1

TD2: PCR

• Rappel • Détermination des conditions (amorces, t°C d’hybridation)• RT-PCR• PCR et séquençage• PCR quantitative

Module 9: B. BrunelSeptembre 2007

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Le principe de la PCR (rappel)

= amplification génique« clonage in vitro » 100 pb-3 kb max 5 kb(standard), long PCR kits ---> 35 Kb

Kary Mullis, prix nobel 1993

outil incontournable

avantages: simple, rapide, très sensible, peu de matériel, peu de purification

3

4

Programmation d’un thermocycleur pour PCR:

4

32

1

1. Dénaturation 2. hybridation 3. polymérisation95°C des amorces 72°C

Thyb?

4. nombre de cycles: 20-40

5

Elaboration des amorces

Détermination de la taille optimale desamorces

Exercice n°7» A noter: longueur des amorces pour une

amplification spécifique

Choix des séquences des amorcesExercice n°8a

» Savoir déterminer les amorces sens et antisens

6

Détermination de la T° d’hybridation

Exercices n°8bTm: t° où 50% de l’ADN est double brinFormule empirique Tm = 4(G+C) + 2(A+T)Température d’hybridation:

= min (Tm1, Tm2) - 4°CTm diminue de 1 à 1,5°C par % de différence

si une base diffère: 1/20 ---> 5%

7

Mésappariement possible, mais pas n’importe où (5’ = 3’)

Vitesse d’élongation: env. 1,5-4 Kb/min--->1 Kb/min

Eviter bases complémentaires entre amorces et à l’intérieur de l’amorce (struct secondaire)

Eviter séquences répétées

T° de fusion proche entre amorces

% GC de 40-60

8

Transcriptase inverse

Amplifier l’ARN: la RT-PCR

9

PCR et séquençage:

une amorcematrice

+ dNTP

1. Dénaturation 95-96°C2. Hybridation 50-55°C3. Polymérisation 60-70°C

n= 25 cycles

---> amplification linéaire

10

• structure of a dNTP (déoxynucléotide)

• structure of a ddNTP (didéoxynucléotide)

O

BASE (A, T, G, C)

HO

OPOPOP C

O O O

O- O- O-

O-

OH

O O O

O

BASE (A, T, G, C)

OPOPOP C

O- O- O-

O-

OH

5 ’

3 ’

11

C A G T

12

(Polyacrylamide)

13

Quantifier l’ADN: la PCR quantitative

96 Replicates

-1.00E-01

4.00E-01

9.00E-01

1.40E+001 6

11 16 21 26 31 36

Cycle Number

Analyse temps réel

Analyse point Final

Detection de fluorescence au cours d’une PCR

14

Ex: la chimie Taqman

5’3’

5’5’3’

5’

Amorce sens

Amorce anti-sens

Sonde TaqMan®

R Qp

FRET

Quenching

QuencherReporter

1ère étape: Hybridation de la sonde• Une sonde 20-40NT•Amplifier un petit fragment 75-80NT, pas de chevauchement

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2. Polymérisation

3. Clivage de la sonde(activité nucléase) etémission de fluorescence (500 nm)

4. Fin de polymérisation

PCR en temps réel: émission de fluorescence proportionnelle à la quantité d’ADN amplifié

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Système de détection

Intégré dans un seul instrument

Détection en temps réel des produits de PCR

Detection de lafluorescence

PCRde L'échantillon

Preparation Analyse spécifique à l'application

ABI Prism 7700

500 nmBloc PCR

Signal analysépar ordinateur

Fibres optiques

multiplexeur

caméra

17

Plusieurs types de fluorophores possibles

Q

18

Profil d’amplification de la PCRq

Ct: cycle au cours duquel démarre la phaseexponentielle de la PCR:

-2.00E-02

0.00E+00

2.00E-02

4.00E-02

6.00E-02

8.00E-02

1.00E-01

20 22 24 26 28 30

96 replicats

CYCLE SEUIL(Ct)

Seuil de Détection(Threshold)

Nombre de cycles

Phase exponentielle

Intensité de fluorescence

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Ct est proportionnel au nombre de cibles à amplifierCt est reproductible d’une amplification à l’autre

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Equation de l’amplification de la PCR

Xn = Xo x (1 + Ex)n

Xn = nombre de cibles au cycle nXo = nombre initial de molécules ciblesEx = efficacité de la PCRn = nombre de cycles de PCR

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Détermination d’une courbe standardCt = a x log (Qté ADN cible) + b

Ex = [10 1/a - 1] x 100

Pente efficacité de la PCR (p=3,32 -> E=100%)

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Application: dosage de transgènes• Préparation de 2 gammes étalon

– détermination de la qté d’ADN total– détermination de la qté d’ADN transgénique

Exercice n°33

quantité ADN total (ng) 200 100 50 25 5 2,5quantité ADN transgénique (ng) 4 2 1 0,5 0,1 0,05

Amplification d’une séquence du transgèneCt Ct

Amplification d’un gène de référence

Ct = a x log (Qté ADN total) + b

Ct = a’ x log (Qté ADN transgénique) + b’

log (Qté ADN transgénique (ng))log (Qté ADN total (ng))

% d’OGM contenu dans l’échantillon = Qté d’ADN transgénique/Qté totale d’ADN x 100

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Exercice 33