranjado que es utilizado para quitar las
manchas y carnosidades de los ojos; para conciliar el sueño, así como para
calmar la tos. También se utiliza en infusiones para el mal de orín o para evitar la
caída del cabello. Las flores aplicadas como emplasto curan la sarna (Argueta-
Villamar et al., 1994).
Los principales alcaloides reportados en el género Argemone son fagarina y
protopina y en menor cantidad berberina, coptisina y sanguinarina (Kukula-Koch &
Mroczek, 2015).
Se ha probado que el látex presenta actividad antifúngica y antimicrobiana, la cual
se le adjudica a la presencia de la berberina (Reyes-Tellez et al., 2011).
Argemone platyceras Link & Otto
Argemone platyceras es una planta herbácea anual, con látex amarillo, de 30 a 80
cm de alto. Se le conoce como chicalote de Castilla, amapola silvestre blanca. Se
distribuye más bien hacia la porción central y sur del país: Michoacán, México,
Hidalgo, D.F., Morelia, Tlaxcala, Puebla, Veracruz y Oaxaca (Rzedowski-Calderón
de, 1991).
8
Se ha utilizado en la medicina tradicional mexicana cuando hay flujo vaginal; en té
se bebe para curar los riñones, para la diabetes y un macerado de las semillas con
agua, se administra para sacar basuras de los ojos (Argueta-Villamar et al., 1994).
Cirsium rhaphilepis Hemsl.
Conocida comúnmente con el nombre de cardo santo, pertenece a la familia
Asteraceae. Es una planta herbácea, perenne, erecta, que crece preferentemente
en lugares perturbados; florece de abril a octubre, en altitud de 1,700-2,600 metros
sobre el nivel del mar. Su distribución en el país es extensa, ya que se puede
localizar desde la zona centro norte del país en los estados de Sonora, Durango,
Zacatecas, Nayarit, Jalisco, Michoacán, México, Puebla hasta la zona sur en el
estado de Oaxaca (Rzendowski-Calderón de, 1995).
En las diferentes especies del género Cirsium, se han reportado compuestos
como flavonoides, esteroles, triterpenos, alcaloides, poliacetilenos, acetilenos,
lactonas sesquiterpénicas, ácidos fenólicos y lignanos (Jordon & Louda, 2003).
Montanoa tomentosa Cerv.
Es un arbusto perenne de hasta 3 metros de altura, perteneciente a la familia
Asteraceae. Habita en clima semicálido y templado, entre los 1,240 y hasta los
3,900 metros sobre el nivel del mar. Se le conoce como zoapatle o cihuapatli
candela, chihuapatle, paridora, perimo, vara amargosa y vara prieta (Rzedowski &
Rzendowski-Calderón de, 2011).
En la antigüedad, las hojas eran utilizadas por algunas culturas mexicanas para
acelerar, inducir o facilitar el parto, así como para interrumpir el embarazo.
Actualmente también se utiliza contra el reumatismo y para el cansancio. Esta
actividad ha sido atribuida principalmente a la presencia de los ácidos diterpenicos
como el ácido kaurenoico y grandiflorénico (Argueta-Villamar et al., 1994).
9
Heliopsis longipes A. Gray
Entre las especies nativas de Guanajuato destaca la Heliopsis longipes
“chilcuague” (Zamudio-Ruíz & Galván-Villanueva, 2011). Ésta es una planta
herbácea perenne perteneciente a la familia Asteraceae. Llega a medir de entre 40
a 80 cm, florece de agosto a octubre, con cabezuelas amarillas y un largo
pedúnculo. Sus raíces alcanzan un tamaño de entre 15 a 30 cm. Crece a una
altitud de 1,950 a 2,500 metros sobre el nivel del mar(Rzedowski & Rzedowski-
Calderón de, 2008).
En la zona de la Sierra Gorda de Guanajuato, sus raíces son conocidas como
chilcuague. Se ha encontrado en los encinares del noreste de Guanajuato y de
Querétaro. Es una especie endémica del centro de México, San Luis Potosí,
Guanajuato y Querétaro(Carranza-González, 2005).
Es una planta que ha sido utilizada por sus diferentes propiedades medicinales, en
las que destacan los usos como bactericida e insecticida. También ha sido muy
utilizada para los dolores de muelas y laceraciones en la boca (Zamudio- Ruíz &
Galván- Villanueva, 2011).
Thevetia thevetioides H.B.K
Es un arbusto o árbol pequeño, de 3 a 8 m de alto perteneciente a la familia
Apocinaceae. Florece y fructifica principalmente en la época lluviosa, de junio a
septiembre. Se le conoce como yoyote. En la zona se ha encontrado en el centro y
sur de Guanajuato, así como en Querétaro y Michoacán, formando parte del
bosque tropical caducifolio, a una altitud de entre 1,900 a 2,200 metros sobre el
nivel del mar. Pero también se ha encontrado en Sureste de Estados Unidos de
Norte América, así como en: Sonora, Sinaloa, Nuevo León, Tamaulipas, San Luis
Potosí, Hidalgo, Nayarit, Jalisco, México, Puebla, Veracruz, Guerrero, Oaxaca,
Tabasco, Chiapas, Campeche y Yucatán(Rzendowski & Rzendowski-Calderón de,
1998).
10
Esta especie se utiliza comúnmente para el tratamiento de daños en la piel como
barros y espinillas, también para combatir problemas cardiovasculares, almorranas
o várices. En las afecciones bucales, así como dolor de muelas y caries. También
se ha utilizado para quitar el dolor causado por la picadura de alacrán y la tos
(Argueta-Villamar et al., 1994).
Datura stramonium L.
Las especies del género Datura son hierbas o arbustos pequeños, anuales que
miden desde 30 cm hasta 1 m. El género consiste de aproximadamente 25
especies distribuidas en regiones cálidas de todo el globo. En el valle de México
se han observado tres especies: D. ceratocaula, D. quercifolia y D. stramonium
ampliamente distribuidos en altitudes de 2,250 hasta 2,600 metros sobre el nivel
del mar, se le considera una maleza (Ascárraga, 2001).
A la especies Datura stramonium se le conoce como Toloache, frizillo, tapete,
tlapa, tlaquoal, hierba del diablo, chamico (Tabasco), hierba hedionda (México),
nacazcul, tapate, tepate (Martínez, 1979).
Contiene el alcaloide daturina, de acción narcótica, la que en proporciones
adecuadas tiene usos en la medicina; en ocasiones se le ha utilizado en lugar de
la belladona. Las semillas causan una especie de locura. Además, contiene
alcaloides tropánicos como hiosciamina y escopolamina, por lo que se utiliza para
desinflamar las glándulas secretoras, así como calmante (Berkov-Strahil et al.,
2006; El-Bazaoniet al., 2011).
2.3METABOLITOS SECUNDARIOS EN PLANTAS
En plantas existen una gran variedad de compuestos orgánicos que no están
directamente relacionados con las funciones básicas de la planta, sino con
funciones complementarias como: mecanismos de defensa, producción de
hormonas o de moléculas señalizadoras. Se sintetizan dependiendo dela familia,
11
género o especie a la que pertenecen y de los factores ambientales a los que se
encuentre sometida la planta. Estos compuestos orgánicos recibieron el nombre
de metabolitos secundarios en 1891 por el bioquímico Albrecht Kossel (Ávalos
García & Pérez-Carril, 2011).
Estos compuestos orgánicos también recibieron el nombre de productos naturales,
debido a que es difícil separarlos de los metabolitos primarios porque comparten
rutas de síntesis o precursores. Además, sus estructuras son muy similares
(Talapatra & Talapatra, 2015).Se ha observado que frecuentemente cada familia,
género y especie de la planta produce una mezcla característica de estos
metabolitos (Chinou, 2008).
Los metabolitos secundarios se pueden clasificar por: función, estructura química,
composición, solubilidad o bien su vía de síntesis. Por este último modo pueden
ser: terpenos; compuestos fenólicos; y compuestos que contienen nitrógeno
(Figura 1) (Chinou, 2008).
Existen cuatro principales vías de síntesis de los metabolitos secundarios: la vía
del isopreno, la vía de los policétidos, la vía del ácido shikímico o la vía de los
aminoácidos.
2.3.1 TERPENOS
Los terpenos son los productos naturales más abundantes. Están formados por la
polimerización de unidades de isopreno. Se pueden clasificar en seis grupos:
hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20),
sesterpenos (C25) y triperpenos (C30), dentro de los cuales se encuentran los
esteroles, ácidos biliares, hormonas, saponinas, carotenos, los glucósidos
cardiotónicos y el taxol, entre otros (Osbourn & Lanzotti, 2009).
12
Figura 1. Clasificación tradicional de metabolitos secundarios.
La clasificación de los metabolitos secundarios en función de su vía de síntesis
depende de los precursores utilizados. Existen cuatro principales vías de síntesis
de metabolitos secundarios: del isopreno; de los policétidos, del ácido shikímico y
de los aminoácidos (Chinou, 2008).
13
Las saponinas esteroideas se han utilizado como precursores de muchos
medicamentos: hormonas sexuales, corticosteroides y anticonceptivos orales, por
lo que representan un ingreso importante en el sector económico. La extracción de
saponinas se ha llevado a cabo en plantas de los géneros Dioscorea, Asparagus
Balanites, Costus, Lycopersicon, Solanum, Tribulus, Trigonella y Valeriana. La
diosgenina es la más importante y más estudiada de estas saponinas, la cual es
utilizada para producir anticonceptivos y corticosteroles, se obtiene principalmente
de varias especies del género Dioscorea (Sarin, 2005).
2.3.2 COMPUESTOS FENÓLICOS
Los compuestos fenólicos son característicos de las plantas y se encuentran
usualmente como ésteres o glucósidos en lugar de ser compuestos libres. El
término “fenólico” cubre un grupo muy grande y diverso de sustancias químicas.
Los polifenoles son compuestos que tienen más de un grupo hidroxilo fenólico
unido a uno o más anillos aromáticos. Estos compuestos se pueden clasificar de
varias maneras. Swain y Bate-Smith (1962) agruparon los fenoles en categorías
"comunes" y "menos comunes". Harborne y Simmonds (1964), por su parte,
clasificaron estos compuestos en grupos basados en el número de carbonos en la
molécula.
2.3.3 COMPUESTOS NITROGENADOS
A las biomoléculas que contienen nitrógeno se les conoce como compuestos
nitrogenados. Éstos se encuentran ampliamente distribuidos en el metabolismo,
principalmente en forma de aminoácidos o de alcaloides, los cuales son
sintetizados a partir de los aminoácidos. La palabra alcaloide proviene del árabe y
equivale a “álcali” en español y es una propiedad de los carbonatos alcalinos.
Tradicionalmente los alcaloides se definían como compuestos heterocíclicos
nitrogenados derivados de aminoácidos, que tienen en común su hidrosolubilidad
a pH ácido y su solubilidad en solventes orgánicos a pH alcalino(Osbourn &
Lanzotti, 2009).
14
En humanos, los alcaloides generan respuestas fisiológicas y psicológicas, debido
a su interacción con neurotransmisores. Casi todos los alcaloides son tóxicos a
dosis altas. Sin embargo, a dosis bajas tienen un alto valor terapéutico como
relajante muscular, tranquilizante, antitusivo o analgésico. Hay una gran diversidad
de alcaloides, debido a que provienen de diferentes precursores y se pueden
clasificar según el tipo de anillo que está presente en la molécula. Debido a su alta
diversidad estructural, es imposible dar un resumen completo de los diferentes
tipos de alcaloides, por lo que sólo se describirán los de interés para este
trabajo(Osbourn & Lanzotti, 2009).
Los alcaloides isoquinolínicos son derivados de dos moléculas de tirosina. La (S)-
reticulina es el intermediario central de la síntesis de este tipo de alcaloides, la
cual puede sufrir varios rearreglos estructurales. Se encuentran principalmente en
las familias Berberidaceae, Fumariaceae, Papaveraceae, Menispermaceae y
Ranunculaceae (Harinderetal., 2007).
2.3.4 POLICÉTIDOS
Los policétidos, también conocidos como acetigeninas, son sintetizados en
microorganismos, así como en algunas plantas. La síntesis de policétidos es
similar a la síntesis de ácidos grasos, utilizan como precursor al malonil CoA; sin
embargo, los policétidos no requieren de intermediarios para la reducción. La gran
variedad de policétidos encontrados en la naturaleza está basada en las diferentes
moléculas de inicio (Luckner, 1984).
Las plantas para el humano son de gran importancia debido a los compuestos que
éstas producen y son útiles o necesarios para diversas actividades. No obstante,
existe una gran cantidad de metabolitos secundarios que actualmente siguen sin
estudiarse(Osbourn & Lanzotti, 2009).
15
2.4 CROMATOGRAFÍA
El botánico ruso Mikhail Tswett, en 1903, explicó por primera vez el concepto de
cromatografía. La palabra proviene del griego que significa color y
que significa escritura. Tswett la describió como: “Método en el cual
los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente
dentro de un sistema fluyente.” Tswett trabajó con la clorofila y, al realizar las
extracciones de las hojas vegetales, los distintos solventes mostraban
comportamientos diferentes. Es decir, algunos solventes como el alcohol o la
acetona extraían fácilmente todos los pigmentos de las hojas. Sin embargo, el éter
de petróleo solo extraía compuestos como la clorofila y otros pigmentos asociados
como los carotenos (Ettre, 2003).
Mediante distintos análisis, Tswett dedujo que hay interferencia de algunas fuerzas
moleculares de unión entre los pigmentos de la hoja. Además, estas fuerzas
dependen de cada pigmento de forma individual, por lo que solamente los
solventes con una capacidad de disolución más fuerte que el de las fuerzas
moleculares de unión se pueden utilizar para la extracción de un pigmento
particular (Ettre, 2003).
De acuerdo con este autor, Tswett realizó investigaciones con más de 100
materiales sólidos inorgánicos y orgánicos para determinar la adsorción de los
pigmentos. Encontró que los materiales que presentaban mejor adsorción fueron
el carbonato de calcio y la alúmina, ya que al pasar la solución de los extractos se
formaron diferentes anillos verdes y amarillos. También observó que al adicionar
más solvente se lograba una mejor separación, e incluso se apreciaban más
bandas de distintos colores. Con una elución constante logró separar los
pigmentos de forma individual.
A pesar de este descubrimiento, se retomó nuevamente esta técnica hasta 1930
por Lederer y Khun, quienes la utilizaron para la separación de carotenoides. A
16
partir de ese momento, el uso de esta técnica se fue extendiendo cada vez más
hasta hacer versiones de ésta como: la cromatografía en papel, en capa fina y las
técnicas utilizadas actualmente, en las cuales la separación no está condicionada
por el color (Ettre, 2003).
La cromatografía es un proceso físico que permite la separación de compuestos
presentes en las mezclas complejas, en el que cada compuesto de acuerdo con
su naturaleza se distribuye entre una fase estacionaria, que puede ser sólida o
líquida y una fase móvil, que puede ser líquida o gaseosa. En todo proceso
cromatográfico la fase móvil es la que provoca un movimiento de los distintos
componentes, para que abandonen el medio de soporte, mientras que la fase
estacionaria suministra el efecto retardador y es selectiva para que cada
componente se desplace con una velocidad distinta (Gómez-Ruíz, Sierra-Alonso,
& Pérez-Quintanilla, 2009).
En el libro de Reich y Schibli (2008), “High Performance Thin-Layer
Chromatography for the Analysis of Medicinal Plants”, se describe la
Cromatografía de Capa Fina de Alta Resolución, de una forma simple y detallada
por lo cual en este trabajo se describirán los principales conceptos de
cromatografía basados en su obra.
La cromatografía se puede clasificar de acuerdo con su estado de agregación, por
su principio de separación o bien por su lecho (Tabla 2).
A continuación, se describen los principios de separación utilizados.
A. Adsorción: Es la interacción específica de grupos funcionales de superficies
sólidas con las moléculas de la muestra. Estas interacciones son de tipo
puentes de hidrógeno, ácido-base o dipolo-dipolo.
17
Tabla 2. Clasificación de los métodos cromatográficos
Por su estado de agregación
Por su principio de separación Por su lecho
CSG, Absorción Planar (TLC, HPTLC, papel)
CGL, CG Partición En columna (CG, CL)
CSL, CL Par iónico Por capilaridad (CG, CL)
CLL Interacción hidrofóbica
CSF Afinidad
Exclusión por Tamaño
Modificado de Reich & Schibli, 2008
18
B. Partición: Es la distribución que muestra un soluto entre dos fases. En este
caso la solubilidad de las muestras con la fase estacionaria depende del
carácter lipofílico, o solvatación incluyendo interacción específica entre
uniones de hidrógeno.
C. Afinidad: Es la interacción selectiva entre la molécula objetivo y la selectora.
La separación cromatográfica se produce por la afinidad que presentan los
componentes de la mezcla con la fase estacionaria y con la fase móvil. Esto
debido a que existen diferentes mecanismos e interacciones entre las partículas.
Los compuestos presentes en la mezcla siempre tratarán de alcanzar un equilibrio.
A la distribución de cada componente entre la fase estacionaria y la fase móvil se
le denomina coeficiente de partición.
K = CE/CM
Donde K es el coeficiente de partición, CE es la concentración del componente en
la fase estacionaria y CM es la concentración de la fase móvil.
Siempre que se separe una sustancia por el método cromatográfico, esta
sustancia, que se encuentra inmóvil en la fase estacionaria, se desplazará con la
fase móvil a través de la columna o placa; para distribuirse entre las dos fases,
tratando de alcanzar el equilibrio. Dependiendo de la afinidad, ya sea con la fase
móvil o la fase estacionaria, las moléculas se desplazarán más o menos rápido
sobre la fase estacionaria.
