Proteoma y Transcriptoma 2014-1

7/27/2019 Proteoma y Transcriptoma 2014-1

1/67

El transcriptoma, es el repertorio completo detranscritos en una especie, representa una liga clara

entre la informacin codificada por el DNA y el

fenotipo. Un transcriptoma completo es muy

grande. Por ejemplo, hay ms de 3 billones de bases

en el genoma humano, cerca de 1014 clulas en el

cuerpo, cada clula tiene alrededor de 300,000

molculas de RNA, y el tamao promedio de un gencompleto es de cerca de 28 000 pares de bases.

Por consiguiente, una representacin completa del

transcriptoma humano, tiene cerca de 8.423 (280000

300000 1014) bases de RNA .

Transcriptoma


2/67

Transcriptmica y transcriptoma


3/67

Tcnicas para el estudio del

transcriptoma humano

Microarreglos de DNA ySAGE


4/67

Qu es un

microarray?

Un formato experimental,

basado en la sntesis o fijacinde sondas, que representan

los genes (o proteinas, tejidos o

metabolitos),

sobre un sustrato slido

(cristal, plstico, slice,...),

y expuestos a las molculas

diana(la muestra).


5/67

Cmo funciona un

microarray?

El nivel de hibridacin entre

la sonda especfica (probe) yla molcula diana (target)

se indica generalmente

mediante fluorescencia y se

mide poranlisis de imagen

e indica el nivel de expresin delgen correspondiente a la sonda en la

muestra problema


6/67

Que tipos de

microarraysexisten? de DNA

de Protenas

de tejidos Arrays de CGH

SNPs

de Expresin

de cDNA de oligonucletidos:

GeneChip Affymetrix

Otras marcas


7/67

Aplicaciones de los microarrays

Estudio de genes que se expresan diferencialmente

entre varias condiciones

Sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no

tratados Clasificacin molecular en enfermedades complejas

Identificacin de genes caractersticos de una patologa

(firma o signature)

Prediccin de respuesta a un tratamiento

Deteccin de mutaciones y polimorfismos de un nicogen (SNP)

Etc,etc


8/67

Microarrays de 2 colores (spotted)

Diseo y produccin del chip

Preparacin de la muestraHibridacin

Escaneado del chip

Anlisis de la imagen


9/67


10/67


11/67

Microarrays de oligonucletidos

sintetizados in si tu

Diseo ms avanzado que los de 2 colores

Utilizan tecnologas desarrolladas en el entornode la microelectrnica

Algunos rasgos distintivos

No se basan en hibridacin competitiva: cada chip

contiene muestras de un solo tipo (1 color)

Las sondas se sintetizan directamente sobre el chip

en vez de sintetizarlas in vitro y adherirlas despus

Cada gen esta representado por un grupo de sondas

cortas en vez de por solo una.


12/67

Los GeneChips de Affymetrix

Affymetrix (www.affymetrix.com) es la compaa

lder en este tipo de chips

Se denominan genricamente GeneChips

Cada gen esta representado por un conjunto de

secuencias cortas que lo caracterizan Algunos chips contienen genomas completos

con ms de 50.000 grupos de sondas!

NOTA: Grupos de sondas = Probesets


13/67

Heterogeneidad biolgica en

la poblacin.

Recoleccin del espcimen/Efectos del manejo.

Tumor: ciruga.

Lnea celular: condiciones de

cultivo, nivel de confluencial. Heterogeneidad biolgica en

la muestra.

extraccin de RNA.

Amplificacin del RNA.

Marcaje con flor.

Hibridacin.

Escaneo.

voltage.

Poder del lser.

