Proteoma Sergio Encarnacion

7/23/2019 Proteoma Sergio Encarnacion

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CIENCIAS GENMICAS

EL PROTEOMA, UNA HERRAMIENTA PARA EL ANLISIS GLOBALDEL ESTADO CELULAR DE ORGANISMOS MICROBIANOS.1

Sergio Manuel Encarnacin Guevara

1Centro de Investigacin Sobre Fijacin de Nitrgeno, Universidad Nacional Autnoma deMxico

Las tcnicas de proteoma (electroforesisde alta resolucin en dos dimensiones y lacaracterizacin de protenas) son usadasen gran escala en la investigacinmicrobiana para analizar la sntesis globalde protenas como un indicador de laexpresin gentica de la bacteria. Losrpidos progresos en proteomasmicrobianos se deben a la grandisponibilidad de secuencias de genomasque varios grupos de investigacin hanreportado.

Adems de proveer un entendimientobsico de la expresin gentica enmicroorganismos, el proteoma juegatambin un papel fundamental enimportantes reas de la microbiologa tantomdica como agrcola. Notables progresoshan sido realizados con la utilizacin deesta metodologa, en campos como son la

epidemiologa, la taxonoma de patgenosmicrobianos y bacterias de intersagrcola, adems en la identificacin denuevos mecanismos de patogenicidad y enel anlisis de la resistencia bacteriana alos antibiticos. En cada una de estasreas, el proteoma a provisto de nuevainformacin que complementa lasinvestigaciones basadas en los genomasbacterianos. Este captulo describe losprogresos ms recientes en el campo de la

investigacin realizada con proteomas

adems de algunos de los ms importantesretos tcnicos existentes para la aplicacinde esta tcnica en la microbiologa.

En microbiologa mdica es an un retopara el futuro la caracterizacin deproteomas de patgenos o simbiontesbacterianos creciendo o desarrollando susactividades fisiolgicas en su husped ocompaero natural sin embargo enmicrobiologa agrcola algunos grupos deinvestigacin como el nuestro ya estamosabordando este tipo de estudios.

Iniciaremos este captulo con un anlisisde las tcnicas y metodologas ms usadasen el proteoma, sus principios, paraposteriormente entrar de lleno en lo que esesta importante tcnica de biologa moderna,seguido de un anlisis de los conceptos msimportantes que nos ayuden a entender estemanuscrito, para posteriormente pasar al

anlisis de proteomas en bacterias yprofundizar lo ms posible en susposibilidades, utilizacin actual yperspectivas.

IntroduccinLa Biologa moderna empez con la meta dedefinir las propiedades del material gentico yla manera de como esta informacin esutilizada. En la actualidad se sabe que elmaterial gentico esta constituido de un tipo

particular de molculas (cidos nucleicos), los


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cuales son diferentes en estructura de losotros tipos de molculas (protenas,lpidos, azcares etc.). El gene es launidad gentica de informacin y elparadigma bsico consiste en que losgenes codifican protenas, las cuales son

responsables en su momento de la sntesisde otro tipo de estructuras, incluidos loscidos nucleicos. La secuencia de ungene, especificar la secuencia de laprotena y por lo tanto su estructuramolecular. Pero las caractersticasindividuales de estructura no determinaranexclusivamente la funcin de la molcula,la localizacin y el estado fisiolgico delorganismo son importantes. La produccinde una protena funcional ocurre despusde una serie de interacciones. Lasecuencia de un gene especificar lasecuencia de la protena. La secuencia dela protena especificar la estructura de lamolcula. La estructura moleculardeterminar la ubicacin de la protena enla clula. Es importante notar que el ordende eventos puede diferir en diferentesgrupos de protenas; muchas protenasalcanzan estructura antes de localizacinotras obtienen su localizacin antes quesu estructura. En cada estado metablicoun aparato especfico interpreta lainformacin proporcionada a un nivel

jerrquico para proceder posteriormente alsiguiente nivel. Este nivel jerrquico puedeser resumido en algunos pasos siendo elprimero la perpetuacin del DNA o de susgenes por medio de replicacin,posteriormente la transcripcin en RNA(RNAm) y la traduccin de este paraproducir la protena, lo anterior utilizando elcdigo gentico, el paso jerrquicosiguiente es el armado de la protenamediante "chaperonas", lo cualproporcionar la estructura que definir siesta protena ser localizada en el citosol oasociada a membranas, definiendo esto supapel estructural o actividad cataltica. Conlo anterior podemos concluir que el DNAcontiene la

Informacin pero las protenas proveen lamanera de ejecutarla.

Para muchos microorganismos, losproyectos de investigacin se encuentran yaen la era post-genmica. La secuencia deDNA de estos microorganismos est siendo

analizada con varias herramientascomputacionales para extraer la mayorcantidad de informacin terica. Esta estticadescripcin terica de la clula esactualmente acompaada por dosmetodologas muy dinmicas conocidas comoproteomas y transcriptomas. El transcripomase refiere al perfil de transcritos de la clula(RNAm) (132). El proteoma se refiere alproducto de la traduccin de estos RNAm ylas diferentes variantes o modificacionesgeneradas por la clula despus de esteproceso. Antes de 1975 las protenascelulares eran estudiadas por medio demtodos bioqumicos como entidadesindividuales o como una mezcla de lasprotenas de la clula (por ejemplo laconcentracin total de la protena de la clula,o su tasa de sntesis) todo por medio demtodos qumicos o radio qumicos. Desdeque 0'Farrel y KIose en 1975 (99)demostraron que era posible separar unamuestra compleja de protenas en geles deacrilamida de doble dimensin, basados ensu punto isoelctrico y peso molecular (2-ED)esta metodologa se ha mantenido como laforma ms viable de obtener resultadosconfiables, aunado a esto, modernosformatos de geles, ms grandes (ejemplo 23x 28 cm) son altamente reproducibles y latincin por Coomassie o tincin por platapermiten la cuantificacin, adems tincionesfluorescentes o mareaje radiactivo permiten ladeteccin de miles de protenas en un gel.Este mtodo es comnmente usado paraestudiar la arquitectura proteica de la clula,conociendo la cantidad y localizacinsubcelular de protenas individuales (38),pero tambin ha sido usado en muchosestudios para examinar los cambios en laexpresin de protenas en respuesta aestmulos (97), o para identificar protenasregulatorias (92). En todas esas aplicaciones,


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la electroforesis en geles de dobledimensin es usada para localizar y aislarprotenas de inters. Esas aplicacioneshan hecho y continuaran contribuyendocon aportaciones importantes paraentender como funcionan las protenas en

la clula. Cada grupo de protenasexpresadas en un momento metablicoespecfico de la clula podra ser llamadala firma celular, relacionndola con elestado de trabajo de la clula en unproceso metablico particular.

El estado fisiolgico de la clula enuna circunstancia particular es obtenido dela unin de las firmas metablicasobservadas. El progreso en este campo sebasa en la construccin de una tabla decorrespondencia, ligando las firmas a lasfunciones celulares.

La combinacin del proteoma congentica, biologa molecular, bioqumica ybiofsica de protenas han producido unatcnica de gran alcance, dando porresultado 2 novedosos mtodos paraanalizar mezclas complejas de la protena.Las tecnologas de proteoma queemergen prometen aumentar la velocidadde procesamiento de identificacin de lasmezclas complejas de protenas y conocersus niveles de expresin.

Como mencionamos en el prrafoanterior, el anlisis tipo proteoma es elresultado de la combinacin de una seriede tcnicas que han sido reportadas yperfeccionadas durante los ltimos aos,tcnicas como la electroforesis en geles dedoble dimensin, de tincin altamentesensibles, de caracterizacin de protenasmediante secuencia de la porcin amino ocarboxilo terminal y la utilizacin de laespectrometra de masas dirigida a laidentificacin de protenas presentes enconcentraciones pico molares, son algunasmetodologas actualizadas para su uso enal anlisis de expresin global del genomamediante las protenas que sintetiza laclula, mejor conocido como proteoma.

Pero, que es la electroforesis deprotenas? La electroforesis de protenas

en geles de poliacrilamida es una tcnicaindispensable en el anlisis y estudio de lasprotenas. Cada tipo de separacinelectrofortica puede ser llevada a cabo enuna gran variedad de tamaos de geles,desde minigeles que no son ms grandes que

un sello postal hasta geles gigantes msgrandes que esta pgina. La electroforesis engeles de poliacrilamida puede ser de dostipos, de una dimensin y dos dimensiones,esta ltima ser la que ocupe nuestraatencin. La electroforesis en geles de dobledimensin involucra la combinacin ortogonalde dos diferentes mtodos electroforticos.La tcnica ms comn de electroforesis engeles de doble dimensin combina dosmtodos individuales de alta resolucin,consistentes en el isoelectroenfoque seguidopor la electroforesis con Dodecil Sulfato deSodio (SDS) (Fig. 1). Cada uno de esosmtodos es individualmente capaz de separaralrededor de 100 protenas pero cuando soncombinados, ms de 1500 protenas puedenser separadas en un gel de doble dimensin.Por lo tanto este mtodo puede ser usadopara analizar y comparar mezclas complejasde protenas, incluyendo extractos totales declulas o tejidos.

