Purificação de proteínas
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Espectofotometria, purificação e caracterização de proteínas
2014
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Absorção de luz por moléculas: a Lei de Lamber t-Beer
• Ampla variedade de biomoléculas absorve luz em comprimentos de onda característicos;
• A medida de espectrofotômetro é utilizada para detectar e identificar moléculas e para medir suas concentrações em solução;
• Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm;
• A medição da luz absorvida por uma biomolécula através do espectrofotômetro é usada para detectar, identificar e quantificar moléculas num determinado material biológico;
• Para tanto deve-se levar em consideração a Lei de Lambert-Beer.
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Espectrometria de absorção atômica
Definição: Consiste na medida da absorção da energia luminosa por átomos no estado fundamental nas regiões do visível a ultravioleta.
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Espectrometria de absorção atômica
Relação entre radiação e concentração
Lei de Beer
A= a.b.c = Log Io/I
A: absorbância ; a: absortividade; b: percurso ótico; c: concentração molar
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5Lei de Lambert-Beer
• Quanto maior a concentração (c) ou maior o caminho óptico (b) maior será a absorbância da amostra, por isso geralmente o b é padronizado em 1 cm.
• Exemplo:
– com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbância de uma solução com concentração 0,002 mol L-1 de uma substância com absortividade molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma célula com 2,00 cm de caminho óptico.
A = a.b.c
A= 313 L mol-1 . 2,00 cm . 0,002 mol L-1
A= 1,252
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Pico máximo de absorção de luz
• Toda biomolécula apresenta um comprimento de onda específico onde a absorção de luz é máxima.
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Trabalhando com proteínas
Para se estudar uma proteína detalhadamente deve-se separá-la de outras proteínas em sua forma pura;
Proteínas devem ser purificadas para ser caracterizada quanto as suas propriedades e atividades.
Hemoglobina
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8Purificação de proteínas
Necessário fonte de proteínas (tecido ou células);
Romper estas células, liberando suas proteínas em uma solução (extrato bruto);
Centrifugar se necessário para preparar frações subcelulares;
Uma vez com o extrato pronto, diversos métodos estão disponíveis para a purificação. Exemplos: Diálise, Fracionamento (cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca catiônica, cromatografia de afinidade e cromatografia líquida de alta eficiência -HPLC).
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Purificação de proteínas
Método de Diálise: É um processo que separa proteínas de pequenos solutos
se aproveitando do maior tamanho das proteínas;
O extrato parcialmente purificado é colocado em um saco ou tubo feito de uma membrana semi-permeável;
Ele é suspenso em um volume muito maior de solução tampão de força iônica apropriada, a membrana permite a troca de sal e tampão, mas não de proteínas.
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Purificação de proteínas
Método de Fracionamento: É utilizado diferenças na solubilidade proteica, onde a
mesma é reduzida em elevadas concentrações salinas, um efeito denominado salting out de proteínas;
As proteínas que então precipitam são removidas daquelas que permanecem em solução por centrifugação em baixa velocidade.
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Purificação de proteínas
Cromatografia em coluna: Tem como base diferenças no tamanho,carga, afinidade
de ligação e outras propriedades;
Um material sólido poroso com propriedades químicas apropriadas é mantido em uma coluna, pela qual é percolada uma solução tampão;
A solução contendo a proteína depositada no topo da coluna percola o material sólido poroso dentro da solução tampão.
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13Purificação de proteínas
Cromatografia de troca iônica: Explora as diferenças no sinal e na magnitude da carga
elétrica líquida de proteínas em um dado pH.
A matriz da coluna é polímero sintético (resina) contendo grupos carregados ligados (trocadores de cátions ou trocadoras de ânions);
A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na coluna é afetada pelo pH e pela concentração de íons de sais livres.
Enquanto a solução contendo proteínas permanece na coluna, frações deste efluente são coletadas em tubos teste (cada fração pode ser testada para a presença de proteína de interesse)
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15Purificação de proteínas
Cromatografia de afinidade: Tem como base a afinidade de ligação;
Os grânulos da coluna possuem um grupo químico covalentemente ligado (ligante);
Quando uma mistura de proteinas é adicionada a coluna, qualquer proteína com afinidade por este ligante se liga aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada;
As proteínas que não se ligam são lavadas na coluna, e a proteína ligada é eluida com a solução contendo uma concentração elevada de sal quanto do ligante livre.
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Purificação de proteínas
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high perfomance liquid chromatography):
Utiliza bombas de alta pressão que aceleram o movimento das moléculas de proteína através da coluna;
Ao reduzir o tempo de trânsito na coluna, a HPLC pode limitar o espalhamento difusional das bandas de proteína e assim aumentar significativamente a resolução (Ver cromatografia em coluna).
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Caracterização de proteínas
Caracterização por eletroforese: Baseado em migração de proteínas carregadas em um
campo elétrico;
A eletrofoese permite a determinação de propriedades críticas (ponto isoelétrico e massa molecular estimada);
Para eletroforese de proteínas é utilizado géis de poliacrilamida (peneira molecular), retardando a migração de proteínas na proporção de sua relação carga-massa;
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Caracterização de proteínas - eletroforese
Um método eletroforético utilizado faz uso do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS, sodium dodecyl sulfate);
O SDS se liga a grande maioria das proteínas onde contribui com uma grande carga negativa e conferindo para cada proteína uma carga-massa semelhante;
Na eletroforese o SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base na massa molecular;
As proteínas são visualizadas pela adição de corantes (azul de Coomassie) que liga-se as proteínas e não ao gel.
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Na maioria dos casos vários métodos precisam ser utilizados sequencialmente para purificar uma proteína por completo pois cada método separa as proteínas com base em diferentes propriedades;
Diversas estratégias podem ser tentadas até que seja encontrada a mais eficiente;
Protocolos de purificação publicados estão disponíveis para muitos milhares de proteínas;
Métodos de baixo custo devem ser utilizados primeiro ( volume e número de contaminantes e maior);
Métodos cromatográficos são impraticáveis nos estágios iniciais já que a quantidade de meio cromatográfico cresce com o tamanho da amostra;
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Conforme casa passo de purificação é completado, o tamanho da amostra se torna menor, tornando acessível o uso de procedimentos cromatográficos.
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Referência
NELSON, D. L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. - 5. ed. -Porto Alegre: Artmed, 2011.