Fuentes de variabilidad

de un microarreglo


14/67

Anlisis de

conglomerados(clustering) Los genes no varan de

forma independiente

El anlisis de

conglomerados permite

descubrir grupos de

genes que varan de

forma similar

Puede utilizarse tambinpara agrupar muestras:

(fenotipos similares)

descubrimiento de

subclases


15/67

Anlisis basados en la GO

(Gen Ontology)

Los resultados de los estudios

de microarrays suelen serlargas listas de genes

Para contribuir a su

interpretacin podemos

Proyectarlos en bases de

datos de anotaciones como laGO o KEGGS

Estudiar si hay clases

funcionales enriquecidas entre

los genes seleccionados A ru ar los enes or su


16/67

Anlisis basados en la GO (Gen

Ontology)


17/67

Anlisis basados en la GO..


18/67

Conclusiones y perspectivas Los experimentos con microarrays han revolucionado

el estudio de la genm ica funcional Mejorando el conocimiento de la funcin de los genes a

partir de la similitud de patrones de expresin

Mejorando el conocimiento de las familias de genes:

Permiten incluir nuevos genes en las familias Descubren patrones de expresin coordinados

Aumenta el nmero de familias conocidas de genes

Como toda tecnologas los microarreglos tienen sus

limitaciones

Algunas como la baja reproducibilidad o la calidad del

genoma, se solucionaran con el tiempo

Otras como el uso adecuado de sus posibilidades

dependen del buen (o mal) uso que se haga de ellas.


19/67

La tcnica SAGE (Serial Analysis of GeneExpression) es una tcnica usada por los

biologos moleculares para producir una imagen

de la poblacin de RNA mensajero en una

muestra de inters, en forma de pequeasetiquetas que corresponden a fragmentos de

estos transcritos. La tcnica original fu

desarrollada por el Dr. Victor Velculescu del

Centro de Oncologa de la Universidad JohnsHopkins y se public 1995.

Tcnica SAGE


20/67

Procedimiento de SAGE

1) Aislamiento del mRNA de la muestra (xej untumor)

2) Extraer un pequeo fragmento de secuencia

(etiqueta) de una posicin definida de cada

molcula de mRNA.3) Ligar los fragmentos pequeos de secuencias para

formar una cadena larga (concatmero).

4) Clonar estas cadenas en un vectorplasmdico.

5) Secuenciarestas cadenas usando

secuenciadores de DNA.

6) Procesar estos datos con una computadora para

contar las pequeas etiquetas de secuencias.


21/67

SAGE


22/67

Protemica y Proteoma


23/67

Proteoma-protemica

El proteoma es el complemento total de

protenas producidas por un genoma enparticular, incluyendo variantes de la

misma protena bsica generada por

modificaciones post-traduccionales.

El estudio del proteoma es la protemica.


24/67

Tcnicas

Geles de SDS-PAGE en doble dimencin

( 2D-gels).

Anlisis por espectrometra de masas(MS).

Microarreglos de protenas


25/67

1 dimensin = p

2. Dimensin= PM


26/67

Mapas peptdicos


27/67

Electroforesis en

dos dimensiones

(2Dpage)


28/67

Electroforesis en dos dimensiones


29/67

Nuevas tecnologas en protemica


30/67

Informacin acerca de protenas

(PDb).....

Microarreglo:Un dispocitivo en miniatura conocidocomo chip, conteniendo, cientos o miles demolculas diferentes inmobilizadas en un patrn

regular. Microarreglo de DNA: (genotipificacin y anlisis

de expresin) Microarreglo de protenas: anlisis de expresin y

deteccin de interaccin entre protenas.

MIAME: Informacin mnima acerca de unexperimento de microarreglos. Convencin recientepara la presentacin no ambigua de datos demicroarreglos.


31/67

Informacin.....

B-series: fragmentos N-terminales en unaescalera de pptidos generados porespectrometra de masas.

ESI:Ionizacin por electrospray. Tcnica deespectrometra de masas adecuada para laionizacin de molculas tales como protenas, sinuna degradacin significativa.