Despus de la separacin electrofortica,las protenas son detectadas usualmente conmtodos comunes de tincin como la tincincon azul de Coomassie o uno ms sensibleque es la tincin con plata. Esos mtodos detincin fijan la protena en la matriz del gelpara prevenir la difusin de las manchasproteicas.

Un mtodo de anlisis muy usadodespus del aislamiento de protenas engeles de doble dimensin es el que involucrala transferencia de estas, en un campoelctrico a una membrana o soporte inertecomo pueden ser las membranas dedifluorido de polivinilideno (PVDF), estatcnica suple la electro-elusin de lasprotenas y es muy utilizada ya que lasmembranas de PVDF son fciles de manejary qumicamente inertes, por lo tantos soncompatibles con subsecuentes mtodos deanlisis que incluyen anlisis de aminocidos,


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de modificacin qumica in situ, digestinproteica in situ y anlisis de secuenciaAMerminal, adems la estabilidad yresistencia qumica de las membranas dePVDF provee un medio ptimo para lacombinacin de mltiples mtodos de

deteccin como son mtodosinmunolgicos con el uso de anticuerpos.La combinacin de la tecnologa del

proteoma con otras tcnicas, ha dado lugaral descubrimiento acelerado de lainformacin funcional de las protenas.

Aunque esta tcnica es de granalcance, tiene sus limitaciones. Adems deser necesarios geles laboriosos, en estetipo de geles raramente se identifican lasprotenas hidrofbicas y las de bajaabundancia. Recientemente nuevosmtodos de anlisis de proteomas seestn desarrollando para poder resolverestas clases de protenas y acelerar lavelocidad del anlisis. Finalmente, se estndesarrollando mtodos cuantitativospermitiendo conocer la abundancia ysntesis relativa de estas protenas. Estecaptulo presenta y discute una ampliavariedad de aplicaciones del proteoma a lamicrobiologa. Adems, se discutenmetodologas utilizadas actualmente enproteoma as como mtodos de lacuantificacin que pueden revolucionar elestudio de proteomas.

Por qu es necesario trabajar con elproteoma?

Con la generacin constante de extensascantidades de secuencias en las bases dedatos de ADN, se ha observando que tenersimplemente las secuencias completas degenomas no es suficiente para aclarar lafuncin biolgica. Una clula esnormalmente dependiente para susupervivencia de una multiplicidad decaminos metablicos y reguladores. Noexiste una relacin linear terminante entrelos genes y el complejo proteico o el"proteoma" de una clula. El proteoma escomplementario al genoma porque

se centra en los productos del gene, que sonlos agentes activos en las clulas. Laexistencia de una fase de lectura abierta(ORF) o las secuencias genmicas, noimplican necesariamente la existencia de ungene funcional. Adems a pesar de los

avances en bioinformtica, sigue siendodifcil predecir genes de datos geonmicos(29,32,70). Una ventaja en la constantesecuenciacin de genomas demicroorganismos ser que la secuenciacinde genomas de organismos relacionadosfacilitar la prediccin del gene con base auna comparacin genmica, sin embargo latasa de xito para la prediccin correcta de laestructura primaria es an baja (211Q3).Fundamentalmente se observan problemasde prediccin de fases de lectura en genespequeos (que se puedan perdercompletamente) o en genes con poco o nadade homologa a secuencias conocidas opreviamente reportados. Un estudio recienteconcluy que la tasa de error en la anotacino definicin de genes del genoma deMycoplasma genitalium constituido por 340genes es de al menos el 8%. Si tales tasas deerror se extrapolan al genoma humano, elresultado y las consecuencias pueden serfcilmente calculadas. Por lo tanto, laverificacin del producto de un gene por elmtodo de proteoma es un importante primerpaso en la "anotacin" de los genomas. Porotro lado las modificaciones de las protenasque no son evidentes a partir de la secuenciade ADN (cido desoxiribonuclico), tal comoisoformas y modificaciones post-traduccionales, se pueden determinarsolamente por metodologas protemicas.Adems, si pretendemos estudiar laregulacin en la expresin del genoma sernecesario correlacionar el nivel de laexpresin de la protena directamente con losniveles de RNAm aunque en varios casosestos pueden o no correlacionar con lapresencia de la protena(42,48).

Combinacin de proteomas con modernastcnicas biolgicas.


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Como mencionamos en prrafosanteriores, el potencial real de losproteomas surge cuando el proteoma secombina con gentica, biologa molecular,bioqumica y/o biofsica de protenas.Combinando estudios de proteoma con

gentica y biologa de levaduras, Lee et al.(74) descifraron los papeles que juegan lasprotenas Yap1 y Skn7 en la respuesta alestrs oxidativo, por otro lado Alms et al.(3) identificaron fosfosustratos delcomplejo fosforilado de la protena Reg,un complejo involucrado en la regulacinde las vas metablicas que son reprimidaspor glucosa. Estudios adicionales queutilizan la tecnologa del proteoma,purificacin de protenas y gentica,identificaron las protenas implicadas enensamblaje de la actinia (44) adems deun nuevo componente del nuclolomitocondrial requerido en la reparacin delADN (83) adems ha servido en laclasificacin de los componentes delcomplejo de la histona acetiltransferasa delevadura (31). Rigaut et al. (110)desarrollaron un mtodo que han aplicadopara caracterizar las pequeas partculasdel cido ribonucleico de la levadura,complejo implicado en empalmar el RNAm(19,34) y la protena Dbp5 de la caja DEAD(116) . Combinando el proteoma ybiologa estructural, Houry et al. (57)identificaron in vivo 52 de los substratosde la chaperonina GroEL, una protena deE coli implicada en el plegamiento depolipptidos, adems determinaron losmotivos comunes en 24 de los substratosde esta protena. Sin el proteoma, loscomplejos estudios emprendidos por Houryet al no hubieran sido posibles.

Identificacin y anlisis de protenas

Uno de los pasos cruciales en proteomases la obtencin y manejo de la muestraproteica. Debemos considerar que existengenomas microbianos de cerca de 10 000genes, o lneas celulares potencialmentecapaces de regular la expresin de un

nmero incluso ms alto de genes. Adems,el rango dinmico de la abundancia deprotenas en muestras biolgicas en esteltimo ejemplo puede ser tan alto como 106.Si consideramos que en los mejores geles dedos dimensiones de una mezcla cruda de

protenas solo se puede resolverrutinariamente 1,000 protenas, es obvio quesolamente se pueden visualizar medianteelectroforesis en geles, las protenas msabundantes. La solucin ideal para reducir lacomplejidad y las diferencias en abundanciaes utilizar estrategias de purificacin deprotenas a partir del complejo proteico aanalizar. Por ejemplo, existen receptores deabundancia media, que se encuentran encerca de 1000 copias por la clula, o menosde dos picomoles, (100 ng) en un litro decultivo celular. Estas protenas no seranvisualizadas en los extractos de celulares sino se enriquece la muestra previamentemediante purificacin utilizando una columnade afinidad con anticuerpos.

Este hecho debe ser tomado en cuantapor los que trabajamos con proteomas, siconsideramos que este puede ser el caso dealgunas molculas reguladoras. Despus deobtener la fraccin de protenas, el mtodo deopcin inmediato para este tipo de anlisises la electroforesis en geles de dosdimensiones.

Identificacin espectromtrica deprotenas

Uno de los descubrimientos ms significativospara la investigacin en proteomas, ha sido laidentificacin por medio de espectrometra demasas, de protenas separadas medianteelectroforesis en geles de doble dimensin, locual ha ampliado el anlisis de estas ms allde su simple visualizacin. La espectrometrade masas esencialmente ha substituido latcnica clsica de secuenciacin de laporcin /V-terminal de la protena, por mediode degradacin Edman, sustituyndolaincluso en la qumica tradicional de protenas,esto es porque es mucho ms sensible,puede ocuparse de mezclas de protenas y


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tiene un rendimiento de procesamientomuy alto, lo anterior esta basado en lacantidad de protenas que puedenanalizarse, en ocasiones grupos de 100protenas en pocos minutos, algunas deellas en concentraciones pico molares.

Esta metodologa analiza las protenasseparadas en geles de doble dimensin lascuales son digeridas por una proteasasecuencia-especfica como la tripsina oquimiotripsina y los masas de los pptidosson analizadas y determinadas en unespectrmetro de masas. La razn deanalizar los pptidos preferentemente a lasprotenas es porque las protenasseparadas en el gel son difciles de extraerdel gel que esta constituido de acrilamida,adems de que el conocimiento de lamasa total de la protena generalmente noes suficiente para la identificacin de estasen las bases de datos. En contraste, lospptidos se eluyen fcilmente del gel deacrilamida y un conjunto pequeo depptidos de una protena proporcionasuficiente informacin para suidentificacin. La progresin de pasostpicamente implicados en un anlisismediante espectrometra de masas de unaprotena son ilustrados por el ejemplo quemuestra el anlisis de una molcula (Fig.2b y 3). Un protocolo detallado quedescribe mtodos y las estrategias para laidentificacin mediante espectrometra demasas se puede encontrar en la referencia(107).

