PROTEASAS E INHIBIDORES DE PROTEASAS - UCO · 2020. 1. 12. · Tesista: Ezequiel Darío Bigatton...
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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA INSTITUTO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO PROTEASAS E INHIBIDORES DE PROTEASAS BÚSQUEDA IN SILICO, ENSAYOS DE ACTIVIDAD Y ANÁLISIS PROTEÓMICO EN QUERCUS ILEX BIGATTON, Ezequiel Darío Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Directora: Dra. Biol. Castillejo Sánchez, María Ángeles Codirectora: Dra. Ing. Escandón Martínez, Mónica 28 de junio de 2019
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UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
INSTITUTO DE ESTUDIOS DE POSTGRADO
PROTEASAS E INHIBIDORES DE PROTEASAS
BÚSQUEDA IN SILICO, ENSAYOS DE ACTIVIDAD Y ANÁLISIS
PROTEÓMICO EN QUERCUS ILEX
BIGATTON, Ezequiel Darío
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Directora: Dra. Biol. Castillejo Sánchez, María Ángeles
Codirectora: Dra. Ing. Escandón Martínez, Mónica
28 de junio de 2019
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Índice
Informe razonado del/de los Director/es del Trabajo Fin de Máster ........................................................... 4
Propuestas de Revisores ............................................................................................................................... 5
1. Resumen ................................................................................................................................................ 7
2. Introducción .......................................................................................................................................... 9
3. Objetivos ............................................................................................................................................. 15
4. Materiales y Métodos ............................................................................................................................. 16
4.1 Búsqueda In-silico de la actividad proteasa e inhibidores de proteasas .......................................... 16
4.2 Ensayos de actividad enzimática y de inhibición in vitro e in gel. ..................................................... 18
4.2.1 Material vegetal ......................................................................................................................... 18
4.2.2 Ensayos de actividad enzimática in vitro ................................................................................... 19
4.2.3 Ensayos de actividad enzimática en gel ..................................................................................... 20
4.2.4 Identificación de proteínas mediante análisis shotgun (LC-MSMS) ........................................... 22
5. Resultados y Discusión ........................................................................................................................ 23
5.1 Búsqueda in-silico de proteasa e inhibidores de proteasas .............................................................. 23
5.1.1 Clasificación de proteasas e inhibidores de proteasas .............................................................. 24
5.1.2 Proteínas secretadas como diana en la búsqueda de compuestos bioactivos .......................... 29
5.3 Ensayos in vitro de la actividad proteasa. ......................................................................................... 30
5.4 Ensayos de actividad proteasa e inhibidores de proteasas en gel. ................................................... 31
5.5 Identificación de proteasas mediante proteómica shotgun (LC-MSMS) .......................................... 34
6. Conclusiones........................................................................................................................................ 39
7. Bibliografía .......................................................................................................................................... 40
8. Anexos ................................................................................................................................................. 46
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Índice de Figuras.
Figura 1. Representación esquemática de la hidrolisis del enlace peptídico e interacción proteasa-
sustrato ....................................................................................................................................................... 11
Figura 2. Flujo de trabajo seguido para el análisis in-silico de proteasas e inhibidores de proteasas
utilizando la base de datos especie-específica de Quercus ilex. ................................................................. 16
Figura 3. Clasificación de las 559 proteasas e inhibidores de proteasas .................................................... 24
Figura 4. Red de interacción proteína-proteína generada por la base de datos STRING. .......................... 28
Figura 5. Predicción de la presencia de péptido señal ................................................................................ 29
Figura 6. Actividad proteasa in vitro en diferentes órganos y especies del género Quercus ..................... 31
Figura 7. Zimogramas para detectar la actividad proteasa e IPs. ............................................................... 32
Figura 8. Zimogramas de actividad proteasa en Quercus ilex ..................................................................... 34
Índice de Tablas.
Tabla 1. Ejemplos de compuestos bioactivos que causaron un gran impacto a nivel científico e industrial
por su alcance y aplicación. ........................................................................................................................... 9
Tabla 2. Clasificación de las proteasas e inhibidores de proteasas por familias según la base de datos
MEROPS ....................................................................................................................................................... 26
Tabla 3. Proteasas e inhibidores de proteasas presentes en las bases de datos de Q. ilex y Q. robur ....... 30
Tabla 4. Proteasas e IPs identificados mediante análisis proteómico shotgun de los diferentes órganos de
Q. ilex y Q. coccifera. ................................................................................................................................... 36
Índice anexos.
Figura S1. Diagramas de Venn de la localización a nivel celular de las enzimas proteasas e IPs de Q. ilex.
..................................................................................................................................................................... 46
Figura S2. Número de transcritos de genes ortólogos en A. thaliana y P. trichocarpa que codifican para
proteasas e IPs. ........................................................................................................................................... 47
Figura S3. Actividad proteasa in vitro en diferentes órganos y especies del género Quercus. .................. 48
Figura S4. Actividad proteasa in vitro en diferentes órganos y especies del género Pinus, Actinidia,
Ananas y Arachis……………………………………………………………………………………………………………………………………48
Tabla S1. Enzimas proteasas e inhibidores de proteasas secretadas al apoplasto celular………………………49
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Informe razonado del/de los Director/es del Trabajo Fin de Máster
El documento presentado por Ezequiel Darío Bigatton, y que lleva por título “Proteasas e inhibidores
de proteasas, búsqueda in silico, ensayos de actividad y análisis proteómico en Quercus ilex”
corresponde a su Trabajo Fin de Máster en Biotecnología. Ha ido dirigido a la búsqueda in silico de
proteasas e Inhibidores de proteasas en Quercus ilex, a la determinación de actividad y caracterización
proteómica. Este trabajo es la primera aproximación a la investigación de dichas enzimas en especies del
género Quercus. Ha utilizado un amplio número de técnicas, incluyendo el análisis in silico, técnicas
clásicas de bioquímica y las modernas -ómicas, así como de herramientas bioinformáticas para el análisis
e integración de datos. El trabajo cumple con los requisitos científicos y académicos exigidos para su
presentación y defensa, demostrando el excelente grado de formación científico-técnica alcanzada por
el estudiante.
Por todo ello, se autoriza la presentación del Trabajo Fin de Máster.
Directora: María Ángeles
Castillejo Sánchez
Co-Directora: Mónica
Escandón Martínez
Tesista: Ezequiel Darío
Bigatton
Córdoba, 18 de junio de 2019
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Propuestas de Revisores
M. Ángeles Castillejo Sánchez y Mónica Escandón Martínez, directores del Trabajo de Fin de Máster
titulado “Proteasas e inhibidores de proteasas, búsqueda in silico, ensayos de actividad y análisis
proteómico en Quercus ilex” proponen como posibles revisores de este a:
Elena Prats Pérez. Instituto de Agricultura Sostenible (CSIC). [email protected]
Marta de la Caridad Hernández de la Torre. Universidad de la Concepción, Chile.
Enrique Iván Lucini. Universidad Nacional de Córdoba, Facultad de Ciencias Agropecuarias.
Directora: María Ángeles Castillejo Sánchez
Co-Directora: Mónica Escandón Martínez
Córdoba, 18 de junio de 2019
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Agradecimientos.
En primer lugar, quiero agradecer a mi familia y amigos por el apoyo incondicional que me han
brindado durante todo este tiempo. Gracias inculcarme los valores de la amistad, el amor, el trabajo y la
pasión por aprender, que hace todos los días me levante con la misma energía para perseguir mis
sueños y ser feliz. A ustedes todo mi cariño y amor.
Quiero agradecer a María Ángeles, por su apoyo, confianza y amistad. Gracias por su entusiasmo y
energía para enseñar. No hay obstáculo en la investigación que no pueda ser superado cuando
investigadores con el semblante y la pasión que tú tienes por esta profesión, dan todo de sí para
superarse a sí mismos y hacer de este mundo un lugar mejor.
Agradecer también a Enrique mi gran amigo/mentor/jefe/profesor, que sin sus insistencias y las de mi
familia, hoy no podría estar en España. Gracias por las incontables horas de charlas y consejos, por
aguantar mis indecisiones y brindarme siempre todo tu apoyo. Gracias por transmitirme tu pasión por
aprender, enseñar y ayudar a las personas. Sos un excelente amigo y un ejemplo de profesional.
A Jesús por su apoyo, por su carisma y también por su afán de aprender, enseñar y sobre todo por hacer
sentir a todos y cada uno de los estudiantes que pasan por el laboratorio, como si estuviéramos en
nuestra casa. Gracias por transmitir al grupo los ideales de trabajo en equipo, por generar lazos de
amistad y defender la ciencia.
A María Carmen, Anita y Manolo agradeceros por su confianza, generosidad y amistad durante todo
este tiempo. Como no agradecer a Mónica, Lola, Rosita y Víctor, todos excelentes profesionales y
amigos, de los que aprendí a como aferrarse a la profesión que elegimos por la pasión que le ponen a
cada cosa que hacen y a como disfrutarla. A mis compañeros Bonoso y José María, agradeceros por las
horas compartidas, las charlas y porque no también durante el último tiempo los mates compartidos.
Son todos excelentes personas y no dejen nunca de lado la curiosidad que los caracteriza. Les deseo de
corazón, todos los éxitos en lo que está por venir.
A mis amigos/familia “Los AUIP” gracias por estos 8 meses increíbles, gracias por darme la oportunidad
de conocerlos y brindarme su amistad. Hoy me llevo un pedacito de cada uno de ustedes guardado en
mis recuerdos y ojalá que la vida nos vuelva a reencontrar a todos así de felices. Agradecido a la vida por
encontrar personas tan geniales como ustedes; los quiero y los voy a extrañar.
Agradecer a AUIP por la beca que me han otorgado y la oportunidad de formarme personal y
profesionalmente. Ha sido una experiencia única e increíble.
