pSC101 was the first E. coli cloning vector, used in 1973 by Herbert Boyer and Stanley Norman Cohen. They demonstrated that a gene from a frog could be transferred into bacterial cells and then expressed by the bacterial cells.

pBR322 was one of the first widely used E. coli cloning vectors. Created in 1977 in the laboratory of Herbert Boyer at the University of California, San Francisco. BR is for "Bolivar" and "Rodriguez.“, the two Mexican postdoc who constructed it.

Cloramfenicolo acetil tranferasi (Cat)

Tre tipi di resistenza: export della tetraciclina dalla cellula, protezione ribosomiale, modificazione della tetraciclina

Produzione di fosfotransferasi determina resistenza fosforilando kanamicina in posizione 3’ sfruttando ATP.

Identificazione delle molecole di DNA ricombinanti

Un generale principio su cui si basa questa identificazione è la “insertional inactivation”

Insertional inactivation of an antibiotic resistance gene

Insertional inactivation non sempre coinvolge resistenza agli antibiotici: “Lac selection”

-galattosidasi rompe la molecola di lattosio in glucosio + galattosio

Si usa un analogo del lattosio: 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-galattopiranoside (X-gal)

IPTG: isopropil-tiogalactopiranoside

Lattosio

X-gal

TERRENI• SINTETICI (composizione definita);

Soluzione tampone (fosfato)Fonte di N salinaFonte di C definita (glucosio, glicerolo, altri zuccheri)Oligoelementi/richieste nutrizionali

• SEMISINTETICI (composizione parzialmente definita)Soluzione tampone (fosfato)Fonte di C definita (glucosio, glicerolo, altri zuccheri)Oligoelementi/richieste nutrizionaliEstratto di lievito/peptoni di origine animale o vegetale

• RICCHI (composizione non definita, LB eYT):Estratto di lievitoPeptoni di origine animale o vegetaleFonti di C aggiuntive (glicerolo, zuccheri puri o in miscele)Soluzione tampone (fosfato)Magnesio

Tryptone is the assortment of peptides formed by the digestion of casein by the protease trypsin.

Trasformazione in E. coli

Trasformazione in DH5 (propagano velocemente il plasmide) A 100.0 l di cellule competenti di E.coli (DH5) si aggiungono 5.0 l di ciascuna delle reazioni di ligasi. 30’, ghiaccio90’’, 42°C2’, ghiaccioAggiungere 900.0 l 2xYT, 1h shaker a 37°C, 150 rpm.Strisciare su piastre contenenti 2 x YT + amp (200 g/ml), 200.0 l e 800.0 l di ognuna delle trasformazioni.O/N, 37°C

2 YT 0.5 lTriptone 8.0 g (ottenuto dalla idrolisi enzimatica della caseina) estratto di lievito 5.0 gNaCl 2.5 gPortare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’.

Preparazione piastreLe piastre vengono preparate con un terreno che contiene:1) i nutrienti per la crescita del batterio (LB, YT, M9)2) agar-agar per gelificare (polisaccaride naturale ricavato da alghe rosse) 3) antibiotico

L’antibiotico serve per selezionare le colonie in cui e’ presente il plasmide. Infatti il gene per la resistenza all’antibiotico, se presente, è sul plasmide che contiene anche il gene strutturale della proteina d’interesse

2 YT agar 0.5 ltriptone 8.0 gestratto di lievito 5.0 gNaCl 2.5 gAgar-agar 10.0 gPortare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’. Aggiungere soluzione ampicillina

sterile (concentrazione finale 200 g/ ml, 0.5 ml aggiunti in 0.5 l) quando la soluzione e’ quasi fredda, prima che solidifichi.

