QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRÀ HOA VÀNG...

Vietnam J. Agri. Sci. 2017, Vol. 15, No. 12: 1664-1678 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2017, 15(12): 1664-1678 www.vnua.edu.vn

1664

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRÀ HOA VÀNG (Camellia sp.)

Đặng Quang Bích1, Nguyễn Thị Phương Thảo

2, Nguyễn Văn Phú

3, Đinh Trường Sơn

4,

Ninh Thị Thảo4, Nguyễn Văn Huấn

1, Trần Văn Lin

5, Nguyễn Thị Thùy Linh

4*

1Viện Sinh - Nông, Đại học Hải Phòng

2Công ty Đầu tư Phát triển Sản xuất Nông nghiệp VinEco 3Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

4Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

5K58, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Email*: [email protected]

Ngày gửi bài: 29.08.2017 Ngày chấp nhận: 31.01.2018

TÓM TẮT

Trà hoa vàng (Camellia sp.) là cây dược liệu quý chứa nhiều hợp chất có hoạt tính dược lý có khả năng chống

viêm, phòng và điều trị ung thư. Trà hoa vàng cũng được sử dụng như là cây cảnh do hoa có màu vàng, sáng, đẹp

đặc trưng. Nghiên cứu này đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro cây trà hoa vàng được thu thập tại

huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam. Vật liệu ban đầu tốt nhất được xác định là quả trà hoa vàng. Quả được

khử trùng với dung dịch NaOCl 7% trong thời gian 30 phút sau đó được tách lấy hạt và gieo trên môi trường MS bổ sung 1 mg/l BA và 3 mg/l GA3 để hạt nảy mầm, tạo chồi. Chồi in vitro được nhân nhanh trên môi trường MS + 5 mg/l

BA + 1 mg/l GA3 + 300 ml/l nước dừa + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar cho hệ số nhân 4,7 lần/chồi, chất lượng chồi tốt.

Các chồi sau đó được cấy chuyển lên môi trường 1/4 MS + 0,5 mg/l α - NAA + 2 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 7 g/l

agar để tạo cây hoàn chỉnh với tỷ lệ ra rễ 100%. Ở giai đoạn vườn ươm, cây trà hoa vàng in vitro được trồng trên giá

thể cát đạt tỷ lệ sống 93,75% sau 12 tuần ra cây. Các kết quả nghiên cứu này có thể được áp dụng cho mục đích

nhân nhanh và bảo tồn giống trà hoa vàng tại Ba Chẽ - Quảng Ninh.

Từ khoá: Camellia sp., nhân nhanh in vitro, trà hoa vàng.

Establishment of In vitro Propagation Protocol for Golden Camellia (Camellia sp.)

ABSTRACT

Golden camellia (Camellia sp.) is a medicinal plant containing a wide range of pharmacologically active

compounds that can be used in anti-inflammatory, prevention and treatment of cancer. Golden camillia is also used

as an ornamental plant because of its bright yellow flowers. This study successfully established in vitro

multipropagation protocol of Camellia sp. collected at Ba Che district, Quang Ninh province, Vietnam. Unopened

fruits were identified as the best initial material. Unopened fruits were surface sterilized with 7% NaOCl solution for 30

minutes. Seeds were then placed on MS medium supplemented with 1 mg/l BA and 3 mg/l GA3 for germination.

Shoots were multiplied on MS media containing 5 mg/l BA + 1 mg/l GA3 + 300 ml/l coconut water + 30 g/l sucrose + 7

g/l agar. The rate of shoot multiplication was 4.7 shoots per explant. The shoots were then transferred onto medium

of 1/4 MS + 0.5 mg/l α-NAA + 2 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar for rooting. At the nursery stage, in vitro plants

were grown in sand and reached the survival rate of 93.75%. The established protocol can be applied for

multipropagation and conservation of the golden camellia.

Keywords: Camellia sp., golden camellia, in vitro propagation.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trà hoa vàng (Camellia sp.) là thực vêt hät

kín thuüc hö chè (Theaceae). Bên cänh giá trị

làm cây cânh, trà hoa vàng được đðc biût quan

tâm do chứa nhi÷u hợp chçt có hoät týnh dược lý

có vai trò quan tröng trong phòng chùng lão hoá,

ung thư (Song et al., 2011; Batra & Sharma,

2013; Lin et al., 2013).

Đặng Quang Bích, Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Văn Phú, Đinh Trường Sơn,

Ninh Thị Thảo, Nguyễn Văn Huấn, Trần Văn Lin, Nguyễn Thị Thùy Linh

1665

Täi Quâng Ninh, trà hoa vàng (Camellia

sp.) vùn là loäi cây möc tự nhiên ở Ba Chô và

Hoành Bø. Do là cåy dược liûu quý, có giá trị

kinh tø cao nên trà hoa vàng bị khai thác gæn

như cän kiût trong khi khâ nëng tái sinh ngoài

tự nhiên kém. Chính vì vêy, cæn phâi có biûn

pháp góp phæn bâo tøn cũng như phát triùn

giùng trà quý này trở thành sân phèm mũi nhön

cÿa địa phương.

Các phương pháp nhån giùng như giåm

cành, ghòp cành và ghòp cåy con đã được sử

dụng với mục tiêu nhân nhanh cây giùng trà

hoa vàng. Tuy nhiön, các phương pháp này có

nhi÷u hän chø như: hû sù nhân thçp, không có

sïn vêt liûu trøng thích hợp, phụ thuüc vào thời

vụ, tþ lû sùng ở vườn ươm thçp, tỷ lû cành ra rú

thçp, thời gian từ khi giâm cành tới khi ra rú

kéo dài (Klee et al., 1987; Kuhlemeiere et al.,

1987; Hooykaas & Schilperoort, 1992; Smith &

Hood, 1995; Mondal et al., 2004). Kỹ thuêt nhân

giùng vô tính in vitro cho phép nhân nhanh cây

giùng với hû sù nhân cao, cây giùng đøng đ÷u, có

thù cung cçp müt cách chÿ đüng sô khíc phục

được những hän chø cÿa các phương pháp nhån

giùng kù trên.

Nhân giùng in vitro müt sù loài thuüc chi

Camellia như Camellia japonica, C. reticulate,

C. sinensis và C. nitidissima đã được thực hiûn

(Lü et al., 2013; Mondal, 2014). Täi Viût Nam,

nghiên cứu nhân giùng vô tính in vitro trà hoa

vàng sô góp phæn cung cçp cây giùng phục vụ

sân xuçt, giâm tình träng khai thác dược liûu

quý này ngoài tự nhiön cũng như góp phæn bâo

tøn nguøn gen loài trà quý này.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng các méu cçy là

đoän cành bánh tó mang mít ngÿ, lá, nụ hoa và

quâ cây trà hoa vàng (Camellia sp.) thu thêp täi

Ba Chô, Quâng Ninh. Quâ trà thu ở thời kì bít

đæu chín, quâ chưa mở và hät đã chuyùn hoàn

toàn sang màu đen. Các chøi in vitro thu được

từ giai đoän vào méu, nuôi cçy khởi đüng sô

được sử dụng làm vêt liûu nghiên cứu cho các

thí nghiûm tiøp theo.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Khử trùng méu: Méu cçy được rửa säch

dưới vòi nước máy, sau đó rửa läi trong nước xà

phòng nøng đü 0,01% trong 3 - 4 læn, mûi læn 5

phþt và được tráng läi bìng nước cçt vô trùng.

Méu sau đó được ngâm trong dung dịch KMnO4

1% trong 10 phút và tráng 3 - 4 læn bìng nước

cçt vô trùng. Méu sau khi rửa säch được đưa

vào tÿ cçy vô trùng, ngâm trong dung dịch

ethanol 70% trong 1 phþt và được tráng läi bìng

nước cçt vô trùng 3 - 4 læn (Gorbatyuk et al.,

2015). Các méu sau đó được líc trong hoá chçt

khử trùng HgCl2 0,1% hoðc H2O2 15% hoðc

NaOCl 7% trong 5 - 30 phút (Bâng 1, 2) và cuùi

cýng được rửa läi bìng nước cçt vô trùng 3 - 4

læn. Đùi với méu quâ trà, sau khi khử trùng,

quâ trà được tách bô vô đù thu lçy hät. Méu cçy

sau khử trùng được cçy trön m÷i trường MS

(Murashige & Skoog, 1962).

