Protein folding

Centrala Dogmat

DNA RNA Protein

Anfinsens klassiska experiment

Proteinstrukturer

Faktorer som påverkar den nativa strukturen

∆∆∆∆G = ∆Η∆Η∆Η∆Η−−−−Τ∆Τ∆Τ∆Τ∆S

Termodynamisk förklaring

För stabilisering krävs: ∆∆∆∆H blir mindre eller ∆∆∆∆S större

∆∆∆∆G = - RT ln K

K = [veckat protein] / [ uppveckat protein]

Vad menas med ett proteins stabilitet?

Uppveckat protein Veckat protein

Hur mäter man protein stabiliteten?

Tm eller Cm

CD: circular dichroism

• The far-UV (190-240nm) CD spectrum of proteins can reveal important characteristics of their secondary structure. It can be used to study how the secondary structure of a molecule changes as a function of temperature or of the concentration of denaturing agents (Guanidine hydrochloride or urea). In this way it can reveal important thermodynamic information such as ∆G and Tm.

• The near-UV CD spectrum (>250 nm) of proteins provides information of the tertiary structure .

CD spectrometer

Fluorescens

Stability using ANS as an extrinsic fluorescent probe

80604020

2,6e+0062,4e+0062,2e+006

2e+0061,8e+0061,6e+0061,4e+0061,2e+006

1e+0068e+0056e+0054e+0052e+005

0

Temperature (C)

Flu

ores

cenc

e In

tens

ity (

A.U

)

Binding of Methotrexate to TPMT by displacement of ANS

Bestämma 3d strukturen av ettprotein

Proteinkristaller

Bestämma 3D strukturen av ett protein

Varför stabilisera proteiner?

• Förhindra enzymer från nedbrytning• Förhindra uppveckning i närvaro av

detergent• Öka termostabiliteten

Exempel på stabiliserade proteiner

• Enzymer i bakning

• Enzymer i tvättmedel

Strategier för att förändra proteinstabiliten

• Riktad mutagenes (rationell design)• Slumpartad mutagenes (random design)

Kloning av protein

5’ ATGGCCCATCACTGGGGGTACGGCAAACACAACGGACCTGAGCACTGGCATAAGGACTTCCCCATTGCCAAGGGAGAGCGCCAGTCCCCTGTTGACATCGACACTCATACAGCCAAGTATGACCCTTCCCTGAAGCCCCTGTCTGTTTCCTATGATCAAGCAACTTCCCTGAGGATCCTCAACAATGGTCATGCTTTCAACGTGGAGTTTGATGACTCTCAGGACAAAGCAGTGCTCAAGGGAGGACCCCTGGATGGCACTTACAGATTGATTCAGTTTCACTTTCACTGGGGTTCACTTGATGGACAAGGTTCAGAGCATACTGTGGATAAAAAGAAATATGCTGCAGAACTTCACTTGGTTCACTGGAACACCAAATATGGGGATTTTGGGAAAGCTGTGCAGCAACCTGATGGACTGGCCGTTCTAGGTATTTTTTTGAAGGTTGGCAGCGCTAAACCGGGCCTTCAGAAAGTTGTTGATGTGCTGGATTCCATTAAAACAAAGGGCAAGAGTGCTGACTTCACTAACTTCGATCCTCGTGCCTCCTTCCTGAATCCCTGGATTACTGGACCTACCCAGGCTCACTGACCACCCCTCCTCTTCTGGAATGTGTGACCTGGATTGTGCTCAAGGAACCCATCAGCGTCAGCAGCGAGCAGGTGTTGAAATTCCGTAAACTTAACTTCAATGGGGAGGGTGAACCCGAAGAACTGATGGTGGACAACTGGCGCCCAGCTCAGCCACTGAAGAACAGGCAAATCAAAGCTTCCTTCAAATAA-3´

Genen för humant karboanhydras

Genetiska koden

Riktad mutagenes

Riktad mutagenes

Modellproteiner

• T4 Lysozym• Cold-shock protein• Karboanhydras

T4 Lysozym

• Ett av de mest välstuderade proteinerna om protein stabilitet

• Över 2000 mutanter och 400 kristallstrukturer

• Erhållit klara samband mellan struktur och funktion (stabilitet)

T4 Lysozym

Stabilisering av positiva laddningar i helix,t.ex mutant S38D

Minska entropin i det uppveckade tillstå ndet, t.ex mutant A82P

Optimera hydrofobinteraktion t.ex mutant I3L

Förbättra helixpropensitet,t.ex mutant V131A

Design av stabilt protein

Bs-Csp mesofil Bc-Csp termofil

Jämförelse mellan protein från mesofil och termofil organism

Hur stabilisera mesofila Bs-Csp ?

10 20 30 40 50 60

MLEGKVKWFNSEKGFGFIEVEGQDDVFVHFSAIQGEGFKTLEEGQAVSFEIVEGNRGPQAANVTKEA

MQRGKVKWFNNEKGYGFIEVEGGSDVFVHFTAIQGEGFKTLEEGQEVSFEIVQGNRGPQAANVVK-L

Bc-Csp, termofil, Tm=76.9 Bs-Csp, mesofil, Tm=53.6

Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313, 343-357

Resultat av rationell design

E66LE3R

Ref: D.Perl & F.X Schmid, J.Mol.Biol. (2001), 313, 343-357

Proteinveckning

6420

1

0 ,8

0 ,6

0 ,4

0 ,2

0

[G u H C l] (M )

Fra

ctio

nal c

hang

e

Uppveckat protein Molten globule Veckat protein

Stabilitet HCA II och NGCA

6420

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

[GuHCl] (M)

Fra

ctio

nal c

hang

e

6420

1

0 ,8

0 ,6

0 ,4

0 ,2

0

G u H C l (M )

Fra

ctio

nal c

hang

e

Jämförelse HCA II & NGCA

Ala 23Leu 203

N-terminal

C-terminal

A B

Design av disulfidbrygga

Ref: Mårtensson, L-G, Karlsson; M & Carlsson U. (2002) Biochemistry 41, 15867-15875

Energy minimizedA23C/L203C

Ramachandran plots

Stabilitet disulfidvariant A23C/L203C

43210

354352350348346344342340338336

(GuHCl] (M)

A23C/L203C red.

A23C/L203C ox.

HCA II pwt

Ref: Karlsson, M., Mårtensson, L.-G., Olofsson P. & Carlsson, U. (2004) Biochemistry In press

Slumpartad design

• Förändra genen helt slumpartat• Leta efter den gen som ger ett protein med

hög stabilitet• Selektionsproblem

Framtiden?

• Förutsäga 3D struktur frånaminosyrasekvensen

• In silico design