2.4.1 EFICIENCIA Y RESOLUCIÓN.
En un cromatograma se tiene una mejor eficiencia cuando las bandas se
encuentran bien separadas. A la cantidad de moléculas de un mismo compuesto,
que presenta una distribución Gaussiana en la placa de TLC o HPTLC, se le
19
conoce como banda. Esta distribución está en función de la concentración, así
como del tipo de placa o del sistema de solventes utilizados
El ensanchamiento de una banda debido a la dispersión puede indicar que hay
compuestos que no se encuentran totalmente separados y no es posible
diferenciarlos. Mientras menor sea el valor de separación de los dos picos en
función de la distancia de recorrido, hay un mayor número de platos teóricos, por
lo que el sistema es más eficiente.
Para que se separen dos componentes es necesario que los coeficientes de
partición sean diferentes y que el factor de selectividad α sea mayor que 1.
𝛼 =𝐾1
𝐾2(𝐾1 > 𝐾2)
Donde α es el factor de selectividad y K es el coeficiente de partición. Tanto el
plato teórico como el número de platos teóricos permiten calcular la eficiencia de
la cromatografía. Para determinar el número de platos teóricos (N) a partir del
cromatograma, se asume que el pico tiene una distribución Gaussiana y se utiliza
el ancho medio del pico. La anchura del pico se expresa en unidades de tiempo
por lo que N no tiene unidades.
N = 4 (𝑅𝑡
𝑊ℎ) ×2
Donde N es el número de platos teóricos, Rt es el tiempo de retención, Wh el
ancho medio del pico (Figura 2).
La capacidad de separación de dos compuestos, se conoce como resolución. Esto
es el cociente de la distancia que existe entre los centros de dos picos y el valor
medio de la anchura de cada banda. La resolución se determina con la siguiente
ecuación:
20
Figura 2. Distribución Gaussiana.
Donde h es la altura del pico, σ es la desviación estándar, Wh es el ancho medio
del pico, Wb es la anchura de la base del pico. Imagen tomada de Reich & Schibli,
2008.
21
𝑅𝑠=(𝑡2 − 𝑡1)
1/2(𝑊𝑡1 − 𝑊𝑡2)
Donde RS es la resolución, t1 y t2 es el tiempo de retención de cada pico y Wt1, Wt2
es la anchura media de cada banda (Figura 3).
2.5 CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA DE ALTA RESOLUCIÓN HPTLC
En este trabajo nos vamos a enfocar en la Cromatografía de Capa Fina de Alta
Resolución (HPTLC). Es una cromatografía en placa que proporciona una mejor
separación de los compuestos, debido a que se utilizan materiales optimizados
como fase estacionaria, reduciendo significativamente el volumen de muestra
necesaria, además de contar con la automatización que permite una mejor
dosificación de la muestra. La automatización controla los parámetros en el
desarrollo de la placa por lo que promueve una mayor eficiencia en la separación,
reduce el tiempo de análisis, disminuye el volumen de la fase móvil, facilita el
registro y la obtención de los datos(Srivastava, 2011).
El método cromatográfico por capa fina de alta resolución es un proceso que se
divide en pasos individuales. Primero la muestra es aplicada en una placa de
HPTLC. Posteriormente, la placa es desarrollada, detectada, documentada y
evaluada. En caso de ser necesario, para la detección se utiliza la derivatización.
Actualmente existe la instrumentación específica para cada paso de la
cromatografía, en el cual la placa es desplazada manualmente. A continuación, se
describen cada uno de los pasos y los instrumentos utilizados.
2.5.1 ELECCIÓN DE FASE ESTACIONARIA
Antes de aplicar la muestra es importante elegir la fase estacionaría a utilizar. La
fase estacionaria puede ser de materiales diversos como el óxido de aluminio,
22
Figura 3. Resolución entre dos picos.
Donde t1 es el tiempo de retención del primer pico, t2 es el tiempo de retención
del segundo pico, W t1 es el ancho de la base del primer pico y W t2 es el ancho de
banda del segundo pico. Imagen tomada de Reich & Schibli, 2008.
23
celulosa, silicato de magnesio, así como el gel de sílice, que es el más utilizado
actualmente.
Es importante el tamaño de la partícula debido a que una partícula pequeña y
homogénea será más eficiente para la separación que una partícula mayor. El
tamaño de la partícula homogénea de reciente incorporación al mercado va de 5 a
7 µm, mientras que, la tradicional es más irregular y tiene un tamaño de entre 15 y
20 µm. Además, es deseable contar con una gran cantidad de macro poros para
reducir la superficie de contacto. En el gel de sílice abarca de 400 a 450 m2 g-1. El
volumen del poro índica la porosidad global que se encuentra en valores de 0.8 a
1.2 mL g-1 (Figura 4). Molecularmente, el gel de sílice es similar al dióxido de
silicio, ya que se forma una red tridimensional rígida, donde cada átomo de silicio
se encuentra rodeado por 4 átomos de oxígeno, que participan en la formación de
los poros. También se encuentran grupos silanol (-Si-OH), esta estructura facilita
la interacción entre la placa cromatográfica y los diferentes grupos de compuestos.
Las placas de gel de sílice contienen además del gel de sílice, algún aglutinante y
en algunos casos utilizan un indicador de fluorescencia. La base o soporte de la
placa puede ser de vidrio, poliéster o aluminio. Algunas placas de gel de sílice
contienen unidos compuestos polares o no polares, que les proporcionan
características específicas. Además del gel de sílice existen otras fases
estacionarias (Tabla 3).
2.5.2 APLICACIÓN DE LA MUESTRA
La aplicación de la muestra es el proceso mediante el cual la muestra es
depositada sobre la placa en general de gel de sílice. Es un paso fundamental
para mantener la calidad del método. Los requerimientos para una buena
aplicación son:
24
A. B
C
Figura 4. Comparación entre las partículas gel de sílice en TLC& HPTLC.
A) Micrografía electrónica de partículas irregulares de gel de sílice de TLC B)
Micrografía electrónica de partículas esféricas de HPTLC C) Comparación del
tamaño de partícula y su distribución del gel de sílice para placas de TLC y
HPTLC. Imágenes tomadas de Reich & Schibli, 2008 (Cortesía de Merck,
Darmstadt, Alemania)
25
Tabla 3. Fases estacionarias para TLC.
Fase Funcionalidad
Óxido de aluminio (Al2O3)
Más baja actividad que el gel de sílice. Los iones aluminio Al3+ son selectivos para sistema de electrones.
Tierra de Diatomeas Tierra de diatomeas, adecuado para cromatografía de partición de sustancias polares y para uso en zonas de concentración.
Sílice 50, 000 Porosa extremadamente inerte, es similar a Kieselguhr.
Silicato de Magnesio Polaridad entre la sílice y el óxido de aluminio, utilizada para separar azucares y sus derivados.
Celulosa Derivada del algodón, se utiliza para separación de sustancias hidrofóbicas.
Celulosa acetilada
PEI celulosa
Usada como primera fase reversa, se utiliza para la separación de mono, oligonucleótidos y nucleósidos.
Poliamida Se utiliza para sustancias proteicas.
Tomado de Reich & Schibli, 2008
26
1. Precisión en la aplicación de todas las muestras: La identificación de los
compuestos se basa principalmente en la distancia de migración conocida
como el factor de retención (Rf).
2. Volumen de la aplicación de la muestra: Es requerido principalmente en los
análisis cuantitativos, pero también se utilizan para la correcta comparación
en el método cualitativo. Para obtener una mejor resolución es
recomendable que las bandas sean delgadas.
3. Calidad de las placas: La superficie de la placa es muy delicada, por lo que
se debe evitar marcar los puntos de aplicación, debido a que las marcas de
lápiz o jeringa interfieren con la densitometría. En caso de la aplicación
manual, se debe tener cuidado para no rayar o dañar la placa.
Se conocen al menos dos formas de aplicar la muestra, una es la aplicación por
contacto, en la cual un capilar de volumen definido o una jeringa se ponen en
contacto con la capa de sílice y la muestra es transferida en puntos. Cuando se
aplica un mayor volumen de muestra es recomendable hacerlo por partes. El
tamaño del punto depende del volumen de contacto con el gel de sílice. También
se debe considerar la volatilidad del solvente de extracción de la muestra.
La otra forma es la aplicación en aerosol, este método permite aplicarla muestra
en forma de bandas, las cuales mejoran la resolución de las placas. Se
recomienda un ancho de banda de 6mm. Esta técnica permite aumentar el
volumen de la muestra en bandas más delgadas. El uso del aplicador automático
permite que la muestra se distribuya homogéneamente.
Actualmente, el dispositivo de aplicación de muestra más flexible y versátil es el
TLC Sampler 4 ATS4, CAMAG (Figura 5). El instrumento permite la aplicación de
hasta 66 muestras de viales mediante manchas con la técnica de contacto o de
aspersión. Todos los parámetros del ATS 4, incluidos los de limpieza de la jeringa,
están programados a través del software VisionCat, CAMAG.
27
A B
C D
Figura 5. Instrumentación para HPTLC.
En HPTLC además de contar con placas más eficientes se cuenta también con
instrumentación que permite mayor eficiencia, precisión y reproducibilidad de los resultados.
Estos equipos son: A) Aplicador de muestras ATS4, B) Cámara de desarrollo AD2, C)
Equipo de inmersión, D) Visualizador y registro digital. Visualizer. Los equipos mostrados
pertenecen a CAMAG (Tomado de Reich & Schibli, 2008).
28
2.5.3 DESARROLLO
El desarrollo es el proceso mediante el cual las moléculas de la muestra son
desplazadas por la fase móvil a través de la fase estacionaria. Es el paso central
de la cromatografía. Para lograr una buena separación de compuestos son varios
los parámetros que se tienen que considerar. En TLC, a diferencia de HPLC y GC,
el equilibrio entre la fase estacionaria y la fase móvil es alcanzado sólo
parcialmente, esto dificulta la reproducibilidad del método por lo que su desarrollo
es meramente empírico.
Es importante considerar los modelos establecidos teóricamente y la ayuda
asistida con computadora. La ventaja es que es un proceso independiente y
existen una gran cantidad de posibles combinaciones, que permiten elegir cuales
son los parámetros indicados en cada caso. Los parámetros que se pueden
modificar para el desarrollo son: a) la elección o modificación de la fase móvil, b) la
cámara de desarrollo, c) las condiciones de saturación de la cámara, d) el tipo de
desarrollo, ya sea simple múltiple o con gradientes.
A) Elección de la fase móvil: Para la correcta elección de la fase móvil es
necesario considerar la fuerza del solvente y la selectividad de la fase, de acuerdo
con los compuestos que se requieren analizar.
La fuerza del solvente: es el efecto de la fase móvil sobre la retención de la
muestra, es directamente proporcional con el Rf e inversamente proporcional a la
retención. Dependiendo el mecanismo de la retención, la fuerza del solvente se
debe a varias razones. Por ejemplo, en la cromatografía por adsorción la fuerza
del solvente se debe a la polaridad. Mientras que, en la cromatografía de partición,
depende de la interacción lipofílica. En la cromatografía de intercambio iónico la
fuerza del solvente depende del pH, así como la cromatografía de interacción
hidrofóbica (Figura 6).
29
Figura 6. Evaluación de la fuerza de solvente.
Influencia de la fuerza de solvente en la separación de compuestos en una
mezcla. Muestra problema, un colorante comercial desarrollada con Hexano al 0,
5, 10, 15, 20, 30, 40 y 90% de acetato de etilo (Tomado de Reich & Schibli, 2008).
30
El parámetro de la fuerza del solvente ε0 está definido como la energía libre de
adsorción de la molécula del solvente, por la unidad de área del adsorbente. Por
definición, el pentano tiene un valor de ε0 = 0.00 (Tabla 4).
Calcular la fuerza de los solventes en una mezcla es complicado utilizando la
Tabla 4, porque los cambios no son lineales con la proporción de los solventes,
cuando se añaden solventes fuertes a solventes débiles la fuerza aumenta
drásticamente. Sin embargo, existen gráficas en las que se indican las
proporciones a combinar para calcular ε0 en mezclas. De esta forma, es posible
calcular casi cualquier fuerza del solvente (Figura 7).
La selectividad del solvente de desarrollo: es la capacidad del solvente para
interactuar con más de un grupo de compuestos. Uno de los modelos más
ampliamente utilizados para explicar la selectividad es el modelo de Snyder, el
cual utiliza tres solutos de prueba: el etanol, el dioxano y el nitrometano para
determinar los tres parámetros de selectividad. La suma de los parámetros de
selectividad es siempre 1. El resultado de la gráfica de los valores individuales de
estos parámetros de un gran número de solventes en un sistema de coordenadas
triangulares es denominado “triángulo de selectividad”.
Otros parámetros: Los solventes también pueden ser clasificados como
localizados y no localizados, estos además tienen subgrupos como donadores de
electrones básicos y no básicos. Los solventes no polares son adsorbidos sólo
parcialmente. Cuando se aprovecha la superficie, los solventes participan en una
interacción específica con la fase estacionaria. Esto puede generar una buena
separación con un consumo de baja energía.
31
Tabla 4. Serie eluotrópica para disolventes puros sobre gel de sílice.
Solvente ε0 Índice de Polaridad ´P
Selectividad
Pentano C5H12 0.00 0.0 -
Hexano C6H14 0.00- 0.01 0.1 -
Ciclohexano C6H12 0.03 0.2 -
Tetracloruro de Carbono CCl4 0.11 1.6 -
Tolueno C7H8 0.22 2.4 VII
BencenoC6H6 0.25 - VII
Cloroformo CHCl3 0.26 4.1 VIII
Diclorometano CH2Cl2 0.32 3.7 V
Dietil eter (C2H5)2º 0.38 - 0.43 2.8 I
Acetato de etilo C4H8O2 0.38 – 0.48 4.9 VI
Acetona (C3H6O) 0.47 - 0.53 5.1 VI
Metil, t-butil eter (C5H120) 0.48 2.5 I
Acetonitrilo (C2H3N) 0.50 - 0.52 5.8 III
Thetrahidrofurano (C4H8O) 0.44 - 0.53 4.0 II
Alcohol isopropilico (C3H8O) 0.60 3.9 II
Metanol (CH3OH) 0.70 -0.73 5.1
(Reich & Schibli, 2008)
32
Figura 7. Fuerza de solvente de las mezclas en gel de sílice.
Gráfico para obtener la fuerza de solvente en mezclas. En este grafico se puede
determinar las mezclas de solventes que se pueden utilizar para una fuerza de
solventes específica. iPrCl, cloruro de isopropilo; DCM, diclorometano; Et2O, dietil
éter; ACN, acetonitrilo; MetOH, metanol (Tomado de Reich & Schibli, 2008 2008).
33
B) Cámara de desarrollo: Es importante la saturación de la cámara de desarrollo,
para ello es ventajoso colocar una hoja de papel filtro en una o más de las paredes
de la cámara y dejar un tiempo para lograr el equilibrio entre la fase móvil y la fase
estacionaria. En esta etapa ocurren cuatro procesos principales que son:
Saturación: Es cuando los solventes encuentran el equilibrio entre la fase líquida y
la fase gaseosa, parte de los solventes de la fase móvil se evaporan durante el
desarrollo, además en la cámara se encuentra el oxígeno, el nitrógeno y el vapor
de agua que van a contribuir con la presión de vapor del tanque. El tiempo que
tarde la saturación depende de la relación entre el solvente y la superficie de la
cámara. La saturación puede tomar algún tiempo, pero en la mayoría de los casos
es más o menos completo después de 20 a 30 minutos.
Es importante que la cámara se encuentre totalmente sellada para una adecuada
saturación. Se debe tener cuidado al abrir la cámara saturada para introducir la
placa de TLC, a fin de no alterar la saturación.
Preacondicionamiento: La fase estacionaria de la placa de HPTLC previamente
activada interactúa con las moléculas gaseosas de la fase móvil. La placa está
suspendida en la cámara sin entrar en contacto con el sistema de los solventes,
hasta lograr el equilibrio. Finalmente, la placa queda recubierta con una capa del
solvente que interacciona con la fase estacionaria.
La fase móvil ascendente "desplaza" hacia adelante las moléculas de la fase
estacionaria preadsorbidas y eventualmente crea un área completamente saturada
del solvente que es visible con un frente en la parte superior. Esta zona del frente
de solvente no es accesible a sustancias migratorias y todos los valores de Rf
resultan ser más bajos (Figura 8).
34
A B C
Figura 8 Influencia de la saturación de la cámara de desarrollo.
El preacondicionamiento de la cámara de desarrollo permite que la cámara se
sature con los vapores del sistema de solventes utilizado, esto favorece el
equilibrio entre la fase liquida y la fase gaseosa, obteniendo una mejor
separación de la mezcla sobre la placa. A)Proceso de saturación de la cámara
de desarrollo B) Placa desarrollada sin saturación de la cámara, C) Placa
desarrollada con saturación de la cámara(Tomado de Reich & Schibli, 2008 ).
35
La placa se coloca verticalmente, con la superficie que contiene el gel de sílice
hacia el interior de la cámara, permitiendo la exposición apropiada de la fase
estacionaria con el vapor del disolvente.
Evaporación: Durante el desarrollo de la placa, el solvente se desplaza sobre la
fase estacionaria y parte de éste se evapora. Esto sucede si la cámara no está
totalmente saturada, la evaporación depende tanto de la presión de vapor y del
equilibrio de adsorción de los componentes de la fase móvil.
C) Flujo de la fase móvil: En capa fina, la acción de la capilaridad provoca el flujo
de la fase móvil, debido a que la fase estacionaria es adsorbente, con partículas
pequeñas de gran energía superficial. Esta energía disminuye cuando la fase
móvil entra en la fase estacionaria. El cambio de energía es proporcional a la
tensión superficial y al volumen de la muestra, e inversamente proporcional al
diámetro de los poros. Los poros pequeños se saturan primero que los poros
grandes. Se establece un gradiente del volumen frontal, lo que dificulta la
detección del frente del disolvente "verdadero". Conforme avanza la fase móvil a
través de la fase estacionaria, la velocidad de la fase móvil decrece. Suponiendo
una distribución de tamaño de partícula uniforme, la constante de velocidad
aumenta linealmente con el tamaño de partícula promedio y, por lo tanto, la
velocidad frontal del disolvente es mayor para las capas de partículas gruesas.