Nuôi cçy khởi đüng: Hät trà hoa vàng được

nuôi cçy trön m÷i trường MS bú sung BA và GA3

đù kích thích quá trình nây mæm và sinh trưởng

cÿa chøi (Bâng 3). Các chøi in vitro này sau đó

sô được sử dụng làm vêt liûu cho giai đoän nhân

nhanh chøi.

Nhân nhanh chøi in vitro: Chøi có chi÷u cao

từ 2,0 - 2,5 cm và 2 - 3 lá được sử dụng làm vêt

liûu cho thí nghiûm đánh giá ânh hưởng cÿa n÷n

m÷i trường đøn hû sù nhân nhanh chøi. Các môi

trường n÷n được sử dụng trong thí nghiûm này

là m÷i trường MS, 1/2 MS (hàm lượng cÿa tçt câ

các thành phæn giâm müt nửa so với m÷i trường

MS), m÷i trường WPM (Lloyd & McCown, 1980),

m÷i trường 1/2 WPM (hàm lượng cÿa tçt câ các

thành phæn giâm müt nửa so với m÷i trường

WPM). Các chøi sau đó được nuôi cçy trên môi

trường n÷n tùt nhçt có bú sung các chçt đi÷u tiøt

sinh trưởng và nước dừa với các nøng đü khác

nhau (Bâng 5, 6).

Täo rú cho chøi in vitro: Các chøi có chi÷u

cao 3,5 - 4 cm có từ 3 tới 5 lá, sinh trưởng và

phát triùn bình thường được cçy chuyùn sang

m÷i trường có thành phæn MS thay đúi (MS, 1/2

MS, 1/4 MS), có bú sung 0,5 mg/l - NAA và 2

mg/l IBA đù kích thích täo rú.

Quy trình nhân giống in vitro cây trà hoa vàng (Camellia sp.)

1666

M÷i trường và đi÷u kiûn nuôi cçy in vitro:

Sử dụng m÷i trường MS hoðc WPM có bú sung

3% sucrose, các chçt đi÷u tiøt sinh trưởng, hợp

chçt hữu cơ khác nhau tuỳ theo thí nghiûm, pH

m÷i trường 5,8. Các m÷i trường được khử trùng

ở 121ºC trong 20 phþt. Đi÷u kiûn nuôi cçy gøm

cường đü ánh sáng 2.000 lux, đü èm 60%, nhiût

đü 25 ± 2ºC, chu kỳ chiøu sáng 16 h sáng/8 h tùi.

Ra cåy ngoài vườn ươm: Cây in vitro hoàn

chþnh, khôe mänh, có chi÷u cao đät từ 6 - 8 cm

được rửa säch agar và trøng trên 4 loäi giá thù

khác nhau. Sử dụng giá thù là đçt đøi tæng B lçy

täi rừng Hoành Bø, Quâng Ninh (Nguyún Như

Hà và cs., 2005), trçu hun, xơ dừa, cát (cát sông

Høng). Giá thù được xử lý bìng KMnO4 1 - 2%,

sau đó đóng vào chêu nhựa 40 x 70 cm. Cåy được

đðt trong nhà lưới, che phÿ bìng nylon và lưới

che råm. Lưới che râm có khâ nëng cân 70% ánh

sáng. Tưới nước giữ èm 3 læn/ngày trong tháng

đæu tiên và 2 læn/ngày từ tháng thứ 2. Tưới thúc

bìng phån bón vi sinh MT được sân xuçt bởi

Công ty cú phæn Nông nghiûp MTX Viût Nam, với

lượng 10 - 15 kg/360 m2 ríc đ÷u phân xung

quanh gùc tưới nước đÿ èm cho phân ngçm dæn,

phân bón qua lá pha 5 - 10 g/8 lýt nước phun đ÷u

trên lá, thân và sung quanh gùc, phân bón Nano

NPK HP 666 cÿa Công ty sân xuçt phân bón Hâi

Phòng, däng viön được bón đ÷u dưới gùc với lượng

14 túi nhô/chêu 40 x 70 cm, sau 15 - 20 ngày

chuyùn cåy ra vườn ươm với nøng đü tëng dæn từ

0,4 - 1%, định kỳ 10 ngày/læn.

Bù trí thí nghiûm và xử lý sù liûu: Các thí

nghiûm trong phòng thí nghiûm được bù trí theo

kiùu ngéu nhiên hoàn toàn, mûi công thức nhíc

läi 3 læn, mûi læn 10 méu. Các thí nghiûm ngoài

vườn ươm được bù trí theo khùi ngéu nhiön đæy

đÿ, mûi công thức nhíc läi 3 læn, mûi læn 100

méu, theo dõi sau 12 tuæn ra cây. Sù liûu được

xử lý thùng kö theo chương trünh Excel và

IRRISTART 5.0.

3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN

3.1. Tạo vật liệu khởi đầu

Khi tiøn hành nghiên cứu müt quy trình

nhân nhanh cÿa bçt kü đùi tượng cây trøng nào

cũng cæn phâi có müt sù lượng lớn méu khởi đæu

với chçt lượng đøng đ÷u. Do vêy, viûc xác định

loäi méu cçy và chø đü khử trùng phù hợp có vai

trò quan tröng trong viûc täo được các vêt liûu

ban đæu cho nghiên cứu. Các vêt liûu này phâi

đâm bâo säch vi sinh vêt và có khâ nëng phát

sinh hünh thái như täo chøi, callus hay phôi.

Trong nghiên cứu này, các vêt liûu và chø đü

khử trýng khác nhau đã được khâo sát nhìm

tìm ra vêt liûu và đi÷u kiûn khử trùng cho tþ lû

bêt chøi cao và chøi hình thành sớm.

3.1.1. Ảnh hưởng của hóa chất và thời gian

khử trùng tới hiệu quâ tạo vật liệu khởi đầu

Đoän cành mang mít ngÿ được sử dụng phú

biøn trong giai đoän täo vêt liûu khởi đæu trong

nuôi cçy mô tø bào thực vêt. Trong nghiên cứu

này, køt quâ xử lý đoän cành mang mít ngÿ với

các hoá chçt với thời gian khử trùng khác nhau

cho thçy tþ lû méu bị nhiúm nçm khá cao (Bâng

1). Khi thời gian khử trýng tëng lön thü méu bị

nhiúm cũng giâm xuùng nhưng vén còn khá cao,

khoâng 60 - 65% với méu đã được xử lý trong 30

phút. Tþ lû nhiúm nçm cao này có thù do trong

thân cây trà hoa vàng trong tự nhiên có nçm nüi

sinh và cüng sinh giùng như cåy trà C. japonica

(Osono, 2008). Do vêy, khi tëng thời gian xử

lý, hoá chçt khử trùng có thù thèm thçu vào

bên trong méu, làm giâm tþ lû nhiúm nçm

xuùng nhưng vén không thù tiêu diût được

hoàn toàn nçm nüi sinh và cüng sinh bên

trong. Tuy nhiên, viûc tëng thời gian khử trùng

có thù làm giâm tþ lû sùng cÿa méu (Danso et

al., 2011). Trong nghiên cứu này, khi thời gian

khử trýng tëng lön cũng khiøn tþ lû méu sùng

giâm xuùng và các méu säch thu được cũng

không có méu nào có khâ nëng bêt được chøi.

