Reduzierung der Keimbelastung in Vorflutern durch ... · werden Antibiogramme von...
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Arbeitsbereich Soil Microbial Ecology
Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien UFT
Universität Bremen
Reduzierung der Keimbelastung in Vorflutern durch Behandlung des
Kläranlagenablaufs in einem neuartigen bepflanzten Bodenfilter mit
Untersuchungsfokus auf antibiotikaresistente Bakterien
Abschlussbericht über ein Entwicklungsprojekt,
gefördert unter dem AZ: 32081 von der
Deutschen Bundesstiftung Umwelt
von
Dr. Stefan Knauth (Projektbearbeitung)
Dr. Thilo Eickhorst (Projektleitung)
September 2016
Dr. Stefan Knauth
Tel.: +49 421 218 63447
E-Mail: [email protected]
Dr. Thilo Eickhorst
Tel.: +49 421 218 63446
E-Mail: [email protected]
Universität Bremen
Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien (UFT)
Soil Microbial Ecology
Leobener Str., UFT
28359 Bremen
10/01
Projektkennblatt der
Deutschen Bundesstiftung Umwelt
Az 32081/01 Referat 23 Fördersumme 121.200 € Antragstitel Reduzierung der Keimbelastung in Vorflutern durch Behandlung des Klär-
anlagenablaufs in einem neuartigen bepflanzten Bodenfilter mit Untersu-chungsfokus auf antibiotikaresistente Bakterien
Stichworte Verfahren, Filter, Screening
Laufzeit Projektbeginn Projektende Projektphase(n)
18 Monate 01.11.2014 30.04.2016 1
Zwischenberichte
Bewilligungsempfänger Universität Bremen Tel. 0421/218-63446 FB 2 Biologie/Chemie Fax Soil Microbial Ecology Projektleitung: Herr Dr. Thilo Eickhorst Dr. Thilo Eickhorst Leobener Str. im UFT Bearbeiter: 28359 Bremen Dr. Stefan Knauth Kooperationspartner Wasserversorgung Sulinger Land, Nechtelsen 11, 27232 Sulingen Mikrobiologisches Labor - Dr. Michael Lohmeyer GmbH, Mendelstraße 11,
48149 Münster
Meyer Umweltservice GmbH & Co. KG, Ellerchenhausen 1, 27239 Twistringen
Zielsetzung und Anlass des VorhabensAntibiotikahaltige Abwässer führen in Aufbereitungsanlagen und Kleinkläranlagen zur Bildung von multi-resistenten Bakterien. Die Emission dieser Bakterien in den natürlichen hydrologischen Kreislauf kann zu einer breiten Übertragung der Resistenzgene auf autochthone Mikroorganismen führen und später direkt oder über den Umweg der Nahrungskette zum Menschen gelangen, wo sie zur Verschlechterung der be-reits bestehenden Antibiotika-Therapieprobleme führen können. Ziel des Vorhabens ist, ein am Zentrum für Umweltforschung und nachhaltige Technologien (UFT) der Universität Bremen entwickeltes innovatives Bodenfilterverfahren hinsichtlich der bakteriellen Eliminati-onsleistung von vorgeklärten Abwässern einer kleineren kommunalen Kläranlage zu bewerten. Im Fokus der Überprüfung steht der Einfluss des Filtrationsverfahrens auf Antibiotika-resistente, klinisch relevante Bakterien. Die Reduzierung der Keime dient dabei nicht nur der zusätzlichen hygienischen Entlastung, sondern verhindert indirekt auch eine Ausbreitung von Resistenzgenen in die Gewässer und somit eine mögliche Übertragung auf die dortige Mikroflora und humanpathogene Erreger in die Umwelt.
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden Das Vorhaben zielt auf eine Bewertung der Keimreduktion durch den Einsatz des innovativen bepflanz-ten Bodenfilters und einer Verringerung der Emission Antibiotika-resistenter Keime in den Vorfluter. Die mikrobielle Belastung im Zu- und Ablauf des Bodenfilters sowie der einzelnen Substratzonen wird analysiert und bewertet, was die Grundlage zur weiteren Verfahrensoptimierung liefert. Es werden aktu-elle, moderne molekularbiologische Verfahren wie die Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS) und DNA-Anfärbung zur bestmöglichen phylogenetischen Charakterisierung und Quantifizierung der hygienischen Eliminationsleistung des Bodenfilters verwendet. Bedeutende Antibiotika-Resistenzgene von klinisch re-levanten Bakteriengruppen werden mit Hilfe des Verfahrens der Real-time PCR quantifiziert. Zusätzlich werden Antibiogramme von Indikator-Mikroorganismen (Escherichia coli) angefertigt, um potentielle Bil-dungen von Multiresistenzen identifizieren zu können. Ergänzt werden diese Analysen mit klassischen Verfahren der Kultivierung, sowohl der insgesamt vorhandenen Kolonie bildenden Einheiten (KbE) als auch selektiv der Coliformen und E. coli KbE, sowie Respirationsmessungen der Bodenfiltersubstrate. Die Untersuchungen wurden über einem Zeitraum von April bis Dezember 2015 an einem an der Kläran-lage Sulingen installierten Bodenfilter (DBU AZ 28722) durchgeführt.
Deutsche Bundesstiftung Umwelt An der Bornau 2 49090 Osnabrück Tel 0541/9633-0 Fax 0541/9633-190 http://www.dbu.de
Ergebnisse und Diskussion Die Eliminationsleistung des bepflanzten Bodenfilters konnte sowohl mit klassischen als auch molekular-biologischen Methoden nachgewiesen werden. Im Versuchsverlauf zeigten sich deutliche Schwankun-gen sowohl bei der Keimbelastung des Klärwassers als auch bei der Eliminationsleistung. Letztere zeigte vor allem im Sommer bei der Reduktion coliformer Keime eine gute Leistung (im Mittel -85%). Sobald die Keimbelastung im Klärwerksablauf einen Schwellenwert von ca. 2 Mio. Keimen je ml unterschreitet, kann der Bodenfilter allerdings keine weitere Reduktion erreichen. Hinsichtlich der mikrobiellen Diversität gleicht sich die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft im Bodenfilterablauf dem Substrat des Bodenfilters an und zeigt eine wesentlich geringere Ähnlichkeit mit der Zusammensetzung im Klärwerksablauf (<50%). In beiden Abwässern konnten spezifische Zu- und Abnahmen untersuchter Bakteriengruppen identifiziert werden. Ähnliche Tendenzen konnten bei der quantitativen Analyse der Resistenzgene festgestellt werden, was für 3 der untersuchten 6 Resistenzge-ne eine Zunahme an einzelnen Terminen im Ablauf des Bodenfilters bedeutete. Die Analyse der Antibiotikaresistenz isolierter E. coli Keime zeigte eine Verschiebung der Antibiotikare-sistenz-Muster zwischen Klärwerksablauf und Bodenfilterablauf. Dabei kam es in letzterem zum Auftre-ten neuer Resistenzen, deren Auswirkung aber relativ zur deutlich geringeren Keimbelastung des Filter-ablaufs gesehen werden muss. Nichts desto trotz führt der Bodenfilter zu Veränderungen der mikrobiel-len Qualität des Abwassers, die sich über die allgemeine Bestimmung von KbE oder Analyse der mikro-biellen Aktivität als Summenparameter nicht ableiten lassen.
Öffentlichkeitsarbeit und Präsentation Im Rahmen dieses Projektes wurden der Forschungsgegenstand und Teilergebnisse zu verschiedenen Gelegenheiten präsentiert und mit unterschiedlichen Zielgruppen diskutiert. Bereits zu Beginn des Projektes wurde das Vorhaben im Rahmen eines Zeitungsartikels in der Nord-westzeitung vom 24.04.2015 zusammen mit dem DBU Projekt AZ 28722 thematisiert. Eine weitere Er-wähnung fand das Projekt in einem Zeitungsartikel im Weser-Kurier vom 13.10.2015, in dem Böden und deren Rolle bei der Filtration von Wasser thematisiert wurden. Darüber hinaus wurde das Projekt der Fachöffentlichkeit in Form zweier Tagungsbeiträge („Influence of soil filters on the bacterial diversity in the effluent of a wastewater treatment plant“, KIII Tagung der DBG, 17.-18.03.2015; „Einfluss eines bepflanzten Bodenfilters auf die Elimination von Bakterien aus dem Ab-lauf eine Kleinkläranlage unter Berücksichtigung von Antibiotika resistenten Keimen und deren Resis-tenzgenen“, Jahrestagung der Deutschen Bodenkundlichen Gesellschaft, 05.-10.09.2015) präsentiert. Zu den Beiträgen wurde ein Abstract angefertigt und veröffentlicht. Zudem wurden die methodischen Aspek-te des Projektes während der Teilnahme am 3rd International Symposium on the Environmental Dimen-sion of Antibiotic Resistance (EDAR-3; 17.-21.05.2015) mit Experten dieser Thematik diskutiert. Eine Vorstellung des Projektes unter Fachleuten aus der Anwendungspraxis erfolgte im Rahmen eines Projekttreffens (zusammen mit DBU AZ 28722; 26.05.2015). Die vorgestellten Ergebnisse wurden im Plenum und in vertieften Fachgesprächen diskutiert. Die Endergebnisse des Projektes sollen im Rahmen eine Bodenfilter-Workshops am UFT Bremen gegen Ende 2016 zusammen mit weiteren am UFT ge-wonnenen Ergebnissen vorgestellt werden. Derzeit sind zwei Veröffentlichungen aus diesem Projekt vorgesehen, wobei eine eher auf die Praxisan-wendung ausgerichtet sein wird und eine weitere die methodischen Erkenntnisse aus dem Vorhaben in einer internationalen Fachzeitschrift thematisieren wird.
Fazit Durch das Verfahren des bepflanzten Bodenfilters können Bakterien, insbesondere E. coli und Coliforme aus dem Klärwasserablauf effizient eliminiert werden. Das entsprechende Abwasser aus dem Filterab-lauf trägt somit zur hygienischen Entlastung des Vorfluters und damit auch der gesamten Umwelt bei. Die hochauflösende molekularbiologische Analyse der mikrobiellen Diversität in den untersuchten Ab-wässern des Klärwerks und des Bodenfilters ließen neben der Elimination einzelner Keimgruppen auch ein vermehrtes Auftreten bisher nicht im Klärablauf identifizierter Keime erkennen. Hinsichtlich der Resistenzgene zeigte sich, dass ein Teil der analysierten, klinisch relevanten Gene re-duziert wurden, aber auch eine Zunahme weniger Gene detektiert wurde. Weiterführende Analysen der Resistenzspektren von E. coli Isolaten zeigten ebenso, dass sich neben der Verringerung bestimmter Resistenzen auch gegenüber dem Klärwerksablauf neue Antibiotikaresistenzen im Bodenfilterablauf zeigten. Diese Effekte bezüglich der Resistenzen müssen aber relativiert werden, da bereits die hohe Eliminationsleistung des Bodenfilters das Ausmaß im Bodenfilterablauf deutlich reduziert. Für eine weitere Optimierung des Verfahrens sollte eine Anpassung hinsichtlich der gezielten Elimination spezifischer Bakteriengruppen und damit einhergehend spezifischer Resistenzen vorgenommen werden. Zudem sollte eine Bewertung der verbliebenen bzw. veränderten mikrobiellen Beschaffenheit des Ab-wassers bezüglich ihrer potentiell neuen ökologischen Relevanz im Vorfluter vorgenommen werden.
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I
Inhaltsverzeichnis
Projektkennblatt
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis von Abbildungen und Tabellen
Abkürzungen
Zusammenfassung 1
1 Einleitung 3
2 Material und Methoden 5
2.1 Material 5
2.1.1 Der untersuchte Bodenfilter 5
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 5
2.2 Methoden 6
2.2.1 Entnahme von Wasserproben des Klärwerksablaufes und des Bodenfilters 6
2.2.2 Entnahme von Substratproben aus dem Bodenfilter 6
2.2.3 Herstellung bakterieller Wachstumsmedien 6
2.2.4 Kultivierung der Bakterien aus den Abläufen 6
2.2.5 Extraktion von Gesamt-Nukleinsäure aus Abwasserproben 7
2.2.6 Ermittlung von Zellzahlen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie 7
2.2.7 Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) und Koloniezahlen von
Escherichia coli sowie coliformen Bakterien
7
2.2.8 Hochdurchsatz-Sequenzierung der bakteriellen 16S rRNA Genfragmente
(illumina MiSEQ)
8
2.2.9 Quantifizierung von ausgewählten Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen
Real-time PCR
8
2.2.10 Anfertigung von Antibiogrammen/Resistenzspektren 9
2.2.11 Überprüfung der Escherichia coli Isolate durch Sequenzierung der 16S rRNA-
Gene
9
2.2.12 Mikrobielle Aktivität des Bodenfiltersubstrates 10
3 Ergebnisse 11
3.1 Bakterielle Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme 11
3.1.1 Zellzahlen nach fluoreszierender Markierung durch DAPI 11
3.1.2 Zahl der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) 12
3.1.3 Kolonienzahlen von E. coli und Coliformen 12
3.1.4 Bakterielle Eliminationsleistung des Bodenfilters 13
3.2 Hochdurchsatz-Sequenzierung bakterieller 16S rRNA Genfragmente 14
3.2.1 Clusteranalyse der bakteriellen Klassen 14
3.2.2 Clusteranalyse der bakteriellen Gattungen 17
II
3.3 Quantifizierung von Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen Real-
time PCR
18
3.4 Antibiogramme / Resistenzspektren 21
3.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate 25
4 Diskussion 27
4.1 Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme 27
4.2 Bakterielle Diversität und 16S rRNA-OTU-Zahlen 28
4.3 Quantifizierung ausgesuchter Resistenzgene 29
4.4 Antibiogramme / Resistenzspektren 29
4.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate 31
5 Fazit 33
6 Literaturverzeichnis 35
Anhang
III
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Schematischer Aufbau des Bodenfilters. 5
Abb. 2 Zellzahlen (DAPI) ermittelt durch Fluoreszenzmikroskopie aus dem Klärwerks
(KA)- und Filterablauf (FA).
11
Abb. 3 Koloniezahlen (KbE) ermittelt durch Kultivierung aus dem Klärwerks (KA)-
und Filterablauf (FA)
12
Abb. 4 Koloniezahlen (E. coli und Coliforme) ermittelt durch Kultivierung aus dem
Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA)
13
Abb. 5 Heatmap und Cluster-Analyse (UPGMA, Bray Curtis) der ermittelten
bakteriellen Klassen
15
Abb. 6 Bakterielle Klassen mit mindestens 2% OTU Anteil in einer Probe.
Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS).
16
Abb. 7 Bakterielle Klassen der Filtersubstrate (FS) und der mit mindestens 2% OTU
Anteil. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS).
17
Abb. 8 Cluster-Analyse (UPGMA, Bray-Curtis) der bakteriellen OTU auf
Gattungsebene
18
Abb. 9a 9a Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem
Klärwerks- und Filterablauf.
22
Abb. 9b Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem
Klärwerks- und Filterablauf
23
Abb. 9c Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem
Klärwerks- und Filterablauf
24
Abb. 10 Respirationsraten aus den Bodenfiltersubstraten in Abhängigkeit
verschiedener Tiefen
25
Abb. 11 Darstellung einer Plattierung vom Klärwerksablauf (A) und von drei
Ausstrichen
30
IV
Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Zielgene, Sequenzen und Referenzen der verwendeten Primer und Sonden
für die qPCR
8
Tab. 2 Zielgene, Oligo-Konzentrationen, PCR-Konditionen und Effizienzen der
qPCR
9
Tab. 3 Eliminationsleistung des Bodenfilters von Mikroorganismen in Prozent 14
Tab. 4 Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für vanA, mecA und ampC 19
Tab. 5 Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für blaTEM, blaCTX-M und
intl1
20
Tab. 6 Kolonienzahlen auf selektivem Endo-Agar (mit Ciprofloxacin) pro Liter 21
V
Abkürzungen
3-APB 3-Amino-Phenyl-Borat
16S 16 Svedberg Einheiten (ein Sedimentationskoeffizient)
cm Zentimeter
DAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindol
DNA Desoxyribonucleic acid
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure
FA Filterablauf
FS Filtersubstrat
KA Klärwerksablauf
KbE Kolonie bildende Einheiten
nm Nanometer
mm Millimeter
MRGN Multiresistente Gram-negative
NGS Next Generation Sequencing
OTU Operational Taxonomic Unit
PCR Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kettenreaktion)
qPCR Quantitative Real-time PCR
RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rRNA ribosomal ribonucleic acid (ribosomale Ribonukleinsäure)
1
Zusammenfassung
In Kläranlagen, in denen Abwässer mit verschiedensten Verschmutzungen z.B. medizinischen
Wirkstoffen wie Antibiotika zusammen kommen, kann es durch den intensiven Kontakt der
Mikroorganismen im wässrigen Milieu zur Bildung von multiresistenten Bakterien kommen. Die Emission
dieser Keime in den natürlichen hydrologischen Kreislauf kann zu einer breiten Übertragung von
Resistenzgenen auf autochthone Mikroorganismen kommen und potentiell über natürliche Stoffkreisläufe
zum Menschen gelangen, wo sie zur weiteren Verschlechterung der Antibiotika-Therapieprobleme bei
Patienten führen können.
Es wurden klassische Methoden der Kultivierung sowie aktuelle molekularbiologische Verfahren wie die
Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS), quantitative Real-time PCR und DNA-Färbung zur bestmöglichen
Charakterisierung und Quantifizierung der hygienischen Eliminationsleistung des Bodenfilterverfahrens
eingesetzt. Die Untersuchungen wurden über den Zeitraum von April bis Dezember 2015 an einem an
der Kläranlage Sulingen installierten Bodenfilter (DBU AZ 28722) durchgeführt.
Klassische und molekularbiologische Methoden bestätigen die Elimination von bakteriellen Keimen durch
den Bodenfilter. Die Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS) zur detaillierten Charakterisierung der
bakteriellen Diversität identifizierte viele bisher wenig erforschte bakterielle Gruppen und enthüllte einen
klaren Einfluss des Bodenfilterverfahrens auf die bakterielle Zusammensetzung des filtrierten Wassers.
Untersuchungen durch Real-time PCR zur Analyse von Veränderungen der Genkopienzahl ausgesuchter
Resistenzgene zeigen sowohl die Zunahme als auch die Abnahme von manchen Genkopienzahlen im
Bodenfilter. Bei drei der untersuchten sechs Resistenzgene bedeutete dies eine Zunahme an einzelnen
Terminen im Ablauf des Bodenfilters.
Die Resistenzspektren (Antibiogramme) von E. coli Isolaten im Mikrodilutionstest sollten ebenfalls
Auskunft über mögliche Bildung von Multiresistenzen im Bodenfilter liefern und zeigten eine Variation von
Resistenzmustern der Isolate im Klärwerks- und Filterablauf. In beiden Abwässern konnten spezifische
Zu- und Abnahmen der untersuchten Resistenzen ermittelt werden.
Für eine weitere Optimierung des Filtrationsverfahrens sollte eine Anpassung hinsichtlich der gezielten
Elimination spezifischer Bakteriengruppen und damit einhergehend spezifischer Resistenzen
vorgenommen werden. Zudem sollte eine Bewertung der verbliebenen bzw. veränderten mikrobiellen
Beschaffenheit des Abwassers bezüglich ihrer potentiell neuen ökologischen Relevanz im Vorfluter
vorgenommen werden.
Die vielschichtigen Arbeiten und deren Umsetzung erfolgten in enger Zusammenarbeit mit den
Projektkooperationspartnern Wasserversorgung SULINGER LAND, Mikrobiologisches Labor Dr.
Lohmeyer GmbH und dem Umweltservice Meyer GmbH & Co. KG. Das Forschungsvorhaben wurde von
der Deutschen Bundesstiftung Umwelt (DBU) unter dem Aktenzeichen AZ32081 gefördert.
3
1 Einleitung
Abwasseraufbereitungsanlagen und Kleinkläranlagen wurden aktuell als Quellen multiresistenter
Bakterien identifiziert [CB12], [NT13]. Auf Grund der im Abwasser befindlichen Antibiotika kommt es
verstärkt zur Übertragung von Resistenzgenen [BD13]. Die Mikroorganismen gelangen aus den
Kläranlagen in den natürlichen hydrologischen Kreislauf, wo dann eine breite Übertragung der Antibiotika-
Resistenzgene auf dortige autochthone Mikroorganismen stattfinden kann [CB12]. Die Gefahr hierbei ist,
dass bereits niedrige Konzentrationen das Wachstum resistenter Keime und die Gefahr einer
Genübertragung begünstigen [GA11]. Die resistenten Keime können so direkt oder über den Umweg der
Nahrungskette zum Menschen gelangen, wo sie zu ernsthaften Therapieproblemen führen können
[FS99].