Existen dos estrategias principalespara la identificacin espectromtrica delas protenas. Una es el "mapeo de lamasa del pptido", sugerido inicialmentepor Henzel y colaboradores (52), en estatcnica se obtiene el espectro total de lamezcla de los pptidos obtenidos de ladigestin secuencia-especfica de laprotena, lo que da lugar a una huelladigital de la masa de los pptidos de laprotena que esta siendo estudiada. Esteespectro total es obtenido por un mtodode espectrometra de masas relativamentesimple utilizando una fuente de ionizacin y

la desorcin de muestras asistido por un lser(MALDI-TOF, por sus siglas en ingls) lo queresulta en una medicin del "tiempo devuelo" de los pptidos que constituyen lamezcla de pptidos (Fiq. 3 y 2b). Recientesavances en la automatizacin del

procedimiento de identificacin de protenasmediante MALDI han hecho que cientos deprotenas puedan ser cortadas de los geles,digeridas enzimticamente, su espectro demasas obtenido analizado automticamente eidentificado en las bases de datos deprotenas (12,62). En un procedimiento dedos etapas para la identificacin rpida einequvoca de la protena, la huella digital dela protena obtenida mediante MALDI sera elprimer paso (119,120). El segundo paso serla secuencia de pptidos individuales. En estemtodo, los pptidos son ionizadosdirectamente por ionizacin enelectroaspersin a partir de la fase lquida.Los iones de los pptidos se rocan en unespectrmetro de masas en serie que tengala capacidad de separar los pptidos de unamezcla, adems de aislar una especie almismo tiempo y de disociarla en losfragmentos amino o carboxilo-terminal (Fig.1c). El mtodo de espectrometra de masasen serie es tcnicamente ms complejo ymenos escalable que la "huella digital" de laprotena obtenida por MALDI. Su ventajaprincipal es que la informacin obtenida de lasecuencia de aminocidos de la porcinamino o carboxilo terminal derivada delanlisis de varios pptidos es mucho msespecfica para la identificacin de unaprotena que una lista de las masas de lospptidos que la constituyen. Los datos de lasecuencia no solo se pueden utilizar paraidentificar protenas en bases de datos desecuencias de aminocidos sino tambin enbases de datos se secuencias de nucletidosy bases de datos de genomas.

Anlisis de modi ficac ionespostraducc ionales de las protenas

Una de las ventajas de las investigacionestipo proteoma es la capacidad nica que


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ofrece este tipo de estudios de analizar lasmodificaciones post-traduccionales de lasprotenas. La fosforilacin, la glicosilacin yla sulfatacin as como muchas otrasmodificaciones son extremadamenteimportantes para la funcin de las

protenas pues pueden determinar laactividad, estabilidad, localizacin y elrecambio de las mismas. Estasmodificaciones no son evidentes en datosde secuencia de genomas, o en estudiosde expresin de RNAm. La espectrometrade masas es el mtodo de proteoma deeleccin para determinar lasmodificaciones postraduccionales de lasprotenas, sin embargo, esta tarea esmucho ms difcil que la mismaidentificacin de las protenas. Mientrasque para la identificacin de las protenasen las bases de datos, es necesaria enocasiones la secuencia de uno o dospptidos, para conocer la naturaleza y lalocalizacin de modificacionespostraduccionales, se necesitan analizardetalladamente todos los pptidos que notienen la masa molecular prevista. Debidoa esto y otras razones, es necesaria unamayor cantidad de material para estudiarlas modificaciones postraduccionales queel utilizado para la identificacin de laprotena. Un avance continuo se estteniendo en este campo, especialmente enel caso de estudios de fosforilacin. Lasfosforilaciones se pueden identificar porestrategias genricas, ya que losfosfopptidos son 80 daltones mspesados que sus contrapartes sinmodificar, dando lugar a un fragmentoespecfico (P03-, masa 79), los cuales seunen en una microcolumnas de resinasmetlicas para posteriormente serreconocidos por anticuerpos especficos,adicionalmente los grupos fosfato puedenser removidos por fosfatasas y analizadospor medio de MALDI (13, 23, 93. 96, 144).Como ejemplo, figura 2d.

Bases de datos de protenas yproteomas

Varias parciales bases de datos deproteomas se encuentran disponiblesactualmente, incluyendo mapas de variosorganismos, tales como Escherichia coli, H.influenzae, Saccharomyces cerevisiae,

Bacillus subtilis, siendo las dos primerasbases de datos las que agrupan msprotenas identificadas, en el caso de la deH.influenzaecerca de 500 protenas han sidoidentificadas. Muchas de estas bases dedatos de proteomas son disponibles demanera electrnica, por ejemplo en elservidor ExPASy, el cual es accesible vaWorid Wide Web (http://www.expasy.ch) .

Quizs el anlisis tipo proteoma msdetallado se ha realizado en Saccharomycescerevisiae. La actualizacin ms reciente desu proteoma muestra 279 productosproteicos diversos identificados de 401protenas resueltas mediante geles de dobledimensin (106). Debido a la cantidad deinformacin publicada sobre S. cerevisiae,especialmente sobre la secuencia delgenoma, existe una gran cantidad de basesde datos que tienen clasificadas todas lasprotenas conocidas de levadura. Esto hahecho posible un catlogo de estas en labase de datos del proteoma de esteorganismo, incluso la clasificacin es conbase a su papel funcional y a la localizacinsubcelular (24,84). Por lo anterior un anlisistipo proteoma de S. cerevisiae puedecorrelacionarse fcilmente con estos gruposde clasificacin e identificar la funcin de laprotena y su papel en el metabolismo.

Utilizando la informacin genmica yprotemica disponible para S.cerevisiae,algunos grupos de investigacin hananalizado la posible correlacin entre elmRNA y la presencia de la protena. Conbase a un anlisis logartmico, Futcher et al.(42) descubrieron que la concentracin de148 protenas correlaciona con la abundanciaen RNAm. Sabemos que no en todos loscasos se ha encontrado este tipo decorrelacin, por lo tanto estudios en otrosorganismos que correlacionen el RNAm y losniveles de expresin de las protenas darn


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informacin valiosa de la organizacin y laexpresin de sus genomas proporcionandoen el futuro al conocimiento de las reglascomunes que regulan la expresin de lasprotenas.

El Proteoma en la InternetDada la cantidad de informacin generadapor los diversos grupos de investigacinque trabajan con proteomas en diversosorganismos, existe un importante esfuerzopara hacer esta informacin fcilmentedisponible en la Internet. Las recientesactualizaciones de muchos proteomasmicrobianos, incluyendo los de lacianobacteria Synechocystis (115), S.cerevisiae, (106), M. tuberculosis y M.bovis (85), estn disponibles en susrespectivas ventanas de Internet donde sepueden consultar como bases de datosinteractivas. CordweII et al. (22)recientemente publicaron unaaproximacin que permite integrar toda lainformacin generada por El CentroAustraliano de Anlisis de Proteomas, conproteomas obtenidos de E. coli.Pseudomonas auhginosa yStaphylococcus aureus. Lo anterior sedebe a que no toda la informacingenerada por proyectos tipo proteomapuede ser presentada en una publicacin ydebe ser accesible de alguna otra forma alos grupos de investigacin interesados,por lo cual la Internet es la herramientaideal para este propsito.

Definiciones

En 1994, casi 20 aos despus de que lametodologa de los geles de dobledimensin fue introducida, el trminoproteoma fue utilizado por primera vez.Actualmente han sido sugeridas muchasderivaciones de la palabra y todas sonusadas para describir el anlisis deproteomas. El proteoma de un organismoes el complejo de protenas que estepuede producir. Los proteomas pueden ser

determinados sin ambigedad por losmtodos electroforticos o descritos demanera terica como el predicho por Blattner(14) para E.coliMG1655 el cual consiste de4405 protenas o el construido por nuestrogrupo para el plsmido simbitico de

Rhizobium NGR234. Estos proteomaspueden ser observados en las figuras 4 y 5.Estas figuras muestran el rango de pesomolecular y punto isoelctrico terico de lasprotenas de un organismo y puede ayudar adecidir una estrategia adecuada para separarptimamente las protenas, estos proteomastambin pueden revelar otras caractersticasinteresantes. Por ejemplo los proteomasparecen tener una distribucin bimodal,probablemente relacionada con el pl de lasprotenas y el pH intracelular de la clula.Proteoma, puede ser definido como elanlisis en gran escala de protenas, lo cualcontribuir enormemente a nuestracomprensin de la funcin de los genes en laera post-genmica. Proteoma se puede dividiren tres reas principales: (i) micro-caracterizacin de las protenas y de susmodificaciones postranscripcionales; (ii)proteoma de visualizacin diferencial para lacomparacin de los niveles de sntesis de lasprotenas con la aplicacin potencial en unaamplia gama de enfermedades microbianas;y (iii) estudios de las interacciones protena-protena usando tcnicas tales comoespectrometra de masas. Como es amenudo difcil predecir la funcin de unaprotena basada en la homologa a otrasprotenas o an a su estructuratridimensional, la determinacin decomponentes de una protena compleja o deuna estructura celular es central en el anlisisfuncional. Este aspecto en estudios tipoproteoma es quizs el rea de trabajo msprometedora. Despus de la revolucin en labiologa molecular, el proteoma, en los aospor venir jugar un importante papel en lacomprensin de la bioqumica de protenas yde vas metablicas.

