1

Reduzca sus Costes Operacionales y

Aumente su Productividad en LC/MS

mediante las Tecnologías:

- RapidFire (µSPE/MS)

- Automatización:

- Preparación de muestra.

- Extracción “Dried Blood Spots” (A.A.C.E. - DBS).

Isidre Masana

Especialista Productes LC/MS

Agilent Technologies

Divisió Biociència i Anàlisi Químic

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Reduzca sus Costes Operacionales y

Aumente su Productividad en LC/MS

mediante las Tecnologías:

- RapidFire (µSPE/MS)

- Automatización:

- Preparación de muestra.

- Extracción “Dried Blood Spots” (A.A.C.E. - DBS).

Isidre Masana

Especialista Productes LC/MS

Agilent Technologies

Divisió Biociència i Anàlisi Químic

2

RapidFire 360

Sistema de Alta

Resolución

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Convierta su

Espectrómetro de Masas

en un Lector de Placas

Página 3

Análisis mediante: µ-SPE-MS/MS

Mass spec 30 s

Página 4

3

Agilent RapidFire Mass Spectrometry

Inyector Ultra-rápido & in-line SPE:

• Reemplaza el HPLC en LC/MS

• Cartuchos µ-SPE reutilizables.

• Integrado con instrumentos standard ESI MS

• Tiempos de ciclo = 7-13 s/muestra

Compatible con matrices biológicas

• Preparaciones Microsomales.

• Sobrenadantes de cultivos celulares.

• Extractos de tejidos.

• Suero, plasma, orina, sangre entera,..

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Página 5

Principales Aportaciones RapidFire /MS

• Reduce costes de Operación a 1/10.

• Elución en sentido contrario al de carga cartucho queda limpio.

• Vida típica cartuchos µ-SPE: 2000-5000 muestras/cartucho.

• Coste cartucho µ-SPE < 0.1 €/muestra. Coste total: 0,2-0,4$/mta (LC/MS 2-4$/mta)

• Reduce enormemente el consumo de reactivos con respecto a HPLC: evita

tener que etiquetar para detectar con fluorescencia, utilizar anticuerpos, o

reactivos radiactivos.

• Reduce consumo disolventes: típico 0.3mL/muestra

• Reduce Tiempos de Análisis a 1/10.

• 7-13 seg./muestra

• 10-15 min./placa de 96 muestras 40-60min./placa de 384 muestras

• Multiplexado:

• QqQ-MRM: típico 4-6 analitos/inyección (hasta 10-20)

• TOF/QTOF: ilimitado. • durante 30-40min)

• Permite un rápido intercambio LC/MS SPE/µSPE/MS

Página 6

4

Ciclo RapidFire – Elución…..al MS

Estandard Interno:

(D4-a-hidroximidazolam)

Producto:

(a-hidroximidazolam)

A1 H12

A1 For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Sip

Load Elute

Se recomienda trabajar con:

• Patrones internos

marcados isotópicamente

• Alternativa: técnica de

adición de patrones a la

propia muestra (“adición

standard”)

10-15 min./placa de 96 40-60min./placa de 384

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Excelente Correlación RapidFire/MS “versus”

LC/MS: Levetiracetam – Blinded Human Samples

•HPLC-MS Workflow

• 7.5 min/sample

• multiplex X4 (~2 min/sample)

• 768 samples/day/mass spec

•RapidFire-MS Workflow

• 9.5 sec/sample

• no multiplexing

• > 9000 samples/day/mass spec

> 10X throughput enhancement

y = 0.9901x + 0.7899 R² = 0.9993

0

20

40

60

80

100

0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0

Agil

ent

Resu

lts

(ug/

mL)

Mayo Clinic Results (ug/mL)

Correlation between RapidFire-MS and LC-MS

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

Página 8

5

Excelente Robustez. Datos Bioanálisis

de Metabolito Hidroxilado: HO-Midazolam

en Plasma (PPT)

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

AU

C R

ati

o, P

/IS

# of Injections

HO-Midazolam ~ 1600 Inyecciones

% CV 2.4

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic

Procedures.

