PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS
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Graduao em Biotecnologia Disciplina de ProtemicaCaroline Rizzi Doutoranda em Biotecnologia - UFPel
IntroduoDon't waste clean thinking on dirty enzymes!!!
Efraim Racker (1913-1991)
IntroduoDesta maneira, a enzima alvo pode finalmente ser estudada
Assegurar-se que a reao catalizada por um nico tipo de enzima!
Purificar uma enzima ao ponto que outras enzimas no so detectadas!!!!!
IntroduoNenhuma enzima purificada at a absoluta homogeneidade!!!
Atividade cataltica e resposta a inibidores e ativadores
Interaes com outros componentes celularesMecanismos de represso ou estmulo da sntese celular
Para que a enzima vai ser usada? Quantidade Atividade
Ensaio O ensaio pode ser realizado? Sensibilidade, acurcia, preciso Disponibilidade de substratos, custo
Aditivos ao tampo Ativadores, inibidores.... Conservadores da atividade
Ensaios enzimticosPadronizao de unidades:1. Quantidade de substrato consumido ou produto formado em mol; 2. Tempo da reao (minutos); 3. Quantidade de enzima (mg)
Atividade enzimtica mol/min Unidade 1 unidade: quantidade de enzima que catalisa a transformao de 1 unidade de massa de substrato ou formao de produto (geralmente mol) por minuto sobre as condies de pH e temperatura definidas.
Atividade especfica Unidades/mg
Ensaios enzimticosComponentes: Mix: Tampo para estabilizar o pH Substrato (s) Cofatores ou ativadoresTemperatura tima da enzima
Enzima ou extrato bruto (tratado) Reagente stop Espectrofotmetro
Ensaios enzimticosMetodologias
Substrato consumido
Produto formado
Variao de absoro de coenzimas
Ensaios enzimticosPonto Final
Metodologias
Cinticos Acoplados
Substrato consumido
Complementao gnica
Produto formado
Variao de absoro de coenzimas
Ensaios ponto final ou descontnuos
Reagente stopMix Enzima
Geralmente o produto corado e quantificado
Ensaios ponto finalAvaliao do consumo de substrato Teste da atividade da -amilase pancreticaIncubao da enzima com substrato (amido) e a diminuio da cor azul aps a adio de iodo comparada com o controle
Ensaios ponto finalAvaliao da formao do produto Teste da atividade da fosfatase alcalinaA FAL hidrolisa o substrato de timolftalena monofosfato liberando timolftalena cor azul.
timolftalena monofosfato
timolftalena
Fosfato inorgnico
pH alcalino=cor azul
Ensaios cinticos abs/tempo
Mix
Enzima
Ensaios cinticosAvaliao do consumo de substrato Teste da atividade da DAHP sintase
Fosfoenolpiruvato COOH
Eritrose 4-fosfato OH HH2O
O
COOH C
+P O C CH2
P
O C H2 OH O
_ O _ CH P 2HO
OH
DAHP SintaseEC 4.1.2.15OH 3-desoxi-D-arabino- heptulosonato 7-fosfato
Absortividade mxima a 232nm (=2,8 x 103 M -1 cm-1)
Ensaios cinticosAvaliao do consumo de substrato Teste da atividade da DAHP sintase
Consumo de PEP/s0,35 Absorbncia a 232 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160
abs/60 s = 0,1 PEP232 nm =2,8 x 103 M -1 cm-1
Tempo em segundos
C PEP= 0,1/2,8 x 103 C PEP= 3,57 x 10-5 M = 35,7 M/min
Atividade enzimtica: 35,7 U
Ensaios cinticosAvaliao do produto formato Teste da atividade da PNPMetilguanosina Metilguanina
Formao de produto0,35 Absorbncia a 360 nm 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 50 100 Tempo em segundos 150 200
Ensaios cinticosEnsaio da variao da absorbncia da coenzima associada Ensaios utilizando a reao inversa Teste da atividade da chiquimato desidrogenase
NADPH 340nm=2,8 x 103 M -1 cm-1
Atividade enzimtica: aumento de NADPH Desidrogenao do chiquimato
Ensaios acopladosVerificao da formao do produto utilizando-o como substrato para outra reao enzimtica Atividade da EPSP sintase
Metilguanina
Aumento proporcional atividade enzimtica de EPSP
Complementao gnicaUso de mutantes para comprovar que a construo gnica capaz de reparar os mutantes Atividade da desidroquinato sintase
Hin dIII (4221)
oriC
ADAPTADOR
Kan(R)
Xho I (3408) Hin dIII (3262)
PKK223-3 + aroB 4416 bp
pUP410
Escherichia coli AB2847 mutanteOriM
aroB LeuD
RBS1KpnI (2431) Xho I (2016)
Ausncia de suplementos + complementao gnica
Presena de suplementos
De que maneira avaliar a atividade e cinticas enzimticas???