Die Reinigung von Abwasser durch bepflanzte Bodenfilter wird von einzelnen Haushalten und auch
kleineren Kommunen praktiziert und ist seit langer Zeit etabliert. Der Reinigungseffekt der Filter basiert
auf einem komplexen System in dem chemische, physikalische und biologische Vorgänge den Abbau
von organischen chemischen Verbindungen katalysieren. Bei der Reinigung von kommunalem
Schmutzwasser in Mischsystemen gewinnen sie zunehmend an Bedeutung.
Studien, die bisher das Potential von Boden- und Pflanzenfiltern zur Eliminierung von Bakterien
untersuchten [FW03; GL09; DS13] verwendeten Methoden, die auf der Kultivierung der Mikroorganismen
basieren. Auf Grund der geringen Kultivierbarkeit der meisten Bakterien wird bei dieser
Herangehensweise eine Vielzahl der Organismen nicht erfasst [TD90]. Demgegenüber bietet die
Anwendung von Zellfärbetechniken, wie die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) [AS95; SE13], die
Möglichkeit zur spezifischen Detektion aller Zellen mit hoher Genauigkeit.
Zur phylogenetischen Charakterisierung von Bakterien verwenden molekularbiologische Methoden die
genetische Information der Mikroorganismen (16S rRNA Gene). Bisher erfolgte diese Charakterisierung
durch relativ zeitaufwendige und teure Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sowie
das Klonieren und Sequenzieren der Zielgene [KR05]. Kürzlich etablierte Methoden wie die
Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglichen eine schnelle, günstige und exakte Identifizierung der in der
untersuchten Probe vorhandenen Mikroorganismen. Auch Bakterien, die mit heutigen Mitteln nicht
kultiviert werden können, werden dadurch erfasst [Met10; AK13].
Für die Quantifizierung funktioneller Gene, zu denen auch Antibiotika Resistenzgene zählen, ist die
quantitative Real-time PCR (qPCR) als sensitives und vielseitiges Verfahren etabliert und bewährt.
Alternative Methoden, wie z.B. die Dot-blot-Hybridisierung oder Microarray, werden selten verwendet und
erreichen nicht die Sensitivität der qPCR [MP03; FP13; KL13].
Zur Identifizierung von Empfindlichkeiten einzelner Mikroorganismen in Reinkultur gegen Antibiotika
stehen derzeit drei Gruppen von Verfahren zur Verfügung a) Diffusionsverfahren, b) Dilutionsverfahren
(Bouillon- oder Agar-Dilution) und c) E-Test. Neben der Agar-Dilution wird am häufigsten der
Mikrodilutionstest zur Erstellung von Antibiogrammen angewendet [BD13]. Dieses Verfahren,
insbesondere die Mikrobouillon-Dilution, wird ebenfalls von der DVG-Arbeitsgruppe „Antibiotikaresistenz“
als Methode der Wahl für Routinediagnostik, Forschung und Monitoring empfohlen.
Als nachgeschaltete Klärstufe kann der Bodenfilter die bakterielle Last um ein Vielfaches reduzieren und
verhindert stärker als in der Praxis üblich, dass Antibiotika-resistente Bakterien in die Umwelt gelangen.
Eine daraus resultierende Gefahr einer möglichen Übertragung auf natürliche Umweltmikroorganismen
wird dadurch ebenso verringert. In diesem Zusammenhang ist eine verbesserte Datengrundlage über das
Vorkommen antibiotikaresistenter Bakterien im Abwasserpfad von großer Bedeutung und bietet eine
wichtige Grundlage bei der Bewertung von umweltrelevanten Klärwässern. Durch eine detaillierte
4
Kenntnis der Keimzusammensetzung sollen Verfahren zur Beseitigung von Keimen, insbesondere
antibiotikaresistente Bakterien aus Kläranlagenabläufen, überprüft und weiterentwickelt werden. Das
Verfahren zielt im Wesentlichen auf den Einsatz in Kleinkläranlagen unter Berücksichtigung der
Umweltrelevanz der in den Vorfluter einzuleitenden Klärwässer.
Ziel des Projektes ist es, das Potential eines am UFT entwickelten, innovativen Bodenfilterverfahrens
(DBU Projekt AZ 28722) [DS13] zur Reduzierung der bakteriellen Belastung im Wasser am Beispiel des
Ablaufes einer kleineren kommunalen Kläranlage zu ermitteln. Im Fokus der Überprüfung soll dabei der
Einfluss des Filtrationsverfahrens auf Antibiotika-resistente Bakterien stehen. Im genannten Projekt
konnten bereits Reduzierungen der Keimbelastung des bepflanzten Bodenfilters anhand von Kolonie-
bildenden Einheiten (KbE) nachgewiesen werden [DS13]. Durch diesen Beitrag zur Umweltentlastung soll
darüber hinaus ein Eintreten von Antibiotika-resistenten Bakterien in die Umwelt maßgeblich reduziert
werden. Die Reduzierung der Keime dient dabei nicht nur der hygienischen Entlastung sondern
verhindert indirekt auch eine Ausbreitung von Resistenzgenen in die Gewässer und somit eine mögliche
Übertragung auf die autochthone Mikroflora und humanpathogene Erreger.
Aktuelle und innovative molekularbiologische Methoden wie die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)
und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken (Next Generation Sequencing, NGS) ermöglichen dabei
erstmals eine detaillierte Abbildung der durch den Bodenfilter reduzierten Keimzahlen und
Mikroorganismengruppen. Die Analyse ausgewählter Resistenzgene von Mikroorganismengruppen
(MRSA, VRE, MRGN), die im Krankenhausalltag durch ihre Antibiotikaresistenz eine besonders kritische
Rolle einnehmen [NE12], bietet erstmalig Information über den Einfluss eines bepflanzten Bodenfilters
auf resistente Mikroorganismen. Die im Projekt gewonnenen Daten zur Eliminierungsleistung von den
gewählten Modell-Bakterien lassen sich sowohl auf die Gesamtheit der resistenten Mikroorganismen als
auch auf andere Boden- und Pflanzenfilterverfahren übertragen.
Nach einer Optimierung und Anpassung der molekularbiologischen Methoden an die physikochemischen
Bedingungen des Abwassers soll die Gesamtkeimbelastung mit Hilfe von DNA-Färbung erfasst werden.
Parallel dazu erfolgt ein Screening der phylogenetischen Mikroorganismengruppen mit Hilfe der
Hochdurchsatz-Sequenzierung, was den innovativen Charakter des Projektes unterstreicht. Basierend
auf diesen Ergebnissen soll weiterführend eine gruppenspezifische Quantifizierung relevanter
Bakteriengruppen durchgeführt werden. Für eine Vergleichbarkeit der Keimreduzierung des Bodenfilters
mit vorangegangenen Studien, dienen bakterielle Nährmedien zur Bestimmung der Kolonie bildenden
Einheiten (KbE) von Indikator-Mikroorganismen.
Zur Erfassung des Einflusses des Bodenfilters auf Antibiotika-resistente Mikroorganismen und der
Belastung des Abwassers mit Antibiotika-Resistenzgenen, soll eine spezifische Charakterisierung und
molekularbiologische Quantifizierung der Resistenzgene (Quantitative Real-time PCR) von vorgenannten
relevanten Keimen erfolgen. Zusätzlich soll der Effekt des Bodenfilters auf die Eliminierung oder mögliche
Bildung von Multiresistenzen durch die Erstellung von Antibiogrammen von Indikator-Mikroorganismen
untersucht werden. Somit liegt ein weiterer Schwerpunkt dieses Vorhabens neben der Erfassung und
Bewertung der Keimreduzierung auf der Identifikation und Quantifizierung relevanter Resistenzgene.
Durch neueste molekularbiologische Methoden soll die detaillierte Analyse der Eliminationsleistung einen
Beitrag zur Überprüfung und Aufrechterhaltung des Umweltentlastungspotentials an Bodenfiltern und
Pflanzenkläranlagen leisten.
5
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Der untersuchte Bodenfilter
Die Erstellung des Bodenfilters einschließlich Zulaufbauwerk, Drainagesystem, Befüllung und
Ablaufbauwerk (Kontrollschacht) erfolgte im August 2013. Die Bepflanzung wurde Anfang September in
das Filtersubstrat eingebracht. Der eigentliche Filterkörper ist aus verschiedenen, in Horizonten
orientierten Substraten aufgebaut (Abb. 1) und baut auf einer zu Grunde liegenden Filterfolie auf. Die
Basis begründet eine Schicht Kies in der das Drainagesystem eingelassen ist. Es folgt eine etwa 70
Zentimeter mächtige Schicht aus einem gleichmäßig verteilten Sand/Pflanzenkohle-Gemisch mit einem
Anteil von 15 Volumenprozenten Pflanzenkohle. Anschließend wurde oberflächennah eine ca. 10 bis
20 Zentimeter mächtige Sandschicht mit Anteilen von Silikatkolloid und Strukturkompost eingefügt und
diese abschließend mit einer reinen Sandschicht (10 cm) abgedeckt. Diese Schicht wurde mit den
Pflanzenspezies Phalaris arundinacea, Lythrum salicaria und Iris pseudacorus bepflanzt, wobei in jedes
Pflanzloch etwa 20 ml Mykorrhizapilz-Inokulum gegeben wurde. Der Bodenfilter ist für einen
Tagesdurchfluss von etwa 100 Litern pro Quadratmeter ausgelegt und wurde während des gesamten
Beprobungszeitraumes mit der doppelten dieser Durchflussmenge betrieben [DS16].
Abb. 1: Schematischer Aufbau des Bodenfilters.
2.1.2 Chemikalien und Verbrauchsmaterial
Die Chemikalien für die Kultivierung der Bakterien (siehe Tab. A1-A3) wurden von Fluka, Sigma-Aldrich
und Roth bezogen. Sämtliche Oligonukleotide für die PCR und Real-time PCR wurden von der Firma
Biomers verwendet. Die Mastermixe für die Real-time PCR stammen von Promega. Die Chemikalien für
die Standard PCR wurden von Thermo Scientific Fisher bezogen.
Die DNA-Extraktionskits (NucleoSpin Soil) stammen von Macherey-Nagel.
Verbrauchmaterialien wie Pipettenspitzen, Mikro-Reaktionsgefäße, Reagiergefäße, Petrischalen wurden
von der Firma Sarstedt bezogen. Abweichungen, sofern vorhanden, sind in den entsprechenden
Abschnitten vermerkt.
6
2.2 Methoden
2.2.1 Entnahme von Wasserproben des Klärwerksablaufes und des Bodenfilters
Die Entnahme der Wasserproben wurde sofern möglich an Tagen mit ähnlichen Witterungsbedingungen
wie Niederschlag durchgeführt. Dabei wurden die Termine möglichst monatlich gelegt. Beprobt wurde für
Vorversuche vor der Hochleistungsphase des Bodenfilters [DS16] und für die eigentliche mikrobielle
Analyse des Bodenfilters während der Hochleistungsphase (April 2015 - Dezember 2015). In dieser
Phase wurde der Filter mit dem doppelten Wasservolumen belastet (200 Liter pro Tag und Quadratmeter)
als üblich.
2.2.2 Entnahme von Substratproben aus dem Bodenfilter
Zur physikochemischen Charakterisierung und mikrobiologischen Analyse des Bodenfiltersubstrats wurde
zum Ende des Probenahmezeitraums im Oktober 2015 eine Bohrstockbeprobung durchgeführt. Mit Hilfe
eines Bodenprobenehmers nach Pürckhauer wurden an drei Positionen entlang einer Diagonale auf der
Bodenfilterfläche (Ecke, Mitte, Ecke) jeweils drei Tiefenprofile (0-80 cm) entnommen und in 10 cm
Abschnitten beprobt.
Das Bodenfiltersubstrat der drei parallelen Tiefenprofile je Position auf dem Bodenfilter wurde
luftgetrocknet und homogenisiert. Anschließend wurden größere Pflanzenwurzeln aus den Proben
entfernt.
2.2.3 Herstellung bakterieller Wachstumsmedien
Die Medien R2A, Endo und LB wurden entsprechend der Medienzusammensetzung (Anhang, Tab. A1-
A3) eingewogen und nachfolgend durch Autoklavieren sterilisiert.
2.2.4 Kultivierung der Bakterien aus den Abläufen
Kultivierung zur Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE)
Zur Bestimmung der Zellzahlen von Kolonie bildenden Einheiten (KbE) wurden 10 µl des Klärwerks- und
Bodenfilterablaufes auf Kulturplatten mit R2A-Agar ausplattiert und drei Tage bei 28°C inkubiert.
Anschließend wurden die gebildeten Kolonien auf einem Weißlicht-Transilluminator gezählt.
Kultivierung zur Bestimmung der Koloniezahlen von Escherichia coli und Coliformen
Zur Bestimmung der Koloniezahlen von E. coli und Coliformen wurden 50 µl des Klärwerks- und
Bodenfilterablaufes auf Kulturplatten mit Endo-Agar ausplattiert und über Nacht für mindestens 16
Stunden bei 36°C inkubiert. Kolonien mit grün-goldenem Glanz wurden als E. coli und Kolonien mit einer
dunkelroten Verfärbung wurden als Coliforme identifiziert. Als Vergleichsstämme zur Absicherung der
Identifizierung wurden die Bakterienstämme DSM 1103 (E. coli) und DSM 30053 (Enterobacter
aerogenes, Coliforme) eingesetzt.
7
2.2.5 Extraktion von Gesamt-Nukleinsäure aus Abwasserproben
Die DNA der Wasserproben wurde durch die Kombination von Filtration und anschließender Verwendung
des DNA Extraktionskits NucleoSpin Soil (Machery-Nagel) durchgeführt. Hierzu wurden jeweils
mindestens 250 ml Wasser, durch Anlegen eines Vakuums (800 mbar), durch einen 50 mm
Membranfilter aus Nylon (Sartorius) mit einem Porendurchmesser von 0,22 µm gefiltert. Der Filter wurde
dann in ein steriles 8 ml Plastik-Röhrchen überführt, wobei die Seite mit dem Filtrat zur Innenseite zeigte.
Anschließend wurden Glasperlen (1400 mg = 1 mm; 800mg = 0,1 mm) und 1400 µl SL1 Puffer
sowie 300 µl SX Puffer Enhancer zugefügt. Die Röhrchen wurden in einer Schwingmühle MM200
(Retsch) 1 min bei 25 Hz gemahlen. Anschließend wurde nach Angaben des Herstellers fortgefahren,
wobei die Volumina der entsprechenden Puffer an das größere (doppelte) Startvolumen der Puffer
angepasst wurden. Zuletzt wurde die DNA in 50 µl EB Puffer eluiert und bei -20°C bis zur weiteren
Verwendung gelagert.
2.2.6 Ermittlung von Zellzahlen mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie
Der Fluoreszenzfarbstoff 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurde verwendet, um bakterielle Zellen
unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar zu machen und so deren Abundanz ermitteln zu können. DAPI
gehört zu den Nukleinsäure-Farbstoffen und hat eine besondere Affinität zu AT-reichen Bereichen der
DNA. Es wird angenommen, dass DAPI an dem Phosphatrückgrat der DNA bindet oder diese interkaliert.
Bei einer Anregungswellenlänge im ultravioletten Bereich (λmax = 372 nm) fluoresziert es weißlich-blau bei
λmax = 456 nm. Bei Bindung an DNA erhöht sich die Fluoreszenz etwa um den Faktor 20.
Zu jedem Probenahmetermin wurden aus je 1 l Abwasserprobe des Ablaufs des Klärwerks und des
Ablaufs des Bodenfilters eine Teilmenge (je 200 µl in 10 ml sterilem Wasser verdünnt) auf
Membranscheiben (25 mm Durchmesser) aus Polycarbonat mit 0,2 µm Porendurchmesser filtriert (unter
Vakuum bei 800 mbar). Die einzelnen Filter wurden in 35 µl Low-Melting-Point Agarose (60°C)
eingebettet und Luft getrocknet. Anschließend wurden die Filter in Segmente geschnitten und in einem
Antibleichmedium mit DAPI (Vectashield H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, USA) auf einem
Objektträger positioniert und mit einem Deckglas versehen. Die Zählung der Bakterien wurde mit Hilfe
eines Epi-Fluoreszenz-Mikroskops (Anregungswellenlänge 350 nm) an 3 Filtersegmenten je
Abwasserprobe und Beprobungstermin durchgeführt. Es wurden 20 Stellen pro Filtersegment im
festgelegten Zählraster für eine gleichmäßige Auswertung der Filter gezählt. Dabei wurden immer
Zellzahlen im gesamten Okularzählfeld erfasst. Die Berechnung der Zellzahlen erfolgte pro ml Abwasser.
2.2.7 Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) und Koloniezahlen von Escherichia
coli sowie coliformen Bakterien
Zur Feststellung der mikrobiologischen Eliminationsleistung wurden zwei verschiedene Kulturmedien
verwendet, um eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit anderen Arbeiten zu ermöglichen. Es wurden die
Kolonie bildenden Einheiten (KbE) mit Hilfe des R2A Agars (Tab. A1) sowie die Zahl von Escherichia coli
und Coliformen (Klebsiella, etc.) auf Endo-Agar (Tab. A2) ermittelt.
8
2.2.8 Hochdurchsatz-Sequenzierung der bakteriellen 16S rRNA Genfragmente (illumina MiSEQ)
Die Konzentration der extrahierten DNA wurde mit Hilfe eines Nanodrop Photometers bestimmt, um
genügend DNA für die Sequenzierung einsetzen konnte. Die Hochdurchsatzsequenzierung wurde von
der Firma LGC Genomics (Berlin) durchgeführt. Verwendet wurde dabei die 300 Basenpaar Paired-End-
Read Technik mit einem Illumina MiSeq Sequenzierer unter Einsatz der V3 Chemikalien und der Primer
für die Vervielfältigung bakterieller 16S rRNA-Gene 341F (CCTACGGGNGGCWGCAG) und 785R
(GACTACHVGGGTATCTAATCC) [KG13].
Die erste Prozessierung der Sequenzier-Daten, das Demultiplexing aller Libraries für jede Spur, wurde
mit der Illumina Software bcl2fastq 1.8.4 durchgeführt, wobei ein Mismatch im Barcode erlaubt war.
Es wurden die Barcode- und Primer-Sequenzen entfernt sowie Reads mit weniger als 100 Basenpaar
Länge aus dem Datensatz entfernt. Die Forward und Reverse Reads der Sequenzierung wurden mit der
Software BBMerge 34.48 (http://bbmap.sourceforge.net/) miteinander kombiniert.
Die kombinierten Sequenzen wurden von den Adapter und Primer-Sequenzen befreit und in FastQ-
Dateien gespeichert. Die Prozessierung der FastQ-Dateien wurde mit Mothur 1.35.1
(http://www.mothur.org/) durchgeführt. Mit Hilfe des 16S Mothur-Silva SEED r119 Referenz-Alignment
wurden die Sequenzen einer Phylogenie zugeordnet und Chimären durch den Uchime Algorithmus aus
dem Datensatz entfernt. Die OTU-Bestimmung für verschiedenen Phylogenetische Ebenen wurde durch
die Clusterung auf 97% Identitätslevel durchgeführt (cluster.split Methode) QIIME 1.9.0 (http://qiime.org/).
2.2.9 Quantifizierung von ausgewählten Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen Real-time
PCR
Die Quantitative Real-time PCR wurde mit einem LightCycler 480 (Roche, Mannheim) durchgeführt. Die
für die Real-time PCR verwendeten Primer und Sonden sind in Tab. 1 aufgelistet.
Tab. 1: Zielgene, Sequenzen und Referenzen der verwendeten Primer und Sonden für die qPCR.
Zielgen Oligo Sequenz (5'-3') Referenz
mecA mecA-f TGGTCTTTCTGCATTCCTGGA Francois et al., 2003
mecA-r CATTGATCGCAACGTTCAATTTAAT Böckelmann et al., 2009
mecA-p FAM-CTATGATCCCAATCTAACTTCCACATACC-BHQ-1
vanA vanA-r CTGTGAGGTCGGTTGTGCG Volkmann et al., 2004
vanA-f TTTGGTCCACCTCGCCA
vanA-p (FAM)-CAACTAACGCGGCACTGTTTCCCAAT-(BHQ-1)
ampC ampC-f GGGAATGCTGGATGCACAA Volkmann et al., 2004
ampC-r CATGACCCAGTTCGCCATATC
ampC-p FAM-CCTATGGCGTGAAAACCAACGTGCA-BHQ-1
blaTEM TEM-f TTCCTGTTTTTGCTCACCCAG Narciso-da-Rocha et al.,
TEM-r CTCAAGGATCTTACCGCTGTTG 2014
blaCTX-M CTX-M-f ATGTGCAGYACCAGTAARGTKATGGC Birkett et al., 2007
CTX-M-r ATCACKCGGRTCGCCNGGRAT
intl1 int-f CCTCCCGCACGATGATC Narciso-da-Rocha et al.,
int-r TCCACGCATCGTCAGGC 2014
16S rRNA E1052-f TGCATGGYTGTCGTCAGCTCG Wang & Qian, 2009
E1193-r CGTCRTCCCCRCCTTCC
-f = forward primer, -r = reverse primer, -p = Probe (Sonde)
9
Für die quantitative Real-time PCR (qPCR) wurden sowohl Assays mit dem Farbstoff SYBR Green als
auch mit Hydrolyse-Sonde verwendet. Verwendet wurden hierfür der GoTaq qPCR Mastermix und
GoTaq Probe qPCR Mastermix (Promega).