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1. Resumen
Este Trabajo Fin de Máster tuvo como objetivo el estudio de enzimas proteasas e inhibidores de
proteasas (IPs) en encina y otras especies del género Quercus mediante un análisis in silico, proteómico
y ensayos de actividad in gel e in vitro. El análisis in silico consistió en la búsqueda de proteasas e IPs en
una base de datos especie-específica para Quercus ilex. De un total de 79757 proteínas anotadas, 657
correspondieron a proteasas y 12 a IPs. La búsqueda de genes ortólogos en Arabidopsis thaliana y
Populus trichocarpa reveló que las 669 encontradas correspondieron a 225 y 200 genes, de los 723 y 955
que codifican para estas proteínas en dichas especies.
Las proteasas se clasificaron de acuerdo a la base de datos MEROPS, atendiendo al residuo catalítico.
Encontramos 273 serino y 119 metalo como proteasas mayoritarias. Del total de proteasas e IPs
clasificadas como secretadas (189), 103 contenían péptido señal. La búsqueda de secuencias homologas
en Q. robur, reveló un 72% de homología, lo que indica un alto grado de conservación dentro del
género.
Se llevo a cabo un ensayo comparativo de actividad proteasas e IPs, utilizando azocaseina como
sustrato, en diferentes órganos (hoja, bellota, embrión y cotiledón) de especies del género Quercus (Q.
ilex, Q. suber y Q. coccifera), así como de sistemas modelo para el estudio de estas actividades (frutos de
Ananas comosus y Actinidia deliciosa) y especies de interés agroforestal (semillas de Pinus pinaster y
Arachis hypogaea). Dentro del género Quercus, los mayores niveles de actividad se encontraron en
embriones de Q. suber (60 mU). No se encontraron diferencias significativas entre órganos de Q. ilex
(valores en torno a 18 mU, 10 veces inferiores a los obtenidos con A. comosus y A. deliciosa).
En un intento de resolver las actividades proteasas e IPs, se llevaron a cabo ensayos de actividad in gel,
utilizando gelatina como sustrato. Se utilizaron extractos de órganos de Q. ilex y otros Quercus, así como
de las especies anteriormente indicadas. Se revelaron de 1 a 5 bandas con actividad, dependiendo del
extracto, siendo las de 50-70 KDa las de mayor intensidad. El patrón de bandas dependió de la especie y
el órgano, siendo el del embrión el más complejo. Para Q. ilex se observaron entre 3 (cotiledón) y 5
(embrión) bandas.
Para identificar proteasas e IPs se llevó a cabo un análisis de proteómica shotgun (LC-MSMS) de las
bandas que presentaron actividad en extractos de los distintos órganos de Q. ilex y Q. coccifera. Se
encontraron 75 proteasas y 3 IPs de un total de 814 proteínas identificadas. De ellas 39 fueron serino, 14
metalo y 21 extracelulares. Una “Aminoleucin peptidase (AtLAP2, EC: 3.4.11.1)” fue la única presente en
todos los órganos; esta proteína se ha descrito como marcadora de respuesta a estrés abiótico. Se
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propone como propuesta de investigación futura la purificación, caracterización y ensayos de actividad
biológica de algunas de las proteínas identificadas, tales como: “AED3” (Aspartyl Protease, EC: 3.4.23) y
“SCP18” (Serine Carboxipeptidase-Like 18 EC: 3.4.16), descritas en la literatura como proteínas de
defensa frente a patógenos.
Palabras claves: proteasas, inhibidores de proteasas, Quercus ilex, in silico, actividad enzimática,
proteómica shotgun.
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2. Introducción
Desde sus orígenes, la humanidad ha utilizado a las especies vegetales para la obtención de preparados
curativos y preventivos de enfermedades humanas, animales y vegetales. Las culturas egipcias, griegas,
romanas y árabes han contribuido fuertemente a la generación de conocimientos etnofarmacéuticos
que en la actualidad guían las investigaciones orientadas a la búsqueda y obtención de compuestos
bioactivos. Hasta mediados del siglo XIX los extractos se utilizaron sin conocer cuál era el principio activo
que producía su efecto, a su vez se desconocía su estructura química, estabilidad o su mecanismo de
acción (Azmir et al., 2013; Atanasov et al., 2015). Uno de los primeros compuestos vegetales en ser
aislado y purificado fue la morfina a principios de 1800 por el farmacéutico alemán F. Serturner, quien
logró purificarla del opio (Papaver somniferum); 20 años más tarde empezó a comercializarse con fines
terapéuticos (Atanasov et al., 2015). Otro compuesto de origen vegetal y de gran interés en la
actualidad es el ácido salicílico que logró ser sintetizado en 1853 por el científico alemán C.J. Gerhardt y
que en la actualidad representa una fuente de ingresos muy importante para la industria farmacéutica
(Kaiser, 2008). Hoy en día existen una gran cantidad de compuestos cuyos principios bioactivos han sido
descritos, evaluados y que son de gran utilidad en el sector agrícola, industrial, farmacológico y en la
industria alimenticia (Tabla 1).
Tabla 1. Ejemplos de compuestos bioactivos que causaron un gran impacto a nivel científico e industrial por su alcance y aplicación. Se encuentran descritos según el principio activo/característica principal y su función más relevante.
Compuesto Bioactivo Función característica
Artemisinina (1967). Obtenido a partir de Artemisia annua. Formula comercial: Artemisin (1987).
Utilizado como agente preventivo en la lucha contra la malaria y agente anticancerígeno (Klayman et al., 1984)
Bromelina (1953), proteasa purificada a partir del fruto de la piña (Ananas commosus).
Previene la formación de edemas, agregación plaquetaria y metástasis, gracias a la modificación de superficie celular por su acción proteolítica (Salas et al., 2008)
Dronabinol / Cannabidol o Dronabinol. Obtenido a partir de Cannabis sativa. Sativex (2005)
Tratamiento de Neuropatías crónicas (Receptor CB1 y CB2) (Vree et al., 1972)
Galantamina. Obtenido a partir de hojas Galanthus caucasius. Formula comercial: Razadyne (2001).
Tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (Tsakadze et al., 1972)
Inhibidores de Tripsina (1987). Aislados a partir de órganos vegetales y luego sintetizados en organismos transgénicos.
Acción insecticida sobre lepidópteros principalmente (Hilder et al., 1987)
Paclitaxel (1968). Obtenido de las hojas de plantas del género Taxus. Formula comercial: Taxol® (1992).
Bioactividad probada contra células cancerosas de ovario en (Newman & Cragg, 2012; Cragg & Newman, 2013)
Pancreatina (1913). Extraídas una del páncreas de animales. Con usos en la industria de los detergentes y cueros (Illanes, 2008)
Sacarasa (1980). Inmovilización de la enzima invertasa o sacarasa
Producción de jarabe de alta fructosa a partir de almidón de maíz en la industria alimenticia (Carasik & Caroll, 1984).
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Teniendo en cuenta la necesidad actual por la búsqueda de compuestos con actividad biológica y
atendiendo a que solo el 6% de las especies vegetales han sido estudiadas con fines farmacológicos y
que únicamente un 15% de ellas fueron descritas fitoquímicamente, existe en la naturaleza un elevado
potencial biotecnológico para ser aprovechado en la búsqueda y caracterización de compuestos
bioactivos (Kinghorn et al., 2011; Atanasov et al., 2015). Para que una molécula sea incluida dentro de
esta categoría debe presentar efectos y aplicaciones farmacológicas, toxicológicas, terapéuticas,
antimicrobianas o antifúngicas (González-Rábade et al., 2011; Azmir et al., 2013; Cragg & Newman,
2013).
A los compuestos bioactivos se los puede clasificar en función de su abundancia e importancia en el
metabolismo de los individuos. Esta clasificación incluye compuestos del metabolismo primario, donde
podemos encontrar hidratos de carbono, aminoácidos, proteínas y lípidos principalmente, implicados en
el crecimiento y desarrollo. Por otro lado, están aquellos compuestos pertenecientes al metabolismo
secundario, moléculas de menor tamaño obtenidas como consecuencia de los procesos del
metabolismo primario y que cumplen diversas funciones vitales. En el caso de las plantas, estos
compuestos intervienen en la supervivencia, la interacción y la adaptación del individuo al entorno
donde crece y se desarrolla (Bernhoft, 2010; Atanasov et al., 2015).
Las proteínas y péptidos bioactivos de origen vegetal presentan un potencial biotecnológico elevado
para la búsqueda de nuevos compuestos como los alimentos funcionales, nutracéuticos, en la defensa y
prevención de enfermedades y a su vez en la protección de cultivos frente a factores bióticos y abióticos
(Guaadaoui et al., 2014; Hernández-Ledesma & Hsieh, 2017; Mazorra-Manzano et al., 2018). Dentro de
las proteínas y péptidos con actividad biológica, se incluyen las enzimas proteasas e IPs que a nivel
celular se encargan de regular el destino y la localización de la actividad proteolítica de todo el
organismo. Las proteasas modulan las interacciones proteína-proteína que potencialmente podrían
intervenir en el procesamiento de la información genética y, por consiguiente, modificar rutas
metabólicas específicas relacionadas con los mecanismos de defensa del organismo frente a factores
estresantes. Esto puede ocurrir de forma directa por la simple proteólisis de determinadas proteínas o
por la generación de péptidos reactivos de un menor tamaño, que pueden unirse a receptores de
membrana y desencadenar procesos de transcripción que dan lugar a múltiples cambios metabólicos y
fisiológicos (Schaller, 2004; López-Otín & Bond, 2008; González-Rábade et al., 2011; Mazorra-Manzano
et al., 2018; Torres-Ossandón et al., 2019).
Las enzimas como moléculas catalizadoras de reacciones químicas, se las pueden definir en función de
su acción catalítica. En el caso de las enzimas proteasas se encuentran incluidas dentro del grupo de las
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hidrolasas, las cuales se caracterizan por catalizar la hidrólisis de enlaces tipo amida o “peptídicos” (C-N),
presentando principalmente proteínas como sitio diana de hidrólisis. También se las puede denominar
peptidasas cuando el enlace peptídico que hidrolizan es diferente al de una proteína (Vaseva et al.,
2012).