1. Como montar uma reao enzimtica???Que reagentes e aparelhos vamos usar? Verificar ensaios descritos na literatura; Tampo, substrato, cofatores... Preo, pureza, estabilidade; Enzima pura ou extrato bruto; Disponibilidade de filtros de espectrofotmetro; O espectrofotmetro controla a temperatura? A leitura cintica? A reao em atmosfera com presena ou ausncia de O2?
1. Como montar uma reao enzimtica???Como preparar estes reagentes? Solues estoques que sero diludas na concentrao final no momento da reao!!!! Dissoluo, conservao, utilizao, peso molecular, pKs, ...: Manuais qumicos Estabilidade dos reagentes durante a reao enzimtica.
1. Como montar uma reao enzimtica???Que parmetros devo considerar? Km das anlogas para determinar a concentrao de substrato; Velocidade da reao enzimtica (turnover); Quais so os cofatores? uma metaloenzima? O extrato bruto pode conter inibidores ou interferentes na reao? O que utilizar como controle negativo? A enzima multimrica? Faz parte de um complexo enzimtico?
2. A enzima tem atividade em estado estacionrio?Quais so as condies para o ensaio estacionrio?A enzima est na forma ES A velocidade inicial medida em estgio estacionrio O substrato est em excesso = concentrao constante Em relao [substrato], a [produto] formado desprezvel Todos as outras condies da reao permanecem constante durante a medio.
2. A enzima tem atividade em estado estacionrio?Sem atividade? Concentrao enzima Inibidores Desnaturao Condio da reao
Mix
Enzima
Excesso de Substrato
Com atividade? Aumento da concentrao enzimtica
2. A enzima tem atividade em estado estacionrio?A atividade corresponde atividade da enzima recombinante??? Comparar com um controle negativo!!!!
3. A velocidade inicial proporcional concentrao da enzima?
Atividade enzimtica linearmente dependente do volume de enzima adicionado reao. A velocidade proporcional concentrao enzimtica. Medida da real da velocidade inicial.
O que podemos determinar utilizando a reao em estado estacionrio?O efeito do pH, da temperatura e diferentes ativadores na velocidade inicial; Curva de diluio do substrato: Km, Vmx;
3. Parmetros em estado prestacionrioMetodologia tipo flow methods: Baseados em mistura rpida dos reagentes (milisegundos); Anlise de reaes enzimticas rpidas; Estudo de mecanismos catalticos enzimticos.
Tcnica stopped-flow : Mais apropriada para observao de reaes rpidas; A real velocidade inicial a [substratos] baixas j transcorreu em mix manual.
Reaes no estado prestacionrio: Ligao ao substrato, liberao de produtos, associao a cofatores, alteraes no pH e temperatura....
Estado pr estacionrio
http://bcs.whfreeman.com/stryer/pages/bcs- ain.asp?v=chapter&s=08000&n=00010&i=99010.01&o=|00040|00010|&ns=0
Tabela de Purificao de uma EnzimaProvar que voc est trabalhando com a enzima j que a sua atividade est aumentando em relao ao aumento do nvel de pureza
Componentes da tabela de purificao: Quantidade total de protena (mg) Atividade total (U) Atividade especfica (U/mg) Purification fold: aumento da atividade especfica Rendimento (%): recuperao da atividade em cada passo
Tabela de Purificao de uma Enzima
Quantificao protica /mL X Volume total da etapa
Atividade total Protena total
Atividade total de uma etapa Atividade total do 1 etapa
Atividade enzimtica da etapa (U/mL) X Volume total da etapa
Atividade especfica de uma etapa Atividade especfica do 1 estgio
Quais so os destinos da enzima pura?
Imobilizao Enzimtica
100.000 compostos/dia!!!!!!!
Quais so os destinos da enzima pura?
Cristalografia e predio de estruturas
Desenvolvimento de frmacos
OBRIGADA!!!