Aminoácidos y Proteínas

Temario:

- Curva de titulación de aa.

- Espectrofotometría.

- Cuantificación de proteínas.

- Electroforesis.

- Técnicas de purificación.

- Técnicas de secuenciación de proteínas.

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Cuantificación de proteínas

- Espectrofotometría directa (capacidad intrínseca de las proteínas de

absorber luz a 280 nm)

- Método de Lowry (reacción química)

- Método de Bradford (fijación de un colorante)

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EspectrofotometriaLey de Lambert-Beer

A= lC

A = absorbancia del cromóforo a una longitud de onda de determinada. = absortividad molar (coeficiente de extinción molar), absorbancia de una solución 1M del compuesto (sv, T, ). Unidades: litro/mol x cml = longitud del camino óptico en la cubeta (en cm).C= concentración del cromóforo en la solución, en moles/litro.

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En el caso de las proteínas los cromóforos son los residuos de aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe) y las uniones peptídicas.

DO 280 máximo de absorción aa aromáticos y no absorbe el sv (agua)

Cromóforo Long. de onda para la

absorción máxima (nm)

Absortividad molar

(l/mol.cm)

Triptofano 280 5.600

Tirosina 275 1.400

Fenilalanina 257 200

Unión peptídica 205 4-8.000

Puente disulfuro 250 300

Grupos aromáticos (280 nm) Unión peptídica (205 nm)

VENTAJAS Gran espectro de sensibilidad Proteínas sin grupos

aromáticos

DESVENTAJAS Interferencia de ácidos

nucleicos u otros compuestos

aromáticos

Detección de otros compuestos

químicos (solventes, etc.)

Método de Lowry

Solución I (1ml c/ 0.2 ml de muestra): Na2CO3 2% en NaOH 0.1M + tartrato de Na+ y K+ 2% + CuSO4 1%.Solución II (0.1 ml c/ 0.2 ml muestra): Rvo de Folin (ácido fosfotungstico-fosfomolibdico), color amarillo.

Método colorimetrico para cuantificar proteínas.Paso 1: formación de un complejo entre la proteína y el Cu+2 del reactivo en medio alcalino. Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un color azul claro. La formación de estos complejos provoca el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndo los residuos de Tyr que van a participar en la 2º etapa de la reacción.

Paso 2: reducción del Rvo de Folin dando productos coloreados que pueden leerse a 750 nm.El principal constituyente del reactivo de Folin es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenólicos de las Tyr da lugar a un complejo de color azul intenso.

Procedimiento

• 0.2 ml dilución muestra + 1 ml sc I 10 min• 0.1 ml Rvo Folin 30 min formación de complejos azules• Leer DO 750 nm

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Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de Lowry

1) Curva de calibración: proteína patrón Albúmina 0.4 mg/ml

• Preparar distintas diluciones de la solución de albúmina patrón

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (g                        

Absorbancia                          

• Calcular el contenido de albúmina en cada uno de los tubos

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (g 0 4 4 8 8 12 12 16 16 20 20 24 24

Absorbancia                          

• Agregar los reactivos y medir la DO a 750 nm de cada uno de los tubos

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (g 0 4 4 8 8 12 12 16 16 20 20 24 24

Absorbancia 0 0,065 0,06 0,102 0,098 0,172 0,174 0,219 0,22 0,255 0,263 0,309 0,2966

• Graficar

Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de Lowry

Blanco T1 T1* T2 T2* T3 T3* T4 T4* T5 T5* T6 T6*

Albumina (l) 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 60 60

Agua (l) 200 190 190 180 180 170 170 160 160 150 150 140 140

Albumina (g 0 4 4 8 8 12 12 16   20 20 24 24

Absorbancia 0 0,065 0,06 0,102 0,098 0,172 0,174 0,219 0,22 0,255 0,263 0,309 0,296

Pr (g)= 76.43xDO – 0.361

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Ejemplo de cuantificación de proteínas por el método de Lowry

1) Muestra problema:

• Preparar distintas diluciones de la muestra / tomar distintos volúmenesmuestra 1: homogenato de hígado muestra 2: mitocondrias de hígado muestra 3: mitocondrias de testículo

Dilución 1/50 Dilución 1/20 Dilución 1/20

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

muestra (l) 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50

Agua (l) 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150

Absorbancia            

Proteína (mg/ml)                                    

     

• Agregar los reactivos y medir la DO a 750 nm de cada uno de los tubos

muestra 1: homogenato de hígado muestra 2: mitocondrias de hígado muestra 3: mitocondrias de testículo