Página 9

Drug Discovery with RapidFire/MS

• Genomics

• Proteomics

• Metabolomics

• Lipidomics

• Animal models

• Knockouts

Target

Selection

Preclinical

Testing

Clinical

Trials

Label-free

HTS using

native

substrate

Secondary

screen

Selectivity

screen

ADMET

• DDI (Drug-Drug Interact.)

• Met Stab

• Permeability

• Protein binding

• Pgp inhibition

• CYP inhibition

Bioanalysis:

• PK /PD

• Toxicology

Lead

Optimization

Bioanalysis

• PK /PD

• TDM (Ther. Drug Mon.)

Lead Discovery

High-throughput

Target Screening (HTS)

Therapeutic Areas

• Metabolic disease/diabetes

• Epigenetics

• Cardiovascular disease

• Kinases

• Oncology

• Anti-infectives

• Inflammation/Pain

• Neurology

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

High Throughput

Screening

In vitro /In vivo

ADME Clinical Research

Página 10

6

Aplicaciones y ÁreasTípicas en Investigación Clínica

Pharma Drugs

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic

Procedures.

Página 11

Notas de Aplicación Clínicas

For Research Use Only. Not for Use in Diagnostic Procedures.

• Ultrafast Analysis of Tacrolimus in Whole Blood Using the Agilent

RapidFire High‐throughput Mass Spectrometry System (5990‐9994EN)

• Ultrafast Analysis of Levetiracetam in Serum Using the Agilent RapidFire

High‐throughput Mass Spectrometry System (5990‐9995EN)

• Simultaneous Analysis of Tacrolimus, Sirolimus, Everolimus, and Cyclosporin A in Whole

Blood using the Agilent RapidFire High‐throughput Mass Spectrometry System (5991‐

0263EN)

• Ultrafast Analysis of 6 Antiepileptic Drugs in Serum Using the Agilent RapidFire

High‐throughput Mass Spectrometry System

• Automated High‐throughput Analysis of Proteins and Peptides in Blood‐Based Matrices

Using Immunoaffinity Purification and Ultra fast SPE/MS/MS (5991‐0380EN)

• High‐throughput SISCAPA‐Based Peptide Quantitation Using the Agilent RapidFire

High‐throughput Mass Spectrometry System (5991‐0380EN)

• Ultra Fast Analysis of the THC Metabolite (THC‐COOH) in Urine Using the Agilent

RapidFire High‐ throughput Mass Spectrometry System (5990‐9763EN)

Página 12

7

Resumen Tecnología RapidFire

• Reduce Costes:

• 1/10 con respecto a LC/MS

• +1/10 con respecto a inmunoensayo.

• x10 veces Más Rápida que LC/MS:

• Aumenta la capacidad del laboratorio

• Proporciona una respuesta muy rápida, para toma de

decisiones urgentes.

• Proporciona Resultados Equivalentes a LC/MS.

• Mejora la especificidad y sensibilidad de las

técnicas de inmunoensayo.

• Permita mantener los flujos de trabajo tradicionales.

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Página 14

Reduzca sus Costes Operacionales y

Aumente su Productividad en LC/MS

mediante las Tecnologías:

- RapidFire (µSPE/MS)

- Automatización:

- Preparación de muestra.

- Extracción “Dried Blood Spots” (A.A.C.E. - DBS).

Isidre Masana

Especialista Productes LC/MS

Agilent Technologies

Divisió Biociència i Anàlisi Químic

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¿Porqué Automatizar la Preparación de Muestra?

En algún punto, usted no podrá hacerlo bien sin automatización!

• Mantener la calidad de datos con una mayor capacidad de muestras.

• Reducir costes.

La solución para preparación en placas: Agilent AssayMAP Bravo. Una plataforma de

alto rendimiento para Manejo de líquidos + Preparación de muestra analítica mediante

Microcromatografia Cuantitativa.

Página 15

AssayMAP Bravo Head & Syringe: Microcromatografía

Preparativa en Placas de 96 posiciones

Bravo 96AM head with AssayMAP technology

• Direct displacement, ultra-low dead volume syringe with probe.

• Liquid handling via probes directly, through the cartridge.