TrEMBL: EMBL traducido. Base de datos desecuencias de protenas traducidas de la base dedatos de nucletidos del EMBL. No es tan extensacono Swiss-Prot


32/67

Categoras

Familias de protenas: basado en su similitudfuncional

Dominios de protenas: el dominio dedos decinc es uno de los ms abundantes. Dominio proteico:

Repeticiones de protenas:las ms comunesson la repeticin beta de la protena G-WD-40(

~400 compatibilidades protecas) y la repeticinde ancirina (> de 260 compatibilidades deprotena)


33/67

Familias de protenas

Una familia proteica es un grupo de

protenas evolutivamente relacionadas, yfrecuentemente es sinnima de familia

gnica. El trmino familia proteica no debe

confundirse con famil iacomo se usa paraestudios taxonmicos.


34/67

Familias proteicas

Las protenas estn agrupadas en familiasbasadas en similitudes en estructura y funcin y

se piensa que han evolucionado de una protena

ancestral comn a travs de duplicacin

gnica y mutacin subsecuente.

La base de datos SCOP (Structural Classification

of Proteins http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/)

agrupa a las protenas por familia y superfamilia.
http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/


35/67

Homologa

Las protenas en una familia descienden de un ancestro

comn ( son homlogas) y tpicamente tienen estructuras

tridimensionales similares, funcin y similitud de secuencia

significativa. Es difcil evaluar la significancia de similitud

funcional o estructural, el mtodo de alineamiento desecuencias nos permite evaluar la similitud entre un grupo de

secuencias proteicas. Las protenas que no comparten un

ancestro comn es poco probable que compartan similitud en

sus secuencias, lo que hace del alineamiento de secuenciasde aminocidos, una herramienta poderosa para identificar

miembros de una familia proteica.

Actualmente, se han definido ms de 60,000 familias

proteicas.


36/67

Evolucin de protenas

De acuerdo al dogma actual, las familias proteicas se originande dos formas, porespeciacin y por duplicacin.

Primeramente, la separacin de una especie parental en dos

especies genticamente aisladas (especiacin) acumulan

variaciones (mutaciones) en estos dos linajes. Esto resulta enuna familia de ortlogos, usualmente con motivos de

secuencia conservados. En segundo lugar, una duplicacin

gnica puede crear una segunda copia de un gen (llamado

parlogo). Debido a que el gen original es an capaz de

presentar la funcin, el gen duplicado est libre para divergery puede adquirir nuevas funciones (por mutaciones al azar).

Ciertas familias gnicas/proteicas, especialmente en

eucariotas, llevan a cabo expansiones y contracciones

extremas en el curso de la evolucin, algunas veces con


37/67

Clases de homlogos

Trmino DefinicinHomlogo Surgieron de una protena ancestral en comn, y su

relacin evolutiva es evidente por similitudes en la

secuencia, la estructura y/o en la funcinAnlogo Son similares de alguna forma, pero no hay evidencias

de ancestro comn. Anlogos estructuralescomparten el mismo plegamiento, y anlogos

funcionales la misma funcin.Ortlogos Son genes equivalentes en diferentes especies que

surgieron de un ancestro comn por especiacin.

Parlogos

Surgieron por duplicacin de genes dentro de ungenoma, y tienen funciones diferentes, pero

generalmente relacionadas.Residuos

funcionales Incluyen residuos de unin, en contacto con sustrato ycofactor, y residuos catalticos que intervienen en elmecanismo enzimtico.


38/67

Homlogos


39/67

Dominios de protenas y

motivos

El concepto de familia proteica fu concebido

cuando se conocan un reducido nmero de

estructuras o secuencias proteicas, por ejemplo,protenas pequeas de un solo dominio como

mioglobina,hemoglobina, y citocromo C.

Desde entonces, se encontr que muchas

protenas estn formadas de multiples unidadesfuncionales y estructurales independientes o

dominios.


40/67

La familia de

ciclofilina,representada por las

estructuras de los

dominios deisomerasa de algunos

de sus miembros.