Dilución 1/50 Dilución 1/20 Dilución 1/20

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

muestra (l) 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50

Agua (l) 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150

Absorbancia 0,07 0,06 0,13 0,131 0,316 0,314 0,103 0,082 0,286 0,199 0,458 0,491 0,08 0,072 0,119 0,132 0,291 0,297

Proteína (mg/ml)                                    

     

muestra 1: homogenato de hígado muestra 2: mitocondrias de hígado muestra 3: mitocondrias de testículo

Dilución 1/50 Dilución 1/20 Dilución 1/20

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

muestra (l) 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50 10 10 20 20 50 50

Agua (l) 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150 190 190 180 180 150 150

Absorbancia 0,07 0,06 0,13 0,131 0,316 0,314 0,103 0,082 0,286 0,199 0,458 0,491 0,08 0,072 0,119 0,132 0,291 0,297

Proteína (mg/ml) 24,2 21,1 23,7 24,1 23,8 23,6 15,0 11,8 21,5 14,8 13,9 14,9 11,5 10,3 8,7 9,7 8,8 8,9

23,4 14.1 9,7

• Calcular usando la curva de calibración el contenido de proteína de cada muestra

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Método colorimétrico para dosar proteínas.Utiliza el colorante Azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250), el cual se une a las proteínas en medio ácido formando complejos azules que presentan un máximo de absorción a 595nm.

Método de Bradford

Rvo de Bradford : Azul de coomasie G-250,etanol , Ac. fosfórico , agua.

Procedimiento

• 0.2 ml dilución muestra + 1 ml Rvo Bradford 10 min formación de complejos azules• Leer DO 595 nm

Electroforesis

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Criterio de pureza (Qué pasa si corriendo con SDS aparecen dos bandas?)Determinación de PM (SDS-PAGE)Determinación de PI (isoelectroenfoque)Criterio de identificación (western blot)

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Diagnóstico de Anemia falsiforme o Drepanocitica (Hemoglobinopatía S)

Electroforesis sobre acetato de celulosa a pH: 8.6

Revelado con Coomasie-Blue vs Revelado con Ag

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Técnicas de purificación de proteínas

Por solubilidad:• precipitación isoeléctrica• precipitación por salado

Por tamaño:• diálisis• centrifugación en gradiente de densidad• cromatografía de exclusión molecular

Por carga:• cromatografía de intercambio iónico• electroforesis bidimensional

Por afinidad:• cromatografía de afinidad

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Muestras:Órganos o tejidosCultivos celularesProteínas recombinantes

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Diálisis Cromatografia de exclusión molecular

Centrifugación en gradiente de densidad

Cromatografia de intercambio iónico

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Intercambiador catiónico

Intercambiador aniónico

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Cromatografia de afinidad

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1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

2. ¿ Cómo determinamos que la proteína que purificamos es la que nos interesa?

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1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

La actividad específica es una medida de pureza: aumenta durante la purificación de la proteína y llega a ser máxima y constante cuando la proteína está pura.

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1. ¿ Cómo determinamos que la proteína está pura?

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2. ¿ Cómo determinamos que la proteína que purificamos es la que nos interesa?

Medida de la actividad enzimática

Western blot

Ensayos biológicos

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Western Blot como criterio de identificación

SDS-PAGE las calles corresponden a:1-marcador de PM2-cultivo sin inducir3-cultivo inducido con 0.4 mM de IPTG4-sobrenadante ingreso a columna G505-pellet (descartado)6-ACBP eluída 10 l7-ACBP eluída 18 l8-Homogenato de hígado

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1- s/i2- c/i IPTG 0,05 mM3- pellet del lisado4- sobrenadante del lisado DO= 1,4265- sobrenadante mtra+resina agito O/N 6- descarte del primer lavado 7, 8- lavado para elusion de prot inespecíficas hasta DO< 0,05 (> [imidazol]) 9, 10, 11, 12- elusion T7 RNA polimerasa DO= 1,770; 1,223; 0,439; 0,211

1- marcador PM 500 pb 2- transcripción con T7 comercial3- transcripción con nuestra T7 0,5 ul4- idem con 0,9 ul

1- marcador PM 250 pb 2- pcr como control de PM3- transcripción del molde de pcr4- idem pero con mas [NTP’s]

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Métodos para determinar el PM

SDS-PAGE

Cromatografía de exclusión molecular (proteína nativa): graficar log PM vs tiempo o volumen de elusión

Equilibrio de sedimentación (proteína nativa):

S = m(1- dmedio/dpartícula) f

S = dx/dt w2x

S: coeficiente de sedimentación (seg)m: masa de la partículaf: coeficiente de fricciónx: distancia desde el centro de rotaciónw: velocidad angular de rotación