Proteoma es un trmino usado para definirlas protenas de clulas, tejidos y organismos


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incluyendo las interacciones de estas conel medio ambiente. El perfil de expresinde protenas es el catlogo cuantitativo deprotenas sintetizadas por la clula bajouna circunstancia determinada. Porejemplo, cada gel de doble dimensin o

grupo de geles de doble dimensinobtenidos de una muestra revelan muchode un perfil particular de protenas.Obtener un perfil de expresin deprotenas completo no es tcnicamenteposible en este momento debido adificultades asociadas con la solubilidad deprotenas, pl extremos y baja abundanciade algunas de ellas.

Fenotipo proteico es un carcter oestado de una protena en especial en unacondicin y tiempo definido. Este trminofue introducido por primera vez por J.KIose(67).La informacin en el fenotipo proteicoincluye: la cantidad, la tasa de sntesis, latasa de degradacin, las modificacionespostraduccionales y la actividad de laprotena. Por ejemplo, fenotipo proteico dela fosfatasa alcalina en E.coli incluye lainformacin acerca de esta protena paracada condicin de crecimiento de la clula.Los fenotipos proteicos pueden incluirresultados de muchas fuentes. La mscompleta coleccin de fenotipos proteicosfue compilada por Garreis et al, (56) paraSaccharomyces cerevisiae.

Reguln es un grupo de protenascuya sntesis es regulada por la mismaprotena regulatoria (91) El anlisisgentico ha sido utilizado clsicamentepara encontrar y estudiar estos regulones,pero los proteomas son de mucha msutilidad para identificar los miembros deestos regulones. Por ejemplo, comparandoel perfil de expresin de protenas de unacepa silvestre y una mutante, puedenidentificarse protenas miembros de unmismo reguln.

Estimuln es un grupo de protenaspara las cuales se puede determinar la

cantidad y tasa de sntesis de estas enrespuesta a un estmulo, varios estmuloneshan sido descritos (91). Un estimuln puedeconsistir de varios regulones.

Firma protemica es el grupo deprotenas en las cuales la alteracin en su

expresin es caracterstica de una respuestaa una condicin definida o cambio gentico.Las firmas con frecuencia relacionan vasmetablicas especficas y funciones (Fig. 8).

El uso de perfiles de expresin deprotenas

La correlacin entre la expresin deprotenas y la fisiologa de la clula conduce ala obtencin de perfiles de protenas. En latabla 1a, tabla 1b y figura 9, se pudeconsultar un listado y un diagrama de flujoque ilustra una serie de procesos necesariospara la obtencin de un perfil de expresin deprotenas. El seguimiento de estos pasosproducir la informacin necesaria para laobtencin del fenotipo proteico, estmulones,regulones y firmas protemicas. Una parte dela informacin obtenida por medio deproteoma estar basada en caractersticastales como cambios en la cantidad y tasa desntesis de cada protena. Por ejemplo, unaprotena podra ser considerada en base acambios cualitativos (ausencia o presencia) oen cambios cuantitativos. Otro tipo decaractersticas a estudiar son los cambios derelacin. La tasa de abundancia entre dosprotenas en un perfil de expresin individualo entre dos subunidades de una sola protenay puede ser tomado en cuenta como uncambio en la regulacin de la funcin.

Fenotipos proteicos, estmulones,regulones y firmas protemicas pueden y hansido encontrados utilizando simples mtodosde anlisis de imgenes y tambin con lautilizacin de mtodos computarizados deanlisis de imgenes como el pdQuest y elmelanie3. La profundidad del anlisis enmicrobiologa corresponder a la profundidady metas del proyecto. Un anlisiscomprensible de cada protena que seainducida o reprimida en 1.5 veces en una


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condicin comparada con otra, puede serexcesivo si la meta fue solo realizar unreconocimiento o bsqueda de marcadoresproteicos. Por otro lado este tipo deanlisis sera justificado si la meta fuese laidentificacin de todas las protenas

controladas por una cierta protenareguladora. En algunos casos la meta es eldefinir fenotipos adicionales de unaprotena en particular. En otros casos sernecesario identificar estmulones yregulones que puedan ayudar a revelar lafirma o firmas celulares que provean lainformacin necesaria para entender lareaccin celular a un estmulo.

Estmulones son directamenteidentificados usando los perfiles deexpresin de protenas. Comparandoperfiles de expresin de una condicincontrol con una condicin de intersrevelar el estimulen de la condicin deinters. En una serie de estudioscualitativos realizados en Vibrio sp., variosestmulones fueron identificados yrevelaron la potencial funcin de la clula(97).

Los regulones son usualmenteidentificados de dos maneras: (i) usandocepas en las que es mutado el gene quecodifica para una protena regulatoria deinters, y (ii) examinando la respuesta amltiples condiciones de prueba yanalizando las protenas que son comunesen la mayora de las respuestas obtenidas.El reguln del choque por alta temperatura(heat shock), fue el primer regulnidentificado usando perfiles de expresinde protenas (92). En este caso se observel reguln al utilizar una cepa mutantecomparando su perfil de protenas con elperfil de protenas de la cepa padre.

En un estudio reciente, miembrospotenciales del reguln Pho en E.colifueron identificados cuantitativamente porcomparacin de tres estmulones, ladeprivacin temprana de fosfatos, ladeprivacin tarda de fosfatos ycondiciones de crecimiento con restriccinde fsforo (130). La intercepcin de esos

tres estmulones, el cual contiene cerca de150 protenas, incluye miembros del reguinPho. En 8 de los genes que codifican paraestas protenas ge identificada ro arriba, unasecuencia promotor similar a la secuenciaconsenso que enlaza el regulador PhoB. La

mayora de estas 150 protenas an no hansido identificadas.Firma Protemica, es un nuevo trmino

presente en una reciente publicacin (128).Pero a pesar de que el trmino es nuevo, yahan sido previamente identificadas firmasprotemicas en bacterias durante los ltimosveinte aos. Muchos de los esfuerzosrealizados y reportados en la base de datosEC02DBASE tienen como fin generar losdatos para identificar firmas protemicasrelacionadas con la mayora de estadosfisiolgicos de la clula. La meta fundamentales usar esta firma protemica paradiagnosticar el estado fisiolgico de la clulacuando el blanco de un estimulen de unafuncin o mutante es desconocido.

Ejemplos de fenotipos proteicos y firmasprotemicas

En los ltimos 20 aos se han llevado a cabonumerosos estudios buscando perfiles deexpresin de protenas en diferentesbacterias los cuales han definido los fenotiposde varias protenas como son RpIL, MetE yPhoE.

La electroforesis en geles de dobledimensin y el proteoma microbiano

Como ya mencionamos reiteradamente lameta bsica de un estudio de proteoma esidentificar en un organismo las protenasimplicadas en un proceso determinado.Generalmente, un organismo se cultiva bajodiversas condiciones experimentales y lasprotenas presentes en cada muestra seanalizan en 2-ED (Fig.6). Despus de lacomparacin de los geles en programas decomputacin diseados para ello, lasprotenas de inters se seleccionan,proporcionando datos acerca de cambios en


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la expresin de las protenas (Fig.6).Usando esta metodologa, se hanidentificado grupos funcionales deprotenas en Bradyrhizobium japonicum,cultivado bajo condiciones anaerobias yaerbicas (26) (Fig.7) y sujetas a presiones

ambientales como el estrs por calor (88).Adems, Guerrerio et al. (46) determinaronlos cambios en los patrones o modelos deexpresin de la protenas de Sinorhizobiummeliloti expresados durante la fase decrecimiento exponencial temprana y tarda,Vasseur et al. (131) investigaron lasalteraciones en la expresin de lasprotenas de Pseudomonas fragicultivadabajo una variedad de condiciones,incluyendo el choque osmtico, choque porpH, y la combinacin de tratamientos.Estos estudios han contribuidoexitosamente en el conocimiento denuevos descubrimientos en la biologa demicroorganismos, una revisin de lasaplicaciones de esta metodologa en variosorganismos microbianos se ha publicadorecientemente (128).