Una proteasa es capaz de hidrolizar un enlace peptídico cuando la enzima polariza el grupo carbonilo
asociado al enlace peptídico a nivel del sustrato y de esta forma puede estabilizar el átomo de oxígeno
reactivo del grupo carbonilo asociado al enlace, volviendo así al carbono alfa del enlace peptídico
vulnerable al ataque del nucleófilo activado de la enzima (Figura 1) (van der Hoorn, 2008). En función de
cuál es el mecanismo catalítico de hidrólisis, las proteasas se pueden clasificar en dos grandes grupos.
Las serino, cisteino y treonina proteasas integran el primer grupo, caracterizadas por presentar un
residuo se serina, cisteína o treonina respectivamente, como nucleófilo en su centro activo, los cuales a
su vez se activan por la presencia del aminoácido de histidina. Las aspartato y métalo proteasas utilizan
como nucleófilo una molécula de agua activada por las interacciones del tipo electrostáticas que
ocurren entre esta molécula y los iones metálicos o el aminoácido de aspartato respectivamente.
También se las puede clasificar en endopeptidasas o exopeptidasas en función de la localización del
sitio de catálisis del enlace peptídico en la propia proteína. Endopeptidasas son aquellas proteasas
capaces de hidrolizar a nivel de proteínas enlaces peptídicos internos. Las exopeptidasas a su vez se
clasifican en aminopeptidasas, cuando la hidrólisis del enlace peptídico ocurre en el extremo amino
terminal, o en carboxipeptidasas cuando se produce en el extremo carboxilo terminal (van der Hoorn,
2008; Vaseva et al., 2012).
Para llevar a cabo el estudio, la caracterización y la clasificación de las proteasas IPs se utiliza la base de
datos pública MEROPS (Rawlings et al., 2014) que incluye unas 4000 proteasas y sus inhibidores
procedentes de un total de 31034 organismos. La clasificación realizada por MEROPS se basa
Figura 1. Representación esquemática de
la hidrolisis del enlace peptídico e
interacción proteasa-sustrato. El sustrato
se encuentra representado en verde y la
proteasa en gris. “R” indica la cadena
lateral de aminoácidos del sustrato que se
une al sitio activo de la proteasa. (van der
Hoorn, 2008)
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principalmente en el nucleófilo predominante en el sitio activo de la enzima. Las proteasas e IPs son
agrupados en familias de acuerdo con la similitud de secuencias de aminoácidos, y a su vez las familias
se pueden agrupar en clanes o grupos de proteasas que han surgido de un solo origen evolutivo, aunque
comúnmente se han desviado tanto que ahora pertenecen a más de una familia, lo cual permite
establecer relaciones de tipo evolutivo entre estas proteínas y las especies.
A nivel del DNA, las proteasas pueden ser codificadas por genes únicos o familias multigénicas
altamente conservadas entre especies, lo que sugiere que estas proteínas cumplen roles fundamentales
en la mantención de la vida desde el inicio de la evolución (Lawrence & Koundal, 2002). Un mismo gen
puede dar lugar a más de un transcrito, cada uno de los cuales a su vez puede originar más de una
proteína por splicing (corte y empalme alternativo) que pueden tener diferentes funciones. Es por tanto
necesario realizar estudios a nivel genómico y transcriptómico para identificar genes candidatos que
codifiquen para enzimas proteasas o sus inhibidores y a su vez analizar las posibles isoformas de éstas
(García-Lorenzo et al., 2006; Huang et al., 2013; Chopra et al., 2014; Guerrero-Sanchez et al., 2017,
2019). Así pues, el término “Degradomics” define todos aquellos estudios referidos a procesos de
degradación de proteínas, donde las proteasas cumplen un papel fundamental. Este término surge de la
integración de la investigación en genómica y proteómica utilizada en la identificación de proteasas y
sus inhibidores, así como de sus sustratos, lo que en conjunto se denomina “Degradoma” (López-Otín &
Overall, 2002). García-Lorenzo et al. (2006) confirmaron mediante estudios in silico la presencia de
genes altamente conservados que codifican para proteasas en Populus spp. y Arabidopsis thaliana,
encontrando 955 y 723 genes, respectivamente. Este alto número de genes conservados demuestra que
las secuencias y la función de estas proteínas se han mantenido a lo largo del proceso evolutivo.
Los IPs constituyen el mecanismo regulador de la actividad proteolítica más importante que presentan
los seres vivos (Vaseva et al., 2012). En plantas, además de bloquear la acción de las propias proteasas,
intervienen en los procesos de defensa frente a estreses de tipo biótico (Brzin & Kidrič, 1996). A los IPs
se los clasifica en función de su mecanismo de reacción en dos grupos. Los IPs de tipo competitivos, son
aquellos péptidos en los que la inhibición ocurre por la unión covalente del inhibidor al sitio activo de la
proteasa diana, de manera similar a como ocurre entre la proteasa y los sustratos. El IPs genera una
serie de cambios conformacionales y bioquímicos en el centro activo de la proteasa, que elevan la Km
de la reacción a valores próximos a 104-106 y bloquean la capacidad hidrolítica de la enzima. Debemos
tener en cuenta que estos mecanismos únicamente funcionan sobre enzimas proteasas de tipo
endopeptidasas. El segundo grupo son los IPs no competitivos, que no afectan la estructura de la
proteasa, pero si elevan la Km de la reacción. Los IPs se pueden encontrar de forma mayoritaria en las
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hojas más jóvenes y en los órganos de reserva como las semillas (Haq et al., 2004; Mosolov & Valueva,
2005; Vaseva et al., 2012).
Las proteasas y los IPs presentan un potencial biotecnológico e industrial elevado. El kiwi (Actinidia
deliciosa) y la piña (Ananas comosus) son sistemas ampliamente estudiados y que pueden ser utilizados
como sistemas modelos para el estudio y la búsqueda de proteasas e inhibidores en plantas. En ambas
especies las proteasas son utilizadas a nivel industrial como compuestos bioactivos con actividad
farmacológica, terapéutica, antimicrobiana y antifúngica (López-García et al., 2012; Yuk et al., 2017;
Misran et al., 2019). Una de las características que convierten a las proteasas vegetales o sus inhibidores
en moléculas de interés, es el amplio rango de acción frente a condiciones de pH y temperatura
variables, donde mantienen sus funciones biológicas activas (Brzin & Kidrič, 1996; González-Rábade et
al., 2011; Vaseva et al., 2012).
Existen multitud de especies vegetales cuya aplicación y potencial biotecnológico para la búsqueda de
compuestos bioactivos como las proteasas y sus inhibidores aún no han sido explorados. Esto ocurre
dentro del género Quercus, en concreto la encina (Q. ilex) y el alcornoque (Q. suber), las especies
arbóreas dominantes en los ecosistemas de bosques naturales de la cuenca Mediterránea occidental, así
como en la “dehesa” agrosilvopastoral española. Si bien aparecen a nivel bibliográfico diversos estudios
orientados a la búsqueda de compuestos bioactivos en estas especies (Narjisse et al., 1995; Cárdenas-
García et al., 2014), no se han encontrado documentos sobre sus proteasas e IPs.
El fruto de la encina, la bellota, cuenta con una serie de características nutritivas similares a las de otros
frutos secos (Vinha et al., 2016). Además de servir como alimento animal (cerdos y pequeños rumiantes)
(Keddam et al., 2010; Tejerina et al., 2011), las propiedades de las bellotas pueden ser aprovechadas y
explotadas para ser usadas como suplemento alimenticio con propiedades beneficiosas en la dieta
humana con propiedades beneficiosas. Distintas especies del género Quercus han demostrado poseer
actividad antimicrobiana y terapéutica. Así pues, en encina se ha estudiado la actividad antioxidante y
antimicrobiana de extractos de hojas, que muestran posibles efectos sinérgicos con los fungicidas
convencionales (Karioti et al., 2011), así como el efecto gastro-protector inducido por extractos de la
raíz (Gharzouli et al., 1999). Otros estudios también han revelado el efecto antimicrobiano, regulador
del metabolismo ruminal en ovejas y cabras, nutraceútico, etc. de extractos de Q. ilex (Narjisse et al.,
1995; Güllüce et al., 2004; Berahou et al., 2007; Cárdenas-García et al., 2014; Custódio et al., 2015).
Incluso, algunas especies dentro de este género han sido evaluadas debido a la presencia de
compuestos anticancerígenos en la corteza y en las hojas (Frédérich et al., 2009). Por lo que es factible
pensar que, además del renovado interés por el consumo de bellotas como alimento funcional, la
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identificación de compuestos bioactivos, entre ellos proteasas y sus inhibidores, proporcionaría un valor
económico importante al encinar y supondría un cambio en su percepción desde la perspectiva
ambiental a la productiva.
La búsqueda de nuevas aplicaciones y soluciones biotecnológicas abren el camino para la utilización,
conservación, regeneración y explotación de estas especies. Sin embargo, la aplicación de la
biotecnología orientada al estudio de la encina y el alcornoque se ve obstaculizada por el conocimiento
limitado de su biología, particularmente desde un punto de vista molecular, suponiendo todo un reto,
debido a su carácter recalcitrante y la ausencia de un genoma secuenciado (Rey et al., 2019). La
búsqueda de compuestos bioactivos, entre ellos proteasas y metabolitos secundarios, en el género
Quercus se ve favorecida por la disponibilidad de recientes estudios multiómicos (Guerrero-Sanchez et
al., 2017, 2019; López-Hidalgo et al., 2018) que nos permiten disponer de bases de datos fiables de
transcritos y proteínas para realizar estudios in silico y su comprobación mediante ensayos de
bioquímica clásica. La variabilidad y riqueza genética de las especies del género Quercus definen su gran
plasticidad ecológica y potencial biotecnológico para ser explotadas, tanto para usos industriales,
farmacológicos como agroforestal, por lo que la búsqueda y caracterización de estos compuestos está
justificada.