Køt quâ thí nghiûm túng hợp bâng 1 cho

thçy, tçt câ méu cçy sau khử trùng bìng ba

chçt khử trùng khác nhau đ÷u chưa tái sinh

täo chøi. Mðc dù vêy, méu cçy sau khi khử

trùng bìng NaOCl có biùu hiûn khôe mänh, có

sức sùng hơn các chçt khử trýng khác như H2O2

15% và HgCl2 0,1%. Như vêy, mðc dý đã sử

dụng tới ba tác nhân khử trùng và 5 thời

gian khử trùng khác nhau, viûc täo nguøn

vêt liûu ban đæu säch vi sinh vêt (đðc biût là



1667

Bâng 1. Hiệu quâ tạo nguồn vật liệu ban đầu từ đoạn cành mang mắt ngủ

Chất khử trùng Thời gian khử trùng (phút)

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu sạch vi sinh vật tái

sinh tạo chồi (%)

NaOCl 7% 10 100 95 0

15 100 85 0

20 90 65 0

25 80 35 0

30 60 15 0

H2O2 15% 10 100 90 0

15 100 80 0

20 80 55 0

25 70 45 0

30 65 20 0

HgCl2 0,1% 10 100 85 0

15 100 75 0

20 80 55 0

25 75 35 0

30 60 15 0

Ghi chú: Bảng kết quả dựa trên số liệu được thu thập sau 8 tuần nuôi cấy

Hình 1. Đoạn cành mang mắt ngủ được khử trùng

bằng NaOCl 7% bị nhiễm nấm sau 1 tuần nuôi cấy

nçm) từ đoän cành mang mít ngÿ cÿa cây trà

hoa vàng là không có tính khâ thi.

3.1.2. Khâo sát sự tái sinh của các loại vật

liệu nuôi cấy tới hiệu quâ tạo nguồn vật

liệu ban đầu

Sau khi täo vêt liûu khởi đæu từ đoän cành

không thành công, các loäi méu cçy khác gøm

lá, nụ hoa và hät được tiøp tục thử nghiûm.

Khâo sát ban đæu cho thçy, so với H2O2 15% và

HgCl2 0,1% thì NaOCl 7% cho tþ lû méu sùng cao

hơn. Khử trýng đoän cành với H2O2 15% và

HgCl2 0,1% làm méu cçy bị hoá nâu (køt quâ

kh÷ng được trình bày). Chính vì vêy, ở thí

nghiûm này NaOCl 7% được sử dụng đù khử

trùng vêt liûu.

Sù liûu bâng 2 cho thçy, viûc khử trùng

bìng dung dịch NaOCl 7% trong thời gian từ 5

phþt đøn 30 phút không mang läi hiûu quâ tùt

với vêt liûu lá và nụ hoa. Khi được xử lý trong

thời gian ngín từ 5 - 10 phút, các méu lá và nụ

hoa vén còn xanh, tươi nhưng läi bị nhiúm nçm.

Tuy nhiön, khi tëng thời gian khử trùng lên thì

tþ lû méu có hiûn tượng thåm đen, hòo kh÷, và

chøt tëng lön. Sau 2 ngày nu÷i cçy, nhi÷u méu

bít đæu xuçt hiûn hû sợi nçm màu tríng. Toàn

bü vêt liûu lá và nụ hoa sau khử trùng không có

khâ nëng phát sinh täo chøi.


1668

Bâng 2. Ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy tới hiệu quâ tạo nguồn vật liệu ban đầu

Vật liệu khử trùng Thời gian khử trùng

(phút) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu sống (%)

Tỉ lệ mẫu sạch vi sinh vật tái sinh tạo chồi (%)

Lá 5 100 100 0

10 100 80 0

15 85 75 0

20 65 45 0

25 40 10 0

Nụ hoa 5 100 100 0

10 100 85 0

15 70 65 0

20 65 40 0

25 50 20 0

Hạt 10 66,7 100 33,3

15 53,3 100 46,7

20 20,0 100 80,0

25 6,7 100 93,3

30 0,0 100 100

Ghi chú: Bảng kết quả dựa trên số liệu thu thập sau 8 tuần nuôi cấy

Bâng 2 cũng cho thçy, trong khi viûc khử

trùng méu lá và nụ hoa gðp nhi÷u khó khën thü

viûc sử dụng hät trà hoa vàng läi cho køt quâ

khâ quan. Tþ lû hät säch vi sinh vêt đät thçp

nhçt là 66,7% với tþ lû nây mæm 33,3% khi quâ

được khử trùng trong 10 phút. Khi tëng thời

gian khử trùng thì tþ lû nhiúm giâm, tþ lû méu

säch nây mæm cũng tëng lön. Hät thu từ quâ đã

được khử trùng với NaOCl 7% trong 30 phút cho

tþ lû nhiúm là 0% với 100% méu sùng và nây

mæm sau 8 tuæn nuôi cçy. Trong nhân giùng in

vitro các loài thuüc chi Camellia, nhi÷u nghiên

cứu cũng đã sử dụng hät làm vêt liûu cho nuôi

cçy khởi đüng, chîng hän như nhån nhanh in

vitro C. sinensis (Mondal et al., 1998) hay C.

piquetiana (Nguyún Vën Køt và cs., 2014).

Trong nghiên cứu cÿa nhóm tác giâ Mondal et

al. (1998), hät C. sinensis được khử trùng bìng

NaClO 4% trong 10 phþt. Trong khi đó, Nguyún

Vën Køt và cs. (2014) đã khử trùng hät C.

piquetiana bìng Ca(OCl)2 7% trong 20 phút.

Thời gian khử trùng ở câ hai công bù trön đ÷u

ngín hơn so với công thức tùt nhçt ở nghiên cứu

này (30 phút), tuy nhiên, các công bù này läi

Hình 2. Cây nây mầm từ hạt trà hoa vàng được khử trùng

bằng NaOCl 7% sau 12 tuần nuôi cấy



1669

kh÷ng đ÷ cêp đøn tþ lû nhiúm cÿa méu. Nguyún

Vën Køt và cs. (…..) đã xác định tþ lû nây mæm

cÿa hät C. piquetiana 30 ngày tuúi đät 100%

sau 60 ngày nuôi cçy. Tþ lû này tương đương với

tþ lû nây mæm cÿa công thức tùt nhçt ở nuôi cçy

này. Từ các køt quâ trên, có thù køt luên rìng

vêt liûu tùt nhçt cho nuôi cçy khởi đüng là hät

được thu từ quâ trà hoa vàng chưa mở, được khử

trùng với NaClO 7% trong 30 phút.

3.1.3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và GA3 tới

quá trình nây mầm của hạt trà hoa vàng

Thí nghiûm trön đã chþ ra hät là vêt liûu tùt

nhçt cho nuôi cçy khởi đüng. Chø đü khử trùng

tùt nhçt cho hät cũng đã được xác định. Tuy

nhiên, thời gian nây mæm và tùc đü phát triùn

cÿa chøi còn tương đùi dài. Viûc bú sung chçt

đi÷u tiøt sinh trưởng đù kích thích nây mæm cÿa

hät và sinh trưởng cÿa chøi trong nuôi cçy mô là

khá phú biøn. Trong nghiên cứu nhân nhanh

cây C. nitidissima, Huang et al. (2016) đã tiøn

hành đánh giá ânh hưởng riêng rô cÿa BA và

GA3 lên sự nây mæm cÿa hät. Nhóm tác giâ trên

đã sử dụng m÷i trường MS có bú sung BA với

nøng đü 1,0 và 3,0 mg/l và GA3 với nøng đü 0,5

và 1,0 mg/l. Tþ lû nây mæm cÿa hät trên môi

trường tương ứng là 40,7%, 61,5%, 52,8% và

82,4%. Chi÷u cao trung bình cÿa chøi trên môi

trường bú sung 1,0 mg/l GA3 là 1,53 cm sau 60

ngày nuôi cçy. Dựa vào køt quâ cÿa công bù

trên, nghiên cứu này đã tiøn hành đánh giá ânh

hưởng cÿa tú hợp BA và GA3 đøn sự nây mæm

cÿa hät trà hoa vàng.

