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XXIV Jornadas Técnicas de laAETC | Octubre2012 |

Análisis de Micotoxinasen cerealesPaul Aguiar.

R-Biopharm España S .A.


Análisis de Micotoxinas en cereales

Int roducción

Legislación

Técnicas analíticas

Conclusiones



Micotoxinas

Toxinas producidas por mohos, de modo natural,

presentes en productos agrícolas: cereales.

Son metabolitos secundarios.

La mayoría de las micotoxinas de interés son

producidas por tres géneros de mohos:

ê Aspergillus

ê Penicillium

ê Fusarium

Int ro ducció n


Int ro ducció n

Micotoxinas

Se conocen miles de metabolitos tóxicos producidos por mohos.

Han sido detectadas más de 200 micotoxinas en cereales.

AFLATOXINAS

Af latoxinas B1 G1 B2 G2.

Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus.

Cereales, frutos secos, higos y especias.

Aflatoxina M 1.

OCRATOXINA

Ocratoxina A.

Penicillium verrucosum, Aspegillus ochraceous.

Maíz, cebada, trigo, avena, café, uvas, cacao y especias.



Int ro ducció n

FUM ONISINAS

Fumonisinas B1 B2.

Fusarium verticilloides.

Cereales, principalmente maíz.

TRICOTECENOS

DON (Vomitoxina), Toxina T-2 & HT-2.

Fusarium spp.

Trigo, cebada y maíz, en Europa y USA.

ZEARALENONA

Fusarium grammineum.

Trigo, cebada avena y maíz.

ALCALOIDES DEL CORNEZUELO

Claviceps spp.

Centeno, trigo y cebada.


Factores que influyen en la producción de micotoxinas

Biológicos

•V ariedades

•M ohos toxigénicos

Ambient ales

•T emperatu ra

•Hu medad

•Plagas

Cosecha

•M adu rez

•Secado

•Daño mecáni co

Almacenamient o

•Hu medad

•T emperatu ra

•A ireación

•Plagas

Mohos MicotoxinasTemperatura

Humedad (aw)

Prevención Variedades resistentes Prácticas agronómicas (GAP)

Tecnología post-cosecha Transporte / Almacenamiento

Int ro ducció n



Exposición a las micotoxinas

Prevenir la presencia de micotoxinas en alimentos:

Evit ar la formación de micotoxinas en materias primas.

Análisis de micotoxinas materias primas.

Prevenir la aparición durante transporte y almacenamiento.

Control de alimentos para consumo humano y piensos.

Int ro ducció n


Micotoxicosis: enfermedad provocada por la exposición a micotoxinas.

Efectos de las micotoxinas

Efectos tóxicos agudos observables en situaciones excepcionales.

Efectos crónicos por exposición prolongada.

Factores que influyen en la toxicidad:

Tipo de micotoxina y su toxicidad.

S inergia ent re micotoxinas.

Ingest a y exposición.

Individuales.

Int ro ducció n

Edad Media: En Europa: Ergotismo.

Producida por ingest a de Claviceps purpúrea.

Años ‘60: En Reino Unido: Enfermedad “X” de los pavos.

Producida por harina de cacahuetes con Aspergillus Flavus.

Los lis i ados . Piet er Brueghel, el v iej o. 1568.M useo del Louv re ( París)



Efectos de las micotoxinas en animales

Estudios experimentales han permitido determinar diversos efectos:

Inmunológicos Aflatoxinas, Tricotecenos, Ocratoxina A.

Hemorrágicos Aflatoxinas, Tricotecenos.

Hepatotóxicos Aflatoxinas, Ocratoxina A, Fumonisinas.

Nefrotóxicos Ocratoxina, Tricotecenos, Fumonisinas.

Reproductivos Fumonisinas, ciertos Alcaloides del cornezuelo.

Teratógenos Aflatoxina B1, Ocratoxina A, Toxina T-2, Zearalenona.

Neurotóxicos Deoxinivalenol, Fumonisinas, Alcaloides del cornezuelo.

Cancerígenos Aflatoxinas, Ocratoxina A, Fumonisinas.

Dermatológicos varios Tricotecenos.