En HPTLC las partículas son más pequeñas, la placa tiene una mayor densidad
de esta y presenta mayor resistencia al flujo. La velocidad constante también
depende de la linealidad en la relación de tensión superficial con respecto a su
viscosidad. Independientemente del tamaño de las partículas, la distancia en
donde se observa una mejor separación de las bandas está entre 6 y 7 cm a partir
del punto de la aplicación de la muestra (Figura 9).
36
Figura 9. Influencia de la distancia de desarrollo.
Al permitir un mayor desplazamiento de los compuestos presentes en la mezcla
de interés sobre la placa se favorece la separación de éstos e incluso la de
aquéllos que presentan afinidades similares. Esto lo podemos verificar en el
ejemplo. Extracto de aceite de manzanilla en placa de HPTLC con acetato de
etilo, tolueno (5:95v/v). Con un incremento en la distancia de desarrollo de 3 a
8cm (Tomado de Reich & Schibli, 2008).
37
Influencia de la humedad en la actividad de la placa .
Se conoce como humedad absoluta al vapor de agua que se encuentra en el
ambiente, cuando la cámara de desarrollo se encuentra en contacto con el
ambiente. El porcentaje de humedad relativa es la relación entre la humedad
absoluta y la humedad de saturación de la cámara.
% RH=(𝐻𝑎𝑏𝑠
𝐻𝑠𝑎𝑡) ∗ 100
Las placas de gel de sílice, al estar en contacto con el vapor de agua, generan un
equilibrio de adsorción. Si consideramos que entre más contacto tenga con el
agua atmosférica en fase gaseosa, más se gelifica la sílice por lo que pierde su
actividad, mientras que los componentes de la muestra interactúan menos con la
placa generando valores de Rf mayores (Figura 10).
Automatización del desarrollo.
Hay mucha variación en el desarrollo de la TLC principalmente en la saturación,
debido a que las condiciones no se pueden controlar fácilmente, por lo cual, se
propuso el uso de una cámara de desarrollo automática (Automatic Developing
Chamber 2, CAMAG) (Figura 5), que es capaz de controlar los parámetros de
preacondicionamiento, saturación, elución y secado de la placa. Estos parámetros
se controlan a través del software VisiónCats para realizar un proceso
automatizado, lo que permite mayor reproducibilidad del método de desarrollo.
2.5.4 DETECCIÓN Y DERIVATIZACIÓN
La detección de los compuestos presentes en la placa cromatográfica por el
método de TLC desarrollada se realiza mediante la observación de las bandas
presentes con ayuda luz blanca o de una fuente de radiación selectiva como luz
ultravioleta cercana 254 nm o luz ultravioleta lejana 366nm. Los compuestos
38
A B C
Figura 10.Influencia de la humedad relativa (RH).
La humedad relativa influye directamente sobre los valores de Rf en el análisis de
separación de mezclas. Pues entre mayor humedad se encuentre en la cámara de
desarrollo, se aprecia una mejor separación. A) RH=17%, B) RH=47%, C)
RH=75% (Tomado de Reich & Schibli, 2008).
39
coloridos se pueden observar en la placa a simple vista con una lámpara de luz
blanca. En cambio, los compuestos que absorben luz UV a una longitud de onda
(λ) de 254 nm, son visualizados con ayuda de un indicador como fluorescencia
incorporado en la fase estacionaria. Generalmente se utiliza la fluoresceína que
absorbe a λ = 254 nm y emite a una longitud de onda correspondiente al color
verde claro. Mientras que, si algún componente de la muestra absorbe a λ = 254
nm, se observa una zona obscura donde se encuentran dichos componentes. Si
se utiliza λ= 366nm, los compuestos que absorben a esta longitud de onda pueden
producir una fluorescencia visible sobre un fondo oscuro. Los compuestos que no
pueden ser observados con ninguna de las condiciones anteriores son
derivatizados.
Existe un gran número de reactivos derivatizantes que se pueden utilizar. La
elección adecuada depende de la característica de los compuestos que se están
analizando. Se han establecido al menos tres métodos diferentes de aplicación del
derivatizante (Berkov-Strahil et al., 2006).
Derivatización por fase gaseosa.
La derivatización a través de la fase gaseosa ofrece la ventaja de ser rápida y
uniforme. Para realizar esta derivatización se dispone de pocos reactivos
actualmente. Estos son: Yodo, bromo y cloro, así como ácidos volátiles, bases y
algunos gases como: NH3, H2S y NO.
En la práctica, la derivatización en la fase gaseosa puede realizarse fácilmente en
las cámaras de doble fondo, donde se coloca el reactivo. Por ejemplo, cristales de
yodo o se genera cloro a partir de HCl y permanganato, en un fondo alterno.
Mientras que la placa se sitúa en el fondo delantero de la cámara, con el gel de
sílice hacia el interior de la cámara.
40
Derivatización por aspersión.
La aspersión es ampliamente utilizada para la aplicación de los reactivos sobre la
placa de TLC porque ofrece varias ventajas: A) Es simple y rápida, especialmente
con placas pequeñas; B) No se necesita equipo costoso; C) Sólo se utilizan
pequeños volúmenes de reactivo. La aspersión es muy flexible y particularmente
útil cuando se deben aplicar reactivos en secuencia.
Derivatización por inmersión.
Sumergiendo una placa de TLC en el reactivo derivatizante, se puede conseguir
una aplicación muy homogénea. La inmersión tiene que realizarse suavemente
para evitar las marcas en la placa. El uso de un dispositivo de inmersión puede
mejorar significativamente la reproducibilidad.
La concentración del reactivo es fácil de mantener, ajustando la velocidad vertical
y el tiempo de inmersión. No se generan humos y la exposición a los productos
químicos peligrosos es limitada. Se puede utilizar equipo de inmersión de CAMAG
(Véase Figura 5C). Sin embargo, en algunos casos se produce escurrimiento de
las bandas.
Derivatización por calentamiento.
La mayoría de las reacciones químicas utilizadas en la derivatización en TLC
requieren calentamiento para completarse. Los métodos principales son el horno,
el calentador de placa, las pistolas de aire caliente o los calentadores de luz
infrarroja.
41
2.5.5 SISTEMA DE DOCUMENTACIÓN
La inspección visual de la placa siempre es subjetiva. Para poder comparar los
resultados es necesario documentar adecuadamente el cromatograma, de forma
duradera para permitir la posterior verificación. Las imágenes son generadas con
cámaras digitales. Se encuentra disponible el sistema de documentación DigiStore
(CAMAG) (Véase Figura 5). Una característica común de este sistema es la
disponibilidad de varios modos de iluminación: UV λ = 254 y 366 nm, luz blanca en
transmisión, reflexión o ambas, permitiendo la generación de múltiples imágenes
de la misma placa (Figura 11).
2.5.6 DENSITOMETRÍA.
La densitometría es el método utilizado para la detección de las sustancias
separadas por TLC y la generación de las curvas provenientes de estas
sustancias. Inicialmente, se medía la intensidad de las bandas en la placa
cromatográfica. La técnica hace incidir un haz de luz monocromático sobre la
placa. Se registra la cantidad de luz que se refleja con la ayuda de un
fotomultiplicador, en función de la posición.
La luz emitida por la lámpara choca con las partículas del gel de sílice, que al ser
color blanco refleja la luz. El detector está colocado en un ángulo de inclinación de
45°. Solo una pequeña porción de la luz que recibe la placa se refleja llegando al
detector para ser analizada. A esta medida se le conoce como remisión o
reflexión. Cuando el haz de luz se mueve a través de la placa limpia el detector
registra una línea base (LB), en función de la posición, que corresponde al 100%
de la reflexión. Para trazar el cromatograma, la señal se invierte y la línea base
tiene un valor de cero y la absorción muestra valores positivos.
En donde se localiza la sustancia que absorbe a la longitud de onda de la luz
entrante, la señal que se refleja será más baja. Al invertir la señal se formará el
pico del cromatograma. En la zona de mayor absorción se observará un pico más
42
A B C D E
Figura 11. Comparación del perfil con diferente sistema de iluminación.
Muestra de1, Panax ginseng; 2, P. quinquefolium; A) Sin derivatizar, luz UV 4254
nm. B) Derivatizada, luz UV366 nm. C) Derivatizada, luz blanca reflexión. D)
Derivatizada, luz blanca transmisión. E) Derivatizada, luz blanca reflexión y
transmisión (Tomado de Reich & Schibli, 2008).
43
alto. A esta técnica se conoce como medición de la absorción. Si una sustancia
puede excitarse para fluorecer al incidir la luz UV, se puede realizar la medición de
la fluorescencia. En este caso, se coloca un filtro: de paso de banda o de corte,
entre la placa y el detector. La luz monocromática llega a la placa, pero la porción
de luz reflejada en la dirección del detector está bloqueada cuantitativamente. La
señal de línea de la base resultante es "cero". Generalmente se utiliza como
fuente de luz una lámpara de mercurio o de deuterio.
Si el haz pasa una zona de fluorescencia, la luz emitida que tiene una longitud de
onda más larga puede pasar el filtro y alcanzar el detector. Entonces se observa
un pico. En el cromatograma, existen algunos casos especiales en los que el
fotomultiplicador se coloca por debajo de la placa de TLC. De esta manera, la
placa se puede medir utilizando luz transmitida, siempre que la luz no sea
absorbida por el soporte de la placa.
2.5.7 ANÁLISIS DE RESULTADOS.
Para el análisis de los componentes es importante conocer datos de rutina como:
el frente del solvente, el punto de la aplicación de la muestra o los parámetros del
desarrollo de la placa, debido a que estas condiciones no son constantes. A la
relación que existe entre el desplazamiento de la sustancia a analizar con respecto
al frente de solvente, se le conoce como Factor de retención (Rf) y se calcula en la
siguiente ecuación:
𝑅𝑓 =𝑍𝑖
(𝑍𝑓 − 𝑍0)
Donde Rf es el factor de retención, Zi es la distancia de migración de la sustancia,
Zf es la distancia de migración del frente de solvente medida desde la línea de
aplicación, Z0 es distancia entre la línea de inmersión (Figura 12). Otro punto
importante es mantener constante el volumen del solvente para que la línea de
44
Figura 12.Determinación del Rf de acuerdo con su desplazamiento.
Donde Zi distancia de migración (MD) de la muestra en milímetros. Zf distancia de
migración del frente de solvente en milímetros medida desde la línea de inmersión.
Z0distancia entre la línea de inmersión y la aplicación de la muestra (Reich &
Schibli, 2008).
45
inmersión se mantenga en la misma posición para obtener resultados
reproducibles ya que si se mueve la línea de inmersión la sustancia se desplaza.
2.5.8 PERFIL FITOQUÍMICO
El perfil cromatográfico en capa fina de alta resolución es la imagen visual
obtenida a partir del cromatograma en placa, esta imagen permite obtener un
amplio espectro de información sobre la muestra y realizar más de un análisis en
la misma placa. La calidad del análisis depende de la calidad de la imagen
electrónica de la placa. Para obtener una buena comparación es necesario
considerar el uso de sustancias de referencia, así como entandares que
determinen si el sistema utilizado es adecuado.
En caso de no existir una sustancia de referencia, es necesario realizar varias
réplicas biológicas en distintas placas del extracto analizado para que se utilice
como sustancia de referencia. El perfil fitoquímico de las muestras desconocidas
debe ser similar al de la sustancia de referencia.
La similitud entre una muestra y otra se determina de acuerdo con el análisis
visual de la imagen electrónica obtenida es decir se comparan la resolución,
número, posición, color e intensidad de las bandas. Con base a este análisis se
determinan los criterios de aceptación del perfil.
Para establecer el perfil fitoquímico de una especie es recomendable colectar y
analizar muestras de diferente origen o región para establecer las posibles
variaciones del perfil. Las placas desarrolladas bajo las mismas condiciones
permiten la comparación del perfil entre ellas, es decir, puedo comparar un análisis
actual con el cromatograma realizado hace dos años.
Para el análisis del perfil fitoquímico se debe tomar una muestra representativa
para la extracción. Esto significa que normalmente se debe incluir más de una
46
muestra biológica para asegurar que el perfil sea representativo. También, es
importante que el perfil sea lo suficientemente selectivo como para destacar
características especiales. Esto permitirá detectar diferencias significativas entre
dos o más extractos.
47
3. JUSTIFICACIÓN
El perfil fitoquímico de las especies vegetales mexicanas permite generar
información, que se puede utilizar como herramienta para garantizar la identidad y
dar seguridad en la comercialización o el consumo de estas plantas de la
herbolaria en preparaciones herbales. Este trabajo tiene como objetivo generar y
estandarizar una técnica rápida y económica para la obtención del perfil
fitoquímico de cinco especies de plantas mexicanas de la región de Guanajuato.
4. HIPÓTESIS
Se puede obtener un perfil fitoquímico preciso, simple con un alto grado de
resolución y repetitividad, de los compuestos bioactivos con potencial
farmacológico de 5 especies vegetales mexicanas: Argemone ochroleuca, Cirsium
rhaphilepsis, Montanoa tomentosa, Heliopsis longipes y Thevetia thevetioides, a
través de la técnica de cromatografía de capa fina.
48
5. OBJETIVO GENERAL
Obtener del perfil fitoquímico de algunas de las especies vegetales más
características de la región.
5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Para la selección de las especies a analizar recopilar de información
taxonómica de especies vegetales en estudio el compendio de Flora del
Bajío Guanajuatense y de Regiones Adyacentes.
2. Seleccionar y colectar especies vegetales de interés biotecnológico.
3. Herborizar y certificar la descripción de las especies en el herbario de
Pátzcuaro.
4. Extracción de metabolitos de los diferentes órganos: raíz, tallo, hoja,
inflorescencia y semilla de las especies.
5. Realizar análisis cromatográfico por capa fina (HPTLC) de los
principales grupos de metabolitos secundarios presentes en los
diferentes tejidos de las especies analizadas
6. Identificación de algunos de los compuestos principales por CG/EIMSD
u otros métodos.
49
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. MATERIAL BIOLÓGICO
Se trabajó con 5 especies vegetales distribuidas y localizadas en la región de
Guanajuato. Para realizar el análisis de los principales compuestos presentes en
cada especie, se utilizaron diferentes órganos de cada especie, esto basado en
sus aplicaciones en la medicina tradicional.
Las especies fueron localizadas y se colectaron de manera aleatoria para su
identificación en base a sus características taxonómicas. Se colectaron tres
especímenes en fase reproductiva para herborización y tres para la extracción de
metabolitos de cada especie (Figura13).
6.2 EQUIPO
Para la cromatografía de capa fina se utilizó el equipo de CAMAG que consta de
un aplicador automático para TLC (Automatic TLC Sampler 4. ATS4180608); un
desarrollador automático de placas de TLC (Automatic Developing Chamber 2,
ADC2200833); y un visualizador de TLC (Visualizer Documentation &Evaluation
System). El software utilizado para el desarrollo de la HPTLC y el control del
equipo fue VisonCat versión 2.3 SP1.
Además, como apoyo para el análisis de algunos compuestos se utilizó un
cromatógrafo de gases (Agilent Technologies 7890A) provisto con un inyector
automático y acoplado a un detector selectivo de masas (Agilent Technologies
5973) con ionización por impacto electrónico (GC/EIMS). Para el procesamiento
de la información de iones se utilizó el programa MS Chem y el software de
deconvolución automatizada de espectros de masas e identificación del NIST:
AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System),
herramienta que permite extraer los iones asociados a un componente y
compararlos con la base de datos de espectros de masas NIST (National Institute
of Standards and Technology, Mass spectra Library).
50
A B C
D E
Figura 13. Especies seleccionadas para la obtención del perfil fitoquímico.
A) Argemone ochroleuca Sweet B) Cirsium rhaphilepis Hemsl C) Montanoa
tomentosa Cerv D) Heliopsis longipes A. Gray E) Thevetia thevetioides HBK
Fotografías tomadas por Buitimea Cantúa 2015
51
6.3 PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Placas analíticas para TLC: Placa con base de aluminio y matriz de gel de
sílice impregnada de fluoresceína, marca SIGMA-ALDRICH.
Placas analíticas para TLC: Placa con soporte de vidrio de gel de sílice 60
con fluoresceína F254 marca Macherey & Nagel.
Placa preparativa: Placa con base de vidrio y una capa de gel de sílice de
500 micrones de espesor de la marca ANALTECH.
Placas analíticas para HPTLC: Placa con soporte de vidrio y una capa de
gel de sílice 60G, sin fluoresceína o 60G con fluoresceína (F254) de la marca
SIGMA-ALDRICH.
6.4. REACTIVOS
Los solventes utilizados fueron de la marca Karal grado analítico los
reactivos sólidos de la marca KEM grado analítico.
Reactivos para la derivatización y detección de componentes en TLC.
Existen algunas revisiones de reactivos o reveladores para este fin como Wagner
y Bladt (1996). Sin embargo, aquí se mencionan solamente los utilizados para los
fines de este estudio
1. Reactivo de Dragendorff.
Este reactivo es utilizado para la detección de alcaloides y compuestos
heterocíclicos de nitrógeno. Se preparan dos soluciones A y B, para
posteriormente preparar la solución madre mezclando 1 mL de A y 1mL de B.
Finalmente, se prepara una mezcla de aspersión con 2 mL de solución madre, 4
mL de ácido acético glacial y 20 mL de agua. Solución A: Se disuelven 0.85 g de
nitrato de bismuto básico en 10 mL de ácido acético glacial y 40 mL de agua bajo
52
calentamiento. Si es necesario, filtrar. Solución B: Disolver 8 g de yoduro de
potasio en 30 mL de agua.
2. Reactivo de Ninhidrina.
Utilizado para la detección de grupos amino, como aminas primarias, aminoácidos,
efedrina. Se disuelven 30 mg de ninhidrina en 10 mL de n-butanol, seguido de0.3
mL de ácido acético al 98%.
3. Reactivo de productos naturales y polietilenglicol.
El Reactivo de productos naturales se utiliza para la identificación de flavonoides.