Tambin recientemente, fue publicadoel mapa de dos dimensiones del proteomade H. influenzae. El cual contiene 502protenas identificadas (73), las cualesfueron obtenidas de fracciones solubles dela clula, protenas de membrana (estasltimas fueron fracciones proteicasobtenidas con un sistema que utiliza dosdetergentes con la finalidad de resolver lasprotenas hidrofbicas) y protenaspresentes en baja concentracin, lascuales para su observacin y posterioridentificacin fueron enriquecidasparcialmente mediante varios pasoscromatogrficos, de esta manera en estesobresaliente trabajo se presentan 4grupos de protenas, no habindosereportado previamente algo similar enproteomas de microorganismos. Lasprotenas ms abundantes fueron factoresde elongacin y protenas de membrana.Por secuencia amino terminal se determinque en aproximadamente un 70% de lasprotenas existi un pptido seal, el cual

ya no exista en la protena caracterizada, porotro lado se estableci que aproximadamenteel 15% de las protenas identificadas eranprotenas truncadas. Esta base de datosdebe ser considerada una base muy slidapara posteriores estudios de proteoma en

H.influenzae.La respuesta a la deprivacin de fosfatoen Bacillus subtilis fue analizada usandoextractos celulares y sobrenadantes medianteelectroforesis en geles de poliacrilamida de2-dimensiones (8). Muchas de las protenasinducidas durante la deprivacin de fsforo seencuentran bajo el control de un factor sigma.Para poder definir cuales son las protenasreguladas por el reguln Pho, el cual estaconstituido por el sistema de doscomponentes formado por protenasreguladoras llamadas PhoP y PhoR, seanalizaron patrones de protenas de la cepasilvestre comparndolos con las mulantes enlos genes s/g6, el cual codifica para el factorsigma B y la mutante en phoR el cual regulapara uno de los miembros del sistema de doscomponentes. Mediante MALDI-TOF fueronidentificadas dos fosfatasas alcalinas (PhoA yPhoB), una fosfodiesterasa alcalina (PhoD),una glicerofosforil diester fosfodiesterasa(GlpQ) y una lipoprotena YdhF las cualesfueron inducidas fuertemente por lasprotenas PhoPR. Por otro lado en la fraccincitoplsmica, las protenas PstB1, PstB2 yTuaD tambin fueron inducidas por este parde genes reguladores solo que de estas ya sehaba previamente publicado este tipo deregulacin sobre ellas. Estudiostranscripcionales de los genes glpQ y ydhFcorroboraron lo ya observado medianteproteoma, la fuerte dependencia en laregulacin de estos genes por PhoPR.Tambin mediante este tipo de estudios enlas mutantes s/g6 y phoR se pudo observaralgunas protenas que se inducen durante ladeprivacin de fosfato, lo cual sugiere queestas son reguladas de maneraindependiente de PhoPR. A pesar de lavaliosa informacin presentada por estegrupo mediante un anlisis tipo proteoma delestimulen de fosfato, no todas las protenas


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que lo componen pudieron ser analizadasya que algunas de ellas se encuentranintegradas en la membrana y para ellotendrn que realizar estudios tipoproteoma con detergentes que lassolubilizen.

Unin entre el proteoma y el genoma

Un requerimiento clave para el proteomaes la habilidad para ligar las protenasindividuales resueltas mediante 2-ED a suscorrespondientes secuencias gnicas. Enparalelo con estudios de proteomas,especialmente en eucariontes, han sidodescritos algunos que pueden ser usadospara identificar estas protenas. Losprimeras aplicaciones de 2-ED examinaronla sntesis de protenas y expresin delgenoma de Escherichia coli, identificandolas protenas presentes en lisadoscelulares totales en base a su comigracincon protenas purificadas (90,105).Anticuerpos monoclonales y policlonalespueden ser usados para identificarprotenas de inters junto con tcnicasinmunolgicas. Sin embargo estasmetodologas son limitadas por ladisponibilidad de protenas purificadas oanticuerpos especficos. Mtodos msgeneralizados de identificacin, estnbasados en la determinacin de lacomposicin de aminocidos (140) o enuna secuencia parcial de aminocidos(76,125) o perfil de las masas de lospptidos que constituyen la protena(35,77). Esos datos pueden ser usadospara buscar en una apropiada base dedatos de secuencias de protenas o decidos nucleicos similitud u homologa conun gene o protena relacionado. En estoscasos, los grupos de investigacin quetrabajan con microorganismos a los cualesse les ha determinado su secuenciagenmica, sin duda alguna tienen unaenorme ventaja.

En proteomas de organismos congenomas totalmente secuenciados el usode mtodos de identificacin nicos es

suficiente, sin embargo en organismos pococaracterizados genticamente, es necesariala combinacin de dos o ms tcnicas. Porejemplo en el caso del proteoma deSpiroplasma melliferun, un miembro de laclase Mollicutes, usando 2-ED teidos con

plata, fueron detectadas 456 protenas de lascuales 156 fueron seleccionadas para unaposterior caracterizacin usando unacombinacin de un anlisis tipo composicinde aminocidos, anlisis del patrn depptidos con MALDI-TOF y secuencia aminoterminal por degradacin de Edman. Usandouna combinacin de esos mtodos, 98protenas fueron identificadas por homologacon secuencias gnicas ya existentes en ungrupo diverso de bacterias, treinta de estasprotenas no estn presentes enMycoplasma genitallium y M. pneumoniaeorganismos muy relacionadosfilogenticamente a los cuales su genoma yaha sido secuenciado (40,54). Un anlisissimilar empleando una combinacin demetodologas como composicin deaminocidos y espectrometra de masas(MALDI) fue usado para caracterizar elproteoma de Ochrabacterum anthropi (136).Sin embargo solo 45 de las protenasresueltas fueron identificadas. Mediante unaestrategia similar nuestro grupo en Rhizobiumetii se encuentra en la tarea de identificarprotenas presentes en el metabolismo celularen vida libre y en simbiosis con Phaseolusvulgaris, la estrategia en este momento seencuentra en la combinacin entreespectrometra de masas (MALDI-TOF) ysecuencia amino terminal mediantedegradacin de Edman, lo cual nos hapermitido identificar cerca de 90 protenas entotal.

Desde la primera secuencia genmicacompleta de un organismo vivo (Haemphilusinfluenzae) publicada en 1995 (33), ha habidoun rpido incremento en el nmero degenomas bacterianos secuenciados. Hasta elmomento el "Megpie Genome Proyect List"(http://www-fp.mcs.anl.gov/gaasterland/genomes.html)presenta 25 secuencias de genomas


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completamente secuenciados enprocariontes adems de 48 en proceso determinacin. A esto se adiciona a unnmero extenso de secuencias de genesindividuales que constantemente estnsiendo publicados en las bases de datos

Estas secuencias genmicas son la mejorfuente para la identificacin de protenasen proyectos de proteomas bacterianos.No obstante lo anteriormente comentadoaunado a que la secuencia genmicacompleta de al menos nueve patgenoshumanos y una bacteria de inters agrcola(Sinorhizobium meliloti) sern prontodisponibles, existen grupos deinvestigacin interesados en trabajar conmicroorganismos en los cuales unalimitada base de datos de secuenciasgenmicas han sido publicadas. En estecaso algunos grupos utilizan la bsquedacruzada con secuencias de genomastotalmente secuenciados como en al casode Listeria monocytogenes los cualesanalizaron fundamentalmente susprotenas en comparacin con lasecuencia genmica de Bacillussubtilis logrando identificar de un extractocelular bacteriano, medianteespectrometra de masas (MALDI) 13 delas ms abundantes protenas inducidasdurante su cultivo en un pH (W7). Enresumen los estudios en proteomasbacterianos solo podrn continuar si a lapar se contina la caracterizacingenmica completa de microorganismos.

Anlisis de variabi lidad gentica

Las tcnicas de biologa molecular hansido extensivamente utilizadas parainvestigar aspectos epidemiolgicos ytaxonmicos de microorganismos. Lasprotenas tambin pueden ser utilizadascomo marcadores moleculares basando elanlisis en diferencias en sus movilidadeselectroforticas. La mobilidadelectrofortica de protenas especficas(ejemplo, enzimas metablicas (60,H7) yprotenas de membrana externa (78) o

protenas de extractos celulares completos)son analizadas en geles de una dimensin (1-ED). Pero el anlisis de protenas bacterianasmediante 2-ED ha sido recientementedocumentado. Estudios comparativos deextractos celulares analizados en 2-ED de

Neisseha sp (60, 61, 66), Treponemapallidum (4, 114), Campylobacter sp., (30),Haemophillus sp., (1_7) Mycoplasma sp.,(100. 135, 138) y Plasmodium falciparum(10,H) han sido utilizados para diferenciaraislados de inters clnico. De hecho, lascepas bacterianas pueden algunas vecesmostrar un mayor grado de variabilidad por 2-ED que la observada mediante hibridizacinADN (112). Jackson et al., (60) compararonmediante 2-ED protenas de mltiplesaislados de Neissera gonorrhoea, N.meningitidis y Brahhamella catarrhalis.Comparaciones cuantitativas y cualitativas deaproximadamente 200 protenas resueltas por2-ED mostraron diferencias en los perfiles de2-ED colaborando en el establecimiento de suya reconocida clasificacin taxonmica (60).De manera similar, seis cepas deMycoplasma, que representan 4 diferentesespecies, mostraron grados equivalentes desimilitud por 2-ED al por hibridizacin de suADN (5). Un estudio extensivo realizado enListona sp., clasifico 29 aislados queconformaron 6 diferentes especies, esteanlisis fue realizado en base a las protenascelulares resueltas por 2-ED (45).

Estudios de patogenicidad bacteriana

Una meta importante en la microbiologamdica es lograr el conocimiento de como losorganismos patgenos interactan con sushuspedes para producir los procesosclnicos. Durante un largo perodo de tiempovarios grupos de investigacin han trabajadoen la identificacin de nuevos determinantesde virulencia que puedan servir como futurosobjetivos para la sntesis de vacunas o parael desarrollo de frmacos. Algunas tcnicasde biologa molecular permiten ahora a losinvestigadores analizar este tipo de eventosde manera detallada y como discutiremos


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ms adelante, los proteomas juegan unpapel importante en estos desarrollos.