Dada la importancia económica y ecológica que presentan las especies del género Quercus para
Andalucía y el sur de la península Ibérica, este trabajo fin de máster ha tenido como objetivo identificar
enzimas proteasas e IPs. Para ello se ha llevado a cabo una búsqueda in silico de proteasa e IPs s usando
las bases de datos de proteínas especie-específica de Q. ilex (Guerrero-Sanchez et al., 2017) y pública de
Q. robur (Plomion et al., 2018), así como su validación mediante ensayos de actividad enzimática e
identificación de proteínas utilizando una estrategia de proteómica shotgun. Tambíen, se han incluido
en nuestro estudio otros sistemas biológicos en los que se han descrito previamente actividad proteasa
para validar nuestro sistema experimental, como la piña (Ananas comosus) y el Kiwi (Actinidia deliciosa),
además de otras especies de interés agrícola y forestal, entre las que se encuentra el cacahuete (Arachis
hypogae) y el pino resinero (Pinus pinaster).
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3. Objetivos
Objetivo General
Estudio de proteasas e inhibidores de proteasas en especies forestales del género Quercus mediante un
análisis in silico, proteómico y de ensayos de actividad.
Objetivos Específicos:
1. Realizar una búsqueda in silico de proteasas e inhibidores de proteasas utilizando las bases de
datos especie-específicas de proteínas de Quercus ilex y Quercus robur.
2. Determinar la actividad proteasa e inhibidora de proteasas en diferentes órganos de Q. ilex, Q.
suber y Q. coccifera mediante ensayos de actividad enzimática in vitro e in gel.
3. Identificar proteasas e inhibidores de proteasas en los diferentes órganos de Q. ilex, Q. suber y
Q. coccífera mediante una aproximación de proteómica shotgun (LC-MSMS).
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4. Materiales y Métodos
4.1 Búsqueda In-silico de la actividad proteasa e inhibidores de proteasas
Para la búsqueda de proteasas e IPs se siguió el siguiente flujo de trabajo (Figura 2):
Figura 2. Flujo de trabajo seguido para el análisis in-silico de proteasas e inhibidores de proteasas utilizando la base de datos especie-específica de Quercus ilex.
1. Se realizó una selección de proteasas e IPs utilizando una base de datos de proteínas especie-
específica de Q. ilex generada a partir de la traducción de sus transcritos (Guerrero-Sánchez et
al., 2017) constituida por 79757 entradas. Para ello se aplicó un filtro de búsqueda por palabras
clave como “protease”, “peptidase” “proteinase”, “protease inhibitor” “serpin” y “kunitz type”.
2. De la selección anterior se eliminaron aquellas proteínas cuya anotación no aparece como
revisada en la base de datos UniProtKB (https://www.uniprot.org/uniprot; UniProt Consortium,
2018), siendo éstas las que aparecen como “probable”, “subtilisin-like” y “putative”.
3. Las proteínas seleccionas se clasificaron en función de la información disponible en UniProtKB y
MEROPS (Rawlings et al., 2014): localización celular, familia, procesos biológicos, función
molecular, peso molecular, punto isoeléctrico y gen ortólogo en Arabidopsis thaliana (Tabla 2,
Figura 2, Figura S1).
4. Los genes ortólogos y únicos encontrados a partir de la búsqueda en UniProtKB, se ingresaron a
la plataforma Ensembled Genome vinculada a la base de datos TAIR 10 (A. thaliana) y
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Pop_tri_v3 (P. trichocarpa) (Kersey et al., 2018) para obtener el número de transcritos (RNAm)
correspondientes a cada uno de esos genes y así dilucidar la cantidad de productos génicos que
se obtienen de cada gen como consecuencia de mecanismos de corte y empalme (“splicing”)
alternativo o variantes alélicas (Figura S2).
5. Las proteasas clasificadas por UniProtKB como secretadas o extracelulares fueron verificadas
mediante una búsqueda manual del péptido señal utilizando la herramienta SignalIP 5.0
(Almagro-Armenteros et al., 2019)(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) vinculada a la
plataforma ExPASy (https://www.expasy.org/). Esta plataforma predice la probabilidad de la
presencia de péptido señal en una proteína en base a su secuencia FASTA. Un péptido señal está
formado por una secuencia de 5 a 30 aminoácidos altamente conservada que se ubican en un
orden en particular y decide sobre el destino, la ruta de transporte y la eficiencia de secreción
de una proteína. Para realizar este análisis se utilizaron las secuencias FASTA completas de las
proteínas análogas pertenecientes a la base de datos de Q. suber, la especie forestal
filogenéticamente más cercana a Q. ilex cuyo genoma se encuentra secuenciado y anotado,
realizando para ello un análisis de alineamiento proteína-proteína BLASTP (Basic Local
Alignment Search Tool) considerando una identidad mayor al 85%.
6. A partir de las secuencias FASTA de las proteasas e IPs seleccionadas en el paso 1, se realizó un
análisis de interacciones funcionales entre las proteasas e IPs utilizando la plataforma STRING
V11.0 (http://string-db.org; (Szklarczyk et al., 2019) y la base de datos de A. thaliana
proporcionada por el software.
7. Por último, se realizó una búsqueda y alineamiento de proteasas e IPs presentes en Q. ilex
frente al proteoma de Q. robur a partir de sus secuencias FASTA. El objetivo de esta búsqueda
fue determinar el número de proteasas y genes compartidos entre ambas especies y el grado de
conservación de estas proteínas. Para el análisis se utilizó un programa informático denominado
bash (Bourne-again shell) (http://ftp.gnu.org/gnu/bash/) (Altschul et al., 1990). Con la
herramienta de Blast protein para Ubuntu (https://www.exoscale.com/syslog/blast/), se realizó
la alineación de las secuencias de las proteínas de Q. ilex frente al proteoma de Q. robur, de esta
manera se predijo las tres proteínas con mayor identidad encontradas en el proteoma de Q.
robur. Los siguientes algoritmos fueron empleados:
- en primer lugar se creó una base de datos para BlastP de Q. robur con el Shell de Linux
ingresando el siguiente algoritmo: “makeblastdb -in q_robur_proteome.fa -parse_seqids -
dbtype prot -out dbqrobur“
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- seguidamente se realizó un alineamiento BlastP entre Q. ilex y Q. robur ingresando el
algoritmo de búsqueda “blastp -query proteasesqilex.fasta -out alineamientos.txt -db
dbqrobur -num_threads 8 -evalue 1e-50 -num_alignments 3”
- para obtener una disposición tabular se usó el algoritmo “blastp -query proteasesqilex.fasta
-out alineamientos.txt -db dbqrobur -num_threads 8 -evalue 1e-50 -num_alignments 3 -
outfmt 6”.
Las condiciones de búsqueda y alineamiento se establecieron con un e-value de 1e-50, para
restringir y disminuir la probabilidad de encontrar falsos positivos. De los tres alineamientos se
consideró como homóloga aquella proteína que presentaba la mayor identidad y un e-value más
cercano a cero.
4.2 Ensayos de actividad enzimática y de inhibición in vitro e in gel.
4.2.1 Material vegetal
Se emplearon distintas especies del género Quercus, entre ellas Q. ilex L., Q. suber L. y Q. coccifera L.
procedentes de la localidad de Córdoba. De cada una se recolectaron distintos órganos: bellotas,
cotiledones, embriones y hojas, congelados en nitrógeno líquido, macerados hasta obtener un polvo
fino y almacenados a -80°C hasta su análisis. Previo a la congelación los materiales se recolectaron de la
siguiente forma:
- Las bellotas maduras fueron desprovistas del pericarpo troceadas.
- Para la obtención de cotiledones y embriones las bellotas fueron germinadas en bandejas con papel
húmedo durante 5 días a temperatura ambiente, hasta que la radícula alcanzó una longitud de
unos 2 centímetros. Cotiledones y embriones fueron separados manualmente tomando como
referencia el nudo cotiledonar que divide embrión y cotiledones.
- Las hojas se obtuvieron de plántulas de un año de edad sembradas en macetas de 0.5 L
conteniendo perlita en invernadero (luz natural, 44/19˚C y 30/60% de humedad relativa). Se
recolectaron las hojas de la zona media y basal de los tallos, las cuales fueron congeladas en
nitrógeno líquido.
Otras especies fueron incorporadas en nuestros experimentos como sistema de validación
experimental. Se incluyó en nuestro análisis el fruto maduro del kiwi (Actinidia deliciosa),
específicamente el endocarpio y mesocarpio, y de la piña (Ananas comosus), los cuales fueron
troceados y congelados en nitrógeno líquido, macerados y conservados a -80°C.
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Por último, se incluyeron especies de importancia forestal/agronómica para la validación de la
universalidad del método. Para la especie Pinus pinaster, las semillas fueron recolectadas de árboles
localizadas en la localidad de Cerro Muriano (Córdoba), a las cuales se les elimino el pericarpo y se
congelaron en nitrógeno líquido para ser macerados y almacenados a -80°C. También se usaron dos
cultivares de Arachis hypogaea (ASEM 400 INTA y GRANOLEICO), material proporcionado por el
programa de mejoramiento genético de cacahuete de la Estación Experimental INTA Manfredi (Provincia
de Córdoba, República Argentina). Las semillas de estos cultivares fueron germinadas en perlita y tras 5
días de la emergencia de la radícula se separó embrión y cotiledón de forma similar a las semillas de
Quercus. Los distintos órganos, semillas sin germinar, cotiledones y embriones se congelaron en
nitrógeno líquido, se maceraron en un mortero hasta obtener un polvo fino y se almacenaron a -80°C.