Se produce una intensa fluorescencia a UV-365 nm, el comportamiento de
fluorescencia depende de la estructura. Si se adiciona polietilenglicol con reactivo
de productos naturales aumenta la sensibilidad en la detección de flavonoides.
Reactivo de productos naturales: Se pesa 1 g del éster β etil amino del ácido
difenil bórico, o difenil butil oxietilamina, se disuelve en 10 mL de metanol.
Polietilenglicol: Se pesa 0.5 gramos de polietilenglicol 4000, se disuelve en 10 mL
de etanol.
4. Reactivo de Kedde
Este reactivo es utilizado para la identificación de cardenólidos. Se prepara una
solución de NaOH 2M en metanol y otra de ácido dinitrobenzoico al 3% en etanol.
Se mezcla 1:1 las dos preparaciones y se asperja o se sumerge.
5. Reactivo alfa naftol
Este reactivo se utiliza para la identificación de carbohidratos. Se pesa 1.5 g de
alfa naftol y se mezcla con 135 mL de etanol absoluto, 9 mL de H2SO4 al 50% en
agua, se asperja o se sumerge.
53
6. Reactivo vainillina- ácido sulfúrico
Con este reactivo es posible identificar componentes de aceites esenciales como
terpenoides o fenilpropanoides. Se pesa 0.1 g de vainillina y se afora hasta 10 mL
con etanol solución de vainillina al 1% en etanol (I) y una solución de ácido
sulfúrico al 10% en etanol.
7. Reactivo de anisaldehído-ácido sulfúrico.
Con este reactivo es posible identificar todo tipo de terpenos. Se mezcla 0.5 mL de
anisaldehído, con 0.5 mL de ácido sulfúrico y 0.1 mL de ácido acético glacial,
finalmente, se afora hasta 10 mL con etanol.
6.5 COLECTA, HERBORIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPECIES.
6.5.1 Identificación de especies y herborización.
Para cada especie se colectaron seis especímenes: tres para herborizar y tres
para la extracción. Se tuvo cuidado de colectar especímenes en etapa
reproductiva. Todo el material vegetal utilizado se colectó en CINVESTAV Irapuato
y sus alrededores. Su ubicación se encuentra en N 20° 43′ 8.9″, W 101° 19′ 42.6″
1,740 msnm. Las fechas de colecta fueron las siguientes.
Argemone ochroleuca, Cinvestav Irapuato, 9 de octubre de 2015
Cirsium rhaphilepis, Cinvestav Irapuato, 13 de julio de 2015
Montanoa tomentosa, Cinvestav Irapuato, 16 de diciembre de 2015.A
Heliopsis longipes, Cinvestav Irapuato, 24 de mayo de 2016 en el
invernadero del Dr. Jorge Molina Torres.
Thevetia thevetioides, Cinvestav Irapuato, 11 de diciembre de 2016.
Datura stramonium, Cinvestav Irapuato, 11 de septiembre de 2015.
Argemone platyceras, Cinvestav Irapuato, 30 de noviembre de 2015.
54
Para la herborización se colectaron al menos tres especímenes de cada en su
fase reproductiva, las plantas se lavaron con agua de la llave, se eliminó el exceso
de agua con papel absorbente. El montaje del espécimen se realizó sobre una
cartulina blanca de 30 X 42 cm. Se dejó prensar hasta sequedad. Para una
correcta identificación al momento de colocar la planta sobre la cartulina, se tuvo
cuidado de que las hojas estuvieran bien extendidas y se mostraran ambos lados,
además de que contara con flor, fruto y tallo. La identificación taxonómica se
realizó utilizando la ficha técnica descrita por Dr. Jerzy Rzedowski y la Dra.
Graciela Calderón de Rzedowski, de acuerdo con cada especie en la Flora del
Bajío y de Regiones Adyacentes. Finalmente se enviarán a certificación en el
Herbario del Instituto de Ecología, A.C., México (IE-BAJÍO) Pátzcuaro Michoacán.
6.6 METODOLOGÍA GENERAL
6.6.1 APLICACIÓN DE LA MUESTRA.
Con el extracto obtenido de hoja, raíz o semilla de cada especie se dosificaron
distintos volúmenes (Tabla 5), sobre una placa de TLC de gel de sílice 60 F 254
con soporte de vidrio marca Macherey & Nagel de 10 X10 cm. La aplicación se
inició a 1.5 cm de la base de la placa, el tamaño y separación entre bandas, el
frente de solvente y la velocidad de dosificación fue distinta en cada especie
(Tabla 5). En base a los resultados obtenidos en las placas posteriores se utilizó
un volumen de aplicación de entre 2 y 4 µL por banda de muestra según la
especie.
55
Tabla 5. Condiciones de aplicación de los extractos en placas de HPTLC
Especie Órgano Volumen de aplicación
Longitud de banda
Separación de banda
Frente de solvente
Velocidad dosificación
Argemone ochroleuca
Hoja 2 y 4 µL 6mm 7.2mm 75mm 0.15L/s
Cirsium rhaphilepis
Hoja 2µL 8mm 9.4mm 84mm 0.15 L/s
Montanoa tomentosa
Hoja 2, 4 y 6µL 10mm 14mm 80mm 0.15 L/s
Heliopsis longipes
Raíz 2µL 9mm 11.4mm 70mm 0.10 L/s
Thevetia thevetioides
Semilla 2, 4, 5 y10µL 15mm 17mm 85mm 0.10 L/s
56
6.6.2 DESARROLLO.
El desarrollo de la TLC es un paso fundamental para obtener el perfil
cromatográfico, por lo que se probaron distintas condiciones en el desarrollo para
cada especie. Principalmente se evaluaron los sistemas de solventes.
Las condiciones de desarrollo se utilizaron de acuerdo con las que maneja el
software VisionCat. Donde el tiempo de saturación de la cámara fue de 20 min, el
tiempo de activación de la placa 10 min, el tiempo de secado y
preacondicionamiento de la placa 5 min cada uno. En algunos casos la saturación
y preacondicionamiento se modificaron. El equipo ADC2 de CAMAG cuenta con
control de humedad que se ajustó al 47% utilizando una solución saturada de
tiocianato de potasio en el equipo. En todos los casos la humedad varió entre el
48% y el 50% según la lectura de la cámara.
6.6.3 TLC PREPARATIVA.
En una placa preparativa de TLC Sigma Aldrich de 10 X 20 cm se aplicaron 500
µL del extracto de hoja, raíz o semilla según la especie en una banda única de
170mm, con una separación de 1.5 cm de la orilla de la placa por cada lado y a
una de 1.5 cm de la parte inferior. Una velocidad de aplicación de 150 nL/s para A.
ochroleuca, M. tomentosa. En cambio, se utilizó la velocidad de 100 nL/s para H.
longipes y T. thevetioides. En el desarrollo se utilizaron las mismas condiciones
establecidas en cada especie (método estandarizado). Una vez desarrollada la
placa se utilizó el método de detección estandarizado en cada caso (Tabla 6). Las
bandas sin derivatizar se rasparon, se eluyeron del gel de sílice con etanol o
metanol según sea el caso y se sonicaron por 5 min. Finalmente, se recuperó el
sobrenadante por centrifugación a 13,000xg por 5 min y se almacenó en frascos
ámbar a 4°C hasta su análisis.
57
Tabla 6. Métodos cromatográficos seleccionados para la obtención del perfil fitoquímico
Especie Tipo de compuesto
Método de extracción Sistema de solventes (v/v)
Detección
A. ochroleuca Alcaloides 5 g de hoja fresca molida con N2 liq.
0.5mL de NH4OH al 10%. Maceración por 72 h con 50 mL de CH3OH
1-Butanol, Acetato de etilo, acido fórmico, agua (30:50:10:10)
Sin derivatizar
λ = 366 nm
C. rhaphilepis Fenoles 2 g de hoja fresca molida con N2 liq.
Macerar en 10 mL de CH3OH por 72 horas.
acetato de etilo, ácido acético, ácido fórmico, agua (100:11:11:26
Reactivo de Productos Naturales NP
λ = 366 nm
M. tomentosa Terpenos 5 g de hoja fresca molida con N2 liq.
Macerar a 4°C por 72 horas en 50 mL de bencidina. Concentrar a sequedad. Resuspender en 2 mL de DCM - metanol (1:1)
hexano, acetato de etilo (4:1)
Vainillina- H2SO4 observado a luz blanca RT
H. longipes Alcamidas 1 g de raíz fresca molida con N2 liq.
Macerar a 4°C por 72 horas en 50 mL de Etanol.
Concentrar hasta un volumen de 2 Ml
hexano, acetato de etilo (2:1)
Anisaldehído – ácido sulfúrico observado a luz blanca RT
T. thevetioides Glucósidos cardiotónico
s
1 g semilla fresca molida con N2 liq. Desgrasado con hexano en equipo Soxhlet. Extracción con etanol 10 ciclos en Soxhlet. Concentrar hasta 2 mL
acetato de etilo, metanol, agua (81:11:8)
Reactivo de Kedde,
alfa naftol observado con luz blanca RT
58
6.7 ANÁLISIS DE ALCALOIDES PRESENTES EN ARGEMONE OCHROLEUCA.
Extracción: Se estandarizó el método de extracción de los metabolitos presentes
en A. ochroleuca. Para la estandarización se utilizó 1 g de hoja fresca, en un
volumen de 5 mL de solvente (0.2g/mL), Una vez estandarizando el método de
extracción, se extrajo el metabolito de interés del resto de los órganos, para
métodos HPTLC en general (ver Reich, 2012,HPTLC Association Methods).
Comparación entre métodos de extracción de alcaloides en Datura sp.
Por la cantidad de alcaloides reportada en el género Datura se realizó una
comparación entre 6 métodos de extracción específicos para alcaloides (Tabla 7):
A. Método general de extracción para alcaloides A (Wagner y Bladt (1996).
B. Método de extracción para alcaloides tipo tropano (Caligiani et al. 2011).
C. Método de extracción para alcaloides tipo tropano (EI-Bazaoui et al., 2011)
D. Método de extracción para alcaloides tipo tropano (Jakabová et al., 2012).
59
Tabla 7. Métodos de extracción para alcaloides en hoja fresca de Datura.
stramonium
Método Peso (g) Solventes y reactivos Tipo de extracción
Wagner 1.109 1 mL de hidróxido de amonio al 10% y 10
mL de metanol Reflujo durante 30 min a 45 °C.
Caligiani 1.028 Se lavó con 0.5 mL de KOH al 5% en
metanol, se eliminó el solvente y se adicionó DCM
Maceración por 24h en DCM
Bazaoui 0.775 1 mL de metanol y 0.5 mL hidróxido de
amonio al 10% Calentamiento a ebullición 10 min
Jakabová 0.100 se adicionó 10 mL de una solución
metanol-agua (3:2) v/v Sonicación por 30 min a 40°C.
Extracción Soxhlet
1.002 80 mL de metanol. Se utilizó un cartucho de extracción, Whatman de alta celulosa de 30x80 Iq/Alto (mm)
Soxhlet 10 ciclos a 60°C
Método de Todd
100.002 Extracción:100mL metanol
Purificación:
125 ml de HCl 0.5 N
5 lavados con 75mL de éter etílico. 5 lavados con CCl4.
Alcalinización de la fase metanólica con NO3OH hasta pH de 11
6 lavados con CCl4
Recuperar fase de CCl4 Evaporar en rotavapor suspender en 1mL de metanol.
Extracción: Maceración 72h.
Concentración hasta 25 mL.
Purificación.
Método de Wagner
modificado.
50 5 mL de hidróxido de amonio al 10% y 500 mL de metanol
Maceración por 72h
60
E. Método de extracción con metanol en equipo Soxhlet (Comunicación
personal Molina-Torres, 2016).
F. Método de extracción para alcaloides (Todd et al 1995).
Para todos los métodos se utilizó 1 g de hoja fresca de Datura sp. Molida con
nitrógeno líquido, excepto cuando el método indica otra cantidad. En todos los
casos una vez que se obtuvo el extracto, se filtró la muestra con papel Whatman
541 y se concentró hasta un volumen de 2 mL. Se almacenó en refrigeración
hasta su análisis.
Extracción de alcaloides isoquinolínicos en Argemone ochroleuca por
el método de Todd y el método de Wagner.
Para extraer los alcaloides isoquinolínicos presentes en A. ochroleuca se realizó
una comparación entre el método de Todd, así como una adaptación del método
de Wagner, en este último en lugar de extraer por reflujo se extrajo por
maceración durante 72 horas (Tabla 7).Para ambos métodos se utilizó 10 mL de
etanol por cada gramo de hoja fresca de A. ochroleuca. Se realizó el perfil de
ambos métodos y se eligió el mejor.
Finalmente, para realizar el perfil de toda la planta se separó cada uno de los
órganos de las tres réplicas biológicas de A. ochroleuca, se pesaron (Tabla 8), se
dejaron en maceración durante 72 h a temperatura ambiente en 10 mL de metanol
absoluto por gramo de muestra fresca. Se extrajeron los alcaloides durante 72 h y
después de filtrar cada extracto con papel Whatman No. 541, se llevó a sequedad
y se almacenó a 4°C hasta su análisis.
Aplicación de la muestra: Se aplicaron distintos volúmenes (2, 4, 6 8, 10, 12 y
14 µL) del extracto obtenido de hoja R1 sobre la placa de TLC, el ancho de las
bandas fue de 8mm con una separación de 9.4 mm entre bandas. La velocidad de
dosificación fue de 150 nL/s, condición correspondiente a extractos metanólicos.
61
Tabla 8. Peso de los órganos de Argemone ochroleuca
Órgano Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Inflorescencia 19.3 g 9.9 g 2.5 g
Tallo 125.2 g 64.5 g 32.2 g
Hoja 159.5 g 55.8 g 50.0 g
Raíz 25.5 g 17.1g 14.8 g
62
En base a los resultados obtenidos, en las placas posteriores se utilizó un volumen
de 4 µL por banda de muestra.
Desarrollo: Para determinar el mejor sistema de solventes se probaron cuatro
mezclas de solventes que se han utilizado para alcaloides.
1. Cloroformo metanol 4:1 v/v.
2. Metanol, diclorometano 10:90 v/v., con 5% de hidróxido de amonio.
3. 1-Butanol, acetato de etilo, acido fórmico, agua 30:50:10:10 v/v.
4. Acetato de etilo, metanol, agua 100:13.5:10 v/v.
En una placa de TLC se cargaron 4µL por banda del extracto de hoja de A.
ochroleuca y la placa se colocó en el desarrollador automático de TLC utilizando la
mezcla de solventes 1. La cámara se saturó durante 20 minutos con la mezcla
anterior, el % de humedad relativa se mantuvo a 47%.La activación de la placa fue
de 10 min y tanto el secado como el preacondicionamiento de la placa fueron de 5
min. El desarrollo se detuvo hasta que el frente de solvente alcanzó una altura de
85 mm. El mismo proceso se repitió con cada uno de los sistemas solventes.
Detección y derivatización: Los alcaloides se detectaron mediante la
observación a 366 nm sin derivatizar. Posteriormente se realizaron cuatro
procesos de derivatización para mejorar la definición de las bandas. Los métodos
de derivatización fueron los siguientes: 1) Reactivo de Dragendorff, 2) Ninhidrina,
3) Anisaldehído H2SO4,4) Reactivo de Wagner.
I. Sin derivatización: Una vez desarrollada la placa, se observó con una lámpara
de luz blanca de transmitancia (T), reflectancia(R) y la combinación de ambas
(RT), así como con una lámpara de Luz UV a 254 nm y 366 nm.
II. Derivatización con el Reactivo de Dragendorff. La placa se derivatizó con
reactivo de Dragendorff. Para ello se asperjó la placa con 20 mL de reactivo de
Dragendorff. La placa se observó con una lámpara de luz blanca (T, R, RT).
63
III. Derivatización con el reactivo de Ninhidrina. La placa se derivatizó con
ninhidrina. Se realizó la inmersión de la placa en una cámara de inmersión con 50
mL de reactivo de ninhidrina. La placa se calentó por 5 min a 100°C y finalmente
se observó con lámpara de luz blanca (T, R, RT).
IV. Derivatización con yodo - reactivo de ácido hidroclorhídrico. La placa de
TLC se asperjó con 5 mL de la solución de yodo y posteriormente con 5 mL de la
solución de ácido clorhídrico. Finalmente se observó con lámpara de luz blanca (T,
R, RT).
V. Derivatización con anisaldehído - ácido sulfúrico. La placa de TLC fue
asperjada con 10 mL de la mezcla de anisaldehído-ácido sulfúrico, se calentó a
100°C por 5 min y se observó con lámpara de luz visible (T, R, RT).
Perfil fitoquímico: Se utilizaron los extractos de los órganos (tallo, hoja,
inflorescencia y raíz) de los tres especímenes, obtenidos con el método de
extracción de Wagner adaptado. Considerando que en placas de HPTLC se
requiere menor cantidad de muestra, se dosificó 2 µL por banda de cada extracto
sobre una placa de HPTLC de gel de sílice 60 F 254 con soporte de vidrio marca
Sigma Aldrich de 10X20 cm. La aplicación se inició a 1.5 cm de la base de la
placa, el tamaño de las bandas, la separación entre bandas, el frente de solvente y
la velocidad de dosificación fueron de acuerdo con el método de aplicación
estandarizado.
Identificación de compuestos.
TLC Preparativa: En la placa preparativa de TLC se aplicaron 500 µL de
extracto de la raíz R1 de A. ochroleuca. Para el desarrollo se utilizó el sistema de
solventes 1-butanol, acetato de etilo, ácido fórmico, agua (30:50:10:10 v/v), con
una saturación de la cámara de 20 min, una activación de 10 min, secado y
preacondicionamiento de la placa de 5 min. Una vez desarrollada la placa se
64
utilizó una lámpara de luz ultravioleta a 365 nm para identificar y marcar las
bandas obtenidas. Posteriormente, se raspó cada una de las bandas, se colocaron
en tubos Eppendorf de 2mL y se adicionó metanol hasta un volumen de 1.5 mL.