Protenas homlogas

C i i l
http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_10//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e8/Structural_coverage_of_the_human_cyclophilin_family.png


41/67

Como se originan las

protenas


42/67


43/67


44/67

Dominios proteicos

Un dominio proteico es la zona de la protena donde se

halla mayor densidad. Es decir, donde hay mas

plegamientos. Una cadena polipptidica puede tener uno o

ms dominos. Si una protena est formada por ms de una

cadena polipeptidica, los dominios de cada cadena depolipptidos son sus dominios. Inclusive una proteina

formada por ms de una cadena polipptidica puede tener

un solo dominio, compartido por las cadenas de polipptidos.

Un dominio proteico puede serfunc ionalsi es una unidadmodular de la protena que lleva a cabo una funcin

bioqumica determinada, y estructuralsi se refiere a un

componente estable de la estructura.


45/67

Dominio proteico

Un dominio es un trmino ms genrico que

designa una regin de una protena con

inters biolgico funcional o estructural.

Tambin se llama dominio a una regin de la

estructura tridimensional de una protena con

una funcin concreta, que incluye regionesno necesariamente contiguas en la secuencia

de aminocidos.


46/67

Unmotivoes un elemento conservado en la secuencia de

aminocidos, que habitualmente se asocia con una

funcin concreta. Los motivos se generan a partir de

alineamientos mltiples de regiones con elementosfuncionales o estructurales conocidos, por lo que son tiles

para predecir la existencia de esos mismos elementos en

otras protenas de funcin y estructura desconocida.

Una huella o perfil (fingerprint)es un conjunto de motivos

que se usan para predecir la presencia de motivos

similares, bien en una secuencia concreta o en una base de

datos. Una huella contiene un nmero de motivosconsecutivos tomados de distintos puntos de un alineamiento

mltiple. Las secuencias que pertenecen a la misma familia

contienen todos los motivos del mismo f ingerpr int,

mientras que las subfamilias comparten slo parte de la

huella.

U i t i d l


47/67

Uso e importancia de las

familias proteicas

A medida que se incrementa el numero de

secuencias proteicas y crece el inters en el

anlisis protemico, hay un incremento delesfuerzo para organizar a las protenas en

familias y describir los dominios y motivos que las

forman. Una identificacin de las familias proteicas

es crtica para el anlisis filogentico, laanotacin funcional y la exploracin de la

diversidad de funcinde las protenas en una

cierta rama filogentica.


48/67

Ejemplos de dominios


49/67

Protena con tres dominios

M d l t d dif t
http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_10//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/67/1pkn.png


50/67

Modelo mostrando diferentes

dominios


51/67

Las protenas pueden compartir motivos similares. Los motivos son secuencias

comunes de aminocidos con secuencia de pliegues bien conocidas. Algunosejemplos son las terminales de zinc y las uniones de leucina (conocidos en

ingls como "zinc fingers" y "leucine zippers respectivamente). Las secuencias

que se encuentran entre motivos pueden ser muy diferentes entre una protena

y otra y la estructura plegada de esas reas puede ser desconocida pero las

regiones de los motivos conocidos usualmente se plegarn de forma similar


52/67

CDART(herramienta para bsqueda de

dominios en una secuencia de aminocidos)

Bases de datos biolgicas de


53/67

Bases de datos biolgicas de

protenas There are many biological databases that record examples of

protein families and allow users to identify if newly identified proteins

belong to a known family. Here are a few examples:

Pfam - Protein families database of alignments and HMMs

PROSITE - Database of protein domains, families and functional

sites

PIRSF - SuperFamily Classification System

PASS2 - Protein Alignment as Structural Superfamilies v2 -

PASS2@NCBS[6]

SUPERFAMILY - Library of HMMs representing superfamilies anddatabase of (superfamily and family) annotations for all completely

sequenced organisms

SCOP and CATH - classifications of protein structures into

superfamilies, families and domains.