Køt quâ bâng 3 cho thçy, tþ lû hät trà hoa

vàng nây mæm trên tçt câ các công thức là

100%, chi÷u cao và sù lá/chøi tþ lû thuên với

nøng đü GA3 được bú sung vào m÷i trường. Trên

n÷n m÷i trường MS + 1 mg/l BA, không bú sung

GA3 cho chi÷u cao chøi trung bünh đät 0,6 cm và

sù lá/chøi là 3,4 lá, trong khi đó, các c÷ng thức có

bú sung GA3 vào m÷i trường đ÷u làm tëng chi÷u

cao chøi, sù lá/chøi. M÷i trường MS + 1 mg/l BA

+ 3 mg/l GA3 cho chøi sinh trưởng phát triùn tùt

nhçt, chi÷u cao trung bünh đät 2,5 cm, 4,6

lá/chøi, lá có bân to dõp, gân lá rõ ràng, mép lá

hünh rëng cưa, lá möc cách với khoâng đ÷u

nhau. Khi hät được gieo trön m÷i trường được bú

sung 1 mg/l BA và 5 mg/l GA3 thì chøi xuçt hiûn

biøn däng, thân và lá phình to, lá möng, mép lá

nhïn, không có gân lá. Bên cänh đó, viûc bú

sung thêm GA3 giúp rút ngín thời gian nây

mæm cÿa hät, chþ còn 15 - 21 ngày so với 30

ngày trön m÷i trường chþ chứa 1 mg/l BA. Thời

gian nây mæm cÿa hät được nuôi cçy trên môi

trường có bú sung 1 mg/l BA và 3 mg/l GA3

tương đương với hät được nuôi cçy trên môi

trường có bú sung 1 mg/l BA và 5 mg/l GA3. Như

vêy, so sánh v÷ các chþ tiöu được đ÷ cêp trên

bâng 3 thü m÷i trường có bú sung 1 mg/l BA køt

hợp 3 mg/l GA3 và m÷i trường bú sung tú hợp 1

mg/l BA và 5 mg/l GA3 cho hiûu quâ tương

đương, ngoäi trừ chþ tiêu chi÷u cao chøi. Tuy

nhiên, do chøi trön m÷i trường bú sung 1 mg/l

BA và 5 mg/l GA3 có kiùu hình dị däng nên MS

+ 1 mg/l BA + 3 mg/l GA3 được lựa chön là công

thức tùt nhçt ở thí nghiûm này.

Bâng 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và GA3 tới sự nây mầm của hạt trà hoa vàng

Công thức BA (mg/l) GA3 (mg/l) Thời gian nảy mầm

(ngày) Tỉ lệ nảy mầm (%) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi

Đc 1 0 30 100 0,6 3,4

1 1 1 21 100 1,9 3,6

2 1 3 15 100 2,5 4,6

3 1 5 15 100 3,3 4,7

LSD0,05 0,14 0,15

CV% 3,4 1,9

Ghi chú: Bảng kết quả dựa trên số liệu được thu thập sau 8 tuần nuôi cấy.


1670

A B C

Hình 3. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và GA3 tới quá trình nây mầm của hạt trà hoa vàng

Ghi chú: A. Phôi hạt trên môi trường bổ sung 1 mg/l BA; B. Phôi hạt trên môi trường bổ sung 1 mg/l BA + 1 mg/l GA3; C. Phôi

hạt trên môi trường bổ sung 1 mg/l BA + 3 mg/l GA3

3.2. Nhân nhanh chồi

3.2.1. Ảnh hưởng của nền môi trường tới

quá trình sinh trưởng của chồi in vitro cây

trà hoa vàng

Mûi loài, giùng và loäi vêt liûu có nhu cæu

dinh dưỡng khác nhau, chính vì vêy, thí nghiûm

này được thực hiûn nhìm tüm ra m÷i trường n÷n

phù hợp cho nuôi cçy in vitro trà hoa vàng Ba

Chô. Sau 8 tuæn nuôi cçy trön m÷i trường 1/2

WPM, chøi sinh trưởng thçp nhçt, chþ đät chi÷u

cao trung bình là 2,1 cm, sù lá trung bình là 1,3

lá/chøi, chøi mânh, lá nhô, dài, hû sù nhân chþ

đät 1,0 læn. Trên n÷n m÷i trường WPM, hû sù

nhân chøi và các chþ tiêu chi÷u cao, sù lá có tëng

so với m÷i trường 1/2 WPM nhưng chøi vén nhô,

mânh, lá nhô, dài và xoën. Chøi được cçy trên

m÷i trường 1/2 MS có chçt lượng tùt hơn m÷i

trường WPM, có kých thước trung bình, lá bình

thường, kh÷ng xoën, tuy nhiön chi÷u cao cũng

như sù lá thçp hơn m÷i trường MS. Trên môi

trường MS, chøi sinh trưởng và phát triùn tùt

nhçt và cho các chþ tiöu theo dõi đ÷u vượt trüi so

với 3 m÷i trường khác. Cụ thù, hû sù nhån đät

1,2 læn, sù lá trung bünh đät 3,3 lá/chøi, chi÷u

cao trung bình chøi đät 3,1 cm/chøi.

Nhi÷u nghiên cứu trön các đùi tượng khác

nhau thuüc chi Camellia đã chþ ra rìng môi

trường MS là phù hợp cho sự sinh trưởng cÿa

chøi. Cụ thù, Nakamura (1987) đã køt luên rìng

m÷i trường MS là tùt nhçt cho sự nhân nhanh

chøi C. sinenesis khi so sánh với các m÷i trường

n÷n khác bao gøm m÷i trường B5 (Gamborg et

al., 1968) và m÷i trường Nitsch & Nitsch (1969).

Trước đó, Carlisi & Torres (1986) cũng chþ ra

rìng m÷i trường MS và 1/2 MS là m÷i trường tùt

nhçt cho nuôi cçy C. japonica. Tuy nhiên, theo

nghiên cứu cÿa Vieitez et al. (1989), C. japonica

cv. Alba Plena läi có khâ nëng tái sinh kòm trön

m÷i trường MS. Nguyún Vën Køt và cs. (2014)

cũng đã tiøn hành nghiên cứu v÷ sự sinh trưởng

cÿa chøi C. piquetiana trên 5 loäi n÷n môi

trường khác nhau MS, 1/2 MS (đa lượng), 1/2

MS (đa lượng + vi lượng), WPM, 1/2 WPM. Køt

quâ cho thçy n÷n m÷i trường WPM là thích hợp

nhçt cho sự sinh trưởng và phát

Bâng 4. Ảnh hưởng của môi trường nền tới sự sinh trưởng của chồi trà hoa vàng

Công thức Nền môi trường Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá)

1 MS 1,2 3,1 3,3

2 1/2 MS 1,0 2,2 2,1

3 WPM 1,1 2,9 2,2

4 1/2 WPM 1,0 2,1 1,3

LSD0,05 0,1 0,2 0,19

CV% 4,5 3,8 4,2




1671

triùn cÿa chøi. Bên cänh đó, San - Josee &

Vieitez (1990) cũng đã tiøn hành nghiên cứu

ânh hưởng cÿa n÷n m÷i trường tới sự sinh

trưởng và phát triùn cÿa cây C. reticulate in

vitro và cũng køt luên n÷n môi trường WPM là

phù hợp cho sự phát triùn cÿa cây chè này. Các

køt quâ nghiên cứu trên chứng tô các loài thuüc

chi Camellia thích hợp với n÷n m÷i trường nuôi

cçy khác nhau và viûc nghiên cứu tìm ra n÷n

m÷i trường phù hợp cho từng đùi tượng cây

trøng là cæn thiøt.