Expresin de determinantes devirulencia en microorganismos

La habilidad de los microorganismospatgenos para causar enfermedades enhospederos susceptibles es determinadapor mltiples factores que actanindividualmente o en grupo durantediferentes grados de la infeccin. Porejemplo, los dos ms importantes factoresde virulencia, en Helicobacter pylor vacA ycagA, han sido identificados y mostradoque se encuentran involucrados endistintos aspectos de la patognesis deesta bacteria (9). El cagA es actualmenteun marcador de una isla de patogenicidadque contiene 29 genes (124). El proteomatiene el potencial de proporcionar unaimportante informacin que colabore en elcontrol de la expresin de esos genes enaislados de H.pylor cagA+. La capacidaddel proteoma para analizar la sntesisglobal de protenas y por extensin laexpresin gentica, convierte a estatcnica en una poderosa herramienta deestudio para comparar protenassintetizadas por cepas bacterianasvirulentas y avirulentas. La electroforesisen geles de doble dimensin puede sercatalogada como un popular mtodo parala identificacin de determinantes devirulencia al nivel de sntesis de protenas.Estudios tempranos comparando cepasvirulentas y no virulentas de Mycoplasmapneumoniae identificaron tres nuevasprotenas expresadas solo por cepasvirulentas y que se no se encuentran enlas cepas no virulentas (49). Un trabajosimilar fue realizado en B. abortus paracomparar una cepa virulenta con una cepaavirulenta que haba sido utilizada comouna vacuna as como unos aisladosdeficientes en la sntesis delipopolisacridos derivados de ambascepas.

En promedio 935 protenas fueron resueltaspor 2-ED en cada una de las cuatro cepas, unnmero menor a las 2129 protenaspotenciales predichas para el genoma de estabacteria que tiene un tamao de 3.3 X106pares de bases. Las cepas virulentas y

avirulentas mostraron una homologa a nivelde AND del 98.4 y 99.3%. La cantidad deADN equivalente a la diferencia tiene unpotencial de capacidad codificadora de 34protenas. La comparacin en 2-D de losperfiles de protenas de la cepa virulenta y laavirulenta mostr un total de 86 diferenciascualitativas y 6 diferencias cuantitativas, locual se acerca bastante a lo esperado siconsideramos las posibles entidadeselectroforticas productos de lasmodificaciones que pueden sufrir lasprotenas, estos resultados les permitir a losautores, previa identificacin de estasprotenas, caracterizar las molculasresponsables de la virulencia en estabacteria.

Seleccin de cepas virulentas yavirulentas

Una dificultad en la interpretacin de datosobtenidos en estudios comparativos como losmencionados en prrafos anteriores es laseleccin de cepas virulentas y avirulentasusadas como la base de la comparacin. Enmuchos casos las cepas virulentas y lasavirulentas son genticamente distintas y lasdiferencias en el proteoma con frecuencias noson ligadas a la virulencia. Maharias et al (79)describieron una estrategia alternativa paraminimizar este problema. Una hibridizacingenmica sustractiva fue usada para localizardiferencias genticas entre la cepa vacunaBGC de M. Bovis y aislados virulentos deM.bovis y M. tuberculosis. Tres regionesfueron deletadas en la vacuna BCGcomparada con las cepas virulentas. Unfragmento de 9.5 kb (designado RD1)ausente en seis BCG subcepas fueconservado en la cepas virulentas de M.tuberculosis y M. Boris as como en 62 de 62aislados clnicos. Anlisis de secuencia del


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fragmento RD1 revelaron la presencia deal menos 8 genes. Anlisis por 2-ED de lasprotenas expresadas por las cepasvirulentas de M. bovis y M. tuberculosismostraron un indistinguible perfil deprotenas. En contraste, la cepa BCG

expres al menos 10 protenas adicionalesy niveles inducidos en la expresin deotras. La regin RD1 fue introducida en elgenoma de la cepa BGC para generar lacepa BCG::RD1 (Fig. 10).Cuando se analizaron por 2-ED, el perfil deprotenas de la cepa BCG::RD1 fueindistinguible de la cepa virulenta de M.bovis, sugiriendo que la porcin de ADNcatalogada como RD1 causa unasupresin especfica en la sntesis deprotenas en la cepa virulenta deMycobacteria. Algunas protenas de bajopeso molecular fueron identificadas en lacepa BCG::RD1 lo cual es consistente conel tamao de los genes pequeoscodificados en la secuencia del fragmentoRD1.

Patognesis de Haemophilus influenzae

Para examinar la patognesis deHaemphilus influenzae ha sido utilizadauna estrategia gentica. H. influenzae tipoB es un patgeno humano comn quecoloniza la parte superior del tractorespiratorio pero puede invadir el torrentecirculatorio, las bacterias son expuestas auna decreciente concentracin de oxgenoy se ha propuesto que la enzimasuperxido dismutasa (SOD) juega unimportante papel en la supervivenciadurante la transicin (28). H. influenzaetipo B posee una nica superxidodismutasa (SOD) funcional que escodificada por el gene sodA. Una mutacinen el gene sodA muestra una reducidacapacidad colonizadora del tractorespiratorio comparado con la cepa padre(28)(Fig. 11). Sin embargo, esta mutante ancausa bacteriemia indicando que labacteriemia

podra proceder an en ausencia decolonizacin. Esto sugiri que la SOD no espor mucho un factor de virulencia per se perocontribuye enormemente a la supervivenciabacteriana durante la colonizacin. Lasprotenas sintetizadas por la cepa padre y la

mutante fueron comparadas por medio de 2-ED. Adicionado a la ya esperada prdida delproducto del gene sodA dos protenasmostraron cuantitativas diferencias en suexpresin(28). Ahora se sabe por anlisis de MALDI,que esas dos manchas proteicas soncodificadas por el ORF H10572. A pesar de lainformacin obtenida hasta ahora es andifcil saber como puede intervenir el productode este ORF en la patogenicidad de H.influenzae, este prrafo solo pretendemostrar como un problema de anlisis oestudio de determinantes antignicos puedeser analizado de esta manera, dejando aldescubierto lainterligada red de control gentico presentedurante la patogenicidad.

Expresin gentica in vivo

Durante la infeccin bacteriana in vivo, lospatgenos modifican su expresin genticaen un contexto espacial y temporal, esto enrespuesta a la exposicin a diferentesestmulos ambientales. Varios mtodos hansido desarrollados para examinar la expresingentica de la bacteria durante la infeccin invivo. Muchas de esas estrategiasexperimentales usan la tecnologa de ADNrecombinante para identificar y caracterizarpromotores que son especficamenteactivados durante el crecimiento bacterianocon el husped (50, 51,80, 127, 134). El proteoma puede jugar unpapel complementario a esas tcnicas en ladefinicin de expresin gentica in vivo.Deiwick y Hansel (27) desarrollaron unaestrategia experimental combinando lastecnologas de ADN recombinante yproteoma para identificar y caracterizar genesasociados a la virulencia en S. typhimurum,dentro de un modelo de salmonelosis en


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ratones. Identificando un grupo de genesque afectan la virulencia, los cuales fueronposteriormente localizados en el grupo degenes depatogenicidad conocido como isla 2(SP12). Esos datos fueron analizados

mediante el proteoma estudiando lasntesis global de protenas en respuesta aseales ambientales as como amutaciones en genes reguladorespresentes en la isla SP12. Este tipo deexperimentos lustra el potencial de laintegracin de proteoma con genoma parainvestigar la compleja y multifactorialregulacin de los determinantes de lapatognesis microbiana.

El cultivar a las bacterias enpresencia de clulas eucariticas puedeser suficiente para inducir la sntesis deprotenas no expresadas por la bacteriacuando es cultivada sola en un mediodefinido. Durante este tipo de cocultivos deCampylobacter jejuni y la lnea celular deepitelio INT407, la bacteria sintetiz almenos 14 nuevas protenas nuevas. Estoscambios en la sntesis de protenas fueronanalizados mediante 2-ED combinando elmareaje radiactivo e inmunotransferencia(69, TV). La induccin de estas14 protenas tambin se observa en lasbacterias previo cultivo con mediocondicionado, es decir medio en el cual lasclulas epiteliales fueron previamentecultivadas (68). Esto sugiere que lasntesis de novo de esas protenas esrequerida como parte de un programa deinternalizacin de la bacteria en las clulasepiteliales.

Bacterias intracelulares cultivadas enfagosomas celulares al ser expuestas auna variedad de condiciones adversas,como acidez extrema, oxgeno y nutrientesen bajas concentraciones inducen unaserie de respuestas que han sidomonitoriadas mediante proteomas (71).Durante la infeccin de macrfagos,Legionella pneumophila, Brucellaabortus y S. typhimurum permanecenasociadas con fagosomas y pueden

interferir con su maduracin. Una observacinconsistente en esas bacterias patgenasintracelulares es que la sntesis de ciertasprotenas es inducida o reprimida durante elcrecimiento intracelular comparadas con elcrecimiento bacteriano en medios de cultivo

artificiales. Adems, un nmero de protenasbacterianas inducidas durante su crecimientointracelular son tambin alteradas en subiosntesis bajo condiciones de estrs in vitro.La sntesis de protenas bacterianasconocidas como protenas de "heat shock"como son GroEL y DnaK son inducidasdurante la infeccin de B.abortus amacrfagos de bovino (109). Las mismas dosprotenas son parte del espectro de protenasinducidas por S. typhimurum durante lainfeccin a macrfagos (16). Treinta y una delas (71) protenas bacterianas inducidasdurante la infeccin de L. pneumophila amacrfagos son tambin inducidas encondicin de estrs in vitro. Estas incluyen aGroEL y GroES (1). Una protena catalogadacomo protena global de estrs llamadaGspA, es expresada por L. pneumophila enrespuesta a todas las condiciones de estrsprobadas as como durante la infeccin ,sugiriendo que esta bacteria en este medioambiente particular puede estar expuesta amltiples y simultneas condiciones de estrs(2, 71).