Principali Antibiotici Conc.ampicilllina 50-200 g/mlcloramfenicolo 30-40 g/mlcanamicina 50 g/mlstreptomicina 50 g/mltetraciclina 50 g/ml

Screening delle colonie

Reazione Reazione di controllo

La reazione di controllo non contiene il gene, ma solo il vettore.Se il vettore è stato correttamente tagliato e defosforilato questo non può chiudersi su se stesso e quindi non deve essere in grado di sviluppare la resistenza all’antibiotico presente sulla piastra

Sulla piastra di controllo non dovrebbe crescere nessuna colonia

Se è presente qualche colonia questa è dovuta alla presenza di background

E’ opportuno selezionare alcune delle colonie sulla piastra positiva, per verificare la presenza del gene

Screening delle colonie

Con un’ansa sterile si prelevano singole colonie. Ciascuna di queste, viene inoculata, in condizioni di sterilità, in un tubo da coltura contenente 5 ml di terreno liquido (2 xYT + amp (200 g/ml)

Le colture vengono cresciute O/N, sotto agitazione, a 37 °C finoal raggiungimento della fase stazionaria (12-16 ore)

tempo di incubazione

OD600

0 4 8 12 16

fase stazionaria

fase esponenziale

Lisi cellule batteriche per isolare il DNA plasmidico

Le cellule batteriche vengono raccolte per centrifugazione e poi lisate per isolare il plasmide

La lisi delle cellule per isolare il DNA può essere ottenuta per trattamento con:solventi organicialcaliriscaldamentodetergenti

Detergente lisa la cellula batterica, il trattamento con alcali distrugge l’appaiamento tra le basi

L’acetato di potassio riporta la soluzione a pH neutro e fa precipitare i lipidi e le proteine più grandi. Il DNA cromosomiale lineare si denatura irreversibilmente e viene intrappolato nel precipitato, mentre i plasmidi rinaturati rimangono in soluzione

La centrifugazione separa il DNA plasmidico dal precipitato

Da ogni coltura verrà isolato il DNA plasmidicocon il QIAprep Spin Miniprep kit: Le cellule vengono lisate per trattamento con SDS e alcali.L’estratto viene neutralizzato, portato ad alta forza ionica, assorbito su membrana, ed eluito con bassa forza ionica.

Protocollo di isolamento del DNA plasmidico

P1:50 mM Tris-HCl10 mM EDTA100 g/ml RNase

P2:200 mM NaOH1% SDS

N3:3.0 M CH3COOK

Protocollo di isolamento del DNA plasmidico

PCR screening

La presenza del gene nel vettore di espressione viene verificataamplificando un tratto del vettore contenente il gene, da ciascuno dei campioni isolati

vettore di espressione

gene

Si utilizzano 2 primers, uno che si appaia al gene e uno al vettore esternamente al gene.

Dopo amplificazione via PCR, se il gene è correttamente inserito nel vettore si deve identificare un frammento corrispondente al numero di basi comprese tra i 2 primers

Un metodo alternativo è quello di “digerire” il plasmide con opportuni enzimi di restrizione e verificare la lunghezza dei frammenti ottenuti

PCR screeningPer gli n campioni di DNA preparare un miscela di reazione (Master Mix) così composta H2O sterile 17.5 x (n+1) l

Buffer per Taq (10 x) 2.5 x (n+1) ldNTPmix (10 mM tot, 200 M ognuno fin) 2.0 x (n+1) l Primer SODfor (100 pmol/l) 0.25 x (n+1) lPrimer SODSal I (100 pmol/l) 0.25 x (n+1) lTaq polimerasi 5 U/ 0.5 x (n+1) l In eppendorf aliquotare 22.0 l di Master Mix. Aggiungere a ciascuno 3.0 l di DNA plasmidico estratto dalle colture. Cicli 94 °C 5’  94 °C 30’’41 °C 30’’ 30 cicli72 °C 1’ 72 °C 10’15 °C O/N Caricare 5.0 l di ciascuna reazione + 1.0 l loading buffer su un gel di agarosio al 2% Aggiungere come ultimo campione 1.0 l marker 100 bp + 4.0 l H2O + 1.0 l loading

buffer.  Verificare dal gel che i frammenti amplificati abbiano la lunghezza aspettata (500 bp).

Determinazione spettrofotometrica della conc. di DNA

 

Misurare allo spettrofotometro la concentrazione dei campioni di DNA isolati che hanno dato risultato positivo allo screening via PCR. Fare il bianco a 260 nm con 998.0 l di H2O in una cuvetta da 1 ml

Aggiungere 2.0 l di campione. A260 = 1 corrisponde circa a 50 g/ml DNA a doppia elica Aobs : 1 = X : 50 g/ml X = (Aobs x 50)= concentrazione DNA in cuvetta