Se sonicó y centrifugó.
Análisis de compuestos por GC/EIMS: Para identificación de alcaloides en
A. ochroleuca, se realizó el análisis con el método AMINOACB1MSUI60M.M en un
sistema GC/EIMS (Agilent Technologies 7890A) provisto con un inyector
automático y acoplado a un detector selectivo de masas (Agilent Technologies
5973), así como con una columna Agilent 122-0162UI (DB-1MS Ultra Inerte, 60 m
x 250 μm x 0.25 μm). La temperatura del inyector fue de 200°C.El volumen de
inyección de la muestra fue de 1 µL. La temperatura de calentamiento inicial del
horno fue de 150°C por 3 minutos, seguido de un incremento en la temperatura de
5°C/min hasta una temperatura de 250°C. Una vez alcanzada esta temperatura se
mantuvo por 20 minutos. Como gas acarreador se utilizó helio con un flujo constante
de1 mL/min.
Los cromatogramas por GC/EIMS se obtuvieron por el software Mass Hunter, el
patrón de los iones se analizaron con el software Automated Mass Spectral
Deconvolution and Identification System (AMDIS) y con la base de datos del
National Institute of Standards and Technology (NIST, 2011).
Comparación entre el perfil de A. ochroleuca y A. platyceras:
Adicionalmente se desarrolló una placa con el extracto de los órganos de A.
platyceras bajo las mismas condiciones de análisis que A. ochroleuca. Esto con la
finalidad de comparar el perfil entre ambas especies.
6.8 ANÁLISIS DE FENOLES PRESENTES EN CIRSIUM RHAPHILEPIS.
Extracción: El método para la extracción de fenoles en un método muy sencillo
por lo que desde el inicio se realizó la extracción por triplicado utilizando tallo, hoja
65
e inflorescencia. Primero se pesó cada órgano (Tabla 9) y se molió con nitrógeno
líquido, una vez molido se adicionó metanol en una relación peso volumen 1:10
para quedar una concentración de 100 mg/mL. La suspensión se colocó a baño
María por5 minutos y después de filtrar con papel Whatman No. 541, se concentró
hasta eliminar el metanol y el agua en el rotavapor, se almacenó a 4°C hasta su
análisis en metanol hasta un volumen de 5mL.
Aplicación de la muestra: Con los extractos obtenidos de C. rhaphilepis se
dosificaron 2 µL de hoja sobre la placa de TLC. El tamaño de las bandas fue de 8
mm de espesor con una separación de 9.4 mm entre bandas, con un frente de
solvente de 85mm. La velocidad de dosificación fue de 150 nL/s, condición
correspondiente a extractos metanólicos.
Desarrollo: Para determinar el mejor sistema de solventes se probaron cuatro
mezclas de solventes que se han utilizado para flavonoides.
A. Acetato de etilo ácido acético, ácido fórmico, agua 100:11:11:26 v/v.
B. Diclorometano, acetona, ácido fórmico 75:16.5:8.5 v/v.
C. Cloroformo, acetona, ácido fórmico 75:16.5:8.5 v/v.
D. Hexano, acetato de etilo 2:1 v/v.
Se cargó la placa de TLC con 2 µL de muestra por banda, la saturación de la
cámara se realizó en un tiempo de 10 min con el sistema de solventes A, la
activación se dejó solo por 5 min, el secado y el preacondicionamiento de la placa
fueron de 5min. El proceso se repitió con cada uno de los sistemas de solventes.
Derivatización: La placa se derivatizó con el reactivo de productos naturales y
polietilenglicol. Se realizó la inmersión de la placa en una cámara con 50 mL del
reactivo de productos naturales, e inmediatamente después se quitó el exceso del
reactivo y se sumergió en la cámara con 50mL polietilenglicol. Se eliminó el
exceso del reactivo con papel absorbente y finalmente se observó con una
66
Tabla 9. Peso de los órganos de Cirsium rhaphilepis.
Órgano Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Inflorescencia 5.4 22.6 3.6
Tallo 10,0 19.9 10.4
Hoja 54.3 55.5 43.4
67
lámpara de luz blanca de transmitancia (T), reflectancia (R) y la combinación de
ambas (RT)
Perfil fitoquímico: Se utilizó el extracto de los órganos: tallo, hoja, e
inflorescencia, de los tres especímenes, obtenidos con el método de extracción
para fenoles. Se dosificó 2 µL de los extractos por banda sobre una placa de
HPTLC de gel de sílice 60 F 254 con soporte de vidrio marca Sigma Aldrich de
10X20 cm. La aplicación se inició a 1.5 cm de la base de la placa, el tamaño de las
bandas, la separación entre las bandas, el frente de solvente y la velocidad de
dosificación fueron los utilizados en el método de aplicación estandarizado.
Identificación de compuestos: En C. rhaphilepis, la identificación se realizó
comparando el perfil con los estándares de rutina, ácido clorogénico y ácido
gálico. Se preparó una mezcla de los estándares a una concentración de
1 mg mL-1 c/u. Se aplicó 1 µL por banda de esta mezcla en la placa de HPTLC,
donde se realizó el perfil fitoquímico. Una vez desarrollada la placa se derivatizó
con reactivo de productos naturales y polietilenglicol, finalmente se observó con
luz UV a 366 nm y se compararon los compuestos presentes en el perfil con los
estándares utilizados.
6.9 ANÁLISIS DE TERPENOS PRESENTES EN MONTANOA TOMENTOSA.
Extracción: Para la extracción de terpenos de M. tomentosa se realizó una
comparación entre 5 sistemas de solventes:
A. Cloroformo
B. Diclorometano
C. Metanol
D. Mezcla de hexano, acetato de etilo 85:15 v/v
E. Éter de petróleo.
68
Se pesaron 5 g de hoja para cada solvente, se molieron con nitrógeno líquido y se
maceraron por 10 min con 10 mL de solvente. Después de filtrar con papel
Whatman No. 541, se eliminó el resto de solvente en el rotavapor. Finalmente,
cada extracto se resuspendió en 2 mL de la mezcla diclorometano, metanol (1:1) y
se almacenó a 4°C hasta su análisis.
Una vez que se observó que el éter de petróleo fue el que extrajo mayor cantidad
de terpenos, se utilizó como solvente de extracción. Se pesaron por triplicado, hoja
e inflorescencia de Montanoa tomentosa (Tabla 10). Se extrajeron los terpenos
con éter de petróleo de acuerdo con el protocolo de extracción utilizado para la
estandarización. Los extractos se almacenaron en refrigeración hasta su análisis.
Desarrollo: Se cargó la placa de TLC con 4 µL de muestra por banda, la
saturación de la placa se realizó con cuatro distintas mezclas de solventes para
determinar cuál permite una mejor separación de terpenos.
1. DCM, acetona 85:15 v/v,
2. Acetato de etilo, metanol, agua 100:13.8 v/v.,
3. Acetato de etilo, metanol, agua 77:15:8 v/v. y
4. Hexano acetato de etilo 4:1 v/v.
Se saturó la cámara con el primer sistema de solventes durante 5 min, la
activación de la placa fue de 10 min, el secado y el preacondicionamiento de la
placa se realizaron en 5 min. Se probaron los otros sistemas bajo las mismas
condiciones.
Derivatización: Una vez desarrollada la placa se asperjó con 10 mL de solución
de vainillina al 1 % en etanol y posteriormente con 10 mL de ácido sulfúrico al 10%
en etanol. La placa se calentó en una plancha de calentamiento CAMAG a 110 °C
por 5 min, finalmente se observó en el Visualiser de CAMAG con luz blanca de
transmitancia, reflectancia y ambas.
69
Tabla 10. Peso de los órganos de Montanoa tomentosa
Órgano Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Inflorescencia 1.050 g 0.773 g 1.221 g
Hoja 13.093 g 11.002 g 8.315 g
70
Perfil fitoquímico: Se utilizaron los extractos de hoja e inflorescencia de los tres
especímenes, obtenidos con éter de petróleo, se dosificó 2 µL por banda de cada
extracto sobre una placa de HPTLC del gel de sílice 60 F 254 con soporte de
vidrio marca Sigma Aldrich de 10X10 cm. La aplicación se inició a 1.5 cm de la
base de la placa, el tamaño de las bandas, la separación entre bandas, el frente
de solvente y la velocidad de dosificación fueron los utilizados en el método de
aplicación estandarizado.
Identificación de compuestos:
TLC Preparativa: En una placa preparativa de TLC se aplicaron 500 µL de
extracto de la hoja R1 de M. tomentosa. Las condiciones de desarrollo fueron las
establecidas en la estandarización. De las cuales se modificó la saturación de la
cámara de 20 a 5 min, mientras que la activación de la placa de 10 min, el secado
y el preacondicionamiento de la placa de 5 min. Una vez desarrollada la placa se
derivatizó solo 1cm del extremo izquierdo de la placa. Se utilizó iluminación de luz
blanca RT para identificar y marcar las bandas obtenidas.
Posteriormente se raspó cada banda y se colocó en tubos Eppendorf, se adicionó
éter de petróleo hasta un volumen de 2 mL y se extrajeron los compuestos
contenidos en la sílice de cada banda mediante sonicación y centrifugación. Se
eliminó el resto de solvente en el rotavapor. Finalmente, cada extracto se
resuspendió en 2mL de la mezcla diclorometano, metanol (1:1).
Análisis por GC/EIMS: Para el análisis GC/EIMS es necesario la derivatización
por silanización. Se tomó una alícuota de 100 µL del extracto completo y de cada
una de las bandas, se colocó en un reactivial y se llevó a sequedad con nitrógeno.
Posteriormente al reactivial se le agregó 20 µL de piridina y 80 µL de N-O-Bis
(trimetilsilil), trifluoroacetamida (BSTFA Sigma). Se agitó en un vórtex hasta
obtener una mezcla homogénea y se incubó a 80°C por 30 min en un bloque de
calentamiento. La muestra se dejó enfriar a temperatura ambiente y se aforó en un
71
volumen final de 100 µL con isooctano. Finalmente, la muestra se trasvasó a un
vial para ser evaluada cuantitativamente por el equipo de CG-EIMS.
Los extractos silanizados se analizaron por GC/EIMS por el método
ALCADB1MSUI60M.M. El volumen de inyección de la muestra fue de 1 µL. La
temperatura del inyector fue de 200°C. La temperatura de calentamiento inicial del
horno fue de 150°C por 3 minutos, seguido de un incremento en la temperatura de
4°C/min hasta una temperatura de 300°C. Una vez alcanzada esta temperatura se
mantuvo por 20 minutos. Se utilizó helio como gas acarreador con un flujo
constante de1 mL/min. La columna empleada fue Agilent 122-0162UI (DB-1MS
Ultra Inerte, 60 m x 250 μm x 0.25 μm).La identificación de los compuestos se
realizó por la comparación espectros con la base de datos de espectros de masas
NIST 2011.
Los cromatogramas GC/EIMS se obtuvieron por el software Mass Hunter y el
espectro de masas de cada pico se analizó por el software Automated Mass
Spectral Deconvolution and Identification System (AMDIS); finalmente se
compararon cada uno de los espectros obtenidos con la base de datos del
National Institute of Standards and Technology (NIST, 2011).
6.10 ANÁLISIS DE ALCAMIDAS PRESENTES EN HELIOPSIS LONGIPES
Extracción: El laboratorio de Fitobioquímica ya tiene estandarizado el método de
extracción de alcamidas por lo que no fue necesario hacer pruebas preliminares.
Para realizar el extracto se pesó 1 g de raíz de tres réplicas biológicas de
Heliopsis longipes, se molió cada una en mortero con nitrógeno líquido. El polvo
se dejó macerar a 4°C por 72 horas con 50 mL de etanol absoluto, se filtró con
papel Whatman No 541y se concentró en el rotavapor hasta eliminar el etanol. En
semilla se pesó 1 g de tres réplicas biológicas de Heliopsis longipes (Tabla 11). Se
molió cada réplica en mortero con nitrógeno líquido. El polvo se colocó en un
cartucho de extracción, Whatman de alta celulosa de 30x80 I/ Alto mm. Se
desengrasó la semilla en el equipo Soxhlet con 100 mL de hexano
72
Tabla 11. Peso de los órganos de Heliopsis. longipes.
Órgano Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Raíz 1.384 g 1.394 g 1.226 g
Semilla 1.028 g 1.041 g 1.002 g
73
aplicando 10 ciclos de 40°C, por aproximadamente 90 min. Se separó el extracto
de hexano y se cambió el solvente de extracción por 80 mL de etanol absoluto, se
aplicaron 10 ciclos a 60°C, el tiempo aproximado de extracción fue de 90 min, se
concentró en el rotavapor hasta eliminar el etanol. Finalmente, el extracto se
guardó en refrigeración hasta su análisis en 2 mL de etanol.
Desarrollo: Se utilizó el sistema de solventes hexano, acetato de etilo 2:1 v/v. Se
cargó la placa de TLC con 2 µL por banda de muestra, se modificó el tiempo de
saturación de la cámara a 10 min, la activación fue de 10 min. Y el secado de la
placa se mantuvo en 5 min.
Detección y derivatización: Se derivatizó con el reactivo anisaldehído-ácido
sulfúrico, el reactivo se preparó mezclando 5 mL anisaldehído con 10 mL de ácido
acético glacial, se adicionaron 85 mL de metanol y 5 mL de ácido sulfúrico
concentrado. La placa se asperjó con la solución anterior y se calentó por 5
minutos a 100°C en la placa de calentamiento CAMAG. Finalmente, la placa se
observó con una lámpara de luz blanca (T, RT, R).
Perfil fitoquímico: Se utilizaron los extractos de raíz y semilla de los tres
especímenes, obtenidos con el método de extracción para alcamidas, se dosificó2
µL por banda de cada extracto sobre una placa de HPTLC de gel de sílice 60 F
254 con soporte de vidrio marca Sigma Aldrich de 10X10 cm. La aplicación se
inició a 1.5 cm de la base de la placa, el tamaño de las bandas, la separación
entre bandas, el frente de solvente y la velocidad de dosificación fueron los
utilizados en la estandarización del método de aplicación.
Identificación de compuestos.
TLC Preparativa: En este trabajo el procedimiento no se realizó para H. longipes
dado que se consideraron los datos reportados en la tesis de Valdés-Contreras,
2015. En una placa preparativa de TLC se aplicaron bandas con 40 µL de extracto
de Raíz de H. longipes en una placa de TLC preparativa, se preparó el sistema de
74
solventes hexano: acetato de etilo 2:1 v/v, se vertió en la cámara de vidrio se
saturó agitando la cámara con fuerza. El desarrollo fue manual, la placa se dejó 1
hora dentro de la cámara, después del desarrollo se retiró de la cámara y se dejó
evaporar el solvente de la placa dentro de la campana de extracción de gases por
10 minutos, una vez libre de solvente la placa se derivatizó solo 1cm del extremo
izquierdo de la placa. Se utilizó iluminación con luz blanca RT para identificar y
marcar las 4 bandas obtenidas. Posteriormente, se raspó cada banda del gel de
sílice que contenía los compuestos y se colocaron en forma independiente en
tubos Eppendorf, se les adicionó etanol hasta un volumen de 2mL, se sónico y
centrifugó (Valdés Contreras, 2015).
Análisis por GC/EIMS: Antes de realizar el análisis por GC/ EIMS los extractos se
derivatizaron por silanización. Se tomó una alícuota de 100 µL del extracto, se
colocó en un reactivial y se llevó a sequedad con gas nitrógeno. Posteriormente al
reactivial se le agregó 20 µL de piridina y 80 µL de N-O-Bis (trimetilsilil),
trifluoroacetamida (BSTFA Sigma), se agitó en un vórtex hasta obtener una
mezcla homogénea y se incubó a 80°C por 30 min en un bloque de calentamiento.
Terminado el tiempo de incubación, la muestra se dejó enfriar a temperatura
ambiente y se aforó a un volumen final de 100 µL con isooctano, finalmente la
muestra se trasvasó a un vial para ser evaluada cuantitativamente por el equipo
de CG-EIMS.
El análisis de alcamidas se realizó con el método OXYLIPDB1MS60MB.M, en el
cual la temperatura del inyector fue de 250°C; el volumen de inyección fue de 1
µL; la temperatura inicial del horno fue de 150°C por 3 minutos y finalmente un
incremento de la temperatura de 4°C por minuto hasta los 280°C durante 25
minutos. Se utilizó una columna J&W 122-0162:US6622726H (DB-1MS 60 m x
250 µm x 0.25 µm) y helio como gas acarreador con un flujo 1 mL/min. La
identificación de los compuestos se realizó por la comparación de espectros con la
biblioteca NIST (Valdés Contreras, 2015). En este trabajo se comparó el perfil
75
fitoquímico que se obtuvo de raíz y semilla con el reportado por Valdés Contreras,
2015.
6.11 ANÁLISIS DE GLUCÓSIDOS CARDIOTÓNICOS EN THEVETIA THEVETIOIDES
Se utilizaron tres réplicas biológicas de semilla en dos etapas de desarrollo del
fruto: maduro e inmaduro de Thevetia thevetioides. Posteriormente se pesó 1g de
cada semilla (Tabla 12) y se molieron en mortero con nitrógeno líquido. El polvo se
colocó en un cartucho de extracción Whatman de alta celulosa de 30x80 I/Alto
(mm). La extracción se realizó en el equipo Soxhlet con 100 mL de hexano
aplicando 10 ciclos a 40°C, durante aproximadamente 90 min. El extracto de
hexano se separó y se cambió el solvente de extracción por etanol absoluto, se
aplicaron 10 ciclos más a 60°C, durante 90 min. El extracto se concentró en el
rotavapor hasta eliminar el etanol y se guardó en refrigeración hasta su análisis.