4.2.2 Ensayos de actividad enzimática in vitro
La determinación de la actividad proteolítica de los extractos obtenidos se realizó siguiendo el protocolo
propuesto por Coelho et al. (2016) con modificaciones utilizando azocaseina como sustrato. La solución
de azocaseina (Sigma A2765) fue preparada al 1.5 % (p/v) en el buffer de extracción de proteasas (200
mM Tris-HCl pH 7.4, 10 % v/v glicerol y 0.25 % v/v Tritón X-100). La solución de extractos enzimáticos se
preparó a una concentración de proteína total de 1 mg.mL-1 utilizando tampón de extracción. La mezcla
de reacción consistió en mezclar cantidades iguales (125 µL) de extracto enzimático (125 µg totales) y
solución de azocaseina 1.5 % p/v y se incubó a 35°C durante 30, 60, 90 y 120 minutos. La reacción
enzimática se detuvo añadiendo 750 µL de ácido tricloroacético (TCA) al 5 %. La mezcla se dejó reposar a
temperatura ambiente durante 10 minutos para estabilizar la temperatura de la solución, se centrifugó
a 2000 g durante 10 minutos y se recogió el sobrenadante, al que se añadió hidróxido de sodio 0.5 N en
relación 1:1 para determinar la absorbancia de las muestras a 440 nm. El blanco se obtuvo mezclando
TCA al 5 % con el sustrato antes de añadir el extracto enzimático para evitar la liberación de los
azoderivados de tirosina e histidina. Una unidad (U) de actividad proteolítica se definió como la cantidad
de enzima capaz de digerir 1 mg de sustrato (azocaseina) por minuto como se muestra en la siguiente
ecuación:
𝐴(𝑈) =𝐶𝐴𝑍𝑂
𝑡
𝑉𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙2
𝑉𝐸𝑁𝑍
donde CAZO es la concentración de azocaseina, Vtotal2
es el volumen de la reacción, t el tiempo de
digestión y Venz es el volumen de extracto proteico.
4.2.2.1 Análisis estadístico
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Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el software Infostat (Di Rienzo et al., 2017). Para su
normalización los datos de actividad se transformaron (log10), aplicándose el test estadístico ANOVA.
4.2.3 Ensayos de actividad enzimática en gel
4.2.3.1. Extracción de proteínas
Las proteínas de las muestras pulverizadas (100–200 mg) se extrajeron en condiciones no
desnaturalizantes. Estas se homogeneizaron en 2–4 mL de tampón de extracción (200 mM TrisHCl pH
7.4/3% Polivinilpolipirrolidona insoluble (PVPP)) a 4°C con la ayuda de un Potter-Elvehjem. Tras 12 h de
incubación a 4°C se añadió tampón estabilizante de extracción (10% v/v glicerol, 5mM ditiotreitol y
0.25% v/v de Tritón X-100), y seguidamente se centrifugaron a 16000 g durante 35 minutos a 4°C. Se
recuperó el sobrenadante, equivalente a unos 2 ml, y se separaron dos fracciones de 1 ml cada una,
precipitándose una de ellas con 10 volúmenes de acetona a -20°C durante 3 h, y la otra se congeló a -
20°C. La fracción precipitada se centrifugó a 10400 g durante 15 minutos a 4°C, y el pellet se
resuspendió en 200-300 µL de tampón de solubilización (200 Mm Tris-HCl pH 7.4, 10% v/v glicerol y
0.25% v/v Tritón X-100). El extracto precipitado se almacenó a -20°C. Ambas fracciones, precipitada y sin
precipitar, se cuantificaron (Bradford, 1976) utilizando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar.
4.2.3.2. Electroforesis en gel de policacrilamida/gelatina
Se utilizó el método de Heussen and Dowdle (1980) para detectar la actividad de enzimas proteasas e
IPs. Los extractos de proteína (20 µg por muestra) se separaron en geles copolimerizados al 9% de
acrilamida y 0.1% de gelatina. Para determinar la actividad proteasa se utilizaron los extractos
precipitados con acetona, mientras que los no precipitados se usaron para la determinación de actividad
inhibidora de proteasas. Las muestras se diluyeron con tampón de carga (4X) no desnaturalizante (62.5
mM Tris-HCl, 10% v/v glicerol, 0.001% p/v azul bromofenol). En los geles de actividad inhibidora de
proteasa se usaron marcadores de peso molecular de amplio rango (Bio-Rad) entre los que aparece un
inhibidor de tripsina de soja (19-21 kDa) que se usó como control positivo. La electroforesis se desarrolló
a 4°C y 50 V hasta que las proteínas entraron en el gel concentrador, incrementándose después a 90 V
hasta que el frente alcanzó el final del gel.
Posterior a la electroforesis, los geles de actividad proteasa se incubaron a temperatura ambiente en
Tritón X-100 al 2.5% (v/v) durante 30 minutos en agitación constante, el cual permite la renaturalización
de las proteínas. Seguidamente se lavaron 3 veces con agua destilada y se incubaron durante la noche
en tampón de proteólisis (100 mM tampón citrato: Na2HPO4 /ácido cítrico pH 6.8, 4 mM DTT y 10 mM
cisteína) en agitación contante a 35°C. La proteólisis se paró transfiriendo los geles a una solución con
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0.1 % (p/v) de azul brillante de Coomassie R-250 (Neuhoff et al., 1988). En el caso de la de la actividad
inhibidora de proteasas, los geles se incubaron en 1% (v/v) de Tritón X-100 y 25 mM de Tris-HCl pH 8
durante 30 minutos a temperatura ambiente en agitación constante. Posteriormente se incubó 30
minutos en una solución de 10 mM de Cl2Ca para eliminar el SDS procedente del gel a temperatura
ambiente y agitación constante, y finalmente en una solución con tripsina (40 µg.mL-1) a 37°C durante 3
horas, para luego ser transferidos a la solución de Coomassie R-250.
Las imágenes de los geles de ambas actividades se capturaron con el densitómetro calibrado GS-900
(Bio-Rad). La presencia de actividad proteasa viene determinada por aquellas bandas con ausencia de
Coomassie en donde ha tenido lugar la hidrólisis de la gelatina, mientras que el resto del gel aparece
teñido de azul por la presencia de gelatina. Mientras que la presencia de inhibidores de proteasas viene
determinada por la presencia de bandas teñidas de azul donde la tripsina ha sido inhibida, en contraste
con el fondo transparente del gel como consecuencia de la actividad proteolítica de la tripsina sobre la
gelatina.
Las bandas que mostraron actividad proteasa e IPs más representativa en los órganos de Q. ilex (hoja,
bellota completa, embrión y cotiledón) y Q. coccifera (hoja, bellota, y cotiledón) se cortaron del gel para
su análisis mediante espectrometría de masas (LC-MSMS). Para ello se utilizó un escalpelo, se trocearon
las bandas y las proteínas se digirieron según el protocolo descrito por Shevchenko et al. (1996)
modificado. Los trozos de gel fueron desteñidos utilizando 100 µl de tampón 100 mM de bicarbonato
amónico (AmBic)/50% (v/v) acetonitrilo (AcN) a 37°C en agitación constante durante 30 minutos. Este
paso se repitió dos veces. Se eliminó el sobrenadante y se añadió 50 µl de AcN 100 % dejándolo 5
minutos a temperatura ambiente. Tras eliminar el AcN las bandas fueron reducidas con 20mM de
ditiotreitol (DTT)/ 100 mM AmBic durante 30 minutos y posteriormente se alquilaron utilizando 55 mM
de iodoacetamida/ 100 mM AmBic durante 30 minutos, teniendo lugar ambos pasos a temperatura
ambiente. Finalmente, los trozos de gel se lavaron dos veces con 25 mM AmBic durante 15 minutos y
otras dos veces con 25mM AmBic/ 50 % AcN 15 minutos, y por último se deshidrataron con AcN durante
5 minutos a temperatura ambiente.
La digestión de los péptidos se realizó con tripsina (Sequencing grade, Promega) a una concentración de
12 ng.µl-1 en una solución conteniendo 25 mM AmBic, 10 % AcN y 5 mM de CaCl2, incubando las
muestras 18 h a 37°C en agitación constante. La digestión enzimática se detuvo añadiendo ácido
trifluoroacético (TFA) al 1 %. Se realizó una centrifugación (11000 g) y se recogió el sobrenadante con los
péptidos extraídos colocándolos en un nuevo tubo. Posteriormente se extrajeron el resto de los
péptidos retenidos en los trozos de poliacrilamida del gel mediante soluciones conteniendo
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concentraciones crecientes de AcN (20 %, 50 % y 90 %) / TFA 1 % dejando 5 minutos en cada una de
ellas, y por último sonicando 3 minutos. Finalmente, el volumen recuperado se llevó a sequedad en un
SpeedVac y los péptidos resultantes de la digestión fueron resuspendidos en 0.1 % TFA para después ser
desalados en columnas C18 (C18100-01C, Scharlau). Las columnas se activaron con 70 % AcN/0.1 % TFA,
y lavadas con 0.1 % TFA. Las muestras con los péptidos fueron aplicadas a la columna permitiendo el
paso a través de ella, y finalmente se eluyeron con 70 % AcN y se secaron en un SpeedVac.
4.2.4 Identificación de proteínas mediante análisis shotgun (LC-MSMS)
El análisis de espectrometría de masas se realizó en los equipos disponibles en el servicio de la
Universidad de Córdoba (Servicio Central de Apoyo a la Investigación-SCAI). Se utilizó un equipo de
cromatografía líquida nano-LC (Dionex Ultimate 3000 nano UPLC, Thermo Scientific) utilizando una
columna C18 75 μm x 50 Acclaim Pepmam (Thermo Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas
Orbitrap Fusion (Q-OT-qIT, Thermo Scientific). La mezcla de péptidos fue previamente pasada por una
precolumna 300 um x 5 mm Acclaim Pepmap (Thermo Scientific) en 2 % AcN/0.05 % TFA durante 5 min
a un flujo de 5 μl/min. La separación de péptidos se realizó a 40⁰C. La fase móvil A estaba compuesta
por 0.1 % acido fórmico y la fase móvil B por 20 % AcN/0.1 % acido fórmico. La elución se llevó a cabo
con un flujo de 300 nL/min, utilizando el siguiente gradiente de la solución B en A: 4-35 % (120 min); 35-
55 % (6 min); 55-90 % (3 min); finalmente se llevó a cabo un lavado con 90 % B (8 min) y reequilibrado al
4 % B (15 min). El tiempo total de la cromatografía fue de 60 min. Los iones eluidos fueron convertidos a
fase gaseosa por ionización nano-electro espray y analizados en el equipo de espectrometría de masas
operando en modo positivo. El escaneo de péptidos precursores de rango 400 a 1500 m/z se realizó a
una resolución de 120K con un conteo de iones de 4 × 105. El análisis de masas en tándem se realizó por
aislamiento a 1.2 Da con el cuadrupolo, fragmentación CID con una energía de colisión de 35 eV, y
análisis de MS de exploración rápida en la trampa de iones.