La respuesta del hospedero analizada conproteomas

Una gran cantidad de progresos han sidologrados con el uso de proteomas parainvestigar la respuesta inmune del husped ala infeccin bacteriana, 2-ED combinados coninmunotransferencia son comnmenteusados como una herramienta para investigarla respuesta inmune celular y humoral contrapatgenos microbianos (87, 143). Lacombinacin de estas tcnicas conanticuerpos policlonales han sido utilizadasen un gran rango de bacterias, por ejemploen Borrelia burgdorferi, Streptococcuspyogenes (75) y Brucella ovis (123). Laidentificacin de las principales protenas


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inmunognicas es el camino lgico paradefinir el rango de anticuerpos especficospresentes en el suero humano durante losprocesos infecciosos. Snchez-Campillo etal. (113) utilizaron esta metodologa en elproceso inflamatorio genital ocasionado

por Chiamydia trachomatis detectandomediante anticuerpos una gran cantidad deprotenas inmunognicas entre las cualesse encontraron protenas de membranaadems de GroEl y DnaK. Adicionalmente4 nuevas protenas que reaccionan con elsuero fueron identificadas. La frecuenciaen la cual esos antgenos fueronreconocidos por el suero, vari entrepacientes, sin embargo todos reconocieronuna protena de membrana conocida comoOMP2. Estos resultados pueden colaborarposteriormente en la sntesis de vacunascontra patgenos bacterianos.

La respuesta inmunolgica celularmediada por clulas T es el componentems importante en la infeccin producidapor M. tuberculosis. La identificacin de lasprotenas bacterianas que inducen larespuesta de clulas T-dependiente serun resultado importante en el futuro, el cualcolaborar en el desarrollo de nuevas yms eficientes vacunas. Algunos gruposde investigacin han demostrado quedurante el crecimiento en medios de cultivoespecficos M. tuberculosis produceprotenas que pueden inducir la respuestaprotectora mediada por clulas T (6, 72,101, 111). Sonnenberg y Belisie (121)detectaron mediante 2-ED 205 protenasen un proteoma de M. tuberculosis, 34 deellas fueron identificadas con base en sureaccin con anticuerpos monoclonalesespecficos y con el auxilio de la secuenciade aminocidos. Un miembro de estegrupo proteico previamente reconocidocomo un antgeno humoral importante (72),fue identificado comoKatG la cual es una importante protena enla defensa de la clula al estrs oxidativo.

Patognesis y resistencia a antibiticos

La aparicin de la resistencia a antibiticos enun nmero alarmante de patgenos humanosha hecho necesaria su investigacin. Elestudio mediante proteomas ha facilitado elconocimiento de los cambios fisiolgicos enun organismo que conducen a la

patogenicidad, a la resistencia a antibiticosy/o a una inmuno-respuesta. Medianteproteomas se han realizado recientementeestudios sobre la patogenicidad de Candidaalbicans (94) e investigaciones adicionaleshan identificado en sueros humanos variasprotenas inmunogenticas (108). Otrosgrupos han identificado las protenasimmunoreactivas de Chiamydia trachomatis(113) y alteraciones en los patrones deprotenas expresadas por Streptococcuspneumoniae resultado de la resistencia aeritromicina (18) (Fig.12) . En anlisiscomparativos, los proteomas de diversascepas de microorganismos se resuelven y secomparan. Cuando se aplicaron este tipo decomparaciones a cepas de Mycobacterumtuberculosis y Mycobacterium bovis BCG,fueron identificadas protenas que difieren enintensidad y posicin, proporcionandoinformacin importante acerca de lasdiferencias en patogenicidad de ambas cepasde Mycobaterium (65). La meta de estosestudios con proteomas es identificar lasprotenas implicadas en los procesosinfecciosos, colaborandoesperanzadoramente en el desarrollo detratamientos mdicos.

Helicobacter pylori es un importantepatgeno gstrico del hombre ya que infectaa la mitad de la poblacin mundial, esteagente causa desordenes gastrointestinales,como gastritis crnica, lcera pptica ycncer estomacal. Despus de la secuenciacompleta del genoma de dos cepas, 26695 yJ99, un grupo de investigacin se dio a latarea de analizar la parte funcional de lainformacin gentica, el proteoma (64). Lasprotenas expresadas por cepas de H. pylori26695, J99 y SS1 fueron resueltas en gelesde doble dimensin de alta resolucin. Msde 1800 especies proteicas fueron obtenidasde extractos celulares. Mediante MALDI se


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identificaron 152 protenas, incluyendo 9de ellas que fueron caracterizadas comofactores de virulencia y 28 antgenos. Lascepas investigadas presentaron pocasprotenas con la misma movilidadelectrofortica, esto se debe a que

modificaciones en su secuencia de DNArepercuten en un intercambio deaminocidos en la secuencia de lasprotenas y por consecuencia en lamovilidad electrofortica en el gel. Unestudio preliminar realizado conanticuerpos producidos por pacienteshumanos, contra una membrana a la cualse haban electrotransferido las protenaspresentes en un gel, mostr que este tipode estrategias puede ser ideal paraidentificar protenas con valor diagnstico oteraputico. El patrn de geles de dobledimensin con las protenas observadasas como la base de datos obtenida sepueden consultar en la siguiente direccinde internet (http://www.mpiib-berlin.mpg.de/2D-ED/). El conocimiento delas bases de datos generadas de estudiostipo proteoma son un instrumento efectivopara la identificacin de factorespatgenos, antgenos de potencial valordiagnstico o curativo, lo cual se puedeobservar en el siguiente prrafo.

H. pylori, muestra un nico y complejopatrn de componentes moleculares quese unen al complejo de carbohidratospresentes en la mucosa del husped yotros tejidos.Estas molculas de adhesin sonconocidas como adhesinas. Estasadhesinas y otras protenas asociadas amembranas son importantes objetivos enel desarrollo de vacunas.La identificacin y caracterizacin deprotenas expresadas por la superficiecelular de esta bacteria, es un pre-requisitopara el desarrollo de vacunas diseadaspara interferir en la colonizacin bacterianade tejidos del husped. Este grupo deinvestigacin desarroll una interesantemetodologa para resolver mediante 2-EDel complejo proteico expresado por la

bacteria (95). Este grupo logr identificar 40protenas de una muestra de H. pylori, deeste grupo un tercio son protenas asociadasa membrana, entre ellas se encuentra unaprotena membranal de baja abundancia(Leb) la cual ha sido identificada como una

adhesina. El uso de la metodologa delproteoma es catalogado como un mtodo deidentificacin de protenas expresadasdurante la virulencia, as como protenasblanco de vacunas en este y otrosmicroorganismos patgenos.

Mycoplasma genitalium es el mspequeo miembro de la clase Mollicutes, estemicroorganismo tiene un genoma de solo 580kilobases, el cual es potencialmente capaz decontener 480 genes, por lo anterior ha sidotomado como un excelente modelo para: i)conocer la unidad mnima metablicanecesaria por una clula viva ii) conocermediante estudios tipo proteoma su patrn deprotenas. Por lo anterior Wasinger ycolaboradores(136) realizaron un trabajo de investigacinque presenta 73% de las protenaspotencialmente factibles a ser expresadas poresta bacteria, de las cuales lograron analizarel 33%. En resumen, mediante el uso de 2-ED y una combinacin de 4 diferentes tiposde geles de doble dimensin, con diversasventanas de pl, lograron resolver 427protenas presentes en el crecimientoexponencial de la bacteria, de este grupo 201se presentan en abundancia suficiente paraser observadas mediante tincin con plata yser identificadas mediante espectrometra demasas, lo cual produjo un total de 158protenas identificadas. Observndose unadisminucin del 42% en la expresin deprotenas durante la fase estacionaria delcrecimiento, siendo las protenas msabundantes DnaK,GroEL, ADN-girasa mientras que lasprotenas ribosomales disminuyeron en suabundancia en esta fase del cultivo. De estamanera se concluye que la tecnologa delproteoma puede proveer una perspectiva enla bioqumica y actividad metablica de esteorganismo.