Int ro ducció n


Efectos de las micotoxinas en humanos

Grupo 4: probablement e no cance rígeno

Grupo 3: no clasificado como cance rígeno

Grupo 2B: posiblement e cance rígeno

Grupo 2A: probablement e cance rígeno

Grupo 1: cancerígeno

Clasificación de IARC

Grupo 3Toxinas T-2 & HT-2

Grupo 3Zearalenona

Grupo 2BOcrat oxina A

Grupo 2BFumo nisinas B1 B2

Grupo 3Deoxinivalenol

Grupo 2BAflat oxinaM 1

Grupo 1Aflat oxinas B1 B2 G1 G2

Clasificación de las micotoxinas

Agencia Internac ional para la Investigac ión del Cáncer (IARC)

Int ro ducció n

Existen evidencias de los efectos en humanos pero en muchos casos los

posibles efectos son consecuencia de extrapolar los efectos en animales.

Los efectos dependen de la toxicidad y la exposición.



Legislació n

Legislación sobre micotoxinas


Legislació n

Legislación europea sobre micotoxinas

Af latoxinas Todos loscereales y todos losproductos abasedecereles.

Maízy arroz.

Aliment os abasedecereales t ransformadosy aliment os para lactant es.

Semillas oleaginosas, frutos secos,frut as pasas, especias

Leche cruda, leche para la fabricación de productos lácteos.

REGLAMENTO (EU) Nº 165/2010 de la COMISIÓN de 26 de febrero.

Ocratoxina A Cereales no elaborados.

Todos losproductosderivadosdecereales no elaborados, incluidos losproductost ransformados a basedecereales y los cereales dest inados alconsumo humano direct o.

Glut en det rigo no dest inado a la vent a directa al consumidor.

Aliment os elaborados abasedecereales y alimentos infant iles para lactant es.

Uv as pasas,vinos y bebidas a base dev ino, mosto deuv a,zumo deuv a.

Especias, café tost ado y soluble, regaliz.

REGLAMENTO (EU) Nº 594/2012 de la COMISIÓN de 5 de julio.

REGLAMENTO (EU) Nº 1881/2006 de la COMISIÓN de 19 de diciembre.



Legislació n

Legislación europea sobre micotoxinasDeoxinivalenol (DON) Cereales no elaborados queno seant rigo duro, avena y maíz.

Trigo duro y avena no elaborados.

Maíz no elaborado, excepto el dest inado a moliendaporvía húmeda.

Cereales dest inados al consumo humano directo, harina decereales, salvado y germen comoproducto final comercializado para el consumo humano directo.

Past a seca.

Pan, past eles, gallet as, aperit ivosdecereales y cereales para desayuno.


Fracciones demolienda del maíz.

Zearalenona Cereales no elaborados dist intosdel maíz.

Maíz no elaborado excepto el dest inado a molienda porvía húmeda.

Cereales dest inados al consumo humano directo, harina decereales, salvado y germen comoproducto final comercializado para el consumo humano directo.

Aceit edemaíz refinado.

Pan, past eles, gallet as, aperit ivosdecereales y cereales para desayuno.

Maízdest inado alconsumo humano direct o, aperit ivosdemaíz y cereales para desayuno a basedemaíz.




Legislació n

Legislación europea sobre micotoxinas

REGLAMENTO (EU) Nº 1126/2007 de la COMISIÓN de 28 de sept iembre.

Fumonisinas Maíz no elaborado excepto el dest inado a molienda porvía húmeda.

Maízy aliment os a basedemaíz dest inados al consumo humano directo.

Cereales para el desayuno abasedemaíz y aperit ivosdemaíz.



Legislación de micotoxinas en alimentación animalAf latoxina B1

Materias primas para piensos.

Piensos complement arios y completos.

Piensos compuestos para v acas lecheras y terneros,ovejas lecheras y corderos, cabras lecheras ycabritos, lechones y aves de corral jóv enes.

Piensos compuestos para bov inos,ovinos, caprinos, porcinos y av es de corral.

Cornezuelo del centeno Materias primas para piensos y piensos compuestos que contienen cereales no molidos.

REGLAMENTO (EU) Nº 574/2011 de la COMISIÓN de 16 de junio.

Co nt enido m áxim o en mg/kg en pienso s calculadosobre la base de un co nt enido de hum edad del 12%.



Legislació n

Legislación europea sobre toma de muest rasREGLAMENTO (EU) Nº 401/2006 de COMISIÓN de 23 de febrero

Control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios.

El muestreo tiene un papel fundamental en la precisión de la determinacióndel contenido de micotoxinas.

