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Uso de Microorganismos a Nivel Industrial - Producción de Ácido Pirúvico

León, Mauricio y Piedra, Javier

Escuela de Química, Universidad Nacional, Laboratorio de Biotecnología

Heredia, Costa Rica. 24/08/2012

Abstracto: El análisis cualitativo de la producción de ácido pirúvico cuenta con una primera etapa en donde se estudian dos series de muestras con suspensiones de levadura en Na 2HPO4 y KH2PO4 al 10%, respectivamente; y que después son puestas en contacto con glucosa en concentraciones distintas. Mediante una operación de incubación que involucra un baño maría a 37°C se lleva a cabo el proceso de glucólisis, el desprendimiento de CO2 confirma la finalización de esta. La centrifugación a 2500 revoluciones por 10 minutos después de la adición de ácido tricloroacético produce un sobrenadante con el ácido pirúvico. La reacción de este con nitroprusiato de sodio resulta en un anillo verde o azul y la reacción con 2,4-dinitrofenil-hidracina crea un precipitado rojo y una coloración amarilla en disolución. El método se realiza bajo condiciones alcalinas para inactivar la enzima piruvato descarboxilasa, la cual convierte en piruvato en acetaldehído.

Introducción

La glucólisis es el proceso por el cual la glucosa se transforma en piruvato conformación de ATP. En ausencia de oxígeno, luego de la glucólisis se lleva a cabo la fermentación, donde se produce etanol y CO2, o ácido láctico, dependiendo del organismo que lo efectúe; en el primer caso las levaduras son las responsables. Ambas rutas de fermentación (producción de etanol y ácido láctico) son similares hasta la formación de piruvato, manteniendo similares las etapas de conservación de energía que conducen a la formación de ATP. La glucólisis no solo es la vía principal para el metabolismo de la glucosa que conlleva a la producción de acetil-CoA y a su subsiguiente oxidación en el ciclo del ácido cítrico, sino que también proporciona una vía importante para metabolizar fructosa y galactosa derivada de los alimentos. La glucólisis es la oxidación de la glucosa para formar ácido pirúvico y en general representa el primer paso del catabolismo de los hidratos de carbono. La mayoría de los microorganismos (en realidad, la mayoría de las células vivas) utilizan esta vía metabólica.1

El término glucólisis significa ruptura del azúcar y define el proceso con precisión. Las enzimas que participan en la glucólisis catalizan la escisión de la glucosa, un azúcar de seis carbonos, en dos azúcares de tres carbonos. Luego estos experimentan un proceso de oxidación que libera energía y

sus átomos se reordenan para formar dos moléculas de ácido pirúvico. La reducción del NAD+ durante esta serie de reacciones forma NADH, con una producción neta de dos ATP por fosforilación a nivel de sustrato. La glucólisis no requiere oxígeno y puede tener lugar en presencia o en ausencia de este elemento. Esta vía consiste en una secuencia de diez reacciones químicas y cada una de ellas es catalizada por una enzima diferente. Las cinco primeras reacciones constan de un consumo de dos moléculas de ATP, mientras que en las últimas cinco etapas hay una producción de cuatro ATP, lo que da una producción neta de dos ATP. 1

Si hay suficiente suministro de oxígeno, el ácido pirúvico es descarboxilado en la matriz de la mitocondria por el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa rindiendo CO2 y acetil coenzima A que es el inicio de una serie de reacciones llamada ciclo de Krebs, seguida de la fosforilación oxidativa. Si no hay suficiente cantidad de oxígeno disponible o el organismo es incapaz de continuar con el proceso oxidativo, el piruvato sigue una ruta anaeróbica, la fermentación. En esta vía, el piruvato se reduce, permitiendo regenerar las moléculas de NAD+ consumidas en los procesos anteriores. Los animales son capaces de realizar la fermentación láctica cuyo producto es ácido láctico. Las bacterias y levaduras son más versátiles, y pueden realizar otras

1 Tortora, Funde, Case. 2007. Introducción a la microbiología.

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fermentaciones, como la fermentación alcohólica, cuyo producto es etanol. En la conversión en lactato, interviene la enzima lactato deshidrogenasa y la coenzima NADH; en la fermentación alcohólica el piruvato es convertido primero en acetaldehído y luego en etanol y dióxido de carbono.2

En la vía anaeróbica llamada fermentación alcohólica, las enzimas transforman cada molécula de piruvato de la glucólisis a una forma intermedia: el acetaldehído. El NADH transfiere electrones e hidrógeno al acetaldehído y así lo transforma en el producto final, el alcohol llamado etanol. Algunos hongos unicelulares llamados levaduras son famosos por su uso de esta vía. Los del tipo Saccharomyces cerevisiae, se utilizan en la fabricación de pan para que la masa se infle. Los panaderos mezclan la levadura con el azúcar y después mezclan ambas con la harina. Al efectuar la fermentación, las células de la levadura liberan dióxido de carbono. Las burbujas de este gas expanden la masa y hace que aumente. Gracias al calor del horno, el gas escapa de la masa y deja atrás un producto poroso. Los productores de vino y cerveza emplean levaduras salvajes como cepas cultivadas de S. ellipsoideus. Ambas son activas hasta que la concentración de alcohol en los toneles de vino excede el 14%.3

Para conseguir la acumulación de ácido pirúvico y poder detectarlo, la fermentación se llevará a cabo en condiciones ligeramente alcalinas para inactivar a la enzima Piruvato Descarboxilasa. La identificación se realiza mediante dos pruebas cualitativas coloreadas.4 El piruvato generado reacciona con 2,4.dinitrofenilhidrazina para formar dinitrofenilhidrazona, de color amarillo, con una absorbancia que puede ser medida a 505nm.5 La reacción del piruvato con nitroprusiato de sodio da como resultado un anillo de coloración verde o azul en la interfase.4 El ácido tricloroacético es anchamente utilizado en bioquímica para la

precipitación de macromoléculas tal como proteínas, ADN y RNA.5

Figura 1. Levadura Saccharomyces cerevisiae.