Für die benötigten Standardkurven wurden PCR-Produkte von den zu untersuchenden Genen (mecA,
vanA ampC blaTEM, blaCTX-M) erzeugt, mit Hilfe von Gelelektrophorese separiert und durch Elution
aufgereinigt. Für die 16S rRNA-Gen Quantifizierung wurde ein PCR-Produkt von E. coli K12 verwendet.
Allen qPCR-Reaktionen ging eine zweiminütige Aktivierung der Polymerase voraus.
Tab. 2: Zielgene, Oligo-Konzentrationen, PCR-Konditionen und Effizienzen der qPCR.
Zielgen Konzentrationen F/R/P
[nM]
PCR-Konditionen Effizienz
mecA 400 / 400 / 250 45 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 30s - 72°C, 1s 1,897
vanA 300 / 300 / 250 45 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 30s - 72°C, 1s 1,902
ampC 350 / 350 / 250 45 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 30s - 72°C, 1s 1,525
blaTEM 400 / 400 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 20s - 72°C, 3s 1,893
blaCTX-M 350 / 350 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10s - 60°C, 20s - 72°C, 5 2,039
intl1 350 / 350 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10s - 59°C, 15s - 72°C, 5s 1,891
16S rRNA 400 / 400 / ----- 40 Zyklen: 95°C, 10 - 60°C, 20s - 72°C, 3s 1,984
F: forward primer / R: reverse primer / P: Taqman-Sonde
2.2.10 Anfertigung von Antibiogrammen/Resistenzspektren
Um Antibiogramme erstellen zu können, mussten Reinkulturen gewonnen werden. Zur Selektion von
Escherichia coli wurden 250 ml Klärwerksablauf oder 250 ml Ablauf des Bodenfilters auf
Membranfilterscheiben mit 0,45 µm Porendurchmesser filtriert. Dieser Filter wurde auf Endo-Agar gelegt
der 10 mg l-1 Ciprofloxacin enthielt und bei 36°C über Nacht inkubiert. Die gewachsenen Kolonien wurden
auf Endo-Agar zur weiteren Vereinzelung ausgestrichen und bei 36°C über Nacht inkubiert.
Die Antibiogramme oder auch Resistenzspektren wurden durch den Kooperationspartner
Mikrobiologisches Labor Dr. Lohmeyer GmbH in Münster erstellt. Hierzu wurden Mikrotiterplatten
(Micronaut-S MDR MRGN-Screening) im Mikrodilutionstest nach Angaben des Herstellers verwendet.
2.2.11 Überprüfung der Escherichia coli Isolate durch Sequenzierung der 16S rRNA-Gene
Die auf Endo-Agar auf Grund der Koloniefärbung selektierten E. coli Isolate wurden zur Kontrolle mit Hilfe
der Sequenzierung ihrer 16S rRNA-Gene überprüft werden. Hierzu wurde von dem Isolat eine
Flüssigkultur in LB-Medium (Tab. A3) erstellt und bei 36°C über Nacht inkubiert. Von der Flüssigkultur
wurden 2 ml Zellen pelletiert (10.000×g, 4°C, 10 min). Das Pellet wurde mit dem SL1 Puffer des
NucleoSpin Soil Kits (Macherey-Nagel) resuspendiert und in das Extraktionsröhrchen des Kits überführt.
Alle weiteren Schritte wurden entsprechend der Anweisung des Herstellers durchgeführt, wobei eine
Schwingmühle MM200 (Retsch) zur Disruption der Zellen eingesetzt wurde (30 s, 25 Hz.).
Die 16S rRNA-Gene wurden durch PCR mit Hilfe der Primer 27F (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG) und
907r (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT) amplifiziert. Das PCR-Programm beinhaltete eine Denaturierung bei
95°C, 1 min gefolgt von 25 Zyklen (95°C, 20 s - 55°C, 20 s - 72°C, 20 s). Die PCR-Produkte wurden
durch das GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific) aufgereinigt. Die reinen PCR-Produkte
10
wurden mit dem 27F Primer entsprechend den Vorgaben von LGC Genomics (Berlin) versetzt und dort
sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Hilfe einer Blast-Suche (Nucleotide Blast;
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) überprüft.
2.2.12 Mikrobielle Aktivität des Bodenfiltersubstrates
Die mikrobielle Aktivität des Bodenfiltersubstrates wurde in Form seiner mikrobiellen Respirationsleistung
ermittelt. Dazu wurde die Freisetzung von CO2 aus einer definierten Menge Bodenfiltersubstrat über die
Zeit bestimmt und als Respirationsrate (µmol CO2 / 24h / g Substrat) berechnet. Je Probeentnahmepunkt
wurde in 10 cm Abschnitten eine Substratprobe entnommen, von der ca. 5 g Substrat in 20 ml
Glasfläschchen überführt, die anschließend gasdicht mit einem Septum verschlossen wurden. Nach einer
Inkubationszeit von einem Tag wurden 250 µl des Headspace-Volumens beprobt und mit einem
Gaschromatographen analysiert. Abschließend folgte die Trocknung des Filtersubstrats in den
Fläschchen, um die Respirationsrate auf die exakte und nach Trocknung vergleichbare Menge Substrat
beziehen zu können.
11
3 Ergebnisse
3.1 Bakterielle Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme
Die Eliminationsleistung des Bodenfilters wurde durch eine molekulare Methode und durch klassische
Kultivierungen bestimmt. Bei den Kultivierungen wurden die Gesamtheit der Kolonie bildenden Einheiten
(KbE) und die Kolonien von Indikatororganismen wie Escherichia coli sowie von coliformen Bakterien
ermittelt.
3.1.1 Zellzahlen nach fluoreszierender Markierung durch DAPI
Die durch DAPI-Färbung bestimmten Zellzahlen liegen für den Klärwerksablauf und den Bodenfilterablauf
in der Größenordnung von Millionen Zellen pro Milliliter (Abb. 2). Die im Klärwerksablauf gezählten Zellen
waren bis auf an zwei Terminen stets höher als im Filterablauf. Der niedrigste Wert lag bei etwa 300.000
Zellen und der höchste bei 13,2 Millionen. Hier zeigt sich die sehr ausgeprägte Heterogenität des
Klärwerkablaufes bei Schwankungen der Zellzahlen um den Faktor 44.
Abb. 2: Zellzahlen (DAPI) ermittelt durch Fluoreszenzmikroskopie aus dem Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA).
Fehlerbalken: Standardfehler (n=5).
Der Ablauf des Bodenfilters zeigt fast immer niedrigere Zahlen als der Klärwerksablauf. Die maximal
ermittelten Werte liegen bei etwa 4,7 und die niedrigsten bei etwa 1,3 Milionen Zellen. Die
Schwankungen liegen hier bei einem Faktor von 3,6. Die im Bodenfilterablauf ermittelten Zellzahlen
unterliegen geringeren Schwankungen als die im Klärwerksablauf (Abb. 2).
12
3.1.2 Zahl der Kolonie bildenden Einheiten (KbE)
Die Zahl der KbE liegt im Klärwerksablauf im vier- bis fünfstelligen Bereich. Wie auch schon bei den
DAPI-Zahlen zu erkennen, zeigt sich nicht an allen Beprobungsterminen eine Reduktion der Zellzahlen.
Bis auf an zwei Terminen waren die KbE des Klärwerksablauf jedoch höher als im Filterablauf. Die
höchste Zahl der KbE lag bei 82000 und die niedrigste bei 5540 Zellen pro Milliliter (Abb. 3). Die
Schwankung der KbE liegt bei Faktor 14. Die im Filterablauf ermittelten KbE lagen bei maximal 29820
und minimal 914 Kolonien. Das ist eine Schwankung um etwa den Faktor 32. Die Schwankungen der
KbE im Filterablauf (Standardfehler) sind ausgeprägter als im Klärwerksablauf, liegen jedoch auf einem
niedrigeren Niveau. Insbesondere in den Sommermonaten kommt es zu einem deutlichen Anstieg der
KbE im Klärwerksablauf, der sich auch im Filterablauf widerspiegelt.
Abb. 3: Koloniezahlen (KbE) ermittelt durch Kultivierung aus dem Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA). Fehlerbalken:
Standardfehler (n=5).
3.1.3 Kolonienzahlen von E. coli und Coliformen
Die Zahl der Kolonien von E coli und Coliformen (Abb. 4) liegen im zwei bis vierstelligen Bereich. Anders
als bei den DAPI-Zahlen und den KbE ist eine Reduktion der Indikatororganismen an jedem der
beprobten Termine sichtbar. Die höchste Zahl im Klärwerksablauf liegt bei 1978 und die niedrigste bei
rund 15 Kolonien. Die Werte schwanken um den Faktor 131. Für den Bodenfilterablauf wurden Werte von
maximal 388 und minimal 7 Kolonien ermittelt. Die Werte des Filterablaufes schwanken damit um den
Faktor 55. Bei den Indikatororganismen unterliegt der Klärwerksablauf größeren Schwankungen als der
Filterablauf. Insbesondere im Zeitraum von Mitte Juni bis Mitte September zeigt sich ein deutlicher
Anstieg von E. coli und Coliformen im Klärwerksablauf, der sich aber nur sehr schwach im ersten Monat
dieses Zeitraums im Filterablauf widerspiegelt.
13
Abb. 4: Koloniezahlen (E. coli und Coliforme) ermittelt durch Kultivierung aus dem Klärwerks (KA)- und Filterablauf (FA).
Fehlerbalken: Standardfehler (n=5).
3.1.4 Bakterielle Eliminationsleistung des Bodenfilters
Basierend auf den Zellzahlen ermittelt durch DNA-Färbung und Kultivierung wurde die
Eliminationsleistung des Bodenfilters in Prozent bestimmt (Tab. 3). Nur an zwei der untersuchten
Terminen, am 21.05.15, 29.07.15 zeigte die DAPI-Zählung keine Verringerung der Bakterien durch den
Bodenfilter. Die Verringerung der Bakterien lag mindestens bei rund 19 Prozent und erreichte maximal
fast 89 Prozent.
Auch die KbE zeigten am 21.05.15 und auch am 30.09.15 keine Verringerung der Werte, wobei in beiden
Fällen für beide Zählungen (KbE und DAPI) die Zahlen im Filterablauf auf gleichbleibend niedrigem
Niveau lagen.
An allen Terminen zeigten die Zahlen von E. coli und Coliformen eine Verringerung dieser
Indikatorbakterien durch den Bodenfilter. Dabei lag die Elimination bei minimal 26,5 und maximal bei 94,6
Prozent mit einer mittleren Eliminationsleistung in den Sommermonaten von 85%.
Im Mittel ergeben die DAPI Werte eine Reduktion der Bakterien aus dem Klärwerksablauf von 65,88%,
verteilt über den Zeitraum der Beprobungstermine. Bei den KbE-Zahlen zeigt sich eine Elimination der
bakteriellen Keime um durchschnittlich 57,05%. Bei den Koloniezahlen von E. coli und den Coliformen
reduziert der Bodenfilter die bakterielle Fracht um durchschnittlich 63,56% berechnet für den
Beprobungszeitraum. Die mittlere Eliminationsleistung des Bodenfilters bewegt sich also entsprechend
der drei Bestimmungsmethoden (DAPI, KbE und E. coli/ mit Coliformen) um die 60%.
14
Tab. 3: Eliminationsleistung des Bodenfilters von Mikroorganismen in Prozent.
Termine DAPI KbE E. coli und Coliforme
30.04.2015 52.8 83.5 26.5
21.05.2015 * * 30.3
27.05.2015 63.8 39.1 19.0
18.06.2015 64.9 48.5 94.6
25.06.2015 69.4 55.2 80.4
01.07.2015 67.2 87.5 74.3
23.07.2015 18.7 - -
29.07.2015 * - -
18.08.2015 81.8 63.6 89.3
03.09.2015 70.2 50.1 87.8
30.09.2015 69.5 * 40.3
20.10.2015 59.6 68.0 48.7
29.10.2015 88.7 56.7 84.4
14.12.2015 84.0 18.3 87.2
- keine Werte vorhanden; * keine Elimination der Zellzahlen
3.2 Hochdurchsatz-Sequenzierung bakterieller 16S rRNA Genfragmente
Die Hochdurchsatz-Sequenzierung bakterieller 16S rRNA Genfragmente (Next Generation Sequencing)
durch die Illumina-Technik (MiSeq) wurde durchgeführt, um den Effekt des Bodenfilters auf den
Klärwerksablauf hinsichtlich der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft zu untersuchen.
3.2.1 Clusteranalyse der bakteriellen Klassen
Zunächst wurden unter den sogenannten Operational Taxonomic Units (OTU) die dominanten und somit
relevanten Klassen der Bakterien ermittelt. Hierbei wurden 127 Klassen bestimmt. Für eine Visualisierung
dieser Klassen und deren Häufigkeitsverteilung in den Klärwerks- und Bodenfilterabläufen zu den
beprobten Terminen und den unterschiedlichen Tiefen des Filtersubstrats (0-10 cm, 30-40 cm und 70-
80 cm) wurde eine Heat-Map mit Hilfe der Software R [Rde15] erstellt (Abb. 5). Gleichzeitig wurde von
den bakteriellen Klassen eine Clusteranalyse nach Bray Curtis durchgeführt, welche die Ähnlichkeiten der
untersuchten Proben verdeutlichen soll.
Die Analyse zeigt, dass zwar viele bakterielle Klassen innerhalb der Proben vorkommen, es jedoch nur
wenige Klassen gibt deren Anteil über 5 Prozent liegt. Zu den Dominanten Klassen zählen die
Acidobacteria und die Planctomycetacia, die vor allem in den Filtersubstraten vorkommen. Auch die
bisher nicht weiter charakterisierte Gruppe der Candidate Division OD1 die häufiger in den Abläufen und
in geringeren OTU-Zahlen im Filtersubstrat vorkommt. Die Gruppen der Alpha-, Beta-, Gamma und Delta-
Proteobacteria kommen sowohl in den Abläufen als auch in den Substraten vor.
Basierend auf den OTU-Zahlen der bakteriellen Klassen ergeben sich schon hier eindeutige
Clusterbildungen von einem Großteil der Proben von Klärwerks- und Filterablauf sowie den
Filtersubstraten. Nur wenige Proben des Filterablaufes (30.04 und 27.05.15) erscheinen hier als eigene
Gruppe. Jeweils eine Probe aus dem Klärwerks- und Filterablauf, beide vom 30.09.15 gruppieren stärker
mit den Filtersubstraten.
15
Abb. 5:Heatmap und Cluster-Analyse (UPGMA, Bray Curtis) der ermittelten bakteriellen Klassen in den Abläufen und
Substratproben. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS). A, B, C: Wiederholungen der Substratproben
innerhalb des Bodenfilters.
FA27
515
.0.
FA30
415
.0.
KA
23
71
5.0
.K
A1
86
15
.0.
KA
17
15
0.0
.K
A2
56
15
.0.
KA
27
51
5.0
.K
A3
04
15
.0.
KA
14
121
5.
.K
A2
010
15
..
KA
29
101
5.
.K
A3
91
5 0
.0.
KA
18
81
5.0
.K
A2
97
15
.0.
FA1
715
0.0
.FA
256
15.0
.FA
186
15.0
.FA
2010
15.
.FA
237
15.0
.FA
297
15.0
.FA
188
15.0
.FA
39
15 0
.0.
FA14
1215
..
FA29
1015
..
KA
30
91
5.0
.FA
309
15.0
.F
S -
0
1B
FS
-0
1
AF
S -
0
1C
FS
-0
4
CF
S -
0
8A
FS
-0
8
CF
S -
0
8B
FS
-0
4
AF
S -
0
4B
AcidobacteriaAcido Holophagaebacteria Acido Subgroup 22bacteria Acido Subgroup 26bacteria Acido unclassifiedbacteria
Actino Acidimicrobiiabacteria Actinobacteria
Actino Cor iobacter iiabacteria Actino MB−A2−108bacteria Actino Nitr iliruptor iabacteria
Actino OPB41bacteria Actino Rubrobacteria
Actino Ther moleophiliabacteria Actino unclassifiedbacteria
Ar matimonadetes ArmatimonadiaArmatimonadetes Chthonomonadetes
Armatimonadetes unclassifiedBD1−5 unclassified
BHI80−139 unclassifiedBacteroidetes BD2−2Bacteroidetes BSV13
Bacteroidetes BacteroidiaBacteroidetes Cytophagia
Bacteroidetes Fla vobacter iiaBacteroidetes SB−1Bacteroidetes SB−5
Bacteroidetes SM1A07Bacteriodetes Sphingobacter iia
Bacteroidetes VC2.1_Bac22Bacteroidetes WCHB1−32Bacteroidetes unclassifiedBacteroidetes vadin HA17
Candidate division BRC1 unclassifiedCandidate division OD1 unclassified
Candidate division OP11 unclassifiedCandidate division OP3 unclassifiedCandidate division SR1 unclassifiedCandidate division TM7 unclassifiedCandidate division WS3 unclassifiedCandidate division WS6 unclassified
ChlamydiaeChlorobia
Igna viChlorobi unclassifiedbacteria
Chloroflexi AnaerolineaeChloroflexi Ardenticatenia
Chlorofle xi CaldilineaeChlorofle xi Chlorofle xiaChlorofle xiGitt−GS−136
Chlorofle xi JG30−KF−CM66Chloroflexi KD4−96Chlorofle xi Ktedono
Chlorofle xi MSB−5B2Chlorofle xi P2−11E
Chlorofle xi S085Chloroflexi SAR202 clade
Chlorofle xi SHA−26Chloroflexi TK10
Chlorofle xi Ther momicrobiaChlorofle xi unclassified
Cyano bacteriaCyano ML635J−21bacteria
Cyano Melainabacteria Cyano unclassifiedbacteria
Deferr ibacteresDeinococci
Elusimicrobia
Fibro bacteriaBacilli
Firmicutes Clostr idiaFir micutes Erysipelotr ichia
Fir micutes NegativicutesFir micutes OPB54
Firmicutes unclassifiedFusobacter iia
GOUTA4 unclassifiedGemmatimonadetes
JL−ETNP−Z39 unclassifiedLentisphaer ae DEV055
Lentisphaer iaOligosphaer ia
Lentisphaer ae PBS−III−20Lentisphaer ae RFP12 gut group
Lentisphaer ae WCHB1−25Lentisphaer ae WCHB1−41Lentisphaer ae unclassified
NPL−UPA2 unclassifiedNitrospir a
OC31 unclassifiedPlanctomycetes 028H05−P−BN−P5
Planctom ycetes BD7−11Planctomycetes OM190
Phycisphaer aePlanctomycetes Pla3 lineagePlanctomycetes Pla4 lineage
PlanctomycetaciaPlanctom ycetes SGST604
Planctomycetes SPG12−401−411−B72Planctom ycetes unclassifiedPlanctom ycetes vadinHA49
Alphaproteo bacteriaBetaproteo bacteriaDeltaproteo bacteria
Epsilonproteo bacteriaGammaproteo bacteria
Proteo MACA−EFT26bacteria Proteo SC3−20bacteria
Proteo SPOTSOCT00m83bacteria Proteo TA18bacteria
Proteo unclassifiedbacteria SHA−109 classified unSM2F11 unclassified
SpirochaetesSynergistia
TA06 unclassifiedTM6 unclassified
MollicutesTher motogae
Verr ucomicrobia OPB35 soil groupVerr ucomicrobia Opitutae
Verr ucomicrobia S−BQ2−57 soil groupVerr ucomicrobia Sparto bacteria
Verr ucomicrobia UA11Verr ucomicrobia Incer tae Sedis
Verr ucomicrobia Verr ucomicrobiaeVerr ucomicrobia unclassified
WCHB1−60 unclassified
0 25Relative Abundanz [%]
16
Für eine deutlichere Darstellung der bedeutendsten bakteriellen Klassen mit mehr als 2 % relativem
OTU-Anteil in mindestens einer Probe wurde die Darstellung der Anteile als Balkengrafik gewählt. Die
bedeutendsten Klassen innerhalb der Proben mit mindestens 2 % Anteil an den Sequenzen sind die
Acidobacteria, Actinobacteria, Candidate phylum TM6 BD1-5, Bacteroidia, Flavobacteria,
Sphingobacteriia, Candidate Division OD1 (unclassified), Candidate Division TM7 (unclassified),
Chlamydiae, Gemmatimonadetes, Planctomycetes Phycisphaerae, Planctomycetes Planctomycetacia,
Alpha-Proteobacteria, Beta-Proteobacteria, Delta-Proteobacteria, Gamma-Proteobacteria, Proteobacteria
(unclassified) und Candidate Phylum TM6 (unclassified) (Abb. 6). Besonders deutlich werden die
Unterschiede zwischen den Abläufen, betrachtet man die Anteile der Acidobacteria, Chlamydiae und der
unbekannten Klasse TM6, alle Gruppen jeweils grau gefärbt.