Definiciones:

• Lote

• Sublote

• Muestra elemental

• Muestra global

• Muestra de laboratorio

Método de muestreo para los cereales y productos a base de cereales.

Método de muestreo para alimentos infantiles y alimentos elaborados a basede cereales para lactantes y niños de corta edad.

“Guidance document for the sampling of cereals for mycotoxins” (EC, 2010).


Legislació n

Toma de muestras



30.000 t >>> 300 g

Legislació n

Toma de muestras

Muestra: 300 g

30.000 t

300 g


Legislació n

Toma de muestras: dist ribución heterogénea

500 ppm

Dist ribución real en el lote

Co rt esía de K. Esbensen (AAUE)



Legislació n



1000 ppm



Legislació n


5000 ppm





Legislació n


10000 ppm (1%)


Af latoxina B1 en cereales y productos a base de cereales: 2 ppb (0,002 ppm).Co rt esía de K. Esbensen (AAUE)


Toma de muestras

Procedimiento para el control de micotoxinas en un lote

LotePreparac iónde muest ra

Toma demuest ra

Análisis

Error TM Error PM Error A

La variabilidad asociada al control de productos en grano, para determinar micoto-xinas, no permite determinar la verdadera concentración de un lote con un 100% decerteza.

La reducción de la variación asociada a cada etapa permite realizar una estimaciónmás precisa de la concentración verdadera de micotoxinas en un lote.

Error Tot al

El error asociado a la toma de muestra es notablemente mayor que los errores aso-ciados a la preparación de la muestra y el análisis de la misma.

Legislació n



Técnicas an alít icas

Técnicas analíticas para determinar micotoxinas

Recuento de mohos

Recuento Micotoxinas




Detección bajo luz UV

Detección de fluorescencia verde-amarillenta, producidapor un metabolito co-sintetizado con las Aflatoxinas.




Cromatograf ía en capa f ina

(TLC)

Cromatograf ía de líquidos

(HPLC-FLD, HPLC-UV, LC-MSMS)

Enzimoinmunoensayos

(LFD, ELISA)

Fluorimetría





Enzimoinmunoensayos (formato tarjet a)

Ant icuerpos

monoclonales

Ant icuerpos

monoclonales

Ant icuerpos

monoclonales

Ocrat oxina AAflatoxinas

B1, B2, G1, G2

Aflatoxina B1

OCHRACARD®AFLACARD® TotalAFLACARD® B1

Rápido: result ados en 15 minutos.

Sencillo: prueba cualitativa de interpretación visual de resu ltados.

Flex ible: diferentes límites en diversas matrices ( 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20 y 30 ppb)

Fiable: buena correlación de result ados con HPLC.




Rida® QUICK Af latoxin

Rida® QUICK DON

Rida® QUICK Fumonisin

Rida® QUICK Zearalenone

Enzimoinmunoensayos (LFD: dispositivo de flujo lateral)

Rida® QUICKDON Quant



Rápido: result ados en 15 minutos.

Sencillo: ensayo cuantitat ivo empleando lector.



75 ~ 500 ppb5 min.10 min.Zearalenona

0,8 ~ 10 ppm5 min.10 min.Fumonisin

0,25 ~ 5,50 ppm5 min.10 min.DON

4 ~ 75 ppb5 min.10 min.Af latoxin

Rango de medidaIncubaciónExtracciónRida® QUICK

Enzimoinmunoensayos (LFD: dispositivo de flujo lateral)

Flex ible: amplio rango de medida.

Fiable: buena correlación con ELISA y HPLC.




Enzimoinmunoensayos (ELISA)

RIDASCREEN® FAST (48 pocillos/5 patrones): piensosy cereales (materias primas)

RIDASCREEN® (96 pocillos/6 patrones): alimentosy alimentación infant il.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

RIDASCREEN® Aflatoxinas Totales

Aflatoxina B1

Aflatoxina M1

Ocratoxina A

Citrinina

Zearalenona

DON (Vomitoxina)

Toxina T2 & HT-2

Fumonisinas





Enzimoinmunoensayos (ELISA Sandwich)

Detecta y cuantifica la concentración de micotoxinas.

Anticuerpo de captura y un anticuepo conjugado con un enzima.

Sustrato cromogénico para detectar el anticuerpo conjugado.

Medida espectrofotométrica mediante lector de placas (450 nm).

Cuantifica resultados respecto a curva de calibración.