• Unidirectional liquid handling through cartridges for fine control of separation and true, single pass, chromatography.

• Fully enabled for Bravo liquid handling – pipette tips can be pressed on the probe, partial head, deck accessories, ….

CO

N p

un

ta r

ell

en

ab

le

SIN

pu

nta

rell

en

ab

le

Relleno para

microcromatografía

Página 16

Cabezal con 96

puntas pipeta

9

Automatización Preparación Muestra en Placas: Bravo AssayMAp

DIY Captures

Streptavidin

Protein Digestion

Trypsin

Sample Clean Up

Reverse Phase

• Reverse Phase for sample clean up before LCMS

• Protein characterization workflows – Peptide mapping, Oxidation analysis.

• MALDI desalting & spotting steps.

• Streptavidin for Ab, antigen, protein/peptide, small molecule

capture for purification

• Anything that can be biotinylated can be immobilized

• Protein A for general Ab capture and Immunoprecipitation

• Used in all of the targeted workflows – protein purification and characterization.

• Trypsin for rapid, on-column digestion

• Protein characterization workflows – Peptide mapping, Oxidation analysis

General Ab Capture

Protein A

Immunoprecipitation

Protein A

Se puede también combinar con la estación Encore Multispan

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The Encore Multispan Liquid Handling System

Feature Set

Expanded Pipetting Deck

• Sample from tube or plate based formats

• Ample deck space for locating accessories, labware, and more

• Maximize integration capabilities through removable sections of the

deck

• Process more samples in parallel (x8 en 2 grupos independientes de 4)

Intelligent Software

• 3D workflow simulator / Drag & drop interface increases productivity by making configuration and

optimization quick and easy

• Auto calibration & one touch teaching gets you up and running quickly

• Scripting facilitates the creation of complex protocols. Forms allow for customized user interfaces

Permite interaccioar

con el “exterior”

Preparación de muestra en Tubos o Placas

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10

Flexible Multispan Pipetting

• Cherry pick ~2x more samples by spanning in 2 directions

• Variable and independent pipette spacing for addressing all labware

types

• Transfer the correct amount of liquid with pressure based liquid level and

clot detection

Automatización: The Encore Multispan

Liquid Handling System Feature Set

Built-In Robotic Arm

• Robust management of labware both on and off deck

• Integrate more instruments with 21 inches of reach off each side

• No teaching required on deck. One touch teaching for simple movement

programming off deck

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Ejemplo de Automatización Flujos de Trabajo

Preparación de muestra LC/MS

• Samples that require many separation steps prior to sampling by the LC/MS

• Applications in pain management experience high sample volume

• An Encore Multispan system can feed multiple LC/MS systems without any manual

separations

Puede combinarse con el robot AssayMap Bravo para preparaciones de

muestra que requieran el uso de microcromatografia preparativa.

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11

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Reduzca sus Costes Operacionales y

Aumente su Productividad en LC/MS

mediante las Tecnologías:

- RapidFire (µSPE/MS)

- Automatización:

- Preparación de muestra.

- Extracción “Dried Blood Spots” (A.A.C.E. - DBS).

Isidre Masana

Especialista Productes LC/MS

Agilent Technologies

Divisió Biociència i Anàlisi Químic

Sistema LC/MS Agilent Automatizado de Extracción en

Línea de Tarjetas con Gotas de Sangre (DBS: Dried Blood Spots - AACE System)

Muestreo

1. Colectar ~ 15 mL sangre

2. depositar en la tarjeta.

Análisis

1. Extracción en línea de parte de la

mancha (NO requiere preparación muestra).

2. Análisis por LC/MS

Dispone de almacén/

dispensador de tarjetas

Ahorra de costes de transporte, almacenamiento y preparación de muestra

Página 22

12

Informe Cuantitativo Incluyendo Imágenes de Antes y

Después de la Extracción

Pre Extraction Image

Post Extraction Image

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Reduzca sus Costes Operacionales y

Aumente su Productividad en LC/MS

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- RapidFire (µSPE/MS)

- Automatización:

- Preparación de muestra.

- Extracción “Dried Blood Spots” (A.A.C.E. - DBS). Isidre Masana

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¿Preguntas?