Abb. 6: Bakterielle Klassen mit mindestens 2% OTU Anteil in einer Probe. Klärwerksablauf (KA), Filterablauf (FA),
Filtersubstrat (FS).
FA 30.04.15
FA 27.05.15
FA 18.06.15
FA 25.06.15
FA 01.07.15
FA 23.07.15
FA 29.07.15
FA 18.08.15
FA 03.09.15
FA 30.09.15
FA 20.10.15
FA 29.10.15
FA 14.12.15
KA 30.04.15
KA 27.05.15
KA 18.06.15
KA 25.06.15
KA 01.07.15
KA 23.07.15
KA 29.07.15
KA 18.08.15
KA 03.09.15
KA 30.09.15
KA 20.10.15
KA 29.10.15
KA 14.12.15
0
12 24 36 48 60 72 84 96 %
Acidobacteria ; Acidobacteria
Actinobacteria ; Actinobacteria
BD1-5; unclassified
Bactero idetes; Bactero id ia
Bactero idetes; Flavobacteriia
Bactero idetes; Sphingobacteriia
Bactero idetes; unclassified
Candidated ivision OD1; unclassified
Candidated ivision TM7; unclassified
Chlamydiae; Chlamydiae
Gemmatimonadetes; Gemmatimonadete
Planctomycetes; Phycisphaerae
Planctomycetes; Planctomycetacia
Proteobacteria; Alphaproteobacteria
Proteobacteria; Betaproteobacteria
TM6; unclassified
Proteobacteria; Deltaproteobacteria
Proteobacteria; Gammaproteobacteria
Proteobacteria; unclassified
Termine Prozentuale Anteile der Bakterienklassen
17
Im Klärwerksablauf hingegen überwiegen die Actinobacteria (blau), die Candidate Division OD1 (gelb)
und die Beta-Proteobacteria (braun).
Im Vergleich der Filtersubstrate zu den Abläufen am 29.10.15 fällt auf, dass besonders die Acidobacteria
(grau) und die Actinobacteria (blau) stärker im Filtersubstrat vorkommen. Etwas geringer als in den
Abläufen ist auch das Vorkommen der nicht näher beschriebenen Gruppe BD1-5 (orange).
Abb. 7: Bakterielle Klassen der Filtersubstrate (FS) und der mit mindestens 2% OTU Anteil. Klärwerksablauf (KA),
Filterablauf (FA), Filtersubstrat (FS).
3.2.2 Clusteranalyse der bakteriellen Gattungen
Aus den bakteriellen Klassen ließen sich 885 Gattungen ableiten, worunter sich aber auch verschiedene
und nach heutigem Wissenstand nicht weiter differenzierbare (unclassified) Gattungen befinden.
Die Analyse der bakteriellen Gattungen der Abläufe aus dem Klärwerk und dem Bodenfilter sowie der
Filtersubstrate aus unterschiedlichen Tiefen des Filterkörpers zeigt eine klare Gruppierung von den
Abläufen und den Substraten (Abb. 8). Dabei zeigen die Filtersubstrate allgemein höhere Ähnlichkeit
zueinander mit mindestens 74%. Es ist ein Trend der Bildung einzelner Cluster in Abhängigkeit der
beprobten Tiefen erkennbar. Es deutet sich an, dass die Proben aus der Tiefe bis -10 cm eine
Gruppierung zeigt, wobei sich die Probe FS-40 C innerhalb des Clusters befindet. Eigene kleinere
Gruppierungen bilden auch die Proben FS -80 A und FS -80 C sowie die Proben FS -40 A, FS -40 B und
FS -80 B. Dadurch zeigt sich eine Zonenbildung von unterschiedlichen Bakterienpopulationen im
Bodenfiltersubstrat bis zu einer Tiefe von 40 cm und von 40 bis 80 cm. Deutlich ist auch, dass sich die
Substrate, die am 29.10.15 dem Filter entnommen wurden, stets von den Proben des Klärwerks- und
Bodenfilterablaufes unterscheiden.
Die bakteriellen Populationen der Termine aus dem Filterablauf bilden ebenfalls ein eigenes Cluster,
wobei zwei Termine (30.04.15 und 27.05.15) sich relativ stark auf einem eigenen Arm ausgrenzen
FS -10 A
FS -10 B
FS -10 C
FS -40 A
FS -40 B
FS -40 C
FS -80 A
FS -80 B
FS -80 C
FA 29.10.15
KA 29.10.15
0
12 24 36 48 60 72 84 96 %
Acidobacteria ; Acidobacteria
Actinobacteria ; Actinobacteria
BD1-5; unclassified
Bacteroidetes; Bactero id ia
Bacteroidetes; Flavobacteriia
Bacteroidetes; Sphingobacteriia
Bacteroidetes; unclassified
Candidated ivision OD1; unclassified
Candidated ivision TM7; unclassified
Chlamydiae; Chlamydiae
Gemmatimonadetes; Gemmatimonadete
Planctomycetes; Phycisphaerae
Planctomycetes; Planctomycetacia
Proteobacteria ; Alphaproteobacteria
Proteobacteria ; Betaproteobacteria
TM6; unclassified
Proteobacteria ; Deltaproteobacteria
Proteobacteria ; Gammaproteobacteria
Proteobacteria ; unclassified
Substrate/ Prozentuale Anteile der BakterienklassenTermin
18
(Abb. 8). Eine Gruppierung entsprechend der Beprobungszeit und somit Jahreszeit ist hier nicht zu
erkennen, da Termine aus dem August und Dezember zusammen in eine Gruppe fallen.
Bei den Proben aus dem Klärwerksablauf hingegen deutet sich eine leichte Gruppierung entsprechend
der Beprobungstermine oder auch entsprechend der Jahreszeiten an. Das große Cluster der Termine
des Klärwerksablaufes untergliedert sich in zwei kleinere Gruppierungen. In die eine Gruppe fallen die
Termine vom 30.04 bis zum 29.07.15, die zweite Gruppierung besteht aus den Terminen vom 18.08 bis
14.12.15.
Abb. 8: Cluster-Analyse (UPGMA, Bray-Curtis) der bakteriellen OTU auf Gattungsebene von Klärwerksablauf (KA),
Filterablauf (FA) und Filtersubstrat (FS; Tiefen 0-10, 30-40 und 70-80 cm).
3.3 Quantifizierung von Resistenzgenen mit Hilfe der quantitativen Real-time PCR
Die Quantifizierung von ausgewählten Resistenzgenen sollte Informationen darüber liefern, ob das
biologische Bodenfilterverfahren zu Veränderungen der quantitativen Zusammensetzung von bakteriellen
Resistenzgenen führt. Hierzu wurden Resistenzgene gewählt, die bei Krankenhaus relevanten Keimen
vorkommen. Untersucht wurden die Resistenzgene von multiresistenten Staphylococcus aureus MRSA
(Methicillin Resistenz, mecA), Vancomycin resistenten Enterokokken VRE (Vancomycin Resistenz, vanA)
und Beta-Lactam resistente Bakterien wie z.B. Escherichia coli und Klebsiella-Stämmen (ampC, blaTEM,
blaCTX-M). Das Klasse 1 Integrase-Gen (intl1) wurde ausgewählt, weil es sich hier um einen Baustein
0.48
0.54
0.60
0.66
0.72
0.78
0.84
0.90
0.96 Ähnlichkeit [%]
KA 14 1215. .KA 18 8 15.0 .KA 3 9 15 0 .0 .KA 20 1015. .KA 29 1015. .KA 30 9 15.0 .KA 1 7 15 0 .0 .KA 18 6 15.0 .KA 25 6 15.0 .KA 23 7 15.0 .KA 29 7 15.0 .KA 27 5 15.0 .KA 30 4 15.0 .FA 27 5 15.0 .FA 30 4 15.0 .FA 14 12 15. .FA 18 8 15.0 .FA 3 9 15 0 .0 .FA 23 7 15.0 .FA 29 7 15.0 .FA 20 10 15. .FA 29 10 15. .FA 30 9 15.0 .FA 1 7 15 0 .0 .FA 18 6 15.0 .FA 25 6 15.0 .FS - 0 8 AFS - 0 8 CFS - 0 4 AFS - 0 4 BFS - 0 8 BFS - 0 1 BFS - 0 1 CFS - 0 4 CFS - 0 1 A
19
eines komplexen genetischen Elementes handelt, welches zwischen Bakterien horizontal übertragbar ist
und eine Vielzahl an Resistenzgenen tragen kann.
Die ermittelten Kopienzahlen der Resistenzgene (Tab. 4 und Tab. 5) wurden auf die ebenfalls durch die
Real-time PCR ermittelten bakteriellen 16S rRNA Gene bezogen. Um den Vergleich der Werte zwischen
Klärwerks- und Bodenfilterablauf einfacher zu machen, wurden die Werte für das jeweilige Gen auf
denselben Exponenten gebracht.
Tab. 4: Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für vanA, mecA und ampC.
Termine Resistenzgene
mecA vanA ampC[1]
KA FA KA FA KA FA
30.04.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 11.91 n.d.
27.05.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 32.53 61.98
18.06.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 49.14 83.11
25.06.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 73.90 217.21
01.07.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 139.65 70.89
23.07.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 56.57 108.31
29.07.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 29.64 402.85
18.08.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 11.45 14.20
03.09.15 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 16.01
30.09.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 6.60 n.d.
20.10.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 9.67 35.69
29.10.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 1253.87 7.47
14.12.15 n.d. n.d. n.d. n.d. 53.62 297.64
n.d. = nicht detektierbar; [1] : alle Werte mit 10-4 Exponenten; KA: Klärwerksablauf; FA: Filterablauf
In Tab. 4 sind die Werte für mecA, vanA und ampC festgehalten. Zu keinem der 13 Beprobungstermine
konnte im Klärwerks- und Bodenfilterablauf Genkopien von mecA und vanA nachgewiesen werden. Für
ampC konnte an fast allen Terminen die Genkopienzahl ermittelt werden. Am 03.03.2015 lag die
Kopienzahl unterhalb der Nachweisgrenze und am 30.04 und am 30.09.2015 waren im Bodenfilterablauf
keine Gene nachweisbar. Die Kopienzahl von ampC schwankt sowohl im Klärwerksablauf als auch im
Bodenfilterablauf über den Zeitraum der Beprobungen. Der höchste Wert im Klärwerksablauf beträgt
1253,87×10-4 Genkopien pro 16S rRNA-Genkopie der niedrigste Wert beträgt 6,6×10-4. Der im
Filterablauf höchste ermittelte Wert liegt unterhalb des höchsten Wertes vom Klärwerksablauf und beträgt
402,85×10-4. Der niedrigste Wert liegt bei 7,47×10-4 und damit etwa auf dem Niveau des Wassers aus
dem Klärwerk. Die für den Bodenfilterablauf ermittelten Genkopienzahlen von ampC liegen an neun von
13 Beprobungsterminen über den Werten des Klärwerksablaufes. In beiden Abläufen wurden über den
Zeitraum der Beprobungen starke Schwankungen der Genkopienzahl von ampC ermittelt. Die Werte
zeigen keine Tendenz zu trendartigen erhöhten oder erniedrigten Zahlen während warmer
Sommertermine oder kalter Herbst- und Wintertermine. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen über
den Beprobungszeitraum so beträgt die Kopienzahl für den Klärwerksablauf 132,96×10-4 und 109,64×10-4
für den Bodenfilterablauf.
20
Für die Gene blaTEM, blaCTX-M und intl1 konnte an allen Terminen die Kopienzahl bestimmt werden
(Tab. 5). Ebenso wie bei ampC kann kein jahreszeitlicher Trend der Genkopienzahlen beobachtet
werden. Über den gesamten Beprobungszeitraum zeigen sich mal höhere und mal niedrigere Werte.
Tab. 5: Zahl der Resistenzgene pro 16S rRNA Genkopie für blaTEM, blaCTX-M und intl1.
Termine Resistenzgene
blaTEM [1] blaCTX-M
[2] intl1[2]
KA FA KA FA KA FA
30.04.15 11.2 6.1 27.78 107.10 67.56 26.47
27.05.15 11.8 28.6 41.60 63.89 66.22 27.48
18.06.15 29.5 23.6 21.56 119.10 189.71 42.15
25.06.15 30.7 73.1 20.77 117.52 88.08 34.66
01.07.15 35.4 9.8 123.75 33.61 179.43 27.24
23.07.15 14.0 10.4 32.96 125.54 183.05 27.95
29.07.15 6.5 3.8 21.01 148.67 111.95 24.68
18.08.15 19.7 0.9 3.54 16.32 75.58 59.30
03.09.15 19.6 4.8 6.59 20.58 124.74 107.42
30.09.15 5.4 1.2 15.67 22.00 65.04 345.51
20.10.15 14.5 12.9 6.16 12.12 89.15 70.42
29.10.15 5.7 7.5 4.54 9.36 112.05 74.70
14.12.15 74.4 3.5 7.24 7.04 305.86 106.08
n.d. = nicht detektierbar; [1] : alle Werte mit 10-6 Exponenten; [2]: alle Werte mit 10-3 Exponenten; KA: Klärwerksablauf; FA:
Filterablauf
Die für den Bodenfilterablauf ermittelten Kopienzahlen von blaTEM liegen nur an drei Terminen über denen
des Klärwerksablaufes. Der höchste ermittelte Wert kommt im Klärwerksablauf vor und liegt bei 74,4×10-6
Kopien pro 16S rRNA Genkopie (14.12.15), der niedrigste Wert beträgt 5,4×10-6. Die größte Kopienzahl
im Ablauf des Bodenfilters wurde am 25.06.15 ermittelt und beträgt 73,1×10-6, die kleinste Zahl beträgt
1,2×10-6 für den Termin vom 30.09.15. Die Kopienzahl von blaTEM war allgemein niedriger und lag nur an
drei von 13 Terminen über der Zahl des Klärwerkablaufes. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen
über den Beprobungszeitraum so beträgt die Kopienzahl für den Klärwerksablauf 21,42×10-6 und
14,32×10-6 für den Bodenfilterablauf.
Bei den Kopienzahlen von blaCTX-M verhält es sich anders als bei blaTEM und so liegt die Zahl der im
Bodenfilterablauf befindlichen Kopien an elf von 13 Terminen oberhalb der des Klärwerksablaufes, wobei
die Werte an manchen Terminen (27.05, 30.09 und 20.10.15) nicht immer viel höher als die Werte des
Klärwerksablaufes sind. Die höchste Kopienzahl im Bodenfilter wurde am 29.07.15 ermittelt und betrug
148,67×10-3. Die niedrigste Zahl von 7,04×10-3 wurde am 14.12.15 detektiert. Dagegen stehen die
höchste Zahl von 123,75×10-3 und die niedrigste Zahl von 3,54×10-3 im Klärwerksablauf. Bildet man den
Mittelwert der Kopienzahlen für über den Beprobungszeitraum so betrug die Kopienzahl für den
Klärwerksablauf 25,63×10-3 und 61,75×10-3 für den Bodenfilterablauf.
Die Kopienzahl des Klasse 1 Integrase-Gens intl1 lag nur an einem Termin (30.09.15) oberhalb der
Werte des Klärwerkablaufes und bildet hier auch schon den größten Wert von 345,51×10-3 Genkopien
pro 16S rRNA-Gen. Der kleinste Wert lag am 29.07.15 vor und betrug 24,68×10-3. Im Klärwerksablauf
fanden sich fast immer höhere Werte wobei der höchste 305,86×10-3 und der niedrigste 65,04×10-3
21
betrug. Bildet man den Mittelwert der Kopienzahlen für über den Beprobungszeitraum so betrug die
Kopienzahl für den Klärwerksablauf 127,57×10-3 und 74,93×10-3 für den Bodenfilterablauf.
Bezüglich der Mittelwerte der ermittelten Genkopien aller Gene von allen untersuchten Terminen ergibt
sich eine Reihenfolge für die Größe der nachgewiesenen Kopienzahl. Am häufigsten kommen Genkopien
von intl1 vor, gefolgt von blaCTX-M und ampC. Die geringsten Zahlen ergeben sich für Genkopien von
blaTEM.
3.4 Antibiogramme / Resistenzspektren
Die Erstellung von Antibiogrammen sollte Information darüber liefern, ob im Ablauf des Bodenfilters
vermehrt multiresistente Keime gefunden werden. Abweichend von der ursprünglichen Planung wurden
nur Stämme der Spezies E. coli und nicht zusätzlich Coliforme Bakterien analysiert. Diese Entscheidung
war notwendig, um eine größere und somit repräsentativere Zahl Bakterien gleicher Art untersuchen zu
können und so Ergebnisse mit höherer Aussagekraft zu erhalten.
Bei der Isolierung der Reinkulturen aus den Wasserproben des Klärwerks und des Bodenfilters fiel auf,
dass ebenfalls Pilze auf den Agarplatten wuchsen. Vor allem Proben des Klärwerks waren höher belastet
(Tab. 6).
Tab. 6: Kolonienzahlen auf selektivem Endo-Agar (mit Ciprofloxacin) pro Liter.
Organismus Klärwerksablauf Bodenfilterablauf
Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler
Escherichia coli 14 1,73 3 0,58
Coliforme 62 4,62 26 2,89
Pilze 11 2,08 3 0
Die Werte in Tab. 6 beziehen sich auf die ersten Isolierungsversuche. Für spätere Isolierungen wurde zur
Vermeidung von Pilzkolonien das Antibiotikum Cycloheximid eingesetzt. Die Werte zeigen eine deutlich
geringere Kolonienzahl von Ciprofloxacin resistenten E. coli und Coliformen sowie Pilzen pro Liter im
Filterablauf im Vergleich zum Klärwerksablauf.
Bei der Isolierung der E. coli Reinkulturen fiel zusätzlich auf, dass die Stämme nur schwer zu vereinzeln
waren. Dies machte sich durch eine unklare Färbung der Kolonie auf dem chromogenen Selektivmedium
(Endo-Medium) bemerkbar. Die zum Vergleich herangezogenen Referenzstämme DSM 1103
(Escherichia coli) und DSM 30053 (Enterobacter aerogenes) zeigten eine eindeutige Koloniefärbung auf
dem Festmedium. Versuche, die Zellen einer Kolonie durch weiteres Ausstreichen auf Endo-Agar zu
vereinzeln, waren sehr zeitintensiv und führten nur in wenigen Fällen zum Erfolg. Der Versuch der
Vereinzelung wurde pro Stamm nur einfach durchgeführt, um die Gefahr der Veränderung der
Resistenzeigenschaften des Isolates zu vermeiden.
Die aus dem Klärwerks- und Bodenfilterablauf isolierten Reinkulturen wurden deshalb an verschiedenen
Beprobungsterminen auf Endo-Agar isoliert und dann an den Kooperationspartner Mikrobiologisches
Labor Dr. Lohmeyer GmbH übergeben, wo anschließend die Antibiogramme der Isolate erstellt wurden.
Um einen Überblick über die Resistenzhäufigkeit in den jeweils 50 Stämmen aus dem Klärwerksablauf
und dem Filterablauf zu erhalten, wurden die eindeutigen Resistenzen und die intermediären Resistenzen
der Stämme in Abb. 9a, Abb. 9b und Abb. 9c aufgelistet. Die Antibiogramme oder auch Resistenzmuster
22
der untersuchten E. coli Isolate aus den Abläufen zeigen insgesamt Unterschiede. Allen Stämmen
gemeinsam ist eine Resistenz gegen Ciprofloxacin (Abb. 9c) da mit diesem Antibiotikum selektiert wurde.
Es fällt auf, dass bestimmte eindeutige Resistenzen ausschließlich im Klärwerks- oder im Filterablauf
vorkommen. Aus dem Klärwerksablauf besitzen 84 % der Isolate eine Resistenz gegen 8 µg/ml und noch
42 % gegen 16 µg/ml Chloramphenicol. Im Filterablauf sind lediglich intermediär resistente Isolate zu
finden. Ähnliches gilt bei Temocillin, wofür jedoch nur eine Resistenz und eine intermediäre Resistenz
gegen 32 µg/ml gefunden wurden. Im Filterablauf gab es nur zwei intermediäre Resistenzen.