Informacin (definiciones)
http://en.wikipedia.org/wiki/Biological_databaseshttp://en.wikipedia.org/wiki/Pfamhttp://en.wikipedia.org/wiki/PROSITEhttp://en.wikipedia.org/wiki/InterProhttp://en.wikipedia.org/wiki/SUPERFAMILYhttp://en.wikipedia.org/wiki/Structural_Classification_of_Proteinshttp://en.wikipedia.org/wiki/CATHhttp://en.wikipedia.org/wiki/CATHhttp://en.wikipedia.org/wiki/Structural_Classification_of_Proteinshttp://en.wikipedia.org/wiki/SUPERFAMILYhttp://en.wikipedia.org/wiki/InterProhttp://en.wikipedia.org/wiki/PROSITEhttp://en.wikipedia.org/wiki/Pfamhttp://en.wikipedia.org/wiki/Biological_databases


54/67

Informacin (definiciones)

Swiss-Prot: base de datos de secuencias de protenas

confirmadas con extensas anotaciones. Mantenida por elInstituto Suizo de Bioinformtica.

KEGG:Kyoto Encyclopedia of genes and genomes. Informacinde rutas metablicas.

Superfamilia:una coleccin de familias de protenas,

relacionadas por homologas, pero involucrando relacionesevolutivas ms distantes de las de miembros de una nicafamilia.

Espectrometra de masas:(MS) Una tcnica usada para

medir exactamente la relacin masa /de iones en un vaco, ypor consiguiente el clculo de la masa molecular.

MALDI: Matrix assisted laser desorption/ionization. Una tcnicapara generar iones en espectrometra de masas, til paraanlisis de protenas grandes sin degradacin significativa.


55/67

Informacin......

Huella de pptidos: (Peptide mass fingerprinting). Unmtodo para anotacin de protenas en el cual la masa de lospptidos (producida por digestin con proteasas) se determinapor espectrometra de masas y es usada para buscar en basede datos positivos en protenas digeridas virtualmente.

Motivo: (Motif) Una regin corta conservada de secuencia deDNA o protena.

Dominio: Parte de una protena que se puede doblar y llevar acabo una funcin independiente. Usado ms generalmente

indica parte de una secuencia de protena, por ejemplo undominio rico en glicinas.

Matriz: Formato experimental, conocido como arreglo, en elcual la combinacin de condiciones se prueban en todas lascombinaciones posibles en pares.


56/67

Informacin.....

Microarreglo:Un dispocitivo en miniatura conocidocomo chip, conteniendo, cientos o miles demolculas diferentes inmobilizadas en un patrn

regular. Microarreglo de DNA: (genotipificacin y anlisis

de expresin) Microarreglo de protenas: anlisis de expresin y

deteccin de interaccin entre protenas.

MIAME: Informacin mnima acerca de unexperimento de microarreglos. Convencin recientepara la presentacin no ambigua de datos demicroarreglos.

Informacin


57/67

Informacin.....

B-series: fragmentos N-terminales en unaescalera de pptidos generados porespectrometra de masas.

ESI:Ionizacin por electrospray. Tcnica deespectrometra de masas adecuada para laionizacin de molculas tales como protenas, sinuna degradacin significativa.

TrEMBL: EMBL traducido.Base de datos desecuencias de protenas traducidas de la base dedatos de nucletidos del EMBL. No es tan extensacono Swiss-prot


58/67

Informacin en la WWW.

Base de datos protenas: SwissProt y

ExPasy

Tcnicas: Protein chips, electroforesis 2D,

MS.

Videos: Varios en youtube. Para ver

diferentes tcnicas in al sitio del Hospital

General de Boston, USA:

B d d t lt d


59/67

Bases de datos para consulta de

tipo de protenas, secuencia y funcin.