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5. Resultados y Discusión
5.1 Búsqueda in-silico de proteasa e inhibidores de proteasas
A partir de las 79757 entradas registradas como proteínas en la base de datos especie-específica de Q.
ilex (Guerrero-Sanchez et al., 2017), se seleccionaron 669 correspondientes a proteasas e IPs (Figura 2).
Estas representan el 0.8% del total de proteínas registradas en la base de datos, estando muy por
debajo (3%) de las encontradas para A. thaliana (García-Lorenzo et al., 2006). Las 669 proteasas
encontradas fueron revisadas de forma manual en la base de datos de UniprotKB (UniProt Consortium,
2018) de forma de que se seleccionaron aquellas proteínas cuya anotación ha sido validada en esta base
de datos, resultando en 559 proteínas seleccionadas para el análisis. Estas fueron clasificadas según su
localización a nivel celular, familia proteica, rango de masa molecular y punto isoeléctrico, función
metabólica y procesos biológicos en los que intervienen a partir de la información obtenida en
UniprotKB (Figura 3 y Tabla 2). Según esta clasificación podemos observar en la figura 3A que el mayor
número de proteasas registradas en la base de datos de Q. ilex, se encuentran a nivel de apoplasto (189)
seguidas de las cloroplásticas (169), representando ambos grupos más de la mitad del total de proteasas
e IPs encontrados, debemos destacar que muchas de estas proteínas presentan una localización celular
múltiple (Figura S1). En cuanto a la clasificación por familias observamos que de las 559 proteasas, 273
(49%) pertenecen al grupo de las serino proteasas (Figura 3B). Este resultado concuerda con lo descrito
en la bibliografía por Schaller (2004) y van der Hoorn (2008), quienes definen a este conjunto de
proteínas como el grupo más numeroso y de mayor importancia dentro de las proteasas vegetales,
estando implicadas junto con las cisteino proteasas en procesos biológicos clave como degradación
proteica, defensa frente a patógenos, movilización de proteínas de reserva en semilla, apoptosis, etc.
(Schaller, 2004; Antão & Malcata, 2005; van der Hoorn, 2008; Vaseva et al., 2012). Como segundo grupo
mayoritario encontramos las métalo proteasas, seguidas de las cisteino proteasas y proteasas
dependientes de la hidrólisis de ATP (AAA domain) (Figura 3B). En la Figura 3C, se encuentra
representado el rango de peso molecular y de pI de las proteasas e IPs, situados entre valores de 50-100
kDa y de 4-10 respectivamente.
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Figura 3. Clasificación de las 559 proteasas e inhibidores de proteasas seleccionadas en base a su localización celular (A), familias en función del nucleófilo que hidroliza el enlace peptídico (B), y rango de masa molecular (kDa) y punto isoeléctrico (pI) obtenido de la base de datos UniprotKB (C).
5.1.1 Clasificación de proteasas e inhibidores de proteasas
La 559 proteasas e IPs se clasificaron en familias en base a la información disponible en UniprotKB y la
plataforma virtual MEROPS (Rawlings et al., 2014) (Tabla 2). En nuestro análisis con MEROPS, la familia
serino-carboxypeptidasas (familia S10) se constituye como mayoritaria, encontrando 97 proteasas (de
un total 559) pertenecientes a este grupo. Una característica común a todas estas proteínas es que son
clasificadas como extracelulares. Estas fueron comprobadas manualmente para detectar la presencia de
péptido señal característico de las proteínas secretadas usando el software SignalIP 5.0. Las proteasas
pertenecientes a la familia S10 aparecen descritas en la bibliografía como proteínas que presentan
bioactividad frente a patógenos una vez liberadas al apoplasto (Zhou & Li, 2005). Estas proteínas
presentan un potencial biotecnológico a nivel industrial que podría ser explorado. Actualmente
proteínas pertenecientes al grupo serino proteasas están siendo empleadas a nivel agropecuario y
farmacológico por presentar actividad biológica frente a patógenos vegetales, animales y enfermedades
humanas (Antão & Malcata, 2005; Mazorra-Manzano et al., 2018).
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Las proteasas clasificadas como “hidrolasas dependientes de la hidrólisis de ATP” (AAA domain) incluyen
a proteínas y tipos proteicos que comparten una secuencia de 250-300 aminoácidos altamente
conservados entre especies y cuyo dominio principal es ATPasa. Su función catalítica es la eliminación de
proteínas con defectos de plegamiento y el reconocimiento y remodelado de las proteínas diana
correspondientes al dominio proteasa. Este grupo de proteínas se constituyen principalmente como
proteínas integrales de la membrana mitocondrial y tilacoidales (Hanson & Whiteheart, 2005; Janska et
al., 2013). En nuestro análisis estas proteasas se representan el segundo grupo mayoritario.
De las 12 entradas registradas como IPs en la base de datos de Q. ilex, solo siete se encontraron en la
base de datos de UniProtKB. Mediante un análisis Blast se comprobó que su secuencia FASTA
correspondía a un inhibidor y los genes ortólogos correspondientes en Arabidopsis y a su vez fueron
clasificados dentro de la familia I3 e I4 según la clasificación de MEROPS, la que incluye proteínas del
tipo “Kunitz” y “Serpins”. Este tipo de IPs se caracterizan por inhibir las serino proteasas y a su vez se
han descrito como proteínas bioactivas por su actividad antifúngica sobre hongos fitopatógenos como
Fusarium oxyasporum (Wang & Ng, 2006; Habib & Fazili, 2007), por lo que el estudio e identificación en
especies vegetales, es de gran interés agroforestal.
Para analizar la relación entre las 559 proteasas e IPs seleccionadas se realizó una red de interacción
proteína-proteína utilizando la plataforma STRING (https://string-db.org) (Figura 4) en la cual se observa
una fuerte interacción funcional entre el grupo mayoritario de las serino proteasas y el segundo grupo
más abundante en esta red de interacción, las metaloproteasas. Dentro de estos dos grupos
encontramos proteasas dependientes de la hidrólisis de ATP (AAA domain), que establecen la conexión
con casi la totalidad de las proteasas e IPs de la red. Entre estas encontramos dos tipos principales, las
de tipo Clp y FtSH (Zheng et al., 2006; Tatsuta & Langer, 2009; Janska et al., 2013). Las proteasas tipo Clp
(serino proteasas) presentan dominios AAA, sumados a pequeños dominios del tipo Clp proteolíticos y
HSP (Heat Shock Proteins). Las Clp/HSP han sido descritas como proteínas de interés agroforestal por su
implicancia en mecanismos de adaptación al estrés por calor (Schirmer et al., 1996). Las métalo
proteasas del tipo FtSH, cumplen funciones en las mitocondrias y cloroplastos en los procesos de
degradación de proteínas dañadas y a su vez participan en el mantenimiento de la estabilidad de las
membranas mitocondriales y tilacoidales. Intervienen en los mecanismos moleculares que se activan
frente a situaciones de estrés, por lo que su estudio es de gran utilidad para la industria agroforestal
(Zheng et al., 2002, 2006; Mishra & Grover, 2016; Kato & Sakamoto, 2018).
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Tabla 2. Clasificación de las proteasas e inhibidores de proteasas por familias según la base de datos MEROPS.