Nur im Bodenfilterablauf (Abb. 9a) finden sich Resistenzen gegen Amikazin (4, 8, 16 µg/ml), Ceftazidim
(alle Konzentrationen), und Cefotaxim (beide Konzentrationen). Im Klärwerksablauf sind nur intermediäre
Resistenzen vorhanden und insgesamt mit deutlich niedrigeren Zahlen.
Abb. 9a: Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem Klärwerks- und Filterablauf. Dunkle Balken:
eindeutige Resistenzen; helle Balken: intermediären Resistenzen.
Bei Ceftazidim mit APB gibt es bei den Bodenfilterisolaten ebenfalls Resistenzen gegen alle getesteten
Konzentrationen. Bis zu einer Konzentration von 8 µg/ml sind über 60 % der Isolate resistent. Im
Klärwerksablauf kommen nur Resistenzen bei den drei Konzentrationen 0,25, 0,5 und 1 µg/ml vor. Bei
0,25 µg/ml liegt die Zahl der Resistenzen höher als im Filterablauf, 39 zu 36 resistente Isolate. Auch die
Zahl der intermediär resistenten Zellen liegt mit 11 über den fünf des Filterablaufes. Bei den
Konzentrationen von 0,5 und 1 µg/ml kommt im Klärwerksablauf eine Resistenz vor, im Filterablauf
fanden sich jeweils 36.
Piperracillin 16 µg/ml
Piperracillin 8 µg/ml
Piperacillin / Tazobactam 64/4 µg/ml
Piperacillin / Tazobactam 32/4 µg/ml
Piperacillin / Tazobactam 16/4 µg/ml
Piperacillin / Tazobactam 8/4 µg/ml
Piperacillin / Tazobactam 4/4 µg/ml
Tigecyclin 4 µg/ml
Tigecyclin 2 µg/ml
Tigecyclin 1 µg/ml
Tigecyclin 0,5 µg/ml
Tigecyclin 0,25 µg/ml
Levofloxacin 4 µg/ml
Levofloxacin 2 µg/ml
Levofloxacin 1 µg/ml
Levofloxacin 0,5 µg/ml
Colistin 8 µg/ml
Colistin 4 µg/ml
Colistin 2 µg/ml
Colistin 1 µg/ml
Fosfomycin 64 µg/ml
Fosfomycin 32 µg/ml
Fosfomycin 16 µg/ml
Fosfomycin 8 µg/ml
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 8/152 µg/ml
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 4/76 µg/ml
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 2/38 µg/ml
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 1/19 µg/ml
50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50
Konzentrationen Klärwerksablauf Bodenfilterablauf
Antibiotika / Zusätze
23
Bei den Antibiotika Piperacillin, Piperacillin (mit Tazobactam), Tigecyclin, Levofloxacin, Colistin,
Fosfomycin, Trimethoprim (mit Sulfmethoxazol), Ceftazidim (mit 3-Amino-Phenyl-Borat, 3-APB) besitzen
die Isolate aus beiden Abläufen Resistenzen, wobei diese nicht bei allen Konzentrationen vorkommen
(Abb. 9a, Abb. 9b).
Abb. 9b: Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem Klärwerks- und Filterablauf. Dunkle Balken:
eindeutige Resistenzen; helle Balken: intermediären Resistenzen.
Besondere Stellung nehmen die Carbapeneme, Doripenem, Imipenem, Ertapenem sowie Meropenem ein
(Abb. 9c). Diese Wirkstoffgruppe entscheidet unter anderem ob es sich um multiresistente gramnegative
Bakterien (MRGN) der Gruppe 3- oder 4-MRGN handelt. In beiden Abläufen kommen nur vereinzelt
Resistenzen vor wobei die Gesamtheit der Resistenzen im Filterablauf höher als im Klärwerksablauf ist.
Bei den Wirkstoffen Meropenem mit 0,4 mM EDTA (0,25 µg/ml) gibt es drei und bei Meropenem mit
350 µg/ml 3-APB (0,25 µg/ml, 0,5 µg/ml und 1 µg/ml) gibt es neun resistente Isolate und jeweils ein
resistentes Isolat im Klärwerksablauf.
Je ein Isolat aus dem Filterablauf besitzt bei allen Konzentrationen von Imipenem eine Resistenz. Gegen
Ertapenem besitzen zwei Isolate gegen 0,25 µg/ml und ein Isolat gegen 0,5 µg/ml Resistenzen. Gegen
Meropenem mit EDTA ist im Filterablauf ein Isolat resistent bei 0,25 und 0,5 µg/ml.
Wie im Klärwerksablauf kommen die höchsten Resistenzzahlen im Filterablauf gegen Meropenem mit
APB vor. Bei 0,25 µg/ml sind 32 Isolate resistent. Bei 0,5 µg/ml sind acht, bei 1 µg/ml sind zwei und bei 2
bis 32 µg/ml ist jeweils eine Resistenz vorhanden.
Auch die intermediären Resistenzen zeigen bei Meropenem mit APB die größten Zahlen. Im
Klärwerksablauf gibt es intermediäre Resistenzen bis 2 µg/ml wobei die höchste Zahl (20) bei 0,25 µg/ml
Temocillin 128 µg/ml
Temocillin 32 µg/ml
Chloramphenicol 16 µg/ml
Chloramphenicol 8 µg/ml
Amikacin 32 µg/ml
Amikacin 16 µg/ml
Amikacin 8 µg/ml
Amikacin 4 µg/ml
Ceftazidim 128 µg/ml
Ceftazidim 64 µg/ml
Ceftazidim 32 µg/ml
Ceftazidim 16 µg/ml
Ceftazidim 8 µg/ml
Ceftazidim 4 µg/ml
Ceftazidim 2 µg/ml
Ceftazidim 1 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 32 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 16 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 8 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 4 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 2 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 1 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 0,5 µg/ml
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 0,25 µg/ml
Cefotaxim 2 µg/ml
Cefotaxim 1 µg/ml
50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50
Konzentrationen Klärwerksablauf Bodenfilterablauf
Antibiotika / Zusätze
24
vorkommt. Im Filterablauf ist bei dieser Konzentration ebenfalls die höchste Zahl mit neun intermediären
Resistenzen zu finden.
Abb. 9c: Addierte Resistenzen der jeweils 50 E. coli Antibiogramme aus dem Klärwerks- und Filterablauf. Dunkle Balken:
eindeutige Resistenzen; helle Balken: intermediären Resistenzen.
Die Resistenzen gegen Temocillin (32 µg ml-1) und Chloramphenicol sind ausschließlich bei Stämmen
aus dem Klärwerksablauf gefunden worden. Nur im Filterablauf wurden Resistenzen gegen Amikazin,
Ceftazidim und Cefotaxim. Gegen die drei vorgenannten Antibiotika sind jedoch im Klärwerksablauf
intermediäre Resistenzen vorhanden. Die Zahl dieser intermediären Resistenzen liegen allerdings auf
einem niedrigeren Niveau als die Resistenzen im Filterablauf. Während bei Amikazin (4 µg ml-1) im
Filterablauf 26 Resistenzen detektiert wurden, so sind es im Klärwerksablauf nur 9 intermediäre
Resistenzen.
Bei dem Antibiotikum Piperacillin wurden für beide untersuchten Konzentrationen mehr Resistenzen im
Filterablauf als im Klärwerksablauf gefunden. Bei der Anwendung von Piperacillin zusammen mit
Doripenem 4 µg/ml
Doripenem 2 µg/ml
Doripenem 1 µg/ml
Doripenem 0,5 µg/ml
Imipenem 8 µg/ml
Imipenem 4 µg/ml
Imipenem 2 µg/ml
Imipenem 1 µg/ml
Ertapenem 2 µg/ml
Ertapenem 1 µg/ml
Ertapenem 0,5 µg/ml
Ertapenem 0,25 µg/ml
Meropenem 128 µg/ml
Meropenem 64 µg/ml
Meropenem 32 µg/ml
Meropenem 16 µg/ml
Meropenem 8 µg/ml
Meropenem 4 µg/ml
Meropenem 2 µg/ml
Meropenem 1 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 32 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 16 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 8 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 4 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 2 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 1 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 0,5 µg/ml
Meropenem + 0,4 mM EDTA 0,25 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 32 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 16 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 8 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 4 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 2 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 1 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 0,5 µg/ml
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 0,25 µg/ml
Ciprofloxacin 2 µg/ml
Ciprofloxacin 1 µg/ml
Ciprofloxacin 0,5 µg/ml
50 40 30 20 10 0 10 20 30 40 50
Konzentrationen Klärwerksablauf Bodenfilterablauf
Antibiotika / Zusätze
25
Tazobactam in fünf verschiedenen Konzentrationen wurden ebenfalls vorrangig im Filterablauf und bei
allen Konzentrationen Resistente Keime ermittelt.
3.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate
Zur Analyse der mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate wurde deren Respirationsrate
(µmol CO2 / 24h / g Substrat) mit Hilfe der Gaschromatographie in n=3 Wiederholungen bestimmt.
Insbesondere die oberste Schicht des Bodenfilters (0-10 cm Tiefe) zeigte eine deutlich höhere mikrobielle
Aktivität, die innerhalb der nächsten Schicht (10-20 cm Tiefe) auf knapp die Hälfte zurückging. Über die
folgenden 60 cm war ein kontinuierlicher Rückgang mit vergleichsweise geringer Variation unter den drei
beprobten Stellen innerhalb des Bodenfilters zu verzeichnen und sich auf ca. 500
µmol CO2 / 24h / g Substrat einpendelt (Abb. 10). Ein signifikanter Unterschied zwischen dem Sand-
Kompost- oder Sand-Pflanzenkohle-Gemisch konnte hinsichtlich der mikrobiellen Aktivität nicht gefunden
werden.
Abb. 10: Respirationsraten aus den Bodenfiltersubstraten in Abhängigkeit verschiedener Tiefen. Fehlerbalken:
Standardfehler (n=3).
27
4 Diskussion
4.1 Zellzahlen DAPI, KbE sowie E. coli und Coliforme
Die Bestimmung der Kolonie bildenden Einheiten (KbE) heterotropher Bakterien oder die Bestimmung
der Koloniezahl von Indikatororganismen wie Escherichia coli und Coliformer Bakterien (Klebsiella spp.
etc.) gilt als eine Möglichkeit zur Bestimmung von Gewässergüte. Die Bestimmung der Zellzahlen durch
fluoreszierende Farbstoffe in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie wird allgemein eher im
wissenschaftlichen Bereich verwendet und weniger zur Feststellung der Gewässergüte. Im Vergleich zu
den KbE oder den Koloniezahlen von E. coli wird durch die Bestimmung der Zellzahlen durch DAPI die
Zahl der nicht kultivierbaren und die Zahl der dormanten (schlafenden) Zellen erfasst, die auf
Kulturmedium nicht wachsen würden. Dies führt zu einer wesentlich sichereren Ermittlung der
bakteriellen Zahlen. So ist es verständlich, dass die Zellzahlen der DAPI-Bestimmung wesentlich höher
liegen.
Die DAPI-Zellzahlen und die KbE zeigen für die meisten Beprobungstermine eine deutliche Reduktion der
bakteriellen Keimbelastung. Die Eliminationsleistung bestimmt durch KbE ist vergleichbar mit vorherigen
Untersuchungen des Bodenfilters [DS16]. Allerdings wurden auch Termine ermittelt, bei denen scheinbar
keine Elimination der Bakterien durch den Bodenfilter zu beobachten war. Diese Beobachtung trat dann
auf, wenn die Keimzahlen im Klärwerksablauf besonders niedrig (unter 2 Millionen Keime je ml) waren.
Dies deutet darauf hin, dass der Bodenfilter als lebendiges Habitat für eine Vielzahl von Mikroorganismen
eine gewisse Emissionsleistung bezüglich Bakterien besitzt, die dann relativ gesehen erhöht wirken kann
und eine fehlende Eliminationsleitung fälschlich andeutet.
Dass der Bodenfilter zu jedem Beprobungstermin, also auch an den Terminen, an denen scheinbar keine
Eliminationsleistung besteht, einen Einfluss auf die bakterielle Zusammensetzung hat und somit eine
Elimination besteht, zeigt die Clusteranalyse der bakteriellen Gattungen nach der Hochdurchsatz-
Sequenzierung.
Wegen der schwierigen Unterscheidbarkeit der Kolonien wurden die Zellzahlen von E. coli und
Coliformen nicht separat bestimmt sondern zu einem Wert zusammengeführt. Die Zellen von E. coli
sowie von den Coliformen wurden zu fast jedem der beprobten Termine eliminiert (Abb. 4). Dies deutet
darauf hin, dass der Bodenfilter besonders diese Gruppe der Mikroorganismen sehr effektiv aus dem
Klärwerksablauf reduzieren kann und zu einer ökologischen Entlastung beiträgt.
Jeder der drei Ansätze zur Bestimmung der Zell- oder Koloniezahl zeigt jedoch eine starke Heterogenität
der Abläufe bezüglich der ermittelten Zellzahlen über den Zeitraum der Beprobung. Hier sollte eine
verstärkte Probenentnahme auch am jeweiligen Termin erfolgen, um Schwankungen, auch über den Tag,
sicherer erfassen zu können.
Einen Einfluss auf die Zell- und Koloniezahlen durch schwankende Tagesdurchflüsse in der untersuchten
Kläranlage in Sulingen kann ausgeschlossen werden, da diese Durchflüsse zu den Beprobungsterminen
auf fast gleichem Niveau liegen (Tab. A8).
Die erstmalige detaillierte molekularbiologische Quantifizierung von Gesamtkeimzahlen liefert neueste
Erkenntnisse der Eliminationsleitung des Bodenfilters, wobei die Zahlen um ein vielfaches genauer sind
als bei bisher eingesetzten, stark fehlerbehafteten kulturbasierten Methoden zur Keimzahlbestimmung
und –Bewertung.
28
4.2 Bakterielle Diversität und 16S rRNA-OTU-Zahlen
Die bisher etablierten Methoden zur Bestimmung der Gewässergüte beinhalten vor allem die Kultivierung
von bestimmten Indikatororganismen wie z.B. E. coli. Der Einsatz von Hochdurchsatz-Sequenzierungen
stellt eine Innovation dar und kann zu völlig neuen Erkenntnissen der Einteilung von Gewässergüten
führen. Es konnte gezeigt werden, dass sich in den Abläufen des Klärwerks bisher nicht ausreichend
charakterisierte Bakterienklassen befinden, deren Bedeutung in der Umwelt und deren mögliche Wirkung
auf den Menschen noch gänzlich unerforscht sind.
Ein Vergleich der Ergebnisse der Hochdurchsatz-Sequenzierung ist erschwert, weil sich in der Literatur
keine direkt vergleichbaren Studien finden lassen. Die Analyse der 16S rRNA-Gene der ermittelten
Gattungen zeigt jedoch einen klaren Einfluss des Bodenfilters auf die Zusammensetzung der bakteriellen
Keime. Auch im Substrat des Bodenfilters zeigt sich eine klar unterschiedliche Zusammensetzung der
bakteriellen Population. Diese Veränderung war anzunehmen, weil der Bodenfilter ein eigenes Habitat
darstellt und nur entsprechend angepasste Keime in diesem Habitat überleben und sich anreichern
können. Bei den sich relativ stark abgrenzenden Terminen vom 30.04 und 27.05.15 aus dem Cluster der
Filterabläufe ist eventuell noch der Beginn der Hochleistungsphase abzuleiten, der dann im weiteren
Verlauf der Beprobungen zu einer konsequenteren Bildung eines Clusters führte.
Die Analyse der 16S rRNA-Genen ergab zudem ein gehäuftes Vorkommen an Flavobacterium,
Planctomyces, unklassifizierte Rickettsiales und Myxococcales, Aquicella sowie Legionella (Tab. A9).
Wieso diese Gattungen häufiger im Bodenfilterablauf auftreten, kann eigentlich nur durch das
Vorhandensein von passenden Zwischenwirten (eukaryotische Einzeller wie Amöben) erklärt werden, die
letztendlich zu einer Anreicherung der parasitären bakteriellen Keime führt.
Das fast vollständige Fehlen von Sequenzen im Datensatz von Keimen wie Escherichia, Shigella,
Staphylokokken und Enterokokken (Tab. A9) ist überraschend und kaum erklärbar. Mögliche Gründe
können vielseitig sein und beginnen bei der DNA-Extraktion und enden bei der Wahl der Sequenzier-
Primer für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. Hier wäre weiterer Forschungsbedarf zu untersuchen, ob
und welche methodischen Zwischenschritte sich hier auf die Analyse ausgewirkt haben könnten.
Die Bewertung der Abwasserqualität durch Hochdurchsatzsequenzierung erweist sich trotzdem als
moderne und Zukunftsträchtige Methode, vor allem bei Analysen über eine längeren Zeitraum hinweg.
Auch in der Literatur häufen sich entsprechende Untersuchungen, die es erlauben, z.B. die bakterielle
16S rRNA zur Identifikation neuer bakterieller Keime zu verwenden, die als weitere Indikatororganismen
dienen könnten, wie z.B. die Organismen aus der Candidate Division OD1 (Abb. 6). Zusätzlich eignet sich
die Sequenzierung der ganzheitlichen, gesamten DNA einer Umweltprobe, der metagenomischen DNA,
um die gesamten vorhandenen genetischen Kapazitäten zu enthüllen und zu charakterisieren.
Auch die Gesamtheit der RNA steht zur Analyse zur Verfügung, um mit Hilfe der Metatranskriptomik die
Aktivitäten aufzuzeigen, welche funktionellen Gene oder auch Resistenzgene innerhalb des Habitats wie
z.B. dem Bodenfilter oder im Filterablauf aktiv sind. Beide Analysen von DNA und RNA liefern
Erkenntnisse über die mögliche Produktion und Biodegradation von Toxinen und Resistenzgenen [TT15].
Begrüßenswert wäre eine Begleitung der Hochdurchsatz-Sequenzier-Methode mit Aktivitätsparametern in
Form von kulturbasierten Ansätzen, molekularbiologisch basiertem Life-Dead-Staining oder die
Fluoreszenzanalyse mit speziellen Sonden, die an die vorhandenen 16S rRNA binden und so ebenfalls
als Parameter für die Aktivität dienen könnten.
Wie bei jedem von Wasser durchflossenem Lebensraum lösen sich aus den Substraten Zellen, die dann
im Ablauf des Bodenfilters zu finden sind. Dies wirft die Frage auf, ob sich die Substrate des Bodenfilters
29
so verändern lassen, dass sich die Emission der bakteriellen Keime gezielt steuern lässt. Dies hätte eine
große ökologische Bedeutung und würde das Verfahren des bepflanzten Bodenfilters weiter anpassbar
an die Bedürfnisse der Anwendung machen. Zudem würde sich dies höchstwahrscheinlich auch positiv
auf die Vermarktung des Verfahrens durch entsprechende kleine und mittelständische Unternehmen
auswirken.
4.3 Quantifizierung ausgesuchter Resistenzgene
Die Quantifizierung der ausgewählten klinisch relevanten, bakteriellen Resistenzgene im Abwasser liefert
wichtige quantitative Informationen über den Einfluss des Bodenfilters auf Antibiotika-resistente
Bakterien.
Die Gene mecA (Methicillin-Resistengen) und vanA (Vancomycin-Resistenzgen) konnten nicht durch
quantitative Real-time PCR nachgewiesen werden. Es ist durchaus denkbar, dass diese Gene unterhalb
der Nachweisgrenze liegen. In der Literatur sind ebenfalls Untersuchungen bekannt, bei denen an
verschiedenen Beprobungsterminen und auch unterschiedlichen Orten bestimmte Gene (ampC, vanA,
mecA, blaSHV) nicht nachweisbar waren [BG09]. Der Vergleich mit den Sequenzen aus der
Hochdurchsatz-Sequenzierung zeigt zudem (Tab. A9), dass die Keime, die diese Gene tragen, in
verschwindend geringen OTU-Zahlen vorkommen. Folglich liegt es höchst wahrscheinlich an den
niedrigen Konzentrationen von mecA und vanA, dass sie nicht nachweisbar sind.
Alle weiteren untersuchten Resistenzgene waren nachweisbar. Die Zahl der im Versuchsverlauf
ermittelten Resistenz-Genkopien zeigt keine stete Erhöhung im Bodenfilterablauf. Insbesondere die Gene
blaTEM (Beta-Lactamase Resistenzgen) und intl1 (Klasse 1 Integrase Gen)zeigten fast immer geringe
Kopienzahlen gegenüber dem Klärwerksablauf. Die im Filterablauf meist höheren Zahlen der Genkopien
von blaCTX-M (Beta-Lactamase Resistenzgen) und ampC (Beta-Lactamase Resistenzgen) erscheinen
nicht gravierend erhöht und bedenkt man die Eliminationsleitung des Bodenfilters, werden pro Liter
Abwasser weniger Genkopien in die Umwelt abgegeben als es beim Klärwerksablauf ist.
