SONDA MARCATA FLUORESCENT

Nedelcu Alina Larissa Alexandra

Seria C , grupa 15

Sonda ADN este o secventa de ADN marcata fluorescent sau radioactiv ce este folosita pentru identificarea unei gene.

Poate fi vizualizata cu ajutorul microscopului cu florescenta , ce absoarbe lumina cu o anumita lungime de unda si emite lumina cu o lungime de unda mai mare decat cea absorbita.Daca un astfel de component este iluminat cu o lumina pe care o absoarbe , apoi vizualizat utilizand un filtru ce permite doar trecerea luminii emise, acesta lumina va starlucii pe un camp intunecat , astfel ca si o cantitate infima este detectata.

TEHNICA PCR Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o

tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN si care consta  in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.Produsul PCR care reprezinta o copie a ADN/ARN tinta original este denumit amplicon. Aceasta metoda permite detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentratii foarte scazute ale secventei tinta.

Astfel PCR cantitativ utilizează agenți chimici fluorescenti ce pot fi împărțiti în două tipuri: sonde fluorescente și coloranți fluorescenti.

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:1. Denaturarea: in urma incalzirii amestecului de reactie la 94ºC, ADN-ul tinta este separat (denaturat) in 2 catene;2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scaderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor atasa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabila in prezenta Mn2+ si a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina si deoxiuridina) va extinde primerii atasati in lungul matritei tinta si va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un numar stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublandu-se cantitatea de amplicon ADN.

La randul sau, procesul global de amplificare desfasurat de-a lungul unui numar definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficienta de 100% a reactiei);- Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze;- Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.

Metodele PCR traditionale (conventionale) au la baza o detectie a produsilor PCR in faza de platou a procesului (detectie end-point). In ultimii ani, tehnologia PCR a fost revolutionata prin dezvoltarea metodelor de detectie in faza exponentiala (detectie in timp real: real-time PCR).Tehnologia real-time PCR prezinta numeroase avantaje fata de cea conventionala:

- acuratete mai mare a rezultatelor obtinute (efectuarea detectiei se realizeaza in faza de crestere exponentiala a amplificarii, comparativ cu tehnica PCR conventional, unde detectia are loc in faza  de platou, dupa ce reactia a fost stopata iar produsii au inceput sa se degradeze)- domeniu de linearitate mult extins (sunt necesare mai putine dilutii ale probelor);- limita inferioara de detectie mult imbunatatita (se pot detecta cantitati mai mici ale ADN-ului tinta, avantaj esential, spre exemplu, in evaluarea raspunsului virusologic sustinut la pacientii cu hepatita cronica cu virus C.

Cele 2 metode PCR se aplica la efectuarea urmatoarelor teste:- Real-time PCR: determinarea cantitativa a viremiei la pacientii infectati cu virusurile hepatice B sau C; analiza mutatiei factorului V Leiden si a mutatei protrombinei;- PCR conventional: detectia calitativa a tipurilor oncogene ale  virusului papilomatozei umane (HPV).

Determinarea cantitativa a viremiei – are la baza 2 procese majore:- pregatirea probei pentru a izola ADN-VHB;- amplificarea PCR a ADN-ului tinta cu detectia simultana a sondei oligonucleotidice dublu marcate clivate specifice tintei.Cuantificarea viremiei se realizeaza cu ajutorul unei secvente ADN neinfectioase denumita Quantitation Standard (QS). ADN QS cu un numar cunoscut de copii este adaugat in fiecare proba si parcurge aceleasi etape de preparare a probei, amplificare PCR si detectie, ca si secventa tinta. QS contine secvente VHB cu zone identice de legare a primerilor ca si ADN-ul tinta, dar cu o zona unica de legare a sondei de detectie care permite diferentierea ampliconului QS de ampliconul tintei. Analizorul calculeaza concentratia ADN-VHB prin comparararea semnalului tintei cu semnalul QS din fiecare proba si controale.In cazul tehnologiei real-time PCR, amplificarea se face in prezenta unui sistem raportor care emite fluorescenta. Detectia se realizeaza cu ajutorul sondelor de tip 5’ nucleaza-sonde TaqMan, dublu marcate: la un capat cu o substanta fluorofora si la celalat capat cu o molecula blocanta . Cat timp sonda este intacta, fluorescenta sistemului R va fi inhibata de molecula Q. In cazul in care amplificarea este eficienta, moleculele de ADN nou formate vor fixa prin hibridizare sonda TaqMan; in cursul etapei de elongatie, ADN polimeraza Taq va degrada sonda prin activitatea sa enzimatica de 5’ endonucleaza si va elibera astfel fluoroforul.

Energia emisa de fluorofor in urma excitarii in UV va fi inregistrata

la sfarsitul fiecarui ciclu de amplificare, fiind proportionala cu

cantitatea de ADN tinta prezenta in tub pana in momentul

respectiv. Sondele HBV si HBV QS sunt marcate cu fluorofori R

diferiti, permitand inregistrarea independenta a emisiilor lor.

HIBRIZITATEA FLUORESCENTA

Hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) este o tehnică de citogenetică moleculară utilizată în scopul identificării anomaliilor cromozomiale, numerice şi structurale.

Principiul acestei metode constă în ataşarea la secvenţa-ţintă a unei sonde de ADN monocatenar marcată fluorescent, pe baza complementarităţii, de o secvenţă-ţintă a unui cromozom. Hibridizarea sondei cu ADN-ul celular este vizualizată la microscopul cu fluorescenţă echipat cu filtre de excitaţie şi emisie, ceea ce permite citirea semnalelor specifice zonei-ţintă. Se numără şi se analizează semnalele prezente în o sută de celule (de ex., trei semnale fluorescente specifice pentru cromozomul 21 indică sindromul Down).

FISH INTERFAZIC – PREZENTA A TREI SEMNALE ROŞII INDICA TRISOMIA 21 (DOWN)

FISH metafazic –

Prader Willi

Mai multe sindroame dismorfice (sindromul Williams, Prader Willi, Angelman, Di George) produse de microdeleţii sau microduplicaţii, suspectate clinic, imposibil de observat prin tehnicile citogenetice convenţionale, pot fi evidenţiate prin FISH metafazic. Întrucât această metodă presupune ca primă etapă de lucru obţinerea unor culturi celulare (limfocite din sânge periferic sau amniocite recoltate prin amniocenteză în săptămânile 15-17 de sarcină), rezultatul investigaţiei este obţinut în două săptămâni.

FISH-ul interfazic permite punerea în evidenţă a anomaliilor numerice, detecţia sexului genetic într-un timp scurt (48-72 h). Se realizează pe nuclei interfazici fără să fie nevoie de efectuarea de culturi celulare. Se folosesc sonde de ADN corespunzătoare regiunilor centromerice ale cromozomilor 18, X, Y (CEP18, CEPX, CEPY), respectiv sonde locus specifice pentru cromozomii 13 şi 21 (LSI13, LSI21). Metoda este mai puţin informativă în cazul contaminării cu celule materne (comparativ cu alte tehnici).

Analiza FISH este o metodă specifică, performantă, dar laborioasă, care necesită celule intacte; nu se substituie celorlalte metode de analiză cromozomială şi are indicaţii foarte precise. FISH-ul interfazic este indicat a fi folosit ca test de screening rapid atunci când există semne de alertă ecografică sau biochimică (dublu test, triplu test), iar ulterior se recomandă o evaluare citogenetică completă.

INTREBARI