Positiv oNegativ o

Anticuerpos





Anticuerpos

Micotoxina

Matriz

Positiv oNegativ o

EConjugado EE

EE E

EE

EE

EE

Sustrato

Muestra/Standard

Incubar

Lavado

Conjugado

Incubar

Lavado

Sustrato

IncubarEE






Muestra/Standard

Incubar

Lavado

Conjugado

Incubar

Lavado

Sustrato

Incubar

Solución parada

Lectura




0/0,1/0,2/0,4/0,8/1,6 ppb3,50 ppbT-2 Toxin

0/3,7/11,1/33,3/100 ppb18,5 ppbDeox inivalenol

0/50/150/450/1350/4050 ppt1750 pptZearalenone

0/0,025/0,074/0,222/0,666/2 ppm25 ppb.Fumonisin

0/50/100/300/900/1800 ppt1,25 ppbOchratoxin A

0/0,5/1,5/4,5/13,5/40,5 ppb1,75 ppbAflatoxin Total

0 /1/5/10/20/50 ppb1,00 ppbAflatoxin B1

Valores de patronesL.O.D.RIDASCREEN® (96 p.)

RIDASCREEN®

Det erminación cuant it at iva de micotoxinas en aliment osy aliment ación infant il.

L.O.D para cer eales.





0/0,222/0,666/2/6 ppm222 ppbFumonisin

0/50/100/200/400 ppb50,0 ppbT-2 Toxin

0/0,222/0,666/2/6 ppm222 pppDeox inivalenol (DON)

0/50/100/200/400 ppb50,0 ppbZearalenone

0/5/10/20/40 ppb5,00 ppbOchratoxin A

0 /1,7/5/15/45 ppb1,70 ppbAflatoxin

Valores de patronesL.O.D.RIDASCREEN® FAST (48 p.)

RIDASCREEN® FASTDet erminación cuant it at iva de micotoxinas en piensos y cereales (mat erias p rimas)

L.O.D para cer eales.


Columnas de inmunoaf inidad


Solvente qu edesnatu raliza

los anticu erposy eluyen las

micotoxinas

Ant icu erposret ienen y

con centran lasmicotoxinas

Extracto demu estra sepasa por lacolu mna

Ant icu erpos

M atriz

M icotoxinas

Fiable: anticuerpos monoclonales.

Rápido: purifica el extracto de muestra en 20 minutos.

Flex ible: aplicaciones específicas para diferentes matrices.

Sensible: Bajo %CV, buenas recuperaciones y LOD < legislación EU.

Preparativa previa para determinar micotoxinas por HPLC-FLD, LC-MSMS.








HPLC-FLD LC-MSMS

AFLAPREP® DZT MS-PREP®




AFLAPREP® (Aflatoxinas B1 B2 G1 G2)

AFLAPREP® M (AflatoxinaM 1)

OCHRAPREP® (Ocrat oxina A)

AFLAOCHRA PREP® (Aflatoxinas y Ocrat oxina A)

EASI-EXTRACT® Zearalenone (Zearalenona)

DONPREP® (Deoxiniv alenol/Vomitoxina)

EASI-EXTRACT® T-2 & HT-2 (Toxinas T-2 & HT-2)

FUMONIPREP® (Fumonisinas)

AO ZON PREP® (Aflat oxinas, Ocrat oxina A y Zearalenona)

DZT MS-PREP® (Deoxiniv alenol, Zearalenona y Toxinas T-2 & HT-2)

TRILOGY Pat rones de micotoxinas

TRILOGY M at eriales de referencia





Los efectos en humanos son generalmente crónicos no agudos.

Co nclusio nes

Las micotoxinas pueden causar efectos adversos en la salud humana y animal.

Conclusiones

La presencia está condicionada por el tipo de moho, sustratoy factores externos.

La toma de muestra repercute de manera significativa en la determinación del con-tenido de micotoxinas en un lote. La muestra debe ser representativa del lote.

Consecuencias económicas en el comercio decereales y en la productividad de losanimales.

La contaminación puede ocurrir en el campo, durante la cosecha, el transporte y elalmacenamiento.

La reducción es posible aplicando buenas prácticas agrícolas (GAP) y buenas prác-ticas defabricación (GMP).

R-Biopharm dispone de diversas técnicas para el análisis de micotoxinas en cereales.

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Graciaspor su atención

p.aguiar@r-biopharm. es

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