3.2.2. Ảnh hưởng của tổ hợp GA3 với BA,

kinetin và zeatin tới khâ năng nhân nhanh

chồi in vitro cây trà hoa vàng

BA, kinetin và zeatin là các chçt đi÷u tiøt

sinh trưởng thuüc nhóm cytokinin được biøt đøn

với tác dụng kích thích sự phân chia tø bào, ânh

hưởng đøn sự hünh thành và phån hóa cơ quan

cÿa thực vêt, đðc biût là sự phân hóa chøi. Do

vêy, các chçt đi÷u tiøt sinh trưởng này được sử

dụng khá phú biøn trong nhân nhanh in vitro

nói chung và các loài thuüc chi Camellia nói

riêng (Mondal, 2011; 2014). Bên cänh đó, GA3

cũng thường được bú sung vào m÷i trường nuôi

cçy nhìm nâng cao hû sù nhân chøi và chçt

lượng cÿa chøi. Nøng đü GA3 được sử dụng phú

biøn là 1 mg/l (Mondal, 2011; 2014). Chính vì

vêy, ở thí nghiûm này 1 mg/l GA3 đã được bú

sung vào môi trường cùng với BA hoðc kinetin

hoðc zeatin ở các nøng đü khác nhau nhìm xác

định sự ânh hưởng cÿa các tú hợp chçt đi÷u tiøt

sinh trưởng này đøn khâ nëng nhån nhanh chøi in

vitro cây trà hoa vàng.

Khâ nëng nhån nhanh in vitro chøi cây trà

hoa vàng trên môi trường bú sung 1 mg/l GA3

(đùi chứng) là rçt thçp, với hû sù nhân chþ đät

1,2 læn và chi÷u cao chøi đät 3,1 cm, sau 8 tuæn

nuôi cçy (Bâng 5). Køt hợp giữa 1 mg/l GA3 với

BA đã làm tëng đáng kù hû sù nhân chøi và chi÷u

cao chøi. Khi bú sung 1 mg/l GA3 và 2,5 mg/l BA

thì hû sù nhån nhanh đã đät 2,7 læn, chi÷u cao

chøi cũng tëng rõ rût, trung bünh đät 3,9 cm.

Trên n÷n m÷i trường MS + 1 mg/l GA3, càng tëng

Bâng 5. Ảnh hưởng của tổ hợp các chất điều tiết sinh trưởng

tới khâ năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa vàng

Công thức Nồng độ (mg/l) Nồng độ GA3 (mg/l) Hệ số nhân chồi (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá)

Đc 0 1 1,2 3,1 3,3

BA 1,0 1 1,6 3,9 4,1

2,5 1 2,7 3,9 4,1

5,0 1 3,2 3,7 6,0

7,5 1 2,2 2,8 4,2

10,0 1 2,0 2,4 3,3

Kinitin 1,0 1 1,4 3,3 3,5

2,5 1 1,9 3,6 4,1

5,0 1 2,6 3,3 5,3

7,5 1 2,0 2,6 4,0

10,0 1 1,8 2,5 3,1

Zeatin 1,0 1 1,3 3,4 3,3

2,5 1 2,1 4,2 4,9

5,0 1 2,1 3,8 4,1

7,5 1 1,9 3,1 4,0

10,0 1 1,6 2,7 3,0

LSD0,05 0,1 0,18 0,14

CV% 3,1 3,3 2,0



1672

tëng nøng đü BA lên thì hû sù nhân chøi càng

tëng, nhưng đøng thời chi÷u cao trung bình chøi

läi giâm dæn. Quan sát v÷ hình thái chøi cho

thçy, ở các m÷i trường đùi chứng và m÷i trường

có bú sung thêm BA với nøng đü dưới 7,5 mg/l thì

chøi phát triùn bình thường, lá däng bân dõp,

dài, gân lá rõ ràng, mép lá däng rëng cưa. Trong

khý đó, trön m÷i trường MS + 1 mg/l GA3 có bú

sung thêm 7,5 và 10 mg/l BA thì có sự thay đúi v÷

hình däng chøi và lá, chøi nhô kém phát triùn, lá

cuün tròn, xoën kh÷ng mở ra được. Như vêy,

trong các m÷i trường thử nghiûm nhìm đánh giá

ânh hưởng cÿa tú hợp BA và GA3 đøn nhân

nhanh chøi in vitro trà hoa vàng, m÷i trường

nuôi cçy thích hợp đù nhân nhanh chøi trà hoa

vàng là MS + 1 mg/l GA3 + 5 mg/l BA.

Các m÷i trường nhân nhanh in vitro cây trà

hoa vàng có chứa tú hợp 1 mg/l GA3 và kinetin

cho køt quâ khá tùt, nhưng kh÷ng cao bìng môi

trường có bú sung GA3 và BA tùi ưu. M÷i trường

bú sung kinetin đã làm tëng đáng kù hû sù nhân

chøi từ 1,4 - 2,6 læn và làm tëng chi÷u cao chøi

cũng như sù lá. Khi nøng đü kinetin tëng lön thü

có xu hướng tëng hû sù nhân chøi. M÷i trường

MS + 1 mg/l GA3 + 5 mg/l kinetin cho hû sù nhân

chøi đät cao nhçt là 2,6 læn nhưng chi÷u cao chøi

trung bình läi có xu hướng giâm còn 3,3 cm.

Bú sung zeatin cùng với 1 mg/l GA3 đã làm

tëng hû sù nhân, chi÷u cao chøi trung bình và sù

lá trung bình cao so với đùi chứng chþ bú sung 1

mg/l GA3. Hû sù nhân chøi đät cao nhçt là 2,1

læn và chi÷u cao chøi trung bünh đät 4,2 cm trên

m÷i trường MS + 1 mg/l GA3 + 2,5 mg/l zeatin.

Khi tëng nøng đü zeatin lên 5 mg/l, 7,5 mg/l và

10 mg/l thì hû sù nhân giâm dæn và chi÷u cao

chøi trung bünh cũng giâm dæn. Køt quâ thí

nghiûm cho thçy tú hợp zeatin với GA3 cho hiûu

quâ nhân chøi in vitro cây trà hoa vàng là thçp

hơn so với tú hợp GA3 với BA hoðc kinetin.

Các køt quâ trên cho thçy, ở thí nghiûm

này, m÷i trường nuôi cçy MS + 5 mg/l BA + 1

mg/l GA3 là phù hợp nhçt, cho hû sù nhân và cho

chçt lượng chøi trà hoa vàng Ba Chô tùt nhçt.

Chÿng loäi và nøng đü chçt đi÷u tiøt sinh trưởng

phù hợp với các đùi tượng cây trøng khác nhau

là khác nhau. Tú hợp chçt đi÷u tiøt sinh trưởng

BA và GA3 trên n÷n m÷i trường MS cũng đã

được lựa chön đù tiøn hành nhân nhanh müt sù

giùng chè C. sinensis. Nakamura (1987) đã phát

hiûn m÷i trường thích hợp nhçt cho nhân nhanh

chøi C. sinensis cv. Yabukita là MS + 1 mg/l BA

+ 1 mg/l GA3. Gonbad et al. (2014) nghiên cứu

trên C. sinensis (L.) O. Kuntze (Clone Iran 100)

đã køt luên m÷i trường MS + 3 mg/l BA + 0,5

mg/l GA3 là m÷i trường tùt nhçt cho giai đoän

nhån nhanh. Trong khi đó, San - Jose & Vieitez

(1990) läi cho rìng m÷i trường WPM + 2 mg/l

BA + 2 mg/l zeatin + 2 mg/l 2 - iP + 0,01 mg/l

IBA là m÷i trường phù hợp cho nhân nhanh in

vitro cây C. reticulate cv. ĒCaptain Rawesē.