Aplicación de la muestra. Se dosificaron 1,2 y 4 µL por banda, de extracto de
semilla inmadura de T. thevetioidesRéplica1 (R1). A la par se aplicó 2, 4 y 6 µL por
banda, de extracto de semilla madura R1 sobre la placa de TLC. El tamaño de las
bandas fue de 10 mm de espesor con una separación de 11.4 mm entre bandas,
con un frente de solvente de 85mm. La velocidad de dosificación fue de 100nL/s,
condición correspondiente a extractos etanólicos. En base a los resultados
obtenidos en las placas posteriores se utilizó un volumen de 4 µL por banda de
muestra.
Desarrollo: Se utilizó el sistema de solventes acetato de etilo, metanol, agua
81:11:8 v/v. Se cargó la placa de TLC con 2 µL por banda de muestra, se modificó
el tiempo de saturación de la cámara a 10 min, la activación de la placa se
modificó a 5 min, el secado y preacondicionamiento se mantuvieron según lo
especificado.
Detección: La placa se derivatizó por inmersión en una cámara que contenía 50
mL de reactivo de Kedde, se eliminó el exceso de reactivo, se observó
76
Tabla 12. Peso de las semillas de Thevetia thevetioides.
Semilla Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3
Inmadura 4.48 g 3.82 g 5.70 g
Madura 4.38 g 3.96 g 6.28 g
77
rápidamente por la degradación de los compuestos. A la par se derivatizó por
inmersión con alfa naftol, se eliminó el exceso de reactivo y se calentó a120°C por
5 min. Para la derivatización con alfa naftol se aplicó menor cantidad de muestra
para obtener una mejor definición. Finalmente, la placa se observó con una
lámpara de luz blanca (T, RT, R).
Perfil fitoquímico: Se utilizaron los extractos etanólicos de las semillas maduras
e inmaduras de los tres especímenes. Se dosificaron 3 µL por banda de extracto
de semilla inmadura y 4 µL de extracto de semilla madura para la placa revelada
con Kedde y 1 µL tanto de inmadura como madura para la placa revelada con alfa
naftol, sobre una placa de HPTLC de gel de sílice 60 F 254 con soporte de vidrio
marca Sigma Aldrich de 10X20 cm. La aplicación se inició a 1.5 cm de la base de
la placa, el tamaño de las bandas fue de 17 mm, la separación entre bandas, el
frente de solvente y la velocidad de dosificación fueron los utilizados en la
estandarización del método.
Identificación de compuestos: El análisis de glucósidos cardiotónicos no se
realizó en este trabajo debido a que en el laboratorio de Fitobioquímica ya se
estaba trabajando con esta identificación.
78
7. RESULTADOS.
En todos los casos para la elección del perfil fitoquímico se consideró la
resolución, el número, la intensidad y la definición de las bandas.
7.1 IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES Y HERBORIZACIÓN
Se realizó la identificación taxonómica utilizando las fichas bibliográficas de
Rzedowski & Calderón de Rzedowski, siendo todas ellas las esperadas (Figura
14). Los especímenes herborizados serán enviados a certificación y depósito de
Voucher al Herbario del Instituto de Ecología, A.C., México (IE-BAJÍO).
7.2 ALCALOIDES PRESENTES EN ARGEMONE OCHROLEUCA
Comparación entre métodos de extracción de alcaloides en Datura
stramonium.
Debido a la dificultad que presentan los alcaloides para su extracción se
compararon varios métodos. Para la extracción de alcaloides se utilizó como
planta de referencia a Datura sp. Por su gran contenido de éstos. Se compararon
los métodos de Wagner, de Caligiani, de Bazaoui, de Jakabová, Soxhlet y Todd.
Con el método de Wagner, se obtuvieron dos bandas tenues con Rf= 0.15 y 0.42.
Asimismo, se observó a 256nm una ligera banda con Rf= 0.42 en los métodos 2, 3
y 5. En el método 4no se observó ninguna banda. El método de Todd muestra dos
ligeras bandas Rf= 0.28 y 0.30 además de una banda intensa con Rf= 0.73 (Figura
15).El mejor método de extracción fue el método de Todd porque permitió detectar
un mayor número de bandas con alta intensidad.
Extracción de alcaloides isoquinolínicos de A. ochroleuca por el
método de Todd y Wagner:
En la extracción de alcaloides en A. ochroleuca por el método de Todd se pueden
observar dos bandas intensas amarillas Rf = 0.28 y 0.42, respectivamente al
A B C D E
Figura 14. Especímenes herborizados.
A) Argemone ochroleuca, B) Cirsium rhaphilepis, C)Montanoa tomentosa, D) Heliopsis longipes, E) Thevetia
thevetioides
Fotografías tomadas por Rico Martínez, 2016.
80
Figura 15. Comparación del perfil de alcaloides en Datura stramonium
El perfil se obtuvo con diferentes métodos de extracción. Placa desarrollada con
acetato de etilo, metanol, agua (100:13.5:10) v/v. Observada con luz UV a 254nm
sin derivatizar.1) Método de Wagner, 2) Método de Caligiani, 3) Método de
Bazaoui, 4) Método de Jakabová, 5) Extracción Soxhlet, 6) Método de Todd.
81
observarlas con luz UV de 366nm. La banda que se encuentra en Rf = 0.42 se
observa también con luz UV de 254nm (Figura 16).
Aun cuando el método de Todd dio buenos resultados, se realizó una adaptación
al método de Wagner debido a que es menos laborioso. Con este último, se
observa una banda azul con Rf = 0.22 y dos bandas definidas a Rf = 0.35 y 0.55.
Estas dos bandas se pueden observar también en luz blanca en la placa
Derivatizada con Reactivo de Dragendorff (Figura 17).
Aplicación de la muestra: Se utilizaron diferentes volúmenes del extracto. La
obtención de bandas definidas, después del desarrollo, permite elegir el volumen
de aplicación adecuado del extracto, en la placa de TLC se observó que la banda
Azul (Rf = 0.24) y la banda amarilla (Rf = 0.56) se engrosan y deforman al
aumentar el volumen de aplicación, por lo que estas bandas se tomaron como
referencia para elegir el volumen de aplicación. Bajo este criterio en el volumen de
4 µL por banda las bandas con Rf = 0.24 y Rf = 0.56 están mejor definidas (Figura
18).
Desarrollo: en la separación de los alcaloides se probaron cuatro sistemas de
solventes En la placa de TLC observada a 366nm, utilizando el sistema de
solventes 1-Butanol, acetato de etilo, acido fórmico, agua 30:50:10:10 v/v; se
observó una mejor separación de compuestos y 6 bandas definidas: azules Rf
<0.1, Rf = 0.2 y Rf = 0.76; amarillas Rf = 0.42 y 0.56; y una banda roja Rf = 0.99,
en contraste con los resultados obtenidos con los otros sistemas solventes (Figura
19).
Detección y derivatización: al realizar los procesos de derivatización de
alcaloides 1, 2 y 3 utilizando los reactivos de Dragendorff, ninhidrina y
anisaldehído – ácido sulfúrico, no se observaron bandas bien definidas o bien se
observaron bandas muy tenues. En el caso de la derivatización utilizando el
Reactivo de Wagner, se observaron bandas adicionales a las bandas previamente
observadas a 366 nm. Se debe considerar que esta última técnica no es
82
Figura 16. Perfil de alcaloides presentes en hoja de Argemone ochroleuca.
La extracción se realizó por el método de Todd, la placa se desarrolló con
cloroformo, metanol (4:1) v/v. Observada a 254 y 366 nm sin derivatizar.
83
Figura 17. Perfil de alcaloides presentes en hoja de Argemone ochroleuca.
La extracción se realizó por el método de Wagner por maceración. La placa se
desarrolló con metanol, diclorometano (10:90 v/v). Con 5% de hidróxido de
amonio, observada sin derivatizar a 1) 254nm y 2) 366nm. 3) Derivatizada con
Reactivo de Dragendorff observada con luz blanca R
84
Figura 18. Perfil de alcaloides de Argemone ochroleuca, en función del
volumen de aplicación.
Con el extracto obtenido de hoja de A. ochroleuca R1 se dosificaron distintas
concentraciones (2, 4, 6 8 10 12 14 µl). La placa se desarrolló con el sistema de
solventes cloroformo, metanol (4:1 v/v). La observación se realizó a luz UV
254nm sin derivatizar.
85
Figura 19. Perfil de alcaloides en Argemone ochroleuca en función del
sistema de solventes en el desarrollo de la placa.
Se probaron 4 sistemas de solventes para alcaloides: 1) cloroformo, metanol (4:1
v/v); 2) metanol, diclorometano (10:90) con 5% de hidróxido de amonio, 3) 1-
Butanol, acetato de etilo, acido fórmico, agua (30:50:10:10 v/v). 4) acetato de
etilo, metanol, agua (100:13.5:10 v/v). La observación de los compuestos se
realizó a 366 nm UV.
86
específica para alcaloides y, por lo tanto, sólo indica presencia de compuestos
nitrogenados. Así pues, considerando los resultados anteriores, no se recomienda
la derivatización sino la observación directa a 366 nm de los alcaloides presentes
en los extractos de A. ochroleuca (Figura 20).
Perfil fitoquímico: Se realizó uno para alcaloides de los diferentes órganos: flor,
tallo, hoja y raíz; utilizando placas de HPTLC visualizadas a 366 nm. El perfil
fitoquímico de los diferentes órganos de A. ochroleuca en etapa reproductiva se
caracterizó por presentar dos bandas amarillas bien definidas presentes en todos
los órganos con Rf = 0.45 y 0.58.
Adicionalmente, en inflorescencia se observaron 7 bandas azules Rf = 0.1, 0.2,
0.25, 0.35, 0.44, 0.66, 0.76 y una banda roja Rf = 0.99. En hoja se observaron 8
bandas azules Rf = 0.2, 0.25, 0.35, 0.37, 0.44, 0.66, 0.76 y 0.92; y una banda roja
Rf = 0.99. En tallo se observaron 7 bandas azules Rf = 0.1, 0.2, 0.25, 0.35, 0.44,
0.66 y 0.76; y una banda roja Rf = 0.99. En raíz se observaron 7 bandas azules
muy tenues Rf = 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.66, 0.76 y 0.92. Además, una banda amarilla
tenue Rf = 0.99 (Figura 21).
Este mismo perfil fue observado en A. platyceras con variaciones en la intensidad
de las bandas.
Identificación de compuestos: Se realizó una placa de TLC preparativa,
donde se separaron los alcaloides en 4 bandas: una banda azul (Rf 0.3), dos
bandas grandes amarillas Rf = 0.45, 0.56 y una banda amarillo tenue Rf = 0.75
(Figura 22). Posteriormente, con la técnica de GC/EIMS, se identificaron en la
banda amarilla Rf= 0.56 dos picos principales Rt = 37.874 y 37.953.
El espectro de masas del primer pico, Rt = 37.874, muestra un patrón de
fragmentación m/z (%)= M]+, 385 (0.5), [206(18), 165 (14.8), 164 (99.9), 163
(24.8), 149 (29.6), 134 (21.6), 121 (11.4), 104 (11.2), 77 (15.1), 76 (11.4). De
acuerdo con la comparación en la biblioteca NIST, corresponde a la fagarina.
87
Figura 20.Perfil de alcaloides Argemone ochroleuca en función de los
métodos de detección.
Se probaron 5 condiciones diferentes de detección: la primera condición se realizó
sin derivatizar (SD), observando la placa a una λ 366 nm. La placa se desarrolló
con el sistema de solventes 1-Butanol, acetato de etilo, acido fórmico, agua
(30:50:10:10 v/v); la segunda, con reactivo de Dragendorff (RD); la tercera, con
ninhidrina (NH); la cuarta, con anisaldehído ácido-sulfúrico (AAS); y finalmente, la
quinta, con reactivo de Wagner (RW). Las placas de desarrollaron con cloroformo
–metanol (4:1 v/v). Se observaron con luz blanca R.
88
A
B
Figura 21. Perfil fitoquímico de alcaloides en inflorescencia, tallo, hoja y raíz
de Argemone ochroleuca (A) y Argemone platyceras (B).
El perfil se obtuvo con extracto metanólico de los órganos de A. ochroleuca y A.
platyceras respectivamente en placa de HPTLC, desarrollada con el sistema de
solventes 1-Butanol, acetato de etilo, acido fórmico, agua (30:50:10:10) v/v, sin
derivatizar, observada a 366 nm.
89
A B C
D
Figura 22. Argemone ochroleuca identificación de alcaloides.
La identificación de compuestos se realizó a través del análisis GC/EIMS: a) TLC
preparativa, con 4 bandas separadas, b) cromatograma de la banda 3 color
amarillo, c) espectro de masas del primer pico del cromatograma (TR: 30.191), d)
espectro de masas del segundo pico del cromatograma (TR, 31.707).
90
El espectro de masas del segundo pico, Tr = 37.953, muestra un patrón de
fragmentación m/z (%)= [M]+, 353 (1.9), 267(46), 190 (10.6), 164 (43), 163 (22.4),
149 (11.3), 148(99.9), 134 (76), 89(69), 91(68), 42 (47). Al compararlo con la
biblioteca NIST, este alcaloide se identificó como protopina.
7.3 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN CIRSIUM RHAPHILEPIS
Extracción: se obtuvo un extracto metanólico de hoja C rhaphilepis. Se
dosificaron 2 µL por banda de extracto en una placa de TLC de gel de sílice, 10 X
10, derivatizada con Productos Naturales y Polietilenglicol. En el extracto de hoja
se observan 6 bandas: una banda negra Rf = 0.51, dos bandas naranjas Rf = 0.22
y Rf = 0.59, una banda azul Rf = 0.83 y una banda roja Rf =0.99. En todas las
muestras se observaron bandas bien definidas, por lo que se considera que la
concentración utilizada del extracto es adecuada (Figura 23).
Aplicación de la muestra: no fue necesario modificar la concentración, porque
las bandas que se observan son de buen tamaño y están bien definidas.
Desarrollo: se probaron 4 sistemas de solventes (véase en metodología),
observándose que el sistema de solventes que separó mayor número de bandas
con mejor definición fue el sistema de solventes formado con acetato de etilo,
ácido acético, ácido fórmico, agua 100:11:11:26 v/v. Se observaron dos bandas
tenues azules Rf = 0.47, 0.86; una banda amarilla Rf = 0.58 y una banda roja Rf =
0.99, en contraste con los solventes restantes donde no se aprecia separación
(Figura 24).
Detección: se realizó con productos naturales y polietilenglicol iluminada con
UV366 nm, como fue posible apreciar los fenoles no se realizó otra derivatización
(Véase Figura 23).
Perfil fitoquímico: Se realizó el perfil de fenoles en extracto de tres órganos: tallo
hoja y flor de C. rhaphilepis en etapa reproductiva, se observaron dos bandas
azules Rf = 0.60, 0.89 y una banda naranja tenue Rf = 0.29 que se encuentra en
91
Figura 23. Perfil de fenoles presentes en Cirsium rhaphilepis.
La placa se desarrolló con acetato de etilo, ácido acético, ácido fórmico, agua
(100:11:11:26 v/v), derivatizada con PN y PEG, y se observó a366 nm. Se realizó
por triplicado.
92
Figura24.Perfil de fenoles en Cirsium rhaphilepis en función del sistema de
solventes.
Se probaron 4 sistemas de solventes para fenoles: 1) acetato de etilo, ácido
acético, ácido fórmico, agua (100:11:11:26) v/v., 2) diclorometano, acetona, ácido
fórmico (75:16.5:8.5) v/v., 3) cloroformo, acetona, ácido fórmico (75:16.5:8.5) v/v. y
4) hexano- acetato de etilo (2:1) v/v. Se derivatizó la placa de TLC, con PN y PEG.
La observación de los compuestos se observó bajo iluminación uv a 366nm.
93
todos los órganos. En el tallo, además se observa una banda azul muy difusa Rf
=0.83. En la hoja se observa una banda naranja Rf = 0.58 una banda azul Rf =
0.83 y una banda roja Rf = 0.99. Así como las observadas en todas. En la
inflorescencia se observa una mayor variedad de compuestos. Se observan 4
bandas azules Rf = 0.10, 0.20, 0.60, 0.89 además de 6 bandas naranja Rf = 0.29,
0.45, 0.51, 0.58, 0.69, 0.98 y dos bandas amarillas Rf = 0.66, 0.74 (Figura 25).
Identificación de compuestos: se realizó mediante la comparación de
estándares, logrando identificar a rutina, banda naranja Rf 0.45, ácido clorogénico,
banda azul claro, Rf = 0.60 y ácido gálico, banda azul, Rf = 0.90. Se observa que
el ácido clorogénico se encuentra en todos los órganos (Figura 26).
94
Figura 25. Perfil fitoquímico de tallo, hoja, inflorescencia de Cirsium
rhaphilepis
Perfil de extracto metanólico de los órganos de C. rhaphilepis en placa de
HPTLC, desarrollada con el sistema de solventes acetato de etilo, ácido acético,
ácido fórmico, agua (100:11:11:26) v/v. Derivatizada con PN y PEG, a 366 nm.
95
Figura 26. Identificación de fenoles en Cirsium rhaphilepis.
La identificación de fenoles se realizó mediante el uso de estándares que se
corrieron a la par con el extracto de tallo, hoja e inflorescencia.
96
7.4 ANÁLISIS DE TERPENOS EN MONTANOA TOMENTOSA
Extracción: se realizó con cinco solventes diferentes y se logró la mejor
extracción de terpenos con éter de petróleo, en este extracto se detectaron 16
bandas intensas, bien definidas (Figura 27).
Aplicación de la muestra: se eligió la aplicación de 4 µL por banda, porque
podemos identificar las bandas bien definidas (Figura 28).
Desarrollo: se probaron 4 diferentes sistemas de solventes, se eligió el cuatro
sistema de solventes debido a que hexano - acetato de etilo 4:1 v/v, permite la
separación de un mayor número de compuestos en 16 bandas. Se observan 5
bandas amarillas Rf = 0.02, 0.06, 0.14, 0.28, 0.36; 5 bandas color gris Rf = 0.13,
0.18, 0.24, 0.59, 0,96, tres bandas moradas Rf = 0.50, 0.72, 0.90 y tres bandas
azules Rf = 0.31, 0.48 y 0.87 (Véase Figura 27).