Familia N°
proteinas Rango Mw (Da)/pI
Actividad catalítica (Actividad)
Proceso Biológico
AAA Hidrolasas dependientes de ATP
37 22127-99159/4.87-9.33 Peptidasa e hidrólisis del enlace fosfato para obtención de energía necesaria para hidrólisis proteica
Catabolismo de proteínas y finalización proceso de desarrollo embrionario
Peptidasa A1 * 23 36607-119877/5.06-8.64 Endopeptidasa tipo Aspártica Respuesta a estrés Bióticos y catálisis de proteínas
Peptidasa A22B 11 14008-59970/5.02-9.30 Endopeptidasa tipo Aspártica Proteólisis de proteínas en membrana
Peptidasa C1* 19 26283-115105/5.37-8.82 Endopeptidasa tipo Cisteínica Actividad proteolítica y respuesta a estrés biótico (1)
Peptidasa C14B 1 45484/4.85 Actividad endopeptidasa tipo Cisteínica
Respuesta a estrés Bióticos y catálisis de proteínas
Peptidasa C15 3 23618/6.60 Piroglutamil peptidasa Proteólisis
Peptidasa C19 2 25068-130307/5.51-8.62 Endopeptidasa tipo Cisteínica Proteólisis
Peptidasa C2 1 238264/6.15 Peptidasa tipo Cisteínica Desarrollo embrionario que termina en dormancia
Peptidasa C26 2 28225-28312/5.35 Metabolismo del glucosinato Proteólisis
Peptidasa C48 5 49347-67191/5.75-7.53 Peptidasa tipo Cisteínica Proteólisis
Peptidasa C54 2 52202/4.94 Peptidasa tipo Cisteínica Autofagia y transporte de proteínas
Peptidasa C78 2 71466/6.07 Peptidasa tipo Cisteínica Proteólisis
Peptidasa C85 6 28228-39231/4.90-8.97 Proteasa específica de ubiquitina dependiente de tiol
De-ubiquitinación de las proteínas
Peptidasa M1 25 98179-99159/5.34-5.43 Metalo-amino-proteolítica Proceso catabólico de péptidos
Peptidasa M14 2 43279-56046/8.10-8.74 Metalo-carboxi-peptidasa Proteólisis
Peptidasa M16 15 54053-121015/5.52-8.23 Metalo-endopeptidasa Procesamiento de proteínas involucradas en la orientación de proteínas hacia la mitocondria
Peptidasa M17 1 61307/6.62 Aminopeptidasa y Metalo-exopeptidasa
Senescencia de hojas
Peptidasa M18 4 52426/6.29 Metalo-endopeptidasa Proteólisis
Peptidasa M20A
1 48217/5.16 Acetil-ornitina desatilasa Proceso Biosintetico de arginina
Peptidasa M24A
12 37679-49060/5.52-7.21 Metalo-endopeptidasa Modificación N-terminal de las proteínas
Peptidasa M24B
3 71993-78709/5.15-6.08 Aminopeptidasa y metaloexopeptidasa
Transporte polar de auxinas
Peptidasa M28 1 100094/6.66 Metalo-endopeptidasa Proteólisis
Peptidasa M3 10 79044-88757/5.45-5.90 Metalo-endopeptidasa Proteólisis
Peptidasa M41 29 59224-99159/5.12-8.73 Metalo-endopeptidasa Proteólisis y respuesta al estrés térmico
Peptidasa M48 3 37948-48482/7.81-9.13 Metalo-endopeptidasa Procesamiento proteico
Peptidasa M50A
4 48726-56824/8,23-8,58 Metalo-endopeptidasa Proteólisis y respuesta de salinidad hiperosmótica
Peptidasa M79 8 33018-39000/6.98-9.33 Metalo-endopeptidasa Procesamiento proteico y aclimatación fotosintética
Peptidasa S10* 97
47803-56240/5.57-9.20 Caboxi-peptidasa Serínica Proteólisis y procesos metabólicos secundarios
Peptidasa S14 50 17001-66390/4.87-9.38 Endopeptidasa Serínica Proteólisis
Peptidasa S16 19 76126-103930/5.41-8.00 Endopeptidasa Serínica Procesamiento proteico y respuesta a estrés oxidativo
Peptidasa S1B 7 76126/8.00 Endopeptidasa Serínica Procesamiento proteico
Peptidasa S1C 19 12628-66802/5.70-8.23 Endopeptidasa Serínica Procesamiento proteico
Peptidasa S26 7 18837-32554/5.74-9.61 Endopeptidasa Serínica Maduración proteica y procesamiento de proteínas involucradas en la orientación de proteínas hacia la mitocondria
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Peptidasa S28* 18 53234-55807/5.27-8.52 Serino peptidasa Proteólisis
Peptidasa S3 3 19218/9.04 Serino peptidasa Procesamiento del péptido señal
Peptidasa S33 5 43059/5.88 Serino aminopeptidasa Procesamiento proteico
Peptidasa S41A 5 52033-55763/5.25-8.97 Endopeptidasa Serínica Procesamiento proteico
Peptidasa S49 8 75095-9.19 Endopeptidasa Serínica Procesamiento proteico
Peptidasa S59 6 106308/8.85 Serino peptidasa Proteólisis
Peptidasa S8* 9 79415-152368/5.77-9.43 Endopeptidasa Serínica Proteólisis y procesos enzimáticos en semilla (SBT17)
Peptidasa S9 22 34847-91001/4,43-6.22 Endopeptidasa Serínica Proteólisis
Peptidasa S9B 2 83851/8.26 Serino peptidasa Proteólisis
Peptidasa T2 6 34341/4.85 Hidrolasa- Aspártica Procesos catabólicos de asparragina via L-alanina y maduración proteica
Peptidasa T3* 10 61190-61600/5.84-9.53 Glutatión hidrolasa Proceso catabólico del glutatión
Inhibidor tipo LTP
2 18853/8.98
Inhibidores de Proteasas I3*
2 23793/6.73 Inhibidor de Actividad endopeptidasa
Respuesta a estrés Bióticos y Abióticos; muerte celular programada
Peptidasa U 27 15422-206294/5.24-9.67 Proteasa Proteólisis y procesos metabólicos secundarios
Inhibidor de proteasas I4*
1 42369/5.66 Inhibidor de serino proteasas
Inhibidores tipo Patatinas
2 44239-45824/5.57-6.36 Inhibidor de serino proteasas Defensa frente a estrés
*indica a que familia pertenecen las proteasas o inhibidores de proteasas secretadas al apoplasto celular.
Por otro lado, en nuestro análisis vemos 5 proteínas claves dentro de los grupos minoritarios
encontrados (cisteino y asparto proteasas) fuertemente relacionadas con los grupos serino y métalo
proteasas (Figura 4), específicamente dos cisteino proteasas (AT3G45310 y AT3G59950) y tres asparto
proteasas (CDR1, AT5G43100 y AT1G09750). Además del grado de interacción entre proteínas, este
análisis nos proporciona información sobre el grado de conservación de estas proteasas e IPs en función
de los genes ortólogos en A. thaliana y P. trichocarpa (García-Lorenzo et al., 2006) (Figura 4),
encontrando que la mayoría de ellas pertenecen a las familias S1, S16, S14, M1 y M41 según
clasificación MEROPS, para las cuales se han descrito genes altamente conservados (García-Lorenzo et
al., 2006).
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Figura 4. Red de interacción proteína-proteína generada por la base de datos STRING. Un total de 160 de proteasas e IPs son representadas por sus genes homólogos en A. thaliana. Las líneas discontinuas indican agrupaciones por familias; el color azul corresponde a serino proteasas, el color verde a cisteino proteasas, el color rojo a metalo proteasas y el color amarillo a aspártico proteasas. En color violeta se agrupan los IPs. Destacan también Hidrolasas dependientes de la hidrólisis de ATP con líneas punteadas de color naranja, así como las proteasas más representativas de cada una de las familias.
Se realizó una búsqueda de genes ortólogos para los genes que codifican para proteasas e IPs en la base
de datos de Q. ilex en A. thaliana y P. trichocarpa, así como de los transcritos que codifican cada gen
(Figura S2). Se encontraron que 225 genes de un total de 723 genes que codifican para proteasas e IPs
en A. thaliana, y 200 de un total de 955 genes encontrados en P. trichocarpa que codifican para
proteasas por García-Lorenzo et al. (2006). El bajo número de genes que codifican para proteasas e IPs
encontrado en la base de datos de Q. ilex en relación a estas dos especies, se justifica por no disponer
aun del genoma secuenciado de Q. ilex. Tres de los siete IPs representados en la Figura 4 aparecen
anotados como proteasas en la base de datos de Q. ilex. Según la información aportada por UniProtKB,
29 de 49
estas proteasas presentan un dominio inhibidor. Siendo sintetizadas en forma de zimogenos,
volviéndose activas por auto-catálisis mediante la escisión de su propio dominio inhibidor.
5.1.2 Proteínas secretadas como diana en la búsqueda de compuestos bioactivos
En plantas, las proteasas e IPs secretadas cumplen un papel biológico relevante, ya que participan en la
primera línea de defensa contra patógenos, en el metabolismo del nitrógeno hidrolizando grandes
complejos proteicos para facilitar la absorción de aminoácidos, y movilizando proteínas de reserva
durante procesos como la germinación (Vierstra, 1996; López-Otín & Bond, 2008; Vaseva et al., 2012).
Estas proteínas extracelulares son candidatos en la búsqueda de compuestos bioactivos y en la defensa
de las especies cultivadas y forestales frente a patógenos (Islam et al., 2017; Figueiredo et al., 2018).
Para ser secretadas al apoplasto, las proteínas necesitan de un péptido señal que dirija y señalice el
transporte de la proteína desde el sitio de síntesis hasta el sitio de secreción en la membrana
plasmática. De las 189 proteasas clasificadas por UniProtKB como secretadas en nuestro análisis, solo
encontramos la presencia de péptido señal con alta probabilidad (>0.8) en 103 de ellas, las cuales
correspondían a 37 genes ortólogos en A. thaliana (Tabla S1). A modo de ejemplo en la Figura 5 se
muestra el resultado de una búsqueda de péptido señal utilizando el programa SignalIP 5.0 donde se
visualizan las secuencias correspondientes al péptido señal, proteína secretada y el aminoácido
correspondiente al sitio de corte del péptido señal.
Figura 5. Predicción de la presencia de péptido señal. Formato de salida estándar generado por la plataforma SignalIP 5.0. donde se indica la probabilidad de la presencia del péptido señal en la secuencia de la proteína (línea amarilla), la secuencia de la proteína secretada (línea roja) y el sitio de corte del péptido señal (línea verde). A) ejemplo de proteasa con alta probabilidad (p 0.89) de presentar péptido señal; B) ejemplo de proteasa con baja probabilidad (p 0.12) de presentar péptido señal.
Para ver el grado de conservación de las proteínas seleccionadas (proteasas e IPs), se realizó una
comparativa con la especie Q. robur (Plomion et al., 2018), debido a las ya comentadas ventajas de esta
especie (genoma secuenciado y filogenéticamente cercana a Q. ilex). Para ello se realizó un análisis
BLASTP, encontrando un 72% de homología entre ambas especies en cuanto a proteasas e IPs (Tabla 3).
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Esto refuerza la idea de que los genes que codifican para este tipo de proteínas se encuentran
altamente conservados entre especies dentro de un mismo género y entre especies de géneros
divergentes (García-Lorenzo et al., 2006; Vierstra, 2009; Vaseva et al., 2012; Tuskan et al., 2018).
Tabla 3. Proteasas e inhibidores de proteasas presentes en las bases de datos de Q. ilex y Q. robur
Número de entradas Base de datos
Q. ilex Q. robur
Proteínas totales 79757 78665
Proteasas 539 432
Inhibidores de enzimas proteasas 12 16
Coincidencias en ambas bases de datos en base alineamiento BLASTP* 390
*alineamiento BLASTP se realizó ejecutando el sistema operativo Linux y la herramienta de Blast protein para Ubuntu con una
identidad superior al 80%.