In aktuellen wissenschaftlichen Arbeiten gibt es Vorschläge, das Klasse 1-Integrase Gen intl1 als einen
Indikator zur Anzeige anthropogener Verschmutzung einzuführen [GZ15]. Dabei eignet sich das Gen
besonders als Indikator, weil es in pathogenen und nicht-pathogenen Keimen vorkommt.
4.4 Antibiogramme / Resistenzspektren
Die Antibiogramme von jeweils 50 Isolaten aus dem Klärwerks- und Bodenfilterablauf sollten Information
darüber liefern, ob sich in den Isolaten aus dem Klärwerksablauf mehr Resistenzen nachweisen lassen.
Die Untersuchung wurde vom Mikrobiologischen Labor GmbH in Doppelbestimmung mit Hilfe eines
Mikrodilutionstests durchgeführt. Die Isolate, die im Doppelansatz Resistenzen zeigten, galten als
eindeutig resistent. Manche Isolate zeigten nur in einem der Ansätze eine Resistenz gegen
entsprechende Antibiotika und wurden deshalb als intermediär resistent eingestuft.
Bei der Gewinnung der Reinkulturen von Escherichia coli aus dem Klärwerks- und Bodenfilterablauf für
die Antibiogramme ergaben sich Probleme bei der tatsächlichen Reinheit der Kultur. Es zeigte sich, dass
Kolonien nach dem Ausplattieren und bebrüten der Kultur auf Endo-Agar entweder eine klare Mischkultur
entstand (Abb. 11) oder eine Kolonie mit der Ausbildung einer eindeutigen Färbung. Besonders viele der
30
eindeutig gefärbten Kolonien waren trotzdem keine reine Kultur, was ein zur Sicherheit durchgeführtes
erneutes Ausstreichen zeigte (Abb. 11). Überraschend war dabei, dass z.B. eine ursprünglich als zu
E. coli zugehörig identifizierte Kolonie nach dem Ausstreichen zur weiteren Einzelkolonie eine gänzlich
andere Färbung zeigte als die parentale Kolonie (Abb. 11 D). Ähnliches war bei als Coliformen
identifizierten Kolonien zu beobachten (Abb. 11 B, C).
Das zusätzliche Kontrollieren der Kulturen durch Ausstreichen erforderte einen stark erhöhten Arbeits-
und Zeitaufwand. Um sicherzustellen, dass ausschließlich reine Isolate gewonnen wurden, wurde die
DNA der Isolate gewonnen und mit Hilfe der Sanger-Sequenzierung analysiert. Zusätzlich wurden in der
Abteilung Mikrobiologie an der Materialprüfungsanstalt Bremen Tests mit Hilfe eines MALDI Biotypers an
Stichproben durchgeführt, durch die sich die gewonnenen Isolate eindeutig als E. coli identifizieren
ließen.
Abb. 11: Darstellung einer Plattierung vom Klärwerksablauf (A) und von drei Ausstrichen zur Gewinnung von Reinkulturen
für die Antibiogramme (B, C und D). Vereinzelung der Kolonie eines potentiell coliformen Bakteriums (C, D) und
Vereinzelung von einer potentiellen E. coli Kolonie (D) ursprünglich als Reinkultur charakterisiert. Deutliche Verschiebung
der Färbung der neuen Einzelkolonien erkennbar.
Die ergänzende Erstellung von Antibiogrammen ist eine neuartige Vorgehensweise, um die Bildung von
Multiresistenzen ausgesuchter Indikator-Mikroorganismen zu untersuchen. Die Antibiogramme von den
E. coli Isolaten aus dem Klärwerksablauf sowie dem Bodenfilterablauf zeigen insgesamt unterschiedliche
Resistenzprofile (Abb. 9a-c).
Bei den intermediär resistenten Isolaten ist die Interpretation unsicher, ob diese eher als resistent oder
als nicht resistent einzuordnen sind. Die intermediär resistenten Bakterien kommen jedoch vornehmlich
bei wenigen Antibiotika vor, im Wesentlichen bei den Wirkstoffen Amikazin und Ceftazidim (im
Klärwerksablauf) und bei Chloramphenicol sowie Tigecyclin (im Filterablauf). Da die Antibiotika zu
unterschiedlichen Wirkstoffgruppen gehören, die auch unterschiedliche Angriffspunkte innerhalb der
bakteriellen Zelle haben, ist es schwierig Argumente zu finden, wieso gerade diese Wirkstoffe zu dem
entsprechenden Resultat führen. Eine Wiederholung der Messungen mit mehr als zwei Wiederholungen
sollte hier bei zukünftigen Tests für Klarheit sorgen.
31
Deutlich mehr Resistenzen sind bei den Isolaten des Bodenfilterablaufes bei bestimmten Antibiotika zu
finden. Dazu gehören Piperacillin (auch mit Tazobactam), Trimethoprim/Sulfamethoxazol, Ceftazidim
(auch mit 3-APB).
Es stellt sich die Frage, ob jedes E. coli Isolat zu denselben Resistenzmechanismen greift, oder ob
unterschiedliche Mechanismen zum Tragen kommen. Es könnte bei einem Isolat die Zahl der Porine
reduziert sein, während das Andere stärkere Efflux-Pumpen besitzt und ein weiteres Isolat
entsprechende Enzyme wie AmpC exprimiert, die es vor dem entsprechenden Antibiotikum schützen.
Als positiv einzuschätzen ist das geringe Vorkommen von Resistenzen gegen Carbapeneme. Dies zeigt,
dass, wenn überhaupt, im Bodenfilter nur sehr geringe Zahlen von multiresistenten Gramnegativen
Bakterien der Klasse 4 (4MRGN) entstehen. Eher ist klar ersichtlich, dass eine Verschiebung der
Resistenzmuster von Klärwerksablauf und Filterablauf vorhanden ist, was genauer untersucht werden
sollte. Man kann annehmen, dass dieses auf Klebsiella und andere Gramnegative-Bakterien übertragbar
ist. Bei der Wahl der zu untersuchenden bakteriellen Keime muss darauf geachtet werden, dass sich
diese durch klassische Kultivierung oder molekulare Methoden eindeutig identifizieren lassen. Ebenso
sollte in Voruntersuchungen geklärt werden, ob sich durch einfaches Ausplattieren reine Stämme
isolieren lassen und nicht wie bei E. coli beobachtet Probleme bei der Vereinzelung auftreten.
4.5 Mikrobiologische Aktivität der Bodenfiltersubstrate
Die mikrobiologische Aktivität in den Bodenfiltersubstraten zeigte deutlich höhere Werte
(Respirationsraten) in der obersten Schicht (0-10 cm) des Bodenfilters, was vor allem durch die relativ
hohe Wurzeldichte in diesem Bereich und damit einhergehend einer hohen Substratverfügbarkeit und
Durchlüftung. In dem darunterliegenden Filtersubstratkörper gibt es einen leichten Rückgang der
mikrobiellen Aktivität, was für vergleichbare Tiefenprofile in Böden durchaus üblich ist. Demzufolge ist in
der obersten Schicht des Bodenfilters von einem deutlich höheren mikrobiellen Abbaupotential
auszugehen als in den darunterliegenden Schichten. Grundsätzlich kann aber festgehalten werden, dass
der gesamte Substratkörper des Bodenfilters eine mikrobielle Aktivität in Form von Respiration zeigt und
somit auch neben den positiven physikochemischen Eigenschaften als (mikro)biologisch aktiv bezeichnet
werden kann.
Die Hochdurchsatz-Sequenzierung der Filtersubstrate in den Tiefen von 0 bis 40 cm zeigt eine relativ
stabile Zusammensetzung der relativen Zahlen der OTU-Klassen (Abb. 7). In der Tiefe bis 80 cm
dagegen ist eine Veränderung der relativen Zusammensetzung zu beobachten. Es kann eine Reduktion
des Anteils der OTU-Zahlen der Flavobacteria und der Candidate Division TM7 gezeigt werden während
die relative Zahl der Candidate Division OD1 zunimmt. Besonders diese Klasse scheint damit im
potentiell mikroaeroben Bereich der Substratschicht eine größere Bedeutung zu haben. Dieser Vergleich
zeigt, dass sich zwar die mikrobielle Aktivität als Summenparameter kaum mit zunehmender Tiefe
verändert, wobei das Bodenfiltersubstrat aber sehr wohl über eine qualitativ andere Zusammensetzung
verfügt.
32
33
5 Fazit
Der bepflanzte Bodenfilter erweist sich als wirksames Verfahren zur Eliminierung von bakteriellen Zellen,
was durch molekularbiologische Methoden und klassische Kultivierung nachgewiesen wurde.
Das gesteckte Ziel der Quantifizierung und Charakterisierung des Verfahrens hinsichtlich der Diversität
aller Bakterien und der Antibiotika resistenter Bakterien sowie deren Resistenz-Gene wurde erreicht.
Dabei konnte ein Effekt des Bodenfilters auf die bakterielle Zusammensetzung des geklärten Abwassers
gezeigt werden. Ein negativer Effekt des Bodenfilters auf die Abundanz und Weitergabe von
Resistenzgenen konnte nicht gezeigt werden. Allerdings sollte die Verschiebung der mikrobiellen
Diversität sowie der relativen Abundanz von Resistenzgenen des Klärwerksablaufes, durch den
Bodenfilter, weiter besondere Beachtung finden und entsprechend untersucht werden. Hier ist
insbesondere die Bewertung der entsprechenden Umweltrelevanz wichtig wie auch die Auswirkungen auf
die Ökologie des Vorfluters. Zudem kann eine fundierte Ursachenforschung zur Optimierung der
mikrobiellen Eigenschaften und damit Habitate im Bodenfilter, die eine entsprechende Entwicklung
begünstigen, genutzt werden, um das Verfahren des innovativen bepflanzten Bodenfilters weiter zu
verbessern und das positive Potential des bepflanzten Bodenfilters weiter herauszuarbeiten.
Weitere Analysen mit hochauflösenden Aufnahmen der bakteriellen Diversität helfen, das Verfahren des
Bodenfilters weiter zu verfeinern und zu Ergebnissen zu gelangen, die zu einer exakteren, schnelleren
und sicheren Einschätzung des Bodenfilterverfahrens und der Gewässergüte führen.
Insgesamt zeigt die Untersuchung durch molekulare Methoden neue Erkenntnisse über bepflanzte
Bodenfilter und deren Verfahrensweise.
35
6 Literaturverzeichnis
[AS95] AMANN, R.I., LUDWIG, W., SCHLEIFER, K.H.: Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews,
143-169, 59, 1995.
[AK13] ARAVINDRAJA, C., VISZWAPRIYA, D., KARUTHA PANDIAN, S.: Ultradeep 16S rRNA
Sequencing Analysis of Geographically Similar but Diverse Unexplored Marine
Samples Reveal Varied Bacterial Community Composition. PLoS One, e76724, 8,
2013
[BH14] BAYER, K., KAMKE, J., HENTSCHEL, U.: Quantification of bacterial and archaeal
symbionts in high and low microbial abundance sponges using real-time PCR. FEMS
Microbiology and Ecology, 679-690, 89, 2014.
[BC07] BIRKETT, C.I., LUDLAM, H.A., WOODFORD, N., BROWN, D.F., BROWN, N.M., ROBERTS,
M.T., MILNER, N. UND CURRAN, M.D.: Real-time TaqMan PCR for rapid detection and
typing of genes encoding CTX-M extended-spectrum beta-lactamases. Journal of
Medical Microbiology, 52-55, 56, 2007.
[BG09] BÖCKELMANN, U., DÖRRIES, H.H., AYUSO-GABELLA, M.N., SALGOT DE MARCAY, M.,
TANDOI, V., LEVANTESI, C., MASCIOPINTO, C., VAN HOUTTE, E., SZEWZYK, U., WINTGENS,
T., GROHMANN, E.: Quantitative PCR monitoring of antibiotic resistance genes and
bacterial pathogens in three European artificial groundwater recharge systems.
Applied and Environmental Microbiology, 154-163, 75, 2009.
[BD13] BOUKI, C., VENIERI, D., DIAMADOPOULOS, E.: Detection and fate of antibiotic resistant
bacteria in wastewater treatment plants: a review. Ecotoxicology and Environmental
Safety, 1-9, 91, 2013.
[CB12] CZEKALSKI, N., BERTHOLD, T., CAUCCI, S., EGLI, A., BÜRGMANN, H., 2012. Increased
levels of multiresistant bacteria and resistance genes after wastewater treatment and
their dissemination into lake geneva, Switzerland. Frontiers in Microbiology, 106, 3,
2012.
[DS16] DOBNER, I., FILSER, J., WARRELMANN, J., SIOL, A.: Entwicklung eines innovativen
Pflanzenfilters zur Eliminierung von Arzneimittelrückständen im Ablauf kleiner
Kläranlagen und dezentraler Kleinkläranlagen (Phasen 2 u. 3), Abschlussbericht
Projekt AZ: 28722, 2016.
[DS13] DOBNER, I. UND SIOL, A.: Entwicklung eines innovativen Pflanzenfilters zur
Eliminierung von Arzneimittelrückständen im Ablauf kleiner Kläranlagen und
dezentraler Kleinkläranlagen (1. Phase). Abschlussbericht DBU, 2013.
[FP13] FAHRENFELD, N., MA, Y., O'BRIEN, M., PRUDEN, A.: Reclaimed water as a reservoir of
antibiotic resistance genes: distribution system and irrigation implications. Frontiers in
Microbiology, 130, 4, 2013.
[FW03] FEHR, G., GELLER, G., GOETZ, D., HAGENDORF, U., KUNST, S., RUSTIGE, H., WELKER, B.:
Bewachsene Bodenfilter als Verfahren der Biotechnologie. Umweltbundesamt - Texte
281, 2003.
36
[FS99] FEUERPFEIL, I., LÓPEZ-PILA, J., SCHMIDT, R., SCHNEIDER, E., SZEWZYK, R.:
Antibiotikaresistente Bakterien und Antibiotika in der Umwelt. Bundesgesundheitsblatt
- Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz, 37-50, 42, 1999.
[FS03] FRANCOIS, P., PITTET, D., BENTO, M., PEPEY, B., VAUDAUX, P., LEW, D., SCHRENZEL, J.:
Rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from sterile or
nonsterile clinical samples by a new molecular assay. Journal of Clinical Microbiology,
254-260, 41, 2003.
[GZ15] GILLINGS, M.R., GAZE, W.H., PRUDEN, A., SMALLA, K., TIEDJE, J.M., ZHU, Y.G.: Using
the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution. Isme J,
1269-1279, 9, 2015.
[GL09] GRUNERT, A., ARNDT, C., BARTEL, H., DIZER, H., KOCK, M., KUBS, M., LÓPEZ-PILA, J:
Entfernung von Mikroorganismen durch Bodenfilter für Kleinbadeteiche.
Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforsch. - Gesundheitsschutz, 228-237, 52,
2009.
[GA11] GULLBERG, E., CAO, S., BERG, O. G., ILBACK, C., SANDEGREN, L., HUGHES, D.,
ANDERSSON, D. I.: Selection of resistant bacteria at very low antibiotic concentrations.
PLoS Pathogens, e1002158, 7, 2011.
[HR01] HAMMER, Ø., HARPER, D. A. T., RYAN, P. D.: PAST: Paleontological statistics software
package for education and data analysis. Palaeontologia Electronica 4, 9pp., 4, 2001.
[KL13] KIM, J., LIM, J., LEE, C.: Quantitative real-time PCR approaches for microbial
community studies in wastewater treatment systems: applications and considerations.
Biotechnology Advances, 1358-1373, 31, 2013.
[KG13] KLINDWORTH, A., PRUESSE, E., SCHWEER, T., PEPLIES, J., QUAST, C., HORN, M.
GLÖCKNER, F. O.: Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for
classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids
Research, e1, 41, 2013.
[KR05] KNAUTH, S., HUREK, T., BRAR, D., REINHOLD-HUREK, B.: Influence of different Oryza
cultivars on expression of nifH gene pools in roots of rice. Environ Microbiol, 1725-
1733, 7, 2005.
[MP03] MALINEN, E., KASSINEN, A., RINTTILA, T., PALVA, A.: Comparison of real-time PCR with
SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted
oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria. Microbiology, 269-
277, 14, 2003.
[Met10] METZKER, M. L.: Sequencing technologies - the next generation. Nature Reviews
Genetetics, 31-46, 11, 2010.
[NG14] NARCISO-DA-ROCHA, C., VARELA, A.R., SCHWARTZ, T., NUNES, O.C. UND MANAIA, C.M.:
blaTEM and vanA as indicator genes of antibiotic resistance contamination in a
hospital-urban wastewater treatment plant system. Journal of Global Antimicrobial
Resistance, 309-315, 2, 2014.
37
[NE12] NOLL, I., SCHWEICKERT, B., ABU SIN, M., FEIG, M., CLAUS, H., ECKMANNS, T.: Daten zur
Antibiotikaresistenzlage in Deutschland. Bundesgesundheitsblatt -
Gesundheitsforsch. - Gesundheitsschutz, 1370-1376, 55, 2012.
[NT13] NÕLVAK, H., TRUU, M., TIIRIK, K., OOPKAUP, K., SILDVEE, T., KAASIK, A., MANDER, U.,
TRUU, J.: Dynamics of antibiotic resistance genes and their relationships with system
treatment efficiency in a horizontal subsurface flow constructed wetland. The Science
of the Total Environment, 636-644, 461-462, 2013.
[Rde15] R DEVELOPMENT CORE TEAM: R: A language and environment for statistical computing.
R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN 3-900051-07-0, URL
http://www.R-project.org/, 2015.
[SE13] SCHMIDT, H., EICKHORST, T.: Spatio-temporal variability of microbial abundance and
community structure in the puddled layer of a paddy soil cultivated with wetland rice
(Oryza sativa L.). Applied Soil Ecology, 93-102, 72, 2013.
[TT15] TAN, B., NG, C., NSHIMYIMANA, J. P., LOH, L. L., GIN, K. Y., THOMPSON, J. R.: Next-
generation sequencing (NGS) for assessment of microbial water quality: current
progress, challenges, and future opportunities. Front Microbiol, 1027, 6, 2015
[TD90] TORSVIK, V., GOKSØYR, J., DAAE, F. L.: High diversity in DNA of soil bacteria. Applied
and Environmental Microbiology, 782-787, 56, 1990.
[WQ09] WANG, Y., QIAN, P. Y.: Conservative fragments in bacterial 16S rRNA genes and
primer design for 16S ribosomal DNA amplicons in metagenomic studies. PLoS ONE,
e7401, 4, 2009.
A1
Anhang
Tab. A1: Zusammensetzung des Nährmediums R2A. Komponenten 1 L
Yeast extract 0.5 g
Proteose peptone 0.5 g
Caseine hydrolysate 0.5 g
D-Glucose 0.5 g
Starch, soluble (Stärke, löslich) 0.5 g
di-Potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 0.3 g
Magnesium sulfate (MgSO4) 0.024 g
Natrium pyruvate (Brenztraubensäure) 0.3 g
Agar (optional) 14 g
Tab. A2: Zusammensetzung des Nährmediums Endo. Komponenten 1 L
Peptone from meat, peptic digest 10 g
Lactose 10 g
di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 2.5 g
Sodium sulfite (Na2 SO3) 3.3 g
Fuchsin (basic, basisch) 300 mg
Agar (optional) 14 g
Tab. A3: Zusammensetzung des Nährmediums LB. Komponenten 1 L
Yeast extract 10 g
NaCl 10 g
Trypton 5 g
Agar (optional) 14 g
A2
Tab. A4: Mittelwerte und Standardfehler der Zellzahlen von KA und FA nach DAPI-Färbung.
KA FA
Termin Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler
30/04/2015 4153290.8 324835.3 1959830 53538.8
21/05/2015 309060.4 74985.07 2670736 299572.4
27/05/2015 9510782.3 294976.8 3440383 255514.3
18/06/2015 13234859.7 831586.9 4648588 485835.5
25/06/2015 12849702.4 246526.2 3929673 140755.9
01/07/2015 10700965.1 1888305 3514477 236643.0
23/07/2015 3559868.2 200409.7 2893686 138514.2
29/07/2015 725591.0 227029.4 2381701 224495.2
18/08/2015 5849451.5 350480.8 1067360 195557.4
03/09/2015 8405374.1 210291.2 2504524 209111.9
30/09/2015 7486203.2 475806.2 2280238 97038.2
20/10/2015 7934107.1 354451.5 3203414 229180.1
29/10/2015 12415148.8 681391.7 1397781 58998.8
14/12/2015 7938779.8 66581.3 1270285 177412.7
Tab. A5: Mittelwerte und Standardfehler der Koloniezahlen (KbE) von KA und FA.