A B C

Hình 4. Ảnh hưởng của các tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng

đến khâ năng nhân nhanh chồi in vitro trà hoa vàng

Ghi chú: A. Chồi in vitro trên môi trường MS + 5 mg/l BA + 1 mg/l GA3; B. Chồi in vitro trên môi trường MS + 5 mg/l kinetin +

1 mg/l GA3; C. Chồi in vitro trên môi trường MS + 2,5 mg/l zeatin + 1 mg/l GA3



1673

3.2.3. Ảnh hưởng của nước dừa tới khâ

năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa

vàng

Nươ c dư a là müt loäi dịch chiøt hữu cơ có

chư a ca c axit amin, axit hư u cơ, đươ ng, ARN,

ADN. Đë c biö t trong nươ c dư a co chư a như ng

hơ p chå t quan tro ng cho nuôi cå y in vitro la

myo - inositol, ca c hơ p chå t co hoa t ti nh auxin,

ca c glucozit cu a cytokinin. Nghiên cứu cÿa

Shantz & Steward (1952) chþ ra rìng viûc bú

sung nước dừa có tác dụng kích thích quá trình

nhân nhanh tø bào và m÷. Trong m÷i trường

gieo hät và m÷i trường nhân nhanh in vitro C.

sinensis cv. TV - 1 và C. sinensis cv. T - 78

Agarwal et al. (1992) và Jha & Sen (1992) đã

bú sung thöm 10% nước dừa cùng müt sù chçt

đi÷u tiøt sinh trưởng. Thí nghiûm này được

thực hiûn nhìm đánh giá viûc bú sung thêm

nước dừa vào m÷i trường nhân nhanh tùt nhçt

thu được từ thí nghiûm trên (MS + 5 mg/l BA +

1 mg/l GA3) có tác dụng tích cực đøn hiûu quâ

nhân nhanh chøi in vitro trà hoa vàng Ba Chô

hay không. Køt quâ được trình bày ở bâng 6.

Køt quâ sù liûu trên bâng 6 cho thçy, trên

công thức đùi chứng (MS + 5 mg/l BA + 1 mg/l

GA3, không bú sung nước dừa), chøi có kích

thước trung bünh, lá bünh thường, kh÷ng xoën,

hû sù nhân chøi đät 3,2 læn, chi÷u cao trung

bình và sù lá læn lượt là 3,7 cm và 6,0 lá/chøi.

Khi bú sung nước dừa với nøng đü tëng dæn theo

từng công thức thì hû sù nhân và chi÷u cao chøi

trung bünh tëng dæn đøng thời chçt lượng chøi

cũng được câi thiûn, chøi to hơn, mêp và lá xanh

non hơn. Hû sù nhân và chi÷u cao chøi trung

bünh vượt trüi hơn hîn so với các công thức khác

khi m÷i trường được bú sung 300 ml/l nước dừa ở

công thức này cho hû sù nhån đät 4,7 læn và

chi÷u cao chøi trung bünh đät 3,4 cm. Trong

công thức này, chçt lượng chøi cũng tùt hơn,

chøi to, khôe, lá to, màu xanh đêm hơn. Khi bú

sung vào m÷i trường với hàm lượng nước dừa

lớn hơn đã dén tới hû sù nhân và chi÷u cao chøi

trung bình giâm, lá nhanh vàng, cây sinh

trưởng và phát triùn chêm hơn các c÷ng thức thí

nghiûm khác. Như vêy, viûc bú sung nước dừa

vào m÷i trường nuôi cçy có ânh hưởng tích cực

đøn hû sù nhân chøi cũng như chçt lượng cÿa

chøi in vitro. M÷i trường tùt nhçt cho giai đoän

nhân nhanh chøi ở nghiên cứu này là MS + 5

mg/l BA + 1 mg/l GA3 + 300 ml/l nước dừa.

3.3. Giai đoạn tạo cây hoàn chînh

3.3.1. Ảnh hưởng của hàm lượng môi

trường đến khâ năng ra rễ của chồi in

vitro cây trà hoa vàng

Giai đoän täo cây hoàn chþnh là giai đoän

cuùi cùng cÿa quá trình nhân giùng trong phòng

thí nghiûm. Mục đých cÿa giai đoän này là kích

thích sự phát triùn bü rú, täo cây hoàn chþnh

trước khi đưa ra vườn ươm. Các chçt đi÷u tiøt

sinh trưởng thuüc nhóm auxin như α - NAA,

IBA và thành phæn m÷i trường dinh dưỡng gøm

muùi đa lượng, vi lượng và vitamin đóng vai trò

quan tröng trong giai đoän này. α - NAA và IBA

Bâng 6. Ảnh hưởng của nước dừa tới khâ năng nhân nhanh chồi in vitro cây trà hoa vàng

Công thức Nước dừa (ml/l) Hệ số nhân chồi (chồi) Chiều cao chồi (cm/chồi) Số lá (lá/chồi)

Đc 0 3,2 3,7 6,0

1 50 3,3 4,0 6,2

2 100 3,8 4,0 6,5

3 200 4,0 3,6 6,9

4 300 4,7 3,4 7,2

5 400 3,3 2,6 4,7

LS5% 0,11 0,16 0,35

CV% 1,7 2,4 3,1

Ghi chú: Môi trường nền: MS + 5 mg/l BA + 1 mg/l GA3. Bảng kết quả dựa trên số liệu sau 8 tuần nuôi cấy


1674

Bâng 7. Ảnh hưởng của hàm lượng môi trường đến khâ năng ra rễ

của chồi in vitro cây trà hoa vàng

Công thức Môi trường Chất điều tiết sinh trưởng Tỉ lệ ra rễ (%) Số rễ (cái) Chiều dài rễ (cm)

1 MS 0,5 mg/l α - NAA + 2,0 mg/l IBA 0 0 0

2 1/2 MS 62,5 6,2 2,9

3 1/4 MS 100 14,0 3,5

LSD0,05 0,6 0,2

CV% 3,9 4,4

Ghi chú: Bảng kết quả dựa trên số liệu thu thập sau 12 tuần nuôi cấy

được sử dụng rçt phú biøn trong m÷i trường täo

rú cho chøi in vitro Camellia. Bên cänh đó, tác

đüng tích cực cÿa viûc giâm hàm lượng muùi

khoáng cũng đã được công bù trong nhi÷u nghiên

cứu trön các đùi tượng thuüc chi Camellia

(Mondal, 2011; 2014). Dựa trên các công bù này

cùng với các thí nghiûm thëm dò trước đó, thý

nghiûm này đánh giá ânh hưởng cÿa hàm lượng

muùi khoáng đøn sự ra rú cÿa chøi in vitro trà

hoa vàng Ba Chô trong m÷i trường có bú sung 0,5

mg/l α - NAA và 2 mg/l IBA.

Sù liûu bâng 7 cho thçy cây trà hoa vàng in

vitro khi nuôi cçy trên n÷n m÷i trường MS

không có sự phát sinh hình thành rú. Quan sát

hình thái cho thçy cåy sinh trưởng phát triùn

bünh thường nhưng rú kh÷ng được hình thành.

Khi giâm nøng đü môi trường MS xuùng chþ còn

1/2 và 1/4 lượng dinh dưỡng khoáng và vitamin

so với m÷i trường MS tiêu chuèn thì cây trà hoa

vàng in vitro đã phát sinh rú. Tþ lû cây ra rú

tëng dæn khi hàm lượng dinh dưỡng khoáng và

vitamin MS giâm dæn đøng thời sù rú và chi÷u

dài rú trung bünh cũng tëng theo. 100% cåy ra

rú trön m÷i trường 1/4 MS với sù rú trung bình

đät 14,0 rú và chi÷u dài rú trung bünh đät 3,5

cm. V÷ mðt hình thái, sù lượng rú phát sinh

nhi÷u, dài và nhanh hơn ở m÷i trường nghèo

dinh dưỡng hơn. Đøng thời khi cây in vitro ra rú,

cåy sinh trưởng khôe mänh hơn, lá cứng cáp,

không dị däng. Ânh hưởng tích cực cÿa môi

trường nghño dinh dưỡng đøn sự ra rú cÿa chøi

in vitro trong nghiên cứu này là phù hợp với

nhi÷u công bù v÷ m÷i trường ra rú cho chøi in

vitro cÿa các loài thuüc chi Camellia. Trong các

công bù này, n÷n m÷i trường phú biøn được sử

dụng là 1/2 MS hay 1/2 WPM (giâm toàn bü

thành phæn hoðc chþ giâm thành phæn khoáng,

hoðc chþ giâm thành phæn khoáng đa lượng

và/hoðc thành phæn vitamin biøn đúi) có hoðc

không bú sung thêm chçt đi÷u tiøt sinh trưởng

(Mondal, 2011; 2014). Theo nghiên cứu cÿa

Molina et al. (2013), m÷i trường thích hợp nhçt

cho giai đoän ra rú cÿa C. sinensis là 1/4 MS + 6

mg/l IBA. Mðc dù vêy, müt sù nghiên cứu trên

Camellia vén sử dụng m÷i trường đæy đÿ dinh

dưỡng trong giai đoän ra rú như MS và WPM.