Derivatización: se utilizó vainillina-ácido sulfúrico que permitió detectar la
presencia de terpenos tanto en la hoja como en la inflorescencia, caracterizados
por coloración gris, azul o morada al observar con luz blanca. Lo cual indica que
este derivatizante es el correcto. No se analizó ningún otro derivatizante (Véase
figura 27).
Perfil fitoquímico: el extracto obtenido con el solvente éter de petróleo y
resuspendido en DCM-MetOH 1:1 de hoja muestra 16 bandas intensas bien
definidas. Se observan: 5 bandas amarillas Rf = 0.02, 0.06, 0.14, 0.28, 0.36; 5
bandas color gris Rf = 0.13, 0.18, 0.24, 0.59, 0,96; tres bandas moradas Rf = 0.50,
0.72, 0.90; y tres bandas azules Rf = 0.31, 0.48 y 0.87.El mismo perfil se observa
para la inflorescencia sólo que a menor intensidad (Figura 29).
Identificación de compuestos: de las 9 bandas (Rf = 0.12, 0.18, 0.29, 0.43, 0.49,
0.65, 0.67, 0.86, 0.90) obtenidas por la TLC preparativa por GC/EIMS, sólo en la
banda morada Rf =0.72, se pudo identificar los terpenos. El cromatograma de esta
banda muestra un patrón de picos que Robles-Zepeda (2003) identificó como
97
Figura 27.Perfil de terpenos presentes en Montanoa tomentosa en función
del método de extracción, así como el sistema de solventes.
Para el extracto con cloroformo se utilizó como sistema de solventes1. DCM,
acetona (85:15) v/v. Para el extracto de DCM, se utilizó el 2. Acetato de etilo,
metanol, agua (100:13.8) v/v. en los extractos MetOH y Hex-AcEt se utilizó el 3.
Acetato de etilo, metanol, agua (77:15:8) v/v. Para el extracto con éter de petróleo
EP se utilizó el 4. Hexano acetato de etilo (4:1) v/v. Se derivatizó con Vainillina –
Ácido sulfúrico, se observó con luz blanca por reflexión.
98
Figura 28. Perfil de terpenos en Montanoa tomentosa en función del volumen
de aplicación.
Con el extracto (DCM) de hoja R1 obtenido de Montanoa tomentosa se dosificó
por duplicado 0,5,1, 2, 4 y 6 µL; con un ancho de banda de 8 mm sobre la placa de
TLC, La placa fue desarrollada con el acetato de etilo, metanol, agua (77:15:8) v/v.
Derivatizada con vainillina - ácido sulfúrico. Se observó con luz banca R.
99
Figura 29. Perfil fitoquímico de terpenos presentes en hoja e inflorescencia
de Montanoa tomentosa.
El perfil se obtuvo con extracto de éter de petróleo resuspendido en DCM-MetOH
de hoja e inflorescencia de M. tomentosa en placa de HPTLC, desarrollada con el
sistema de solventes hexano acetato de etilo (4:1) v/v. Derivatizada con vainillina-
ácido sulfúrico, observada con luz blanca R.
100
terpenos (Tabla 13). Además, dentro de estos picos se determinó que los
compuestos presentes en Rt = 30.191, 31.707 corresponden al ácido
grandiflorénico y al ácido Kaurenoico.
El espectro de masas del primer pico Rt = 30.191, muestra un patrón de
fragmentación m/z (%)= 372(0.11), [M]+, 358 (18.9), 357 (69.2), 255 (26.5), 254
(35), 240 (22.5), 239 (99.9), 143 (22.1), 117(17.3), 91(19.4), 73(37.3). De acuerdo
con la comparación en la biblioteca NIST corresponde al ácido grandiflorénico
El espectro de masas del segundo pico Rt = 31.707, muestra un patrón de
fragmentación m / z (%)= 374 (1.5), [M]+,420 (11.4), 207(20), 147 (19.8), 116
(10.8), 111 (10.6), 94 (14.1), 75 (28.4), 73 (99.9), 69 (11), 57 (12.3). Al compáralo
con la biblioteca NIST este alcaloide se identificó como ácido kaurenoico (Figura
30).
101
Tabla 13. Compuestos presentes en el extracto de M. tomentosa.
Compuesto TR Pureza
γ-Gurjuneno 13.967 82
Cubenol 14.439 84
Beta-Eudesmol (Selinenol) 15.175 82
Farnesol 16.113 82
Valerianol 16.312 70
Linalol 17.886 89
Alfa copaen- 11 ol 18.047 66
cis-4,7,10,13,16,19-ácido docosahexaenoico 18.185 88
2,3-naftalendiol-2, 3, 4, 4a, 5,6,7, 8-octahidro-1, 4a-
dimetil-7-(1-metiletenil), [2R- (2α, 3α, 4aα, 7α] 20.921 54
Pergnano 21.334 94
Ácido ribónico 21.760 71
Ácido hexadecanoico 24.571 92
Ácido octadenoico 28.946 95
Lavandulol 31.363 81
Exo-Norborneol 31.711 94
102
A
B
C
D
Figura 30.Montanoa tomentosa identificación de terpenos.
La identificación de compuestos se realizó a través del análisis GC/EIMS: A)
Cromatograma del extracto con éter de petróleo) Detalle del Cromatograma de la
banda 6 color morado; C) Espectro de masas del componente del con TR= 30.191
min D) Espectro de masas del pico del cromatograma con Rt=31.707 min.
103
7.5 ANÁLISIS DE ALCAMIDAS EN HELIOPSIS LONGIPES
Extracción: la intensidad de las bandas de la raíz con respecto a la semilla indica
que se llevó a cabo una mejor extracción en raíz que la semilla, es posible que
parte de las alcamidas presentes en semilla se perdieran en el hexano al eliminar
las grasas.
Desarrollo: el extracto etanólico de raíz y semilla de Heliopsis longipes,
desarrollada con el sistema de solventes hexano, acetato de etilo 2:1 v/v, permitió
detectar en la raíz dos bandas intensas Rf = 0.45, 0.99 y tres tenues Rf = 0.52,
0.70, 0,82. Este sistema permitió una excelente separación de los componentes y
se eliminó el preacondicionamiento por la naturaleza de los compuestos (Figura
31).
Derivatización: el reactivo anisaldehído-ácido sulfúrico produjo bandas de color
morado de diferente intensidad y sólo se utilizó este derivatizante para la
detección de estos compuestos (Figura 31).
Perfil fitoquímico: de raíz y semilla mostró diferencias. En la raíz se observan 2
bandas intensas: Rf = 0.45, 0.99; y tres tenues, Rf = 0.52, 0.70, 0.85; mientras que
en la semilla se observan las bandas, Rf = 0.45, 0.99, con menor intensidad y una
banda tenue, Rf = 0.75 (Figura 32).
Identificación de compuestos: la banda con Rf= 0.45 corresponde a N-
Isobutil 2E,6Z,8E-decatrienamida (Afinina). La banda con Rf: 0.52 corresponde a
N-2, Metilbutil - 2E,6Z,8E decatrienamida y la banda con Rf: 0.99 corresponde a
2E,6Z,8E- decatrienoato de bornilo, respectivamente (Figura 33).
104
Figura 31. Perfil de alcamidas presentes en raíz de Heliopsis longipes.
La extracción se realizó con etanol, se desarrolló con hexano, acetato de etilo (2:1
v/v), se derivatizó con el reactivo Anisaldehído – Ácido sulfúrico. La placa se
observó con Luz banca RT.
105
Figura 32. Perfil fitoquímico de raíz y semilla de Heliopsis longipes.
El perfil se obtuvo con extracto etanólico de raíz y semilla de H. longipes en placa
de HPTLC, desarrollada con el sistema de solventes hexano, acetato de etilo (2:1)
v/v. derivatizada con Anisaldehído – Ácido sulfúrico, observada con luz blanca por
Reflexión y transmisión. El perfil se realizó con tres réplicas biológicas (R1, R2,
R3), utilizando para cada réplica 1 g de muestra de cada uno de los órganos.
106
B5
B2
B1
Figura 33. Identificación de alcamidas presentes en Heliopsis longipes.
La identificación de alcamidas se realizó comparando los resultados obtenidos
con el trabajo de Valdés-Contreras, 2013
107
7.6 ANÁLISIS DE GLUCÓSIDOS CARDIOTÓNICOS EN THEVETIA THEVETIOIDES
Extracción: no fue necesaria la comparación de los métodos de extracción debido
a que el método utilizado ya está estandarizado por el laboratorio de
Fitobioquímica. Se observaron diferencias en el perfil en HPTLC del extracto
etanólico de semillas en etapa inmadura, con el de una semilla verde gelatinosa
en formación y en etapa madura con una semilla completamente formada y sólida.
En el perfil de las semillas inmaduras, se observaron 10 bandas (Figura, 34).
Aplicación de la muestra: se determinó que el volumen de aplicación de la
muestra para semillas inmaduras es 3 µL por banda y para semillas maduras es
de 4 µL por banda. También se determinó que el análisis de debe realizar
utilizando bandas de 15 mm de ancho (Figura 35).
Desarrollo: no fue necesaria la evaluación de los sistemas de solventes debido a
que el método de desarrollo utilizado ya está estandarizado en el laboratorio de
Fitobioquímica. El sistema de solventes acetato de etilo, metanol y agua (81:11:8
v/v), con un el tiempo de saturación de la cámara de 10 min y la activación de la
placa por 10 min, permitió obtener una mejor separación de compuestos (Véase
Figura 34).
Derivatización: Se utilizó el reactivo de Kedde para identificar a las agliconas y el
reactivo de alfa naftol para identificar los glucósidos (Figura 36), ambos
derivatizantes permiten la observación de los glucósidos, pero el primero es más
específico.
Perfil fitoquímico: con el reactivo de Kedde se detectaron 10 agliconas en los
extractos de semillas inmaduras con Rf =0.19, 0.22, 0.25, 0.31, 0.36, 0.50, 0.60,
0.70, 0.92 y 0.99. En los extractos de semillas maduras se detectaron 7 bandas de
agliconas con los Rf = 0,04, 0.17, 0.19, 0.22, 0.25, 0.31, 0.36. En cambio, con el
reactivo de alfa naftol se identificaron 7 bandas Rf = 0.04, 0.24, 0.25, 0.35, 0.36,
108
Figura 34. Perfil de glucósidos cardiotónicos en semilla de Thevetia
thevetioides.
La extracción se realizó con 1 gramo de semilla inmadura utilizando etanol como
solvente, se desarrolló con acetato de etilo, metanol, agua (81:11:8) v/v. Se
derivatizó con Reactivo de Kedde. La placa se observó con luz banca por
Reflexión.
109
Figura 35. Perfil de Thevetia thevetioides, en función del volumen de
aplicación.
Con el extracto etanólico de semilla inmadura y madura de T thevetioides. Se
dosificó 1, 2 y 4 µL de extracto de semilla inmadura y 2,4,6 µL de semilla madura
sobre la placa de TLC, La placa fue desarrollada con acetato de etilo, metanol,
agua (81:11:8) v/v. Derivatizada con RK, se observó con luz banca R.
110
Figura 36. Perfil de glucósidos cardiotónicos en semilla de Thevetia
thevetioides en función del método de detección.
Se probaron 2 condiciones diferentes de detección, la primera condición se realizó
con reactivo de Kedde (RK), la segunda se realizó con reactivo de alfa naftol
(RAN) la placa se desarrolló con acetato de etilo, metanol, agua (81:11:8 v/v). Se
observó con luz blanca R.
111
0.92, 0.99; y 5 bandas Rf = 0.04, 0.24, 0.25, 0.35, 0.36; en los extractos de
semillas inmaduras y maduras, respectivamente (Figura 37).
Identificación de compuestos: se realizó por comparación con los resultados
obtenido previamente en el laboratorio, se identificaron 10 bandas Rf = 0.19, 0.22,
0.25, 0.31, 0.36, 0.50, 0.60, 0.70 ,0.92, 0.98.que correspondían a Tevetina
yccotlygenina; tevetina canogenina; tevetina digitoxigénina; así como sus acetatos.
También se identificaron los tres tevebiosidos, los tres peruviosidos y los acetatos
de estos últimos (Figura 38).
112
Figura 37. Perfil fitoquímico de semilla inmadura y madura de Thevetia
thevetioides.
El perfil se obtuvo con extracto etanólico de semillas inmaduras y maduras de T.
thevetioides en placa de HPTLC, desarrollada con el sistema de solventes acetato
de etilo, metanol, agua (81:11:8) v/v. Derivatizada con RK y RAN, observada con
luz blanca.
113
Figura 38. Identificación de glucósidos cardiotónicos en Thevetia
thevetioides.
La identificación de glucósidos se realizó con el extracto etanólico de semillas
inmaduras mediante la comparación de compuestos con el artículo de Molina-
Torres. Rf: 0.19Tevetina Yccotlygenina; Rf: 0.22 Tevetina Canogenina; Rf: 025
Tevetina Digoxigenina; Rf: 0.31 Acetato de Tevetina Canogenina; Rf: 0.36 Acetato
de Tevetina Yccotlygenina; Rf: 0.50 Acetato de Rf: 0.60Tevebiosido Canogenina;
Tevebiosido Yccotlygenina; Rf0: 70 Tevebiosido Digoxigenina: Rf: 92 Peruvósido
de Canogenina, Peruvósido Yccotlygenina, Peruvósido Digoxigenina; RF: 0.99
Peruvósido de Canogenina acetilado, Peruvósido Yccotlygenina acetilado,
Peruvósido Digoxigenina acetilado.
114
8. DISCUSIÓN.
En Estados Unidos los productos de origen vegetal tales como tés y bebidas
herbales, como el café, la yerba mate y las especias, han incrementado su ingreso
económico en los últimos años. En el periodo de 2011-2016 se reportó un
incremento de 33 a 93 mil millones de dólares. Los principales países
exportadores de productos herbolarios son Brasil, Vietnam y Alemania. México se
encuentra entre los 20 principales países exportadores de estos productos por lo
cual estos países se están enfocando en la elaboración de los productos
mencionados. Los países en los que se está generando un mayor crecimiento
económico debido a estos productos son India, China, Brasil, la Unión Europea;
los Estados Unidos están incursionando en este mercado.
Si comparamos a México con estos países por su la gran diversidad vegetal la su
riqueza cultural, principalmente en el uso de las plantas en medicina tradicional,
debería ocupar uno de los principales lugares como productor en el mercado
herbolario. Sin embargo, en México la industria herbolaria se enfrenta a grandes
retos debido a que se desconoce muchos de los compuestos bioactivos presentes
en la riqueza floral. Esto causa que la normatividad mexicana no apruebe el uso
de plantas en forma de tés o bebidas herbales. De hecho, la Farmacopea
Mexicana sólo hasta la última edición empieza a incorporar a las plantas de origen
mexicano, siendo que México tiene entre el 18 y el 30% de la diversidad total del
planeta. De este porcentaje el 10 al 15% son plantas endémicas.
China es otro país que por su ubicación geográfica y su extensa superficie
terrestre, cuenta con gran diversidad biológica, que igual que México, la ha
explotado desde la antigüedad. Parte de la cultura de China es el uso de plantas y
animales en la medicina tradicional impactando en su cultura actual.
De hecho para regular el consumo de estas plantas y animales, ha incursionado
en su Pharmacophea el perfil fitoquímico de más de 300 especies, utilizando el
115
método de Cromatografía de capa fina de alta resolución, por ser un método
rápido, que permite analizar una gran cantidad de muestras, con poco volumen de
extracto, sin importar tanto las estructuras químicas de los componentes, más bien
están caracterizando cada una de las especies (Chinese Pharmacopoeia, 2009)
No solo en China se está utilizando la técnica de HPTLC para la caracterización
de sus especies vegetales. Tanto en American Herbal Pharmacopoeia y Europea
Pharmacopoeia se ha utilizado para la determinación del perfil de las plantas con
carácter medicinal.(Reich E. M., 2012).
Esto es porque mediante el uso de esta técnica se puede hacer un trabajo general
que nos permite analizar hasta 20 plantas en una sola ejecución analítica y
obtener rápidamente una visión general de los perfiles fitoquímicos de
identificación y la calidad relativa de las plantas en el comercio (Reich E. M.,
2012).
Más específicamente, se puede usar para desarrollar perfiles diferenciadores muy
detallados de diferentes especies, a menudo especies estrechamente
relacionadas que de otro modo sería posible distinguir(Reich & Schibli, 2008).
La cromatografía de capa fina de alta resolución no es la antigua TLC realizada en
placas HPTLC con equipos costosos, sino más bien un nuevo concepto. Es la
combinación óptima de equipo moderno (tecnología), base teórica sólida (ciencia)
y metodología estandarizada (rendimiento) (Reich E. M., 2012).
Hoy, HPTLC está en el mismo nivel de calidad que GC y HPLC, también es un
complemento ideal para esas técnicas.(Reich & Schibli, 2008). El perfil fitoquímico
de las especies vegetales mexicanas con la técnica de HPTLC se puede utilizar
como herramienta, siendo la referencia que las autoridades empleen para regular
el consumo de estas plantas en tés o bebidas herbales.
116
En México se requiere la aplicación de estas herramientas de calidad confiable
para garantizar la identidad, pureza y las características del material botánico. La
cromatografía de capa fina de alta resolución (HPTLC) está surgiendo como una
tecnología versátil, de alto rendimiento y rentable que es especialmente adecuada
para evaluar la identidad y la calidad de los materiales botánicos (Reich E. M,
2012).
Este trabajo tuvo como objetivo generar y estandarizar una técnica rápida y
económica para la obtención del perfil fitoquímico de cinco especies de plantas
mexicanas que crecen en la región de Guanajuato: Argemone ochroleuca, Cirsium
rhaphilepsis, Montanoa tomentosa, Heliopsis longipes y Thevetia thevetioides. De
cada una de estas plantas se analizaron diferentes grupos de compuestos en
diferentes órganos de la planta.