KA FA
Termin Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler
30/04/2015 5540 428.3 914 111.6
21/05/2015 11612 972.9 17552 2333.5
27/05/2015 13580 2277.5 8264 360.7
18/06/2015 11272 604.5 5808 766.9
25/06/2015 54720 3600.8 24520 856.9
01/07/2015 14376 563.5 1790 48.9
23/07/2015 - - - -
29/07/2015 - - - -
18/08/2015 82000 1748.2 29820 2023.7
03/09/2015 52560 1528.9 26240 6168.4
30/09/2015 9320 1156.9 9496 1035.8
20/10/2015 13240 2895.1 4240 747.3
29/10/2015 37680 3096.8 16320 2567.5
14/12/2015 19480 3652.7 15920 1013.1
A3
Tab. A6: Mittelwerte und Standardfehler der Koloniezahlen von KA und FA, von E. coli und Coliformen Bakterien.
KA FA
Termin Mittelwert Standardfehler Mittelwert Standardfehler
30/04/2015 272 46.2 200 30.80
21/05/2015 15.2 2.6 10.6 3.84
27/05/2015 63 12.6 51 10.27
18/06/2015 1164 20.1 63.4 11.73
25/06/2015 1978 186.8 388 33.08
01/07/2015 974 85.0 250 27.75
23/07/2015 - - - -
29/07/2015 - - - -
18/08/2015 676 49.6 72 13.5
03/09/2015 360 25.3 44 19.3
30/09/2015 63.6 1.7 38 1.3
20/10/2015 119 9.0 61 7.5
29/10/2015 61.4 7.2 9.6 0.5
14/12/2015 53 3.1 6.8 1.3
A4
Tab. A7a: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.
KA FA
Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär
Piperracillin 16 µg/ml 29 0 39 0
Piperracillin 8 µg/ml 29 1 39 0
Piperacillin / Tazobactam 64/4 µg/ml 0 0 19 3
Piperacillin / Tazobactam 32/4 µg/ml 0 0 22 2
Piperacillin / Tazobactam 16/4 µg/ml 0 3 26 5
Piperacillin / Tazobactam 8/4 µg/ml 0 12 31 5
Piperacillin / Tazobactam 4/4 µg/ml 10 11 31 5
Tigecyclin 4 µg/ml 1 4 0 2
Tigecyclin 2 µg/ml 1 6 0 6
Tigecyclin 1 µg/ml 1 9 0 7
Tigecyclin 0,5 µg/ml 4 29 0 17
Tigecyclin 0,25 µg/ml 28 21 13 33
Levofloxacin 4 µg/ml 50 0 50 0
Levofloxacin 2 µg/ml 50 0 50 0
Levofloxacin 1 µg/ml 50 0 50 0
Levofloxacin 0,5 µg/ml 50 0 50 0
Colistin 8 µg/ml 0 1 0 1
Colistin 4 µg/ml 0 1 0 4
Colistin 2 µg/ml 1 5 1 3
Colistin 1 µg/ml 14 5 3 6
Fosfomycin 64 µg/ml 23 0 0 0
Fosfomycin 32 µg/ml 23 0 0 1
Fosfomycin 16 µg/ml 23 0 1 4
Fosfomycin 8 µg/ml 23 2 2 13
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 8/152 µg/ml 25 0 36 0
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 4/76 µg/ml 25 0 36 2
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 2/38 µg/ml 26 2 36 2
Trimethoprim / Sulfamethoxazol 1/19 µg/ml 26 4 36 2
A5
Tab. A7b: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.
KA FA
Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär
Temocillin 128 µg/ml 0 0 0 0
Temocillin 32 µg/ml 1 1 0 2
Chloramphenicol 16 µg/ml 21 16 0 6
Chloramphenicol 8 µg/ml 42 1 0 36
Amikacin 32 µg/ml 0 0 0 0
Amikacin 16 µg/ml 0 0 1 11
Amikacin 8 µg/ml 0 3 4 15
Amikacin 4 µg/ml 0 9 26 7
Ceftazidim 128 µg/ml 0 1 3 6
Ceftazidim 64 µg/ml 0 1 18 8
Ceftazidim 32 µg/ml 0 1 32 0
Ceftazidim 16 µg/ml 0 2 33 0
Ceftazidim 8 µg/ml 0 6 33 1
Ceftazidim 4 µg/ml 0 10 36 2
Ceftazidim 2 µg/ml 0 10 36 2
Ceftazidim 1 µg/ml 0 24 36 3
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 32 µg/ml 0 0 5 7
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 16 µg/ml 0 0 24 2
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 8 µg/ml 0 0 32 1
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 4 µg/ml 0 0 34 9
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 2 µg/ml 0 2 34 6
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 1 µg/ml 1 5 36 4
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 0,5 µg/ml 1 9 36 5
Ceftazidim+ 350 µg/ml 3-APB 0,25 µg/ml 39 11 36 5
Cefotaxim 2 µg/ml 0 4 36 0
Cefotaxim 1 µg/ml 0 15 36 3
A6
Tab. A7c: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.
KA FA
Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär
Doripenem 4 µg/ml 0 0 0 0
Doripenem 2 µg/ml 0 0 0 0
Doripenem 1 µg/ml 0 1 0 0
Doripenem 0,5 µg/ml 0 4 0 1
Imipenem 8 µg/ml 0 1 1 0
Imipenem 4 µg/ml 0 1 1 0
Imipenem 2 µg/ml 0 1 1 0
Imipenem 1 µg/ml 0 4 1 3
Ertapenem 2 µg/ml 0 0 0 0
Ertapenem 1 µg/ml 0 0 0 0
Ertapenem 0,5 µg/ml 0 0 1 0
Ertapenem 0,25 µg/ml 0 3 2 5
Meropenem 128 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem 64 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem 32 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem 16 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem 8 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem 4 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem 2 µg/ml 0 0 0 2
Meropenem 1 µg/ml 0 2 3 1
A7
Tab. A7d: Ermittelte Resistenzzahlen aus den Antibiogrammen der Escherichia coli Isolate.
KA FA
Antibiotikum Resistent Intermediär Resistent Intermediär
Meropenem + 0,4 mM EDTA 32 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 16 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 8 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 4 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 2 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 1 µg/ml 0 0 0 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 0,5 µg/ml 0 0 1 0
Meropenem + 0,4 mM EDTA 0,25 µg/ml 3 5 1 1
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 32 µg/ml 0 0 1 0
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 16 µg/ml 0 0 1 0
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 8 µg/ml 0 0 1 0
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 4 µg/ml 0 0 1 0
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 2 µg/ml 0 1 1 1
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 1 µg/ml 1 1 2 0
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 0,5 µg/ml 1 6 8 9
Meropenem + 350 µg/ml 3-APB 0,25 µg/ml 9 20 32 9
Ciprofloxacin 2 µg/ml 50 0 50 0
Ciprofloxacin 1 µg/ml 50 0 50 0
Ciprofloxacin 0,5 µg/ml 50 0 50 0
A8
Tab. A8: Tagesdurchflüsse der Sulinger Kläranlage.
Termin Tagesdurchfluss: m³ d-1 Niederschlag: l m-2
30.04.15 2299 -
27.05.15 1794 -
18.06.15 1783 -
25.06.15 1885 -
01.07.15 2012 -
23.07.15 1925 -
29.07.15 2258 5
18.08.15 2937 5
03.09.15 2026 -
30.09.15 1609 -
20.10.15 2074 -
29.10.15 1912 -
14.12.15 2093 -
A9
Tab. A9: Phylogenetische Zuordnung der OTU auf Gattungsebene und Gesamt-Zahlen.
Consensus lineage
Gesamt
OTU
Zahl
Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); Edaphobacter 1 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); Granulicella 4 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); Terriglobus 2 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Acidobacteriales; Acidobacteriaceae_(Subgroup_1); unclassified 7 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; AKIW659; unclassified 1 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; Elev-16S-1166; unclassified 6 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; PAUC26f; unclassified 6 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; SJA-149; unclassified 8 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; Unknown_Family; Bryobacter 49 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_3; Unknown_Family; Candidatus_Solibacter 11 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; 11-24; unclassified 35 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; DS-100; unclassified 11 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; RB41; unclassified 14 Bacteria; Acidobacteria; Acidobacteria; Subgroup_4; Unknown_Family; Blastocatella 30 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Acanthopleuribacterales; Acanthopleuribacteraceae; Acanthopleuribacter 4 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; Geothrix 1 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; Holophaga 4 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; marine_group 2 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Holophagales; Holophagaceae; unclassified 7 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Subgroup_10; ABS-19; unclassified 37 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Subgroup_10; CA002; unclassified 6 Bacteria; Acidobacteria; Holophagae; Subgroup_10; NS72; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiaceae; CL500-29_marine_group 15 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiaceae; Ilumatobacter 4 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiaceae; unclassified 4 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiales_Incertae_Sedis; Aciditerrimonas 1 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Acidimicrobiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Microthrix 20 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Iamiaceae; Iamia 50 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; OM1_clade; unclassified 5 Bacteria; Actinobacteria; Acidimicrobiia; Acidimicrobiales; Sva0996_marine_group; unclassified 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Actinomycetales; Actinomycetaceae; Actinobaculum 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Actinomycetales; Actinomycetaceae; Actinomyces 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Bifidobacteriales; Bifidobacteriaceae; Bifidobacterium 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Catenulisporales; Actinospicaceae; Actinospica 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Catenulisporales; Catenulisporaceae; Catenulispora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Corynebacteriaceae; Corynebacterium 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Corynebacteriales_Incertae_Sedis; Tomitella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Dietziaceae; Dietzia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Mycobacteriaceae; Mycobacterium 16 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Gordonia 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Nocardia 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Rhodococcus 6 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Smaragdicoccus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Nocardiaceae; Williamsia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Corynebacteriales; Tsukamurellaceae; Tsukamurella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Acidothermaceae; Acidothermus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Cryptosporangiaceae; Fodinicola 6 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Frankiaceae; Frankia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Frankiaceae; Jatrophihabitans 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Geodermatophilaceae; Blastococcus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Geodermatophilaceae; Modestobacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Nakamurellaceae; Nakamurella 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; Candidatus_Planktophila 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; Sporichthya 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; hgcI_clade 23 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Frankiales; Sporichthyaceae; unclassified 8
A10
Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; Angustibacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; Kineococcus 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; Kineosporia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Kineosporiales; Kineosporiaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Beutenbergiaceae; Salana 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Brevibacteriaceae; Brevibacterium 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Cellulomonadaceae; Actinotalea 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Cellulomonadaceae; Cellulomonas 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Demequinaceae; Demequina 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Demequinaceae; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Dermabacteraceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Dermatophilaceae; Kineosphaera 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Aquipuribacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Ornithinibacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Phycicoccus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; Tetrasphaera 9 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Intrasporangiaceae; unclassified 19 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Agrococcus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Agromyces 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Alpinimonas 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Candidatus_Rhodoluna 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Frondihabitans 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Leucobacter 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Lysinimonas 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; Microbacterium 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Microbacteriaceae; unclassified 87 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Acaricomes 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Arthrobacter 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Kocuria 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Micrococcus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; Rothia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Micrococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micrococcales; Promicromonosporaceae; Promicromonospora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Actinoplanes 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Catellatospora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Luedemannella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; unclassified 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Aeromicrobium 5 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Kribbella 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Marmoricola 4 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; Nocardioides 41 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Nocardioidaceae; unclassified 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Aestuariimicrobium 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Brooklawnia 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Friedmanniella 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Microlunatus 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Micropruina 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Propionibacterium 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Propionicicella 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Propioniciclava 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; Tessaracoccus 7 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Propionibacteriales; Propionibacteriaceae; unclassified 21 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Actinomycetospora 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Actinophytocola 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Amycolatopsis 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Lentzea 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Pseudonocardia 8 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces 3 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; unclassified 6 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Streptosporangiaceae; Nonomuraea 1
A11
Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Streptosporangiaceae; Thermopolyspora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Streptosporangiaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; Actinocorallia 2 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; Actinomadura 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; Thermomonospora 1 Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Streptosporangiales; Thermomonosporaceae; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Adlercreutzia 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Atopobium 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Collinsella 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Eggerthella 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Enterorhabdus 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; Gordonibacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Coriobacteriia; Coriobacteriales; Coriobacteriaceae; unclassified 4 Bacteria; Actinobacteria; Nitriliruptoria; Euzebyales; Euzebyaceae; Euzebya 1 Bacteria; Actinobacteria; Nitriliruptoria; Nitriliruptorales; Nitriliruptoraceae; Nitriliruptor 1 Bacteria; Actinobacteria; Rubrobacteria; Rubrobacterales; Rubrobacteriaceae; Rubrobacter 1 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Gaiellales; Gaiellaceae; Gaiella 18 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; 0319-6M6; unclassified 3 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; 288-2; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; 480-2; unclassified 11 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Conexibacteraceae; Conexibacter 3 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Elev-16S-1332; unclassified 1 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Patulibacteraceae; Patulibacter 21 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; Solirubrobacteraceae; Solirubrobacter 4 Bacteria; Actinobacteria; Thermoleophilia; Solirubrobacterales; TM146; unclassified 6 Bacteria; Armatimonadetes; Armatimonadia; Armatimonadales; Armatimonadaceae; Armatimonas 3 Bacteria; Armatimonadetes; Chthonomonadetes; Chthonomonadales; Chthonomonadaceae; Chthonomonas 8 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Bacteroidaceae; Bacteroides 26 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Marinilabiaceae; Mangroviflexus 3 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; PL-11B8_wastewater-sludge_group; unclassified 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Barnesiella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Butyricimonas 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Coprobacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Dysgonomonas 5 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Macellibacteroides 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Odoribacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Paludibacter 10 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Parabacteroides 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Petrimonas 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; Proteiniphilum 3 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Porphyromonadaceae; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Prevotellaceae; Alloprevotella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Prevotellaceae; Paraprevotella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Prevotellaceae; Prevotella 15 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; Alistipes 8 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; Blvii28_wastewater-sludge_group 4 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; U29-B03 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; dgA-11_gut_group 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; Rikenellaceae; vadinBC27_wastewater-sludge_group 5 Bacteria; Bacteroidetes; Bacteroidia; Bacteroidales; S24-7; unclassified 7 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cyclobacteriaceae; Algoriphagus 3 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Adhaeribacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Arcicella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Chryseolinea 22 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Cytophaga 9 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Dyadobacter 6 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Emticicia 12 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Fibrella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Flectobacillus 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Flexibacter 3 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Hymenobacter 16
A12
Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Larkinella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Leadbetterella 6 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Meniscus 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Ohtaekwangia 29 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Pseudarcicella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Runella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Spirosoma 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; Sporocytophaga 4 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Cytophagaceae; unclassified 52 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Candidatus_Amoebophilus 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Ekhidna 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Marinoscillum 2 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; Flammeovirgaceae; Reichenbachiella 3 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Cytophagales; MWH-CFBk5; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Order_II; Rhodothermaceae; Rubrivirga 1 Bacteria; Bacteroidetes; Cytophagia; Order_II; Rhodothermaceae; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Crocinitomix 4 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Cryomorpha 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Fluviicola 38 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; NS10_marine_group 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; Owenweeksia 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Cryomorphaceae; unclassified 16 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Aequorivita 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Aquimarina 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Bergeyella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Chryseobacterium 20 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Cloacibacterium 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Empedobacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Epilithonimonas 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Flavobacterium 353 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Gillisia 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Myroides 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; NS3a_marine_group 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Sediminibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Subsaxibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Wautersiella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; Weeksella 2 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; Flavobacteriaceae; unclassified 42 Bacteria; Bacteroidetes; Flavobacteriia; Flavobacteriales; NS9_marine_group; unclassified 40 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; AKYH767; unclassified 22 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Chitinophaga 13 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Ferruginibacter 42 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Filimonas 9 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Flavihumibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Flavisolibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Flavitalea 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Hydrotalea 5 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Lacibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Niabella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Niastella 4 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Parasegetibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Sediminibacterium 9 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Segetibacter 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Taibaiella 46 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; Terrimonas 33 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Chitinophagaceae; unclassified 120 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; FFCH9454; unclassified 3 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; KD1-131; unclassified 2 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; KD3-93; unclassified 15 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; LiUU-11-161; unclassified 41 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; NS11-12_marine_group; unclassified 83 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; PHOS-HE51; unclassified 47 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; ST-12K33; unclassified 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Aureispira 3 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Haliscomenobacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Lewinella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Portibacter 3
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Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; Rubidimonas 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Saprospiraceae; unclassified 135 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Arcticibacter 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Mucilaginibacter 39 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Nubsella 1 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Pedobacter 18 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Solitalea 6 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; Sphingobacterium 5 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; Sphingobacteriaceae; unclassified 26 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; WCHB1-69; unclassified 5 Bacteria; Bacteroidetes; Sphingobacteriia; Sphingobacteriales; env.OPS_17; unclassified 85 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Chlamydiales_Incertae_Sedis; Criblamydia 3 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Candidatus_Metachlamydia 3 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Candidatus_Protochlamydia 63 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Neochlamydia 23 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; Parachlamydia 1 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Parachlamydiaceae; unclassified 184 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Simkaniaceae; Simkania 4 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Simkaniaceae; unclassified 11 Bacteria; Chlamydiae; Chlamydiae; Chlamydiales; Waddliaceae; Waddlia 4 Bacteria; Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales; OPB56; unclassified 30 Bacteria; Chlorobi; Chlorobia; Chlorobiales; SJA-28; unclassified 19 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; BSV26; unclassified 23 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; Ignavibacteriaceae; Ignavibacterium 1 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; IheB3-7; unclassified 1 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; PHOS-HE36; unclassified 2 Bacteria; Chlorobi; Ignavibacteria; Ignavibacteriales; SR-FBR-L83; unclassified 1 Bacteria; Chloroflexi; Anaerolineae; Anaerolineales; Anaerolineaceae; Anaerolinea 2 Bacteria; Chloroflexi; Anaerolineae; Anaerolineales; Anaerolineaceae; unclassified 128 Bacteria; Chloroflexi; Caldilineae; Caldilineales; Caldilineaceae; Litorilinea 8 Bacteria; Chloroflexi; Caldilineae; Caldilineales; Caldilineaceae; unclassified 80 Bacteria; Chloroflexi; Chloroflexia; Chloroflexales; Chloroflexaceae; Chloroflexus 1 Bacteria; Chloroflexi; Chloroflexia; Chloroflexales; Roseiflexaceae; Roseiflexus 26 Bacteria; Chloroflexi; Chloroflexia; Herpetosiphonales; Herpetosiphonaceae; Herpetosiphon 5 Bacteria; Chloroflexi; Thermomicrobia; Sphaerobacterales; Sphaerobacteraceae; unclassified 3 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionI; FamilyI; Snowella 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionII; FamilyII; Pleurocapsa 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Chamaesiphon 3 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Geitlerinema 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Leptolyngbya 4 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Microcoleus 1 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Phormidium 3 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; Planktothrix 2 Bacteria; Cyanobacteria; Cyanobacteria; SubsectionIII; FamilyI; unclassified 4 Bacteria; Deferribacteres; Deferribacteres; Deferribacterales; PAUC34f; unclassified 3 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Deinococcales; Deinococcaceae; Deinococcus 4 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Deinococcales; Deinococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Deinococcales; Trueperaceae; Truepera 2 Bacteria; Deinococcus-Thermus; Deinococci; Thermales; Thermaceae; Meiothermus 1 Bacteria; Elusimicrobia; Elusimicrobia; Elusimicrobiales; Elusimicrobiaceae; Elusimicrobium 2 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; Fibrobacteraceae; possible_genus_04 16 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; Fibrobacteraceae; possible_genus_06 3 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; Fibrobacteraceae; unclassified 3 Bacteria; Fibrobacteres; Fibrobacteria; Fibrobacterales; possible_family_01; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Alicyclobacillaceae; Alicyclobacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Aeribacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus 10 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Calditerricola 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Fictibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Geobacillus 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Ureibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Family_XII; Exiguobacterium 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Listeriaceae; Brochothrix 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Aneurinibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Brevibacillus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Cohnella 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; Paenibacillus 23
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Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Paenibacillaceae; unclassified 5 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Lysinibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Rummeliibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Solibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; Sporosarcina 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Planococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Sporolactobacillaceae; Tuberibacillus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Staphylococcaceae; Staphylococcus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Thermoactinomycetaceae; Planifilum 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Thermoactinomycetaceae; Thermoactinomyces 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Thermoactinomycetaceae; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Carnobacteriaceae; Trichococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Enterococcaceae; Enterococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactobacillus 3 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Leuconostocaceae; Oenococcus 1 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae; Lactococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Streptococcaceae; Streptococcus 5 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Caldicoprobacteraceae; Caldicoprobacter 4 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Christensenellaceae; unclassified 7 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_1 6 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_12 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_13 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_7 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Clostridium_sensu_stricto_9 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Proteiniclasticum 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; Sarcina 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Clostridiaceae_1; unclassified 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Defluviitaleaceae; Incertae_Sedis 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Eubacteriaceae; Acetobacterium 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Eubacteriaceae; Anaerofustis 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Eubacteriaceae; Garciella 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Anaerosphaera 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Gallicola 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Incertae_Sedis 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; Tissierella 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XI; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XII; Acidaminobacter 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XII; Fusibacter 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XIII; Anaerovorax 4 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Family_XVII; Thermaerobacter 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Anaerostipes 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Blautia 6 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Butyrivibrio 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Coprococcus 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Dorea 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Epulopiscium 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Incertae_Sedis 13 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Lachnospira 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Pseudobutyrivibrio 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Roseburia 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; Shuttleworthia 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Lachnospiraceae; unclassified 17 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; P._palm_C-A_51; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Desulfitibacter 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Desulfotomaculum 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae; Pelotomaculum 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Incertae_Sedis 4 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Peptostreptococcus 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; Proteocatella 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptostreptococcaceae; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Anaerofilum 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Faecalibacterium 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Fastidiosipila 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Incertae_Sedis 8 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Ruminococcus 3 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Saccharofermentans 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; Subdoligranulum 2 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Ruminococcaceae; unclassified 28 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Syntrophomonadaceae; Syntrophomonas 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; vadinBB60; unclassified 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Halanaerobiales; Halanaerobiaceae; Halocella 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales; Family_III; Thermoanaerobacterium 1