Procedimiento

El método científico empleado para el análisis cualitativo de ácido pirúvico y la producción del mismo fue el proporcionado según la Cátedra de Química Orgánica, con las siguientes modificaciones:

Por falta de los reactivos Na2HPO4 y KH2PO4 al 10% necesarios para la suspensión de la levadura, la incubación de la misma con la glucosa se dio en forma dividida entre los compañeros de clase, posteriormente los resultados fueron compartidos.

Resultados Obtenidos

Cuadro 1. Análisis Cualitativo de la serie A, disoluciones de glucosa con levadura suspendida en Na2HPO4.

Serie A Reacción con nitroprusiato de sodio

Reacción con 2,4-dinitrofenilhidracina

Glucosa 0,5%

+ +

Glucosa 1%

+ + + +

2 Cody, Boctor, Filley, Hazen, Scott, Sharma, Yoder Jr., Master. Primordial Carbonylated Iron-Sulfur Compounds and the Synthesis of Pyruvate.3 Starr, Taggart. Biología, la unidad y la diversidad de la vida.4 Melo V, Cuamatzi O. Bioquímica de los procesos metabólicos.5 Bennington. Diccionario Enciclopédico del Laboratorio Clínico.

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Glucosa 2%

+ + + + + +

(+) = prueba positiva

Cuadro 2. Análisis Cualitativo de la serie B, disoluciones de glucosa con levadura suspendida en KH2PO4.

Serie B Reacción con nitroprusiato de sodio

Reacción con 2,4-dinitrofenilhidracina

Glucosa 0,5%

+ +

Glucosa 1%

+ + + +

Glucosa 2%

+ + + + + +

(+) = prueba positiva

Discusión de Resultados

Se puede deducir, con las observaciones determinadas en clase, que se procedió adecuadamente la reacción de fermentación, debido a que se observó la presencia de burbujas durante el proceso, mostrando con esto la formación de CO2, un producto de la misma.

Analizando los resultados obtenidos según los cuadros 1 y 2, se destaca que todas las pruebas dieron positivas, generándose un color más intenso conforme se aumenta la concentración de glucosa en disolución, esto para ambas reacciones cualitativas llevadas a cabo (ver anexos). Al aumentar la concentración de glucosa en las muestras se da una mayor producción de piruvato por parte de la levadura, arrojando resultados más notorios en las reacciones cualitativas.

También algo a resaltar es que en la serie B, se generó una coloración menos intensa que en la serie A, esto debido a que el fosfato ácido de potasio es más ácido, que el sulfato ácido de sodio, conllevando con esto, a que el medio de la disolución de la serie A es un medio más básico que el de la serie B, y debido a que la enzima piruvato descarboxilasa se inhibe o inactiva su acción en medio básico, esta se encuentra menos inactiva en la serie A, por lo que en esta serie habrá una mayor concentración y acumulación de ácido pirúvico.

Conclusiones

La glucólisis es el proceso por el cual la glucosa se degrada a Etanol y CO2, y/ó a ácido láctico dependiendo del organismo que lo efectúe, como siendo en el primer caso las levaduras las responsables.

Los metabolitos piruvato y acetaldehído se encuentran presentes normalmente en muy baja concentración, por lo tanto, para demostrar su existencia como intermediarios en el camino metabólico, es necesario impedir que sean transformados en otros compuestos. Esto se puede realizar bloqueando la enzima que cataliza la conversión del compuesto que se está investigando mediante inhibidores, Cambiando las condiciones fisiológicas para que la enzima funcione a una velocidad muy por debajo de su actividad máxima o usando un agente que atrape el intermediario y que forme un compuesto que no pueda metabolizarse.

La piruvato descarboxilasa no es activa en soluciones ligeramente alcalinas, de manera que el piruvato se acumula y su presencia puede demostrarse por la reacción con nitroprusiato de sodio o 2,4 dinitrofenilhidrazina.

Bibliografía

(1) G.J. Tortora, B.R. Funde, C. L. Case. 2007. Introducción a la microbiología. 9° Edición. Médica Panamericana. Buenos aires; Argentina. pp. 127, 137.

(2) G. D. Cody, N. Z. Boctor, T. R. Filley, R. M. Hazen, J. H. Scott, A. Sharma, H. S. Yoder Jr., D. Master. 2000. Primordial carbonylated iron-sulfur compounds and the synthesis of pyruvate. 2° Edición. Science, 289. New York, Estados Unidos. pp. 1337-1340.

(3) C. Starr, R.Taggart. 2007. Biología, la unidad y la diversidad de la vida. 11° Edición. Editorial Thomson. México, D.F., México. pp 542.

(4) Melo V, Cuamatzi O. 2007. Bioquímica de los procesos metabólicos. 2° Edición. REVERTÉ. México. pp 147-166.

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(5) T. Bennington. 2000. Diccionario Enciclopédico del Laboratorio Clínico. Editorial Médica Panamericana. España. pp. 55, 78.

Anexos

Figura 2. Resultado experimental reacciones con nitroprusiato de sodio, y 2,4-dinitrofenilhidracina, para la serie A.

Figura 3. Resultado experimental reacciones con nitroprusiato de sodio, y 2,4-dinitrofenilhidracina, para la serie B.

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