Tuy nhiên các chøi in vitro này đ÷u đã được

nhúng với dung dịch IBA nøng đü cao (300 -

1000 mg/l) trong khoâng 15 - 30 phþt trước khi

cçy vào m÷i trường hoðc nuôi cçy trên môi

trường có bú sung IBA hoðc α - NAA nøng đü cao

(5 - 100 mg/l) trong 7 - 10 ngày trước khi

chuyùn sang m÷i trường không bú sung chçt

đi÷u tiøt sinh trưởng (Mondal, 2011; 2014). Tþ lû

ra rú cho chøi in vitro C. japonica cv. Alba Plena

đät 76% khi chøi được nhúng trong dung dịch

IBA 1.000 mg/l trong thời gian 15 phút và sau

đó được nu÷i trön m÷i trường WPM ở đi÷u kiûn

tùi trong 12 ngày trước khi chuyùn ra đi÷u kiûn

sáng. Nghiên cứu cÿa Jha & Sen (1992) đã chþ

ra rìng trön m÷i trường MS (đæy đÿ hoðc giâm

müt nửa thành phæn) không bú sung hoðc có bú

sung IBA (1 - 4 mg/l) thì chøi in vitro C.

sinensis cv. T - 78 không ra rú. Nhưng khi được

nuôi cçy trön m÷i trường MS có bú sung 100

mg/l IBA trong 10 ngày và sau đó chuyùn sang

m÷i trường MS không chứa chçt đi÷u tiøt sinh

trưởng thì tþ lû ra rú đät 80 - 90%. Trong các thí

nghiûm khâo sát đã thực hiûn ở nghiên cứu này,

chøi in vitro trà hoa vàng Ba Chô cũng đã được



1675

Cây trà hoa vàng in vitro hoàn chỉnh

Hình 5. Ảnh hưởng của hàm lượng môi trường nuôi cấy tới

quá trình ra rễ in vitro cây trà hoa vàng sau 12 tuần nuôi cấy

nhúng với IBA nøng đü cao (1.000 - 2.000 mg/l)

trong 30 phút và cçy lên môi trường MS không

bú sung chçt đi÷u tiøt sinh trưởng nhưng chøi

không ra rú (sù liûu kh÷ng được trünh bày). Như

vêy, có thù thçy mûi loài có phân ứng khác nhau

đùi với các đi÷u kiûn thành phæn dinh dưỡng,

chçt đi÷u tiøt sinh trưởng. Trong nghiên cứu

này, chøi trà hoa vàng Ba Chô ra rú tùt nhçt

trön m÷i trường 1/4 MS có bú sung 0,5 mg/l α -

NAA + 2,0 mg/l IBA.

3.4. Thích nghi cây ngoài vườn ươm

3.4.1. Ảnh hưởng của giá thể đến khâ năng

thích nghi của cây in vitro ngoài vườn ươm

Tüm được giá thù ra cây phù hợp là khâu

quan tröng trong quá trình nhân giùng cây in

vitro do giá thù là müt tröng những nhân tù

quyøt định tþ lû sùng và khâ nëng sinh trưởng

cÿa cây sau in vitro ngoài m÷i trường tự nhiên.

Thí nghiûm được tiøn hành trên 4 loäi giá thù

khác nhau, køt quâ được thù hiûn trên bâng 8.

Køt quâ thí nghiûm trên bâng 8 cho thçy tþ

lû sùng đät từ 31,25 - 93,75% trên 4 loäi giá thù,

trong đó giá thù đçt đøi cho tþ lû cây sùng và

sinh trưởng thçp nhçt, giá thù cát cho tþ lû cây

sùng cao nhçt và các chþ tiöu sinh trưởng khá

tùt. Giá thù køt hợp giữa đçt tæng B, trçu hun

và xơ dừa (1:1:1) cho các chþ tiöu sinh trưởng

cÿa cây là tùt nhçt, với chi÷u cao trung bünh đät

11,3 cm và 2,7 lá mới/cåy. Đçt đøi tæng B dú bị

Bâng 8. Ảnh hưởng của giá thể đến khâ năng thích nghi của cây in vitro ngoài vườn ươm

Công thức Giá thể Tỉ lệ sống (%) Chiều cao cây (cm) Số lá mới (lá)

1 Cát 93,75 10,2 3,2

2 Đất đồi 31,25 8,5 2,4

3 Đất tầng B, trấu hun, xơ dừa (1:1:1) 82,25 11,3 2,7

4 Đất tầng B, trấu hun, xơ dừa (1:1:1) và phân bón hữu cơ vi sinh MT

56,25 9,4 2,1

LSD0,05 0,56 0,13

CV% 2,80 2,60

Ghi chú: Bảng kết quả dựa trên số liệu thu thập sau 12 tuần ra cây


1676

Cây trà hoa vàng ngoài vườn ươm

Hình 6. Ảnh hưởng của giá thể tới khâ năng thích nghi cây in vitro

ngoài vườn ươm sau 12 tuần nuôi cấy

bí chðt sau khi tưới nước nhi÷u læn làm ânh

hưởng đøn quá trình hô hçp, lçy dinh dưỡng và

phát triùn hû rú cây con dén tới køt quâ là tþ lû

sùng cÿa cây con giâm. Giá thù cát thoát nước

tùt, không quá èm giúp cho rú hô hçp tùt hơn,

thích nghi và phát triùn nhanh dén tới tþ lû cây

sùng cao. Giá thù là đçt tæng B køt hợp với trçu

hun, xơ dừa hoðc phân bón hữu cơ vi sinh cho tþ

lû sùng khá cao nhưng trong quá trünh chëm sóc

cây dú nhiúm nçm bûnh làm cho rú cây con

không phát triùn được. Như vêy, giá thù tùt

nhçt đù ra cåy trà hoa vàng ngoài vườn ươm là

giá thù cát với tþ lû sùng là 93,75%.

Tþ lû sùng cÿa cåy in vitro ngoài vườn ươm

ngoài đi÷u kiûn v÷ giá thù còn chịu ânh hưởng

cÿa các yøu tù khác như chçt lượng cåy in vitro,

giùng/loài, chø đü chëm sóc, đi÷u kiûn nhà lưới.

Tþ lû cây sùng cÿa cây in vitro ngoài vườn ươm

trong nghiên cứu này cao nhçt đät 93,75% trên

giá thù cát, cao hơn so với køt quâ cÿa Gonbad

et al. (2014) khi nghiên cứu trên cây chè C.

sinensis (clone Iran 100) với tþ lû sùng là 65%

sau 60 ngày trøng trong nhà kính. Tuy nhiên, tþ

lû sùng này vén thçp hơn so với køt quâ trong

nghiön cứu cÿa Rajasekaran et al. (1996) trên

cây Camellia sp. với tþ lû cåy sùng khi trøng trön

giá thù đçt là 97%.

4. KẾT LUẬN

Nghiên cứu này đã xåy dựng thành công

quy trình nhân nhanh in vitro cây trà hoa

vàng. Vêt liûu khử trùng tùt nhçt là quâ chưa

tách vô. Công thức khử trùng tùt nhçt là sử

dụng dung dịch NaOCl 7% trong thời gian 30

phút cho tþ lû sùng đät 100%. Hät được tách ra

từ quâ trà hoa vàng đã khử trýng được cçy lên

m÷i trường MS bú sung 1 mg/l BA và 3 mg/l

GA3 là phù hợp cho sự nây mæm, täo nguøn vêt

liûu ban đæu. M÷i trường MS có bú sung 5 mg/l

BA, 1 mg/l GA3, 300 ml/l nước dừa, 30 g/l

sucrose, 7 g/l agar là m÷i trường nhân nhanh

tùi ưu cho hû sù nhân 4,7 læn/chøi, chi÷u cao

chøi đät 3,4 cm/chøi và sù lá mới 7,2 lá/chøi.