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Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales; Thermoanaerobacteraceae; Gelria 1 Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Thermoanaerobacterales; Thermoanaerobacteraceae; Syntrophaceticus 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Asteroleplasma 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Erysipelothrix 3 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Incertae_Sedis 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; Turicibacter 1 Bacteria; Firmicutes; Erysipelotrichia; Erysipelotrichales; Erysipelotrichaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Acidaminococcus 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Phascolarctobacterium 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Succiniclasticum 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; Succinispira 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Acidaminococcaceae; unclassified 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Allisonella 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaeroarcus 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaerosinus 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaerospora 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Anaerovibrio 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Dendrosporobacter 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Dialister 5 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Megamonas 2 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Megasphaera 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Mitsuokella 4 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Pectinatus 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Pelosinus 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Selenomonas 1 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Veillonella 4 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; Zymophilus 3 Bacteria; Firmicutes; Negativicutes; Selenomonadales; Veillonellaceae; unclassified 2 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Fusobacteriaceae; Fusobacterium 1 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Hados.Sed.Eubac.3; unclassified 1 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Leptotrichiaceae; Leptotrichia 2 Bacteria; Fusobacteria; Fusobacteriia; Fusobacteriales; Leptotrichiaceae; Sebaldella 3 Bacteria; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadales; Gemmatimonadaceae; Gemmatimonas 30 Bacteria; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadetes; Gemmatimonadales; Gemmatimonadaceae; unclassified 152 Bacteria; Lentisphaerae; Lentisphaeria; Victivallales; Victivallaceae; Victivallis 14 Bacteria; Lentisphaerae; Oligosphaeria; Oligosphaerales; Oligosphaeraceae; unclassified 1 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; 0319-6A21; unclassified 12 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; 4-29; unclassified 8 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; Nitrospiraceae; Leptospirillum 3 Bacteria; Nitrospirae; Nitrospira; Nitrospirales; Nitrospiraceae; Nitrospira 29 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; AKYG587 13 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; CL500-3 16 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; I-8 6 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; Phycisphaera 61 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; SM1A02 134 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; Urania-1B-19_marine_sediment_group 1 Bacteria; Planctomycetes; Phycisphaerae; Phycisphaerales; Phycisphaeraceae; unclassified 16 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Brocadiales; Brocadiaceae; unclassified 3 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Blastopirellula 26 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Candidatus_Anammoximicrobium 2 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Candidatus_Nostocoida 18 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Gemmata 167 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Isosphaera 12 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Pir3_lineage 3 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Pir4_lineage 122 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Pirellula 178 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Planctomyces 265 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Rhodopirellula 16 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Schlesneria 19 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Singulisphaera 21 Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; Zavarzinella 17
A16
Bacteria; Planctomycetes; Planctomycetacia; Planctomycetales; Planctomycetaceae; unclassified 329 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Asticcacaulis 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Brevundimonas 29 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Caulobacter 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; Phenylobacterium 17 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Caulobacteraceae; unclassified 27 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Hyphomonadaceae; Hirschia 41 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Hyphomonadaceae; Hyphomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Caulobacterales; Hyphomonadaceae; Woodsholea 53 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Parvularculales; Parvularculaceae; Parvularcula 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; A0839; unclassified 29 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Aurantimonadaceae; Aureimonas 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; B142; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; BCf3-20; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; Camelimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; Chelatococcus 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; Methylovirgula 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Beijerinckiaceae; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; Bosea 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; Rhodopseudomonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Bradyrhizobiaceae; unclassified 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Brucellaceae; Ochrobactrum 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; D05-2; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; DUNssu044; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; DUNssu371; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; F0723; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; FukuN57; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Devosia 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Hyphomicrobium 27 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Pedomicrobium 18 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Prosthecomicrobium 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Rhodomicrobium 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Rhodoplanes 12 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; Vasilyevaea 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Hyphomicrobiaceae; unclassified 32 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; JG34-KF-361; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; JG35-K1-AG5; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; KF-JG30-B3; unclassified 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; MNG7; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylobacteriaceae; Meganema 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylobacteriaceae; Methylobacterium 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylobacteriaceae; Microvirga 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylocystaceae; Methylosinus 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylocystaceae; Pleomorphomonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Methylocystaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Aliihoeflea 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Aminobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Mesorhizobium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; Phyllobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Phyllobacteriaceae; unclassified 16 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Kaistia 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Shinella 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Agaricicola 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Bauldia 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Liberibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Nordella 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiales_Incertae_Sedis; Rhizomicrobium 60 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; Parvibaculum 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; Rhodobium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; Rhodoligotrophos 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhodobiaceae; unclassified 1
A17
Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Ancylobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Labrys 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Pseudolabrys 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Pseudoxanthobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; Xanthobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Xanthobacteraceae; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; alphaI_cluster; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Amaricoccus 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Defluviimonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Falsirhodobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Paracoccus 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Pseudorhodobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Rhodobacter 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Rubellimicrobium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; Tabrizicola 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodobacterales; Rhodobacteraceae; unclassified 163 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; AKYH478; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; AT-s3-44; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Acetobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Acidicaldus 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Acidiphilium 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Belnapia 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Craurococcus 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Oleomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Roseococcus 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Roseomonas 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Stella 14 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; Zavarzinia 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Acetobacteraceae; unclassified 52 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; B79; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; CCU22; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; DA111; unclassified 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; I-10; unclassified 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; JG37-AG-20; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; KCM-B-15; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; KCM-B-60; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; MNC12; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; MND8; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Azospirillum 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Candidatus_Riegeria 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Defluviicoccus 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Desertibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Dongia 6 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Elstera 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Ferrovibrio 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Inquilinus 6 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Insolitispirillum 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Magnetospira 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Magnetospirillum 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Novispirillum 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Skermanella 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Telmatospirillum 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Thalassobaculum 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; Thalassospira 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillaceae; unclassified 21 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillales_Incertae_Sedis; Candidatus_Alysiosphaera 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillales_Incertae_Sedis; Geminicoccus 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhodospirillales; Rhodospirillales_Incertae_Sedis; Reyranella 83 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; AKIW1012; unclassified 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Anaplasmataceae; 1
A18
Candidatus_Xenohaliotis Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; EF100-94H03; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Holosporaceae; unclassified 18 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; LR_A2-29; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; LWSR-14; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; RB446; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiaceae; Rickettsia 31 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiaceae; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Captivus 44 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Lariskella 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Candidatus_Odyssella 20 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; Constrictibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; Rickettsiales_Incertae_Sedis; unclassified 14 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; SM1B06; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; SM2D12; unclassified 220 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; TK34; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; bac2nit3; unclassified 14 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rickettsiales; mitochondria; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; 7B-8; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Ellin6055; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Erythrobacteraceae; Altererythrobacter 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Erythrobacteraceae; Erythrobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Erythrobacteraceae; Porphyrobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Erythrobacteraceae; unclassified 11 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; M05-Pitesti; unclassified 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; ORCA-3N101; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; SWB04; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Novosphingobium 8 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Sandaracinobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Sandarakinorhabdus 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Sphingobium 10 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Sphingomonas 12 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Sphingopyxis 5 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Sphingosinicella 2 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; Zymomonas 19 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; Sphingomonadaceae; unclassified 41 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; WW2-159; unclassified 4 Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Sphingomonadales; ctg-CGOF202; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Betaproteobacteria_Incertae_Sedis; Unknown_Family; Chitinivorax 21 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Achromobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Alcaligenes 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Candidimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Derxia 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; GKS98_freshwater_group 26 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Kerstersia 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Oligella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Parasutterella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Pigmentiphaga 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Pusillimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; Sutterella 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Alcaligenaceae; unclassified 62 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Burkholderia 5
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Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Chitinimonas 14 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Cupriavidus 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Lautropia 10 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Limnobacter 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Pandoraea 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Polynucleobacter 14 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; Ralstonia 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Burkholderiales_Incertae_Sedis; Thiomonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Acidovorax 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Aquabacterium 6 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Aquincola 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Azohydromonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Caenimonas 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Chlorochromatium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Comamonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Curvibacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Delftia 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Diaphorobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Giesbergeria 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Hydrogenophaga 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Hylemonella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Ideonella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Inhella 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Leptothrix 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Limnohabitans 19 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Macromonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Methylibium 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Ottowia 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Paucibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Piscinibacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Polaromonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Pseudorhodoferax 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Ramlibacter 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Rhizobacter 11 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Rhodoferax 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Rubrivivax 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Simplicispira 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Variovorax 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; Verminephrobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Comamonadaceae; unclassified 366 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Collimonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Duganella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Herbaspirillum 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Herminiimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Janthinobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Massilia 10 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Oxalicibacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Paucimonas 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Pseudoduganella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; Undibacterium 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Burkholderiales; Oxalobacteraceae; unclassified 81 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Ferritrophicum 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Sulfuricella 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Hydrogenophilales; Hydrogenophilaceae; Thiobacillus 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; Methylobacillus 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; Methylophilus 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; Methylotenera 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; PRD01a011B 3
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Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Methylophilales; Methylophilaceae; unclassified 13 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Andreprevotia 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Aquaspirillum 4 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Chitinibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Deefgea 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Formivibrio 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Laribacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Leeia 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Microvirgula 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Paludibacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Uruburuella 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Vitreoscilla 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; Vogesella 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales; Neisseriaceae; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Gallionellaceae; Candidatus_Nitrotoga 4 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; Nitrosomonas 18 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; Nitrosospira 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Nitrosomonadales; Nitrosomonadaceae; unclassified 37 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; 12up 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Azospira 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Candidatus_Accumulibacter 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Dechloromonas 7 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Denitratisoma 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Ferribacterium 3 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Georgfuchsia 5 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Methyloversatilis 1 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Propionivibrio 6 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Sterolibacterium 2 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Sulfuritalea 12 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Thauera 4 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Uliginosibacterium 13 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; Zoogloea 14 Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Rhodocyclales; Rhodocyclaceae; unclassified 78 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bacteriovoracaceae; Bacteriovorax 6 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bacteriovoracaceae; Peredibacter 62 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bacteriovoracaceae; unclassified 6 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bdellovibrionaceae; Bdellovibrio 240 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Bdellovibrionales; Bdellovibrionaceae; OM27_clade 71 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Deltaproteobacteria_Incertae_Sedis; Syntrophorhabdaceae; Syntrophorhabdus 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfarculales; Desulfarculaceae; Desulfarculus 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Candidatus_Desulfamplus 2 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Desulfobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Desulfobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; Desulforegula 2 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobacteraceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobulbaceae; Desulfobulbus 3 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Desulfobulbaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfobacterales; Nitrospinaceae; Candidatus_Entotheonella 3 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales; Desulfomicrobiaceae; Desulfomicrobium 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales; Desulfovibrionaceae; Bilophila 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales; Desulfovibrionaceae; Desulfovibrio 13 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfovibrionales; Desulfovibrionaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfurellales; Desulfurellaceae; unclassified 9 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales; Desulfuromonadaceae; Pelobacter 1
A21
Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Desulfuromonadales; GR-WP33-58; unclassified 43 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; 0319-6G20; unclassified 485 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Cystobacteraceae; Anaeromyxobacter 14 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Cystobacteraceae; Hyalangium 7 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Cystobacteraceae; unclassified 13 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Haliangiaceae; Haliangium 148 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; MSB-4B10; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Myxococcaceae; Pyxidicoccus 2 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Nannocystaceae; Enhygromyxa 2 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Nannocystaceae; Nannocystis 25 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Nannocystaceae; unclassified 6 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Phaselicystidaceae; Phaselicystis 31 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Polyangiaceae; Byssovorax 33 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Polyangiaceae; Sorangium 46 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Polyangiaceae; unclassified 15 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Sandaracinaceae; Sandaracinus 16 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; Sandaracinaceae; unclassified 49 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; VHS-B3-70; unclassified 6 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Myxococcales; mle1-27; unclassified 42 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales; Syntrophaceae; Desulfobacca 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales; Syntrophaceae; Desulfomonile 1 Bacteria; Proteobacteria; Deltaproteobacteria; Syntrophobacterales; Syntrophaceae; Smithella 2 Bacteria; Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales; Campylobacteraceae; Arcobacter 13 Bacteria; Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales; Campylobacteraceae; Sulfurospirillum 3 Bacteria; Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales; Helicobacteraceae; Sulfuricurvum 3 Bacteria; Proteobacteria; Epsilonproteobacteria; Campylobacterales; Helicobacteraceae; Sulfurimonas 5 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Aeromonadales; Aeromonadaceae; Aeromonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Aeromonadales; Aeromonadaceae; Tolumonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Aeromonadales; Aeromonadaceae; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Aeromonadales; Succinivibrionaceae; Succinivibrio 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; BD1-7_clade 10 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; C1-B045 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; Haliea 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; Simiduia 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Alteromonadaceae; unclassified 13 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Alteromonadales; Shewanellaceae; Shewanella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Chromatiaceae; Nitrosococcus 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Chromatiaceae; Rheinheimera 10 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Ectothiorhodospiraceae; Acidiferrobacter 11 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Halothiobacillaceae; Halothiobacillus 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Halothiobacillaceae; Thiovirga 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Chromatiales; Halothiobacillaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Escherichia-Shigella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Ewingella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Morganella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Pectobacterium 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Providencia 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Rahnella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Raoultella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; Yersinia 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Enterobacteriales; Enterobacteriaceae; unclassified 22 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Gammaproteobacteria_Incertae_Sedis; Unknown_Family; Arenicella 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Coxiellaceae; Aquicella 667 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Coxiellaceae; Coxiella 88
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Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Coxiellaceae; Rickettsiella 5 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Coxiellaceae; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Legionellales; Legionellaceae; Legionella 393 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Methylococcales; Crenotrichaceae; Crenothrix 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Methylococcales; IheB2-23; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Methylococcales; Methylococcaceae; Methylocaldum 3 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Methylococcales; Methylococcaceae; Methylomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales; CrystalBog021C3; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales; Hahellaceae; Zooshikella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales; Halomonadaceae; Halomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales; Oceanospirillaceae; Marinomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales; Oceanospirillaceae; Pseudospirillum 19 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Oceanospirillales; Oleiphilaceae; Oleiphilus 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Orbales; Orbaceae; Gilliamella 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Order_Incertae_Sedis; Family_Incertae_Sedis; Marinicella 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pasteurellales; Pasteurellaceae; unclassified 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Moraxellaceae; Acinetobacter 26 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Moraxellaceae; Alkanindiges 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Moraxellaceae; Enhydrobacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Moraxellaceae; Perlucidibaca 13 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Moraxellaceae; Psychrobacter 4 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Moraxellaceae; unclassified 7 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Azotobacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Cellvibrio 20 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas 105 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; unclassified 63 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; CHAB-XI-27; unclassified 15 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; EV818SWSAP88; unclassified 18 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; Thiotrichaceae; Beggiatoa 14 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; Thiotrichaceae; Thiothrix 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; Thiotrichales_Incertae_Sedis; Caedibacter 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; Thiotrichales_Incertae_Sedis; Candidatus_Endoecteinascidia 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Thiotrichales; Thiotrichales_Incertae_Sedis; unclassified 5 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; JTB255_marine_benthic_group; unclassified 3 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Nevskiaceae; Alkanibacter 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Nevskiaceae; Hydrocarboniphaga 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Nevskiaceae; Nevskia 4 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Solimonadaceae; Fontimonas 16 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Solimonadaceae; unclassified 19 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Aquimonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Arenimonas 34 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Dokdonella 14 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Dyella 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Fulvimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Ignatzschineria 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Luteibacter 3 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Luteimonas 4
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Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Lysobacter 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Panacagrimonas 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Pseudofulvimonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Pseudoxanthomonas 9 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Rhodanobacter 16 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Rudaea 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Silanimonas 2 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Stenotrophomonas 6 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Tahibacter 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Thermomonas 13 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Wohlfahrtiimonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; Xanthomonas 1 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadaceae; unclassified 74 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadales_Incertae_Sedis; Candidatus_Competibacter 18 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadales_Incertae_Sedis; Steroidobacter 13 Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Xanthomonadales; Xanthomonadales_Incertae_Sedis; unclassified 3 Bacteria; Spirochaetae; Spirochaetes; Spirochaetales; Leptospiraceae; Leptospira 5 Bacteria; Spirochaetae; Spirochaetes; Spirochaetales; Leptospiraceae; Turneriella 3 Bacteria; Spirochaetae; Spirochaetes; Spirochaetales; Spirochaetaceae; Spirochaeta 14 Bacteria; Spirochaetae; Spirochaetes; Spirochaetales; Spirochaetaceae; Treponema 2 Bacteria; Spirochaetae; Spirochaetes; Spirochaetales; V2072-189E03; unclassified 1 Bacteria; Synergistetes; Synergistia; Synergistales; Synergistaceae; Aminivibrio 1 Bacteria; Synergistetes; Synergistia; Synergistales; Synergistaceae; Aminomonas 1 Bacteria; Synergistetes; Synergistia; Synergistales; Synergistaceae; Cloacibacillus 3 Bacteria; Synergistetes; Synergistia; Synergistales; Synergistaceae; Fretibacterium 2 Bacteria; Synergistetes; Synergistia; Synergistales; Synergistaceae; unclassified 5 Bacteria; Tenericutes; Mollicutes; Haloplasmatales; Haloplasmataceae; Haloplasma 1 Bacteria; Tenericutes; Mollicutes; Mycoplasmatales; Mycoplasmataceae; Mycoplasma 2 Bacteria; Thermotogae; Thermotogae; Thermotogales; Thermotogaceae; GAL15 2 Bacteria; Verrucomicrobia; OPB35_soil_group; Unknown_Order; Unknown_Family; Pedosphaera 4 Bacteria; Verrucomicrobia; Opitutae; Opitutales; Opitutaceae; Alterococcus 2 Bacteria; Verrucomicrobia; Opitutae; Opitutales; Opitutaceae; Opitutus 63 Bacteria; Verrucomicrobia; Opitutae; Opitutales; Opitutaceae; unclassified 4 Bacteria; Verrucomicrobia; Spartobacteria; Chthoniobacterales; Chthoniobacteraceae; Chthoniobacter 43 Bacteria; Verrucomicrobia; Spartobacteria; Chthoniobacterales; DA101_soil_group; unclassified 4 Bacteria; Verrucomicrobia; Spartobacteria; Chthoniobacterales; FukuN18_freshwater_group; unclassified 21 Bacteria; Verrucomicrobia; Spartobacteria; Chthoniobacterales; LD29; unclassified 4 Bacteria; Verrucomicrobia; Spartobacteria; Chthoniobacterales; Xiphinematobacteraceae; Candidatus_Xiphinematobacter 7 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobia_Incertae_Sedis; Unknown_Order; Unknown_Family; Candidatus_Methylacidiphilum 14 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobia_Incertae_Sedis; Unknown_Order; Unknown_Family; Candidatus_Omnitrophus 4 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; DEV007; unclassified 11 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Rubritaleaceae; Rubritalea 1 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Akkermansia 2 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Brevifollis 4 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Haloferula 7 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Luteolibacter 12 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Prosthecobacter 15
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Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Roseimicrobium 1 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; Verrucomicrobium 14 Bacteria; Verrucomicrobia; Verrucomicrobiae; Verrucomicrobiales; Verrucomicrobiaceae; unclassified 47