Varias bases de datos estn dedicadas a aregistrar caractersticas de secuencias que soncompartidas por mltiples protenas e indicanfunciones comunes o relacionadas. Dos bases

de datos utilizadas a menudo son: Interpro: conservada en el European

Bioinformatics Institute (EBI)

Pfam: preservada en el Wellcome Trust SangerInstitute

P i i l f ili d t l


60/67

Principales familias de protenas en el

proteoma humano

InterPro Nombre de la familia Protenas compatiblesIPR000272 Receptor acoplado prot.G/Rhodopsina 826

IPR000719 Cinasa de protena 688

IPR001909 Caja Krab(rel. A Kruppel) 314

IRP001806 Superfamilia GTPasa Ras 192

IPR00582 Protena de transporte inico 149

IPR000387 Fosfatasa de protena especfica de tirosina 139

IPR001254 Proteasa de serina, familia tripsina 128

IPR000379 Esterasa/lipasa/tioesterasa sitio activo 112

IPR007114 Superfamilia facilitadora mayor 100

IPR001993 Transportador mitocondrial de sustrato 86

IPR001664 Protena de filamento intermedio 85

IPR001128 Citocromo P-450 84

Los 15 principales dominios proteicos en el


61/67

Los 15 principales dominios proteicos en el

proteoma humano

Interpro Nombre del dominio No. total

IPR007087 Dedo de cin c, tipoC2H2 28654IPR002186 Caderina 4131

IPR006209 Dominio parecido al EGF 3107

IPR003006 Inmunoglobulina/complejoHM 2384

IPR002048 Banda EF de enlace de Ca 1885

IPR001452 Dominio SH3 1815IPR003961 Fibronectina, tipo III 1812

IPR000504 regin RNP-1 1783

IPR001356 Homeobox 1435

IPR002955 Extensina rica en Prolina 1229

IPR001478 Dominio PDZ/DHR/GLGF 1143

IPR001841 Dedo de cinc, RING 1132

IPR001849 Parecido a Preclastina 1061

IPR000210 Dominio BTB/POZ 494

IPR005225 Dominio pequeo de protena 189

de enlace de GTP


62/67

Evolucin en el laboratorio

Es una herramienta reciente para estudiar la

funcin y adaptacin enzimtica, que nos permite

observar adaptacin bajo condiciones controladas.

Como se pueden definir las presiones evolutivas, sepueden explorar funciones no naturales, y distinguir

lo biolgicamente relevante de lo fsicamente

posible.

Pasos:

Generar diversidad (mutagnesis al azar y/o

recombinacin in vitro)

Identificar variantes mejoradas



63/67


(evolucin acelerada)


64/67

Ontologas gnicas

El Gen Ontology Consort ium (GO), define

las categoras de clasificacin funcional

de acuerdo a:

1) Componente celular en el que opera laprotena.

2) Funcin molecular.

3) Proceso biolgico total al que contribuye

la protena.

Ontologas gnicas por funcin


65/67

Ontologas gnicas por funcin

molecular

Protena de defensaProtena del citoesqueleto

Regulador de la transcripcin

Molcula de adherencia celular

Enlace de ligando o portadorLigando

Receptor

Otra Seal de transduccin

Enzima

Transportador

Regulador enzimtico

Otras funciones

Ontologas gnicas por proceso


66/67

Ontologas gnicas por proceso

biolgico

Adherencia celularSealamiento clula con clula

Muerte celular

Organizacin/biognesis celulares

Metabolismo de protenasMetabolismo del DNA

Metabolismo del RNA

Otros procesos metablicos

Respuesta al estrs

Transporte

Procesos del desarrollo

Transduccin de seal

Otros procesos


67/67

Factores de transcripcin

Factores de transcripcin generales:transcripcin de la mayor parte depromotores para una clase especfica de

polimerasa de RNA.Factores de transcripcin

especializados:

de tejidos

de genes especficos

Activadores y coactivadores

Represores y corepresores

Proteoma y Transcriptoma 2014-1

Documents

Transcript of Proteoma y Transcriptoma 2014-1