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Predicciones de la funcionalidad delgenoma mediante proteomas

El DNA cromosomal contempla dosprincipales funciones en la clula: sirve

como templado para replicacin ytemplado para transcripcin. Existen unagran cantidad de actividades (tales comoreparacin del DNA y segregacin delcromosoma) que muestran que elcromosoma es propiamente mantenido ycuidado para cumplir con sus funcionesbsicas (133). El fenotipo proteico de unaprotena celular, llamada RecA, incluye unestado de induccin en todas lascondiciones que son conocidas porcomprometer la estructura o funcin delcromosoma (129). En la figura 13mostramos la induccin de la protenaRecA en cultivos de Escherchia colitratados con seis diferentes qumicos.Mientras esta protena puede ser usadacomo un factor inicial de prdida defunciones cromosmicas, el examenminucioso de esas seis condiciones, revelafirmas celulares especficas. Veintidsprotenas fueron encontradas (por examenvisual) que pueden servir como indicadorespara separar esos seis agentes en cuatrogrupos. Un anlisis ms comprensible deesas imgenes se encuentra en estemomento en desarrollo (VanBogelen et al,comunicacin personal) y podrn definir lasfirmas celulares especficas producidas porla presencia de cada uno de los agentes.Como algunos de los blancos de losagentes qumicos son exclusivos deorganismos microbianos esas firmascelulares pueden ayudar a seleccionarcompuestos que puedan ser de utilidadcon fines teraputicos.

A pesar del valor y de la enormeinformacin que la electroforesis en gelesde doble dimensin ha generado en elcampo del proteoma, existen algunasdeficiencias en esta tecnologa. A pesar deque hasta 1400 protenas puedenresolverse en un gel, en cada estudio,

hasta el momento son muchos ms lasprotenas que se resuelven que las que sehan logrado realmente identificar. Porejemplo, en un estudio que correlaciona laabundancia de RNAm y la expresin deprotenas en el S. cerevisiae, Futcher et al.

(42) resolvieron 1400 protenas, perosolamente lograron identificar 148 protenas.En un genoma de aproximadamente 6000protenas, sus resultados solo proporcionaroninformacin del 2.5% del potencial proteomade la levadura. El anlisis de las 1400protenas es altamente consumidor entiempo, porque cada protena se debeextraer, digerir y analizar individualmente.Como ya mencionamos una porcinsignificativa del proteoma, especialmente deprotenas de baja abundancia y asociadas amembrana, son raramente observadas eneste tipo de estudio. Actualmente algunosgrupos de investigacin realizan intentos porresolver estas deficiencias, en el caso de lasprotenas de baja abundancia, se trabajamediante estudios cromatogrficos previos altratamiento de la muestra en geles de dobledimensin, esto es con la finalidad deenriquecer las protenas de baja abundanciaque no han sido observadas en gelesconvencionales.Fountoulakis et al. (36) mediantecromatografa en columna de un lisadocelular de E.coli identificaron 269 protenasde 800 obtenidas del eludo de la columna decromatografa.En stas protenas, se incluyen variasprotenas de baja abundancia que no habansido detectadas mediante electroforesis engeles de doble dimensin (36).

En estudios adicionales, Fountoulakis etal. (37) usando cromatografa deinteracciones hidrofbicas enriquecieron unamuestra de protenas de baja abundanciaobtenida de un extracto celular deHaemophilus influenzae. En este caso,solamente las protenas que se unen a lamatriz de la columna fueron enriquecidas, yesto incluy a protenas de alta y bajaabundancia. Aunque el enriquecimiento


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mencionado es prometedor, es necesariauna metodologa ms general queidentifique una mayor cantidad deprotenas de baja abundancia.

Otro de los problemas que ms nospreocupan a los que trabajamos con

proteomas, es la baja solubilidad de lasprotenas unidas a la membrana celular lascuales al no solubilizarse completamenteprevienen su resolucin en geles de dobledimensin, los recientes avances ensolubilizacin de protenas de membranashan sido publicados (53). Estos mtodosson prometedores e incluyen la extraccinde protenas con solventes orgnicosseguido por la solubilizacin condetergentes, lo anterior previo alcorrimiento electrofortico en geles dedoble dimensin (86) por otro lado esimportante mencionar que actualmente seestn sintetizando nuevos detergentes conuna mayor eficiencia en la solubilizacin deprotenas unidas a membrana (20). Apesar de este tipo de esfuerzos hasta lafecha muy pocas protenas de membranahan sido identificadas, siendo esta unarea que necesita un fuerte desarrolloadicional.

Nuevos mtodos de separacin deprotenas

Las dificultades para detectar e identificarprotenas de baja abundancia y asociadasa membrana han hecho necesario eldesarrollo de nuevas tecnologas dirigidasa la resolucin de este tipo de protenas.Estas metodologas estn demostrandoser ms reproducibles y similares enrapidez de procesamiento que laelectroforesis en geles de doble dimensin.El isoelectroenfoque capilar (81) acopladoa la espectrometra de masas(MS) han sido poco utilizados enproteomas, para la separacin de mezclascomplejas de protenas (118), sin embargohan demostrado ser potencialmente tilespara una rpida identificacin de hasta1000 protenas (63). Cuando se han

aplicado estas metodologas a pequeasmezclas de protenas, como extractos deribosomas, se detectaron e identificaron entreel 80 y 90% de las protenas presentes en elribosoma de S. cerevisiae(126).

Proteomas cuantitativos

Dos nuevos mtodos dirigidos a lainvestigacin de proteomas cuantitativos hansido desarrollados en el ltimo ao (82).Psa-Tolic et al. (104) y Oda et al (98) handesarrollado mtodos para marcarmetablicamente protenas de clulascultivadas en presencia de ^N o ^N como lafuente nica del nitrgeno. El producto ofrecemuestras de protenas idnticas solo queunas pueden ser catalogadas como protenas"pesadas" o"ligeras" dependiendo del tipo de istopoincorporado, esto permite la cuantificacinrelativa de una protena entre dos muestras alser estas analizadas por MS. Oda et al.(98) cultivaron dos cepas de levadura, unamutada en el gene que produce el productocatalogado como Cln2 y la cepa silvestre,ambas fueron cultivadas bajo idnticascondiciones (excepto que la nica fuente delnitrgeno para una de ellas ge ^N). Despusde reunir los dos extractos celulares estosfueron fraccionados por cromatografa lquidade alta presin y resueltos por electroforesisde geles de doble dimensin-SDS. Lasprotenas obtenidas del gel fueron extradas ydigeridas e identificadas por MS. Lasdiferencias en masas de protenas idnticaspermitieron a Oda et al. determinar laabundancia relativa de 12 protenas en cadamuestra (98). Aunque esta metodologa es degran alcance, la limitacin que presenta enque el mareaje metablico est limitado agrupos de bacterias que puedan sercultivadas bajo tales condiciones.Gygi et al. (47) han desarrollado un nuevomtodo para la cuantificacin de protenaspresentes en proteomas, en este mtodo elresiduo del cistena de las protenas fueisotpicamente marcado despus del


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crecimiento de la clula (Fig.2). Despusde cultivar la levadura en etanol ogalactosa (como fuente de carbono), lasprotenas de cada condicin decrecimiento fueron extradas y lamodificacin en los residuos de la cisterna

fueron analizados y clasificados como"pesados" o "ligeros"(Fig.2b). Gygi et al.(47) determinaron entonces los cambios enprotenas especficas, resultando delcrecimiento en diversas fuentes decarbono. Estrategias de mareajemetablico como las anteriores se puedenaplicar a cualquier sistema ya que lasprotenas son modificadas posteriormentea su sntesis durante el crecimiento decelular.

Conclusiones

Las ventajas de metodologas deproteomas en organismos procariontes yeucariontes han sido mencionadas demanera detallada en la literatura (55, 58,59, 141). Las ventajas incluyen lacapacidad de esta tcnica para haceranlisis global del genoma analizando loscambios en su perfil de protenas (7, 128)as como las ventajas que ofrece elanlisis de modificacionespostranscripcionales de las protenas, queno pueden ser observadas con elconocimiento de la simple secuencianucleotdica (139). La identificacin post-electrofortica de las protenas ha sidoparcialmente resuelta con el desarrollo detcnicas de mapeo peptdico medianteMALDI-TOF y claro, con el desarrollo yculminacin de algunos proyectosgeonmicos.

El Proteoma de esta manera hacolaborado la investigacin en la nuevabiologa de microorganismos. Lacombinacin del proteoma con otrasherramientas disponibles permite al bilogomoderno un acercamiento al conocimientointegral de la clula. Sin embargo, todavaexiste la necesidad de un desarrollotecnolgico adicional adems es

importante considerar que desde mi juicio y latecnologa actual est subutilizada. Porejemplo, los actuales mtodos deinvestigacin que permiten conocer lasmodificaciones post-traduccionales de lasprotenas apenas se encuentran en desarrollo

(139).Actualmente se han realizado dos anlisiscon proteomas dirigidos a estudios sobrefosforilacin de protenas de fibroblastos deratn (43, 122), pero esta es una rea pocoexplorada, especialmente en el proteomamicrobiano. Debido a las deficiencias en laelectroforesis en geles de doble dimensin,avances tecnolgicos en electroforesis capilaraunados al MS, se estn perfeccionando paraaumentar la capacidad de procesamiento deun anlisis tipo proteoma. Finalmente, con elsurgimiento del proteoma cuantitativo, sernposibles las investigaciones que analicen lasalteraciones celulares a nivel de protenas.

En el futuro, cuando el investigador quetrabaje con proteomas pueda determinarsemicuantitativamente las 2000 protenas quesean resueltas de una muestra celular, elproteoma llegar a ser tan importante para labiologa como el anlisis cuantitativo de laexpresin de los genes.

Proteoma Sergio Encarnacion

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