Para obtener el perfil fitoquímico de A. ochroleuca, se estandarizaron las
condiciones de extracción en Datura stramonium, una planta que tiene una gran
cantidad de alcaloides de fácil extracción. Se probaron 6 métodos, incluyendo el
reportado por Kukula-Koch y Mroczek, 2015. En D. stramonium, se determinó que
el método de Todd fue el más eficiente y permitió detectar una mayor cantidad de
las bandas, como una mayor intensidad. Sin embargo, en A. ochroleuca, (Figura
20).Se logró una mayor resolución de las bandas (Figura 21) con una adaptación
del método de Wagner.
Posteriormente, se estandarizó que 4 µL por banda es el volumen adecuado para
la aplicación del extracto en A. ochroleuca (Figura 22). Para obtener la separación
de los alcaloides de los cuatro sistemas de solventes (ver materiales y métodos),
se observó que el sistema de solventes 1-Butanol, Acetato de etilo, ácido fórmico,
agua 30:50:10:10 v/v fue el más adecuado (Figura 23).
Wagner y Bladt en 1996, recomendaron realizar la derivatización utilizando el
reactivo de Dragendorff. Sin embargo, se determinó que este método de
117
derivatización en Datura stramonium sólo es funcional cuando se utiliza una gran
cantidad de extracto (6-12 µL por banda, dependiendo de la placa utilizada).
En D. stramonium se comprobó que la derivatización con reactivo de Dragendorff
permitía detectar los alcaloides, mientras que en A. ochroleuca, de los 4 sistemas
probados, la detección es mejor sin derivatizar observando directamente con luz
UV366 nm. Esto se debe a que en A. ochroleuca, los alcaloides presentes son de
tipo isoquinolínicos. De acuerdo con Wagner y Bladt (1996), los alcaloides
isoquinolínicos fluorescen a una longitud de onda de 365nm correspondiente al
azul, azul verdoso y amarillo, principalmente.
En la placa de HPTLC con el extracto metanólico de la raíz de A. ochroleuca se
observaron 3 bandas amarillas y 7 azules (Figura 25), correspondientes a los
alcaloides isoquinolínicos. También se observó la desactivación fluorescente
(Quenching) característica de algunos alcaloides de tipo isoquinolínicos.
A través del método de GC/EIMS se identificaron los alcaloides isoquinolínicos
presentes en las bandas amarillas: fagarina Rf = 0.45, Rt = 37.874 y protopina Rf
= 0.76, Rt = 37.953. La protopina también fue hallada en el perfil fitoquímico de los
extractos provenientes de la raíz de Argemone mexicana en el cual, además se
detectaron los alcaloides isoquinolínicos: berberina, queleritina; sanguinarina;
galantamina; magnoflorina; palmitina y coptisina, a través de otra técnica que
detecta estructuras con un mayor peso: TLC-HPLC-MS, TOF-MS.A diferencia del
análisis por GC/MS esta técnica proporciona análisis directo de MS de cualquier
banda obtenida después del desarrollo de TLC(Kukula-Koch & Mroczek, 2015).
En A. ochroleuca no se pudieron identificar los alcaloides presentes en las bandas
azules. En el caso de Argemone mexicana se encontraron bandas azules que
identificaron como magnoflorina y galantamina (Kukula-Koch & Mroczek, 2015). Es
probable que los alcaloides presentes en las bandas azules en A. ochroleuca
tenga una estructura más compleja y su detección no sea posible en las
condiciones utilizadas en el GC/EIMS. Para realizar un análisis más detallado y
118
definir mejor las bandas se puede utilizar una cromatografía en columna en gel de
sílice con un sistema de solventes hexano-cloroformo-etanol, como describen
Kukula-Koch y Mroczek (2015).
Comparando el perfil fitoquímico entre los diferentes órganos de A. ochroleuca se
observa la protopina y la fagarina en todos los órganos, por lo que se puede
considerar a estos compuestos como referencia en el perfil. Entre la flor y el tallo
no se observa diferencia. Sin embargo, en las hojas se observaron un mayor
número de bandas con mayor intensidad, debido a que en las plantas los
alcaloides normalmente se almacenan en las partes aéreas (Arango-Acosta,
2002). La raíz, también mostróun menor número de bandas, cuatro de ellas muy
intensas: que correspondieron a fagarina, protopina, posible galantamina y
sanguinarina, Esta última no se encontró en ningún otro órgano. Adicionalmente,
se observaron seis bandas muy tenues, dos de ellas no se encuentran en ningún
otro órgano, esto puede ser porque, los alcaloides de algunas plantas se forman
en las raíces (Arango-Acosta, 2002).
La obtención del perfil fitoquímico de fenoles de Cirsium rhaphilepsis se realizó
utilizando un extracto metanólico con un volumen de aplicación de 2 µL. Se
probaron 4 sistemas de solventes y se consideró que el sistema acetato de etilo,
ácido acético, ácido fórmico, agua 100:11:11:26 v/v fue el más adecuado. Este
sistema de solventes se recomienda para realizar un análisis de los flavonoides
(Wagner & Bladt, 1996). La derivatización se realizó con productos naturales y se
adicionó polietilenglicol para disminuir el límite de detección, intensificando las
bandas. La detección se realizó observando la placa sin derivatizar con UV 254nm
y 366nm, Esto se debe a que todos los flavonoides presentan desactivación
fluorescente (Quenching). Además, al observarse a 366nm fluorescen los
flavonoides (Wagner & Bladh, 1996). Al detectar los fenoles con UV 254 nm
algunas bandas presentan Quenching. En la placa no se observó una diferencia
en el perfil entre el tallo y la hoja. Ambos órganos poseen bandas azules bien
definidas, así como una banda negra y dos bandas naranjas tenues. De acuerdo
119
con Wagner y Bladh, en 1996, las bandas azules corresponden a ácidos fenol
carboxílicos como el ácido clorogénico o cumarinas. Mientras que las bandas
naranjas y amarillas corresponden a flavonas y flavonoles. El perfil obtenido en la
inflorescencia presentó el mayor número de bandas, 18 bandas, de las cuales al
menos ocho son azules y las restantes son amarillas o naranjas. Por lo tanto,
podemos asumir que en la inflorescencia encontramos ácidos fenol carboxílicos y
flavonoides tipo flavonas, así como flavonoles.
De acuerdo con Wagner y Bladh (1996), las antocianinas son las responsables del
color rojo, azul, morado de las flores y algunas otras partes de la planta. Las
antocianinas se encuentran mayormente en forma de glucósidos. Es decir, están
constituidas por una molécula de antocianidinas, que es la aglicona, a la que se le
une un azúcar por medio de un enlace β-glucosídico. La estructura química básica
de estas agliconas es el ion flavilio, también llamado 2-fenilbenzopirilio. Las flores
de Cirsium rhaphilepsis son moradas, por lo que se sugiere que la banda 1 y 2
correspondes a antocianinas.
De acuerdo con Vermerris y Nicholson (2008), en la identificación de fenoles por
TLC la estrategia más común es la de incluir un conjunto de compuestos de
referencia en la placa. Estos compuestos se aplican de forma individual y si la
mezcla contiene cualquiera de los compuestos de referencia, pueden ser
identificados con base al valor Rf. Sin embargo, esta técnica deja un cierto margen
de incertidumbre, debido a que dos compuestos diferentes pueden tener el mismo
valor Rf. Para establecer la identidad del compuesto con más confianza, se
recomienda la caracterización adicional, separando los compuestos y realizar un
análisis químico más detallado, tal como: GC/MS, HPLC/MS o espectrometría de
masas. En este trabajo, la identificación se realizó utilizando sustancias de
referencia incluyendo rutina, ácido clorogénico y ácido gálico. El ácido clorogénico
es el único compuesto de referencia que se encuentra en todos los órganos
analizados, en contraste con la rutina que parece estar presente sólo en la
inflorescencia, mostrando una banda naranja Rf = 0.45, donde se observa un par
120
de bandas: una azul y otra naranja. El ácido gálico no se encontró en ninguna
muestra.
Nasaruk, en 2006, estudio la actividad antioxidante de los compuestos fenólicos
de 5 especies del género Cirsium: C. arvense, C. oleraceum, C. palustre, C.
rivulare y C. vulgare. Reportó que la actividad antioxidante en estas especies está
correlacionada con la cantidad de compuestos fenólicos de la planta.
Para obtener perfil fitoquímico de los terpenos en M. tomentosa, se probaron 5
diferentes solventes, siendo el éter de petróleo el extracto en el que se obtuvo
mayor cantidad de compuestos. Esto puede ser porque de acuerdo con el análisis
de compuestos volátiles realizado por Robles-Zepeda y colaboradores (2006), el
83 % de los compuestos fueron identificados como monoterpenos los cuales son
compuestos altamente hidrofóbicos presentes en los aceites esenciales (Turina,
Nolan, Zygadlo, & Perillo, 2006).
En este trabajo para los terpenos se probaron diferentes volúmenes de aplicación,
siendo 4µL por banda el volumen más adecuado, el hexano acetato de etilo 4:1 v/v
se utilizó como el sistema de solventes que permite una mejor separación. La
detección se realizó con el reactivo de vainillina ácido sulfúrico, el cual de acuerdo
con Wagner y Bladh, en 1996, al derivatizar los terpenos con este reactivo se
observaron en colores rojo-violeta, café-rojizo, azul, azul verde, gris y gris rojizo;
que corresponde con los colores que se observaron en el perfil que se obtuvo en
este trabajo.
Se comparó el perfil de los terpenos entre la hoja y la inflorescencia, donde se
observó el mismo perfil en ambos. La única diferencia evidente, es la intensidad
de las bandas mientras que en las hojas el perfil muestra bandas muy intensas, en
la inflorescencia las bandas apenas se identifican. La diferencia en la intensidad
puede ser debido a que en los órganos aéreos de las plantas como las hojas se
encuentran los tricomas. De acuerdo con Nagata y colaboradores (2006), los
tricomas son capaces de sintetizar y secretar una alta cantidad de metabolitos
121
secundarios. Se ha demostrado que, en la hoja de menta, los tricomas producen
monoterpenos que le dan su sabor característico. También los tricomas de las
hojas del tomate producen sesquiterpenos que actúan como insecticidas.
Para identificar los compuestos se realizó una TLC preparativa que permitió la
separación de los terpenos en bandas e identificarlos con GC/EIM. En la banda 6
se encontraron dos principales terpenos que son: ácido grandiflorénico y ácido
kaurenoíco. También se encontraron trazas de ácido monogénoico. No se realizó
un análisis más detallado de las otras bandas, pero Robles Zepeda y
colaboradores encontraron 19 terpenos en hoja y 14 en flor, dentro de los que
destacan: sabineno, α-pineno, α-thujeno, γ-terpineno, santolina trieno, limoneno.
Estos compuestos volátiles son los responsables de las múltiples interacciones
entre plantas y otros organismos, como polinizadores y herbívoros, también
muchos de ellos sirven de protección a la planta.
En el perfil fitoquímico de alcamidas en H. longipes se realizó con extracto
etanólico de raíz y semilla, la extracción en semilla fue un poco diferente. El perfil
se desarrolló en una placa de HPTLC utilizando el sistema de solventes hexano -
acetato de etilo, 2:1 v/v, se derivatizó con vainillina–ácido sulfúrico y se visualizó
con lámpara de luz visible. H. longipes fue la primera especie en la que se
determinó la presencia de una alcamida olefínica (Acree, Jacobson, & Haller,
1945). Las amidas cuya cadena acídica es alifática, dependiendo del tipo de
enlaces insaturados que presenten, se pueden separar en dos grupos: las
alcamidas olefínicas, con al menos una doble ligadura; y las alcamidas
acetilénicas, con al menos una triple ligadura (Greger, 2016).
Se observó que hay diferencia entre el perfil de raíz con respecto al de semilla aun
cuando en ambas se encuentran presentes los compuestos: N–isobutil–
(2E,6Z,8E-decatrienamida y el bornil éster del ácido (2E,6Z,8E)-decatrienoico
(Figura 37). De acuerdo con lo reportado por García Chávez (2004), en la raíz de
H. longipes se encontró un total de nueve alcamidas distintas y un compuesto de
122
estructura relacionada que es el (2E,6Z,8E)-trien decanoato de bornilo (García-
Chavez et al., 2004). El éster de bornilo está constituido por la misma cadena
alifática del ácido (2E,6Z,8E)–trien-oico de las alcamidas mayoritarias de las
especies de Heliopsis. Este compuesto, fue descrito inicialmente en esta especie
(Molina- Torres et al., 1995).
En este caso sólo se observaron tres bandas que corresponden a alcamidas,
debido a que el derivatizante utilizado no es específico para alcamidas. Más bien
es un revelador utilizado para la detección de alcoholes superiores, fenoles,
esteroides y aceites esenciales (Wagner & Bladt, 1996).
Las alcamidas son una clase singular de productos naturales que, se forman al
combinarse dos diferentes rutas metabólicas. La parte acídica, según Greger
(2016), se origina de un ácido graso de longitud de cadena de mediana a larga,
que puede ser de ocho a dieciocho carbonos, generalmente alifática o lineal. Éste,
al condensarse con un aminoácido y en descarboxilación concomitante, resulta en
la producción de una alcamida. Sin embargo, esta propuesta de síntesis no se ha
logrado comprobar. En la actualidad en el laboratorio de Fitobioquímica
(CINVESTAV) la estudiante Buitimea Cantúa ha desarrollado su trabajo de
doctorado sobre este tema, proponiendo la mediación de una policétido sintetasa
no descrita hasta la fecha en plantas.
En T. peruviana los glucósidos cardiotónicos, se almacena en las hojas, las flores
y las semillas (Amarango-Villa et al., 2011). En este estudio se obtuvo el extracto
etanólico de las semillas tanto inmadura como madura de T. thevetioides, el
desarrollo se realizó con el sistema de solventes acetato de etilo, metanol, agua
81:11:8 v/v. Los glucósidos cardiotónicos poseen una estructura esteroidal que se
caracterizan por llevar en el C-17 un anillo de lactona no saturado. Los
cardenólidos tienen específicamente un anillo pentagonal con un doble enlace
conjugado con el grupo carbonilo y como parte de la denominada glicona, incluyen
un hidroxilo esterificado en la posición tres con moléculas de azúcar como
123
sustituyentes, siendo las más comunes, la thevetosa, glucosa, ramnosa, mucosa y
digitalosa (Amarango-Villa et al., 2011). Estas características de los glucósidos,
permitió revelar la placa con dos derivatizantes, el reactivo de Kedde y el alfa-
naftol.
Kyeremematen y Hagos reportaron que en las semillas estudiadas de las especies
Thevetia ovata y Thevetia nerifolia, se encontraron tres glucósidos cardiotónicos
tipo cardenólidos conocidos como thevetina A, thevetina B y peruvósido, siendo el
contenido de thevetina A marcadamente menor. En este estudio el perfil
fitoquímico derivatizado con el Reactivo de Keede muestra una diferencia notable
entre la semilla madura y la semilla inmadura. En ambas semillas se encuentra las
estructuras de las tevetinas (agliconas con los tres azúcares) y sus acetatos. Sin
embargo, en las semillas inmaduras se observa adicionalmente los peruvósidos y
los thevebiósidos, estructuras de las agliconas con uno o dos azúcares,
respectivamente y las estructuras acetiladas de los peruvósidos.
Al observar el perfil fitoquímico derivatizado con RAN se identificó un menor
número de bandas con respecto a RK, se visualizó una coloración muy tenue en la
banda correspondiente a Thevetina A, no se observó el acetato de Thevetina B ni
C. Tampoco se observaron los thevebiósidos por lo que es más adecuado utilizar
Reactivo de Kedde.
Para la identificación de los compuestos se utilizó como referencia el artículo de
Molina-Torres y colaboradores, en proceso de publicación. Se encontraron 13
compuestos (Figura 42).
124
9. CONCLUSIONES:
Con el métodode cromatografía en capa fina, se logró la obtención del perfil
fitoquímico, preciso, simple con un alto grado de resolución y repetitividad, capaz
de distinguir los principales componentes presentes en especímenes de
importancia en la herbolaria tradicional a nivel de especie, tejido, o estado de
desarrollo.
En Argemone ochroleuca, se detectaron dos principales alcaloides: protopina y
fagarina.
Al comparar el perfil de Argemone ochroleuca con Argemone platyceras se obtuvo
indicios sobre la similitud entre ambas especies.
En el caso de C. rhaphilepis se detectaron compuestos fenólicos sin lograr una
identificación. Al comparar el perfil de los órganos fue posible diferenciar el perfil
fenólico de inflorescencia con respecto al tallo y la hoja; pero no entre el tallo y la
hoja.
En Montanoa tomentosa se identificaron los terpenos como ácido kaurenoico,
grandiflorénico característicos de esta especie, y se encuentran principalmente en
hoja.
En el caso de Heliopsis longipes se detectaron las alcamidas, con una mayor
intensidad de banda para la afinina.
Para esta misma especie se comparó la intensidad de las bandas tanto en semilla
como en raíz obteniendo mayor intensidad en la raíz.
En Thevetia thevetioides se identificaron cardenólidos y sus glucósidos en una
sola placa. Se observaron diferencias entre el fruto inmaduro con mayor cantidad
de agliconas, mono y disacáridos Mientras que en fruto maduro se observaron
mayormente triglucósidos
125
Por HPTLC es posible observar diferencias entre la distribución de los metabolitos
de las especies en la región de estudio a través de sus órganos, así como entre
las etapas de maduración de las semillas.
El perfil fitoquímico de estas 5 especies se podrá utilizar como referencia para
trabajos posteriores facilitando la identificación de especies.
Para dar solidez a este proyecto hace falta la información de más especies y
especímenes no solo de nuestra región de estudio sino de todo Mesoamérica,
donde ha sido delegada la importancia de la riqueza de la biodiversidad de
biológica nuestra región
En este trabajo se pudo aprovechar la versatilidad de la técnica, pues se logró
analizar diferentes metabolitos, sin importar los tipos de estructuras, incluso de
bajo peso molecular.
126
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