M÷i trường 1/4 MS có bú sung 0,5 mg/l α -

NAA, 2 mg/l IBA, 30 g/l sucrose, 7 g/l agar là

m÷i trường ra rú tùt nhçt, đät tþ lû ra rú 100%,

14 rú/chøi, chi÷u dài trung bình rú đät 3,4

cm/chøi. Giá thù ra cây phù hợp cho tþ lû cây

sùng cao nhçt là giá thù cát đät tỷ lû 93,75%.

Với hû sù nhân cao (4,7 læn/chøi), cây giùng

sinh trưởng khôe mänh, đøng đ÷u v÷ chçt

lượng, có thù áp dụng đù sân xuçt ở quy mô lớn

không phụ thuüc vào thời vụ, quy trình nhân

nhanh in vitro cây giùng trà hoa vàng thu thêp

täi Ba Chô - Quâng Ninh có thù được áp dụng



1677

trong thực tiún sân xuçt nhìm thay thø các

phương pháp nhån giùng truy÷n thùng khác,

góp phæn bâo tøn giùng trà hoa vàng quý này

täi Quâng Ninh.

TÀI LIỆU THAM KHÂO

Agarwal, B., U. Singh and M. Banerjee (1992). In vitro

clonal propagation of tea (Camellia sinensis (L.) O.

Kuntze). Plant Cell, Tissue and Organ Culture,

30(1): 1-5.

Batra, P. and A. K. Sharma (2013). Anti - cancer

potential of flavonoids: recent trends and future

perspectives. Biotech, 3(6): 439-459.

Carlisi, J. and K. Torres (1986). In vitro shoot

proliferation of Camellia ‘Purple Dawn’. Hort

Science, 21: 314.

Danso, K., E. Azu, W. Elegba, A. Asumeng, H. M.

Amoatey and G. Y. P. Klu (2011). Effective

decontamination and subsequent plantlet

regeneration of sugarcane (Saccharum officinarum

L.) in vitro. International Journal of Integrative

Biology, 11(2): 90-96.

Gamborg, O. L., R. A. Miller and K. Ojima (1968).

Nutrient requirements of suspension cultures of

soybean root cells. Experimental Cell Research,

50(1): 151-158.

Gonbad, R. A., U. R. Sinniah, M. A. Aziz and R.

Mohamad (2014). Influence of cytokinins in

combination with GA(3) on shoot multiplication

and elongation of tea Clone Iran 100 (Camellia

sinensis (L.) O. Kuntze). The Scientific World

Journal, pp. 1-9.

Gorbatyuk, I., A. Bavol, A. Holubenko and B. Morgun

(2015). Effect of synthetic auxin like growth

regulators on callus regenerative ability of

common wheat vc. Zymokara Biotechnologia

Acta, 8: 56-62.

Hooykass, P. J. and R. A. Schilerpoort (1992).

Agrobacterium and plant genetic engineering.

Plant Molecular Biology, 19(1): 15-38.

Jha, T. and S. Sen (1992). Micropropagation of an elite

Darjeeling tea clone. Plant Cell Reports, 11(2):

101-104.

Klee, H. J., R. Horsch and S. Rogers (1987).

Agrobacterium - mediated plant transformation and

its further application to plant biology. Annual

Review of Plant Physiology, 38: 467-486.

Kuhlemeier, C., P. J. Green and N. H. Chua (1987).

Regulation of gene expression in higher plants.

Annual Review of Plant Physiology 38: 221-257.

Lin, J. N., H. Y. Lin, N. S. Yang, Y. H. Li, M. R. Lee,

C. H. Chuang, C. T. Ho, S. C. Kuo and T. D. Way

(2013). Chemical constituents and anticancer

activity of yellow Camellias against MDA - MB -

231 human breast cancer cells. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 61(40): 9638 -

9644.

Lloyd, G. and B. McCown (1980). Commercially -

feasible micropropagation of mountain laurel,

Kalmia latifolia, by use of shoot - tip culture.

Combined Proceedings, International Plant

Propagators' Society, 30: 421-427.

Lü, J., R. Chen, M. Zhang, J. A. T. da Silva and G. Ma

(2013). Plant regeneration via somatic

embryogenesis and shoot organogenesis from

immature cotyledons of Camellia nitidissima Chi.

Journal of Plant Physiology, 170(13): 1202-1211.

Molina, S. P., H. Y. Rey, M. L. Pérez and L. A.

Mroginski (2013). Plant regeneration of tea

(Camellia sinensis) by in vitro culture of

meristems, axillary buds and uninodal segments.

Revista de la Facultad de Ciencias Agrarias,

Universidad Nacional de Cuyo, 45(1): 127-134.

Mondal, T. K. (2011). Camellia. Wild crop relatives:

Genomic and breeding resources. C. Kole,

Springer - Verlag Berlin Heidelberg, pp. 15-39.

Mondal, T. K. (2014). Micropropagation. Breeding and

biotechnology of tea and its wild species. New

Delhi, India, Springer, pp. 35-52.

Mondal, T. K., A. Bhattacharya, A. Sood and P. S.

Ahuja (1998). Micropropagation of tea (Camellia

sinensis (L.) O. Kuntze) using thidiazuron. Plant

Growth Regulation, 26(1): 57-61.

Murashige, T. and F. Skoog (1962). A revised medium

for rapid growth and bio assays with tobacco tissue

cultures. Physiologia Plantarum, 15(3): 473-497.

Mondal, T. K., A. Bhattacharya, M. Laxmikumaran, P.

S. Ahuja (2004). Recent advance in tea

biotechnology. Plant Cell, Tissue and Organ

Culture, 75: 795-856.

Nakamura, Y. (1987). Shoot tip culture of tea cultivar

Yabukita. Tea Research Journal, 65: 1-7.

Nguyễn Như Hà, Lê Thị Bích Đào, Vương Thị Tuyết

(2005). Giáo trình thổ nhưỡng, nông hóa. Nhà xuất

bản Hà Nội, tr. 26-27.

Nguyễn Văn Kết, Nguyễn Thị Cúc và Nguyễn Trung

Thành (2014). Khảo sát khả năng nhân giống cây

trà my hoa đỏ (Camellia piquetiana (Pierre) Sealy)

in vitro. VNU Journal of Science: Natural Sciences

and Technology, 30(3): 17-25.

Nitsch, J. P. and C. Nitsch (1969). Haploid plants from

pollen grains. Science, 163(3862): 85 - 87.

Osono, T. (2008). Endophytic and epiphytic

phyllosphere fungi of Camellia japonica: seasonal

and leaf age - dependent variations. Mycologia,

100(3): 387-391.


1678

Rajasekaran, P. (1996). An in vitro and ex vitro rooting

of micropropagated shoots of tea (Camellia spp.).

Sri Lanka Journal of Tea Science, 64: 12-20.

San - Jose, M. C. and A. M. Vieitez (1990). In vitro

regeneration of Camellia reticulata cultivar

‘Captain rawes’ from adult material. Scientia

Horticulturae, 43(1): 155-162.

Shantz, E. M. and F. C. Steward (1952). Coconut milk

factor: The growth - promoting substances in

coconut milk. Journal of the American Chemical

Society, 74(23): 6133-6135.

Song, L., X. Wang, X. Zheng and D. Huang (2011).

Polyphenolic antioxidant profiles of yellow

camellia. Food Chemistry, 129(2): 351-357.

Vieitez, A. M., J. Barciela and A. Ballester (1989).

Propagation of Camellia japonica cv. Alba Plena

by tissue culture. Journal of Horticultural Science,

64(2): 177-182.

QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRÀ HOA VÀNG...

Documents

Transcript of QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY TRÀ HOA VÀNG...