5.3 Ensayos in vitro de la actividad proteasa
La cuantificación de la actividad proteasa se midió a 30, 60, 90, 120 minutos utilizando el protocolo de
Coelho et al. (2016), alcanzándose los valores de máxima actividad enzimática a los 30 minutos de
reacción en las condiciones experimentales empleadas (35°C y pH 7.4) y con un valor promedio de 18.18
mU (Figura 6 y Figura S3). En la Figura 6 se representan los valores de actividad proteasa normalizados
en escala logarítmica, en la que observamos una actividad enzimática significativamente mayor en
embrión de Q. suber, seguido por hoja y bellota de la misma especie. Esto se correlaciona con lo
observado en los zimogramas para el género Quercus (Figura7A), donde las bandas que revelan mayor
intensidad corresponden a Q. suber. La actividad enzimática en todos los de Q. ilex no presenta
diferencias significativas entre ellos, pero sí con el resto de los Quercus, ubicándose en un rango de
actividad intermedio. La menor actividad proteasa registrada en el análisis correspondió a la hoja de Q.
coccifera, lo cual se relaciona con lo observado en el análisis de zimogramas (Figura 7A). La actividad
proteasa medida en el fruto de A. comosus y A. deliciosa se encuentra en 150 mU y 54 mU
respectivamente, siendo utilizados ambos sistemas para validar el método de cuantificación, ya que han
sido ampliamente descritos en la bibliografía (Dutta & Bhattacharyya, 2013; Yuk et al., 2017). Teniendo
en cuenta que los ensayos de actividad con estas especies han sido realizados con proteasas purificadas,
extrapolando a nuestros resultados estaríamos en el rango esperado de actividad proteasa (López-
García et al., 2012) (Figura S4).
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Figura 6. Actividad proteasa in vitro en diferentes órganos y especies del género Quercus utilizando 1.5% de Azocaseina durante un tiempo de reacción de 30 minutos. Se representan los valores de actividad catalítica media normalizada en escala logarítmica y sus respectivas desviaciones estándar. Las letras en común no son significativamente diferentes (p > 0.05). Hoja (H), embrión (E), cotiledón (C), bellota (B), Q. ilex (Qi), Q. coccifera (Qc), Q. suber (Qs).
5.4 Ensayos de actividad proteasa e inhibidores de proteasas en gel
El empleo de zimogramas permitió detectar la actividad proteasa e IPs en extractos procedentes de las
muestras de estudio. Esta técnica presenta una alta reproducibilidad y sensibilidad, pudiéndose detectar
hasta 1 mU de actividad proteasa tal y como se ha descrito en la bibliografía (Granelli-piperno & Reich,
1978; Heussen & Dowdle, 1980; Vandooren et al., 2013). Mediante esta técnica pudimos observar
diferencias en actividad proteasa e IPs entre los distintos extractos ensayados (Figuras 7 y 8).
En el zimograma correspondiente a Q. ilex (Figura 7A) podemos observar la presencia de bandas de
actividad comunes a todos los órganos en un rango de peso molecular comprendido entre 50 y 70 KDa,
y otras específicas encontradas en hoja y embrión (35-40 KDa). También observamos bandas entre los
140-260 KDa en bellota, embrión y cotiledón, las cuales podrían corresponder a complejos proteicos con
actividad de proteasas de alto peso molecular, como ha sido descrito en la bibliografía para otros
sistemas biológicos (Nygren et al., 2007; Vandooren et al., 2013).
En base los resultados obtenidos de nuestro análisis in silico, en los zimogramas cabría esperar un mayor
número bandas que revelen actividad. Esto podría tener explicación a nivel de sitio activo de cada
proteasa, ya que cada una presenta un rango de pH óptimo al cual se vuelven activas (González-Rábade
et al., 2011). En nuestro sistema experimental hemos utilizado un pH de 7.4, con lo cual es lógico pensar
que solo se detectan las que son activas a este pH.
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En la Figura 7B Y C se muestran IPs encontrados para los diferentes órganos de Q. ilex, Q. suber y Q.
coccifera, donde se observan diferentes patrones en cada uno de ellos. En el peso correspondiente a 21
kDa se observa la aparición de una banda de gran intensidad en los órganos correspondientes a hoja de
las tres especies (Figura 7C), la cual coincide con la banda de inhibidor de tripsina de los marcadores de
peso molecular utilizada como control positivo. Por otro lado se observa un gran número de bandas en
la zona de alto peso molecular en ambos geles de IPs, especialmente en cotiledón de Q. ilex y en la hoja
de las tres especies, lo cual contrasta con lo encontrado en la bibliografía donde se describe que la
mayoría de los IsP son de bajo peso molecular (Wilkesman & Kurz, 2009; Jamal et al., 2013). También
hay resaltar la presencia de una banda intensa de bajo peso molecular (inferior a 19 KDa) presente en
Figura 7. Zimogramas realizados para detectar la actividad
proteasa e IPs. Se cargó 50 µg de cada extracto proteico. La
actividad proteasa (A, D, E) e IPs (B, C) se ensayó en geles
copolimerizados al 0.1% de gelatina y 9% (A, B, D, E) o al 12 % (C)
de poliacrilamida en distintos órganos de especies del género
Quercus (A, B, C, D), en semilla de las especies Arachis hypogaea y
Pinus pinaster, y fruto de Ananas comosus y Actinidia deliciosa (E).
Las distintas especies y órganos vienen representados como: Hoja
(H), embrión (E), cotiledón (C), bellota (B), semilla (S), Q. ilex (Qi),
Q. coccifera (Qc), Q. suber (Qs), Arachis hypogaea (Ah) curltivar
INTA 400 (1) y cultivar Granoleico (2), Pinus pinaster (Pp), Ananas
comosus (Ac) y Actinidia deliciosa (Ad). Los recuadros indican las
bandas cortadas e identificadas por espectrometría de masas.
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todos los órganos y solo visible en el gel más concentrado (12% de poliacrilamida y 0.1% de gelatina;
Figura 7C), las cuales podrían corresponder a péptidos inhibidores de proteasas de un tamaño <10 KDa
como se encuentra descrito en la bibliografía (Habib & Fazili, 2007; Vaseva et al., 2012; Jamal et al.,
2013).
La Figura 7D corresponde al zimograma de actividad proteasa para los distintos órganos de Q. suber y Q.
coccifera y la Figura 7E corresponde a A. hypogaea, P. pinaster y dos especies utilizadas como sistema
modelo de estudio de proteasas, A. comosus (Béez et al., 2007; López-García et al., 2012; Misran et al.,
2019) y A. deliciosa (Yuk et al., 2017). Si comparamos los perfiles de proteasas entre los diferentes
Quercus, observamos que en hoja de Q. suber y Q. coccifera se detectan las mismas bandas que en Q.
ilex en un rango de 50 – 70 KDa. En cotiledón de Q. coccifera se observan dos bandas específicas de gran
intensidad. Una de estas bandas corresponde al peso molecular de 70 KDa y la otra a 45 KDa
aproximadamente. En bellota de Q. coccifera, también se observó la presencia de una banda específica
alrededor de los 30 – 40 KDa.
En relación con el zimograma de la Figura 7A, A. hypogaea presenta diferentes patrones de expresión
entre los dos cultivares empleados a nivel de semillas no germinadas, pero no de cotiledón ni embrión.
También se podría establecer una relación de las bandas que aparecen con gran intensidad por encima
de los 50 KDa con la proteasa de 60 KDa descrita por Cameron & Maselis (1971). En fruto de A. comosus
se detectó la mayor actividad proteasa de los extractos ensayados. Teniendo en cuenta que en este
zimograma se partió de la misma cantidad total de proteína para cada una de las muestras, podemos
deducir que el ratio proteasa/proteína total en este órgano está muy por encima del resto de los órgano
y especies evaluadas. El fruto de A. deliciosa, presenta un patrón de bandas de pesos moleculares
variados, dilucidándose alrededor de 30 KDa una banda que podría corresponder con alguna de las
isoformas descritas en la bibliografía de la ‘actinidina’ y otra banda entre 25-20 KDa que correspondería
a la ‘kiwelina’ (Larocca et al., 2010; Boland, 2013). Estos resultados validan nuestro sistema
experimental para determinar la actividad proteasa e IPs.
Debemos tener en cuenta que la utilización de zimogramas no es considerado un buen método de
cuantificación de la actividad proteasa, a pesar de la sensibilidad de la técnica. Esto es debido a las
condiciones en las que se desarrollan las electroforesis, en donde intervienen muchos factores como el
tiempo de incubación con los tampones de hidrólisis, temperaturas de hidrólisis y los pHs que limitan la
capacidad para predecir y cuantificar la actividad (Wilkesman & Kurz, 2009; Vandooren et al., 2013).
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Para detectar el tipo de familia proteica de las proteasas detectadas en gel, se realizó un zimograma
utilizando distintos inhibidores químicos de proteasas específicos para cada una de estas familias (Figura
8). Entre ellos se usaron fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) que inhibe las serino proteasas, ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) como quelante para bloquear métalo proteasas, iodoacetamida que
inhibe las cisteino proteasas y pepstatina A que inhibe las asparto proteasas. Para ello se utilizaron
extractos de distintos órganos Q. ilex (hoja, embrión y cotiledón), y se siguió el protocolo propuesto por
Michaud et al. (1993). En la Figura 8 se observa una clara inhibición de la actividad proteasa en los tres
órganos evaluados (hoja, embrión y cotiledón) cuando se añadió PMSF, pudiendo concluir que las
bandas inhibidas corresponden a serino proteasas. Por otro lado, se observa una disminución de la
intensidad de las bandas en el cotiledón cuando se añadió EDTA, pudiendo corresponder estas bandas a
métalo proteasas. Estos resultados se correlacionan con los obtenidos en el trabajo in silico en el cual, la
actividad proteasa predominante en los órganos de la encina se encuentra representada por serino
proteasas seguido de las métalo proteasas.
Figura 8. Zimogramas de actividad proteasa (9% de poliacrilamida y 0.1% de gelatina) realizados en distintos órganos (hoja: H, embrión: E, cotiledón: C) de Quercus ilex (Qi) donde se probaron inhibidores químicos de proteasas a una concentración de 100mM. Se cargó 50 µg de cada extracto proteico. Los distintos inhibidores químicos se representan con números: 1 (PMSF), 2 (EDTA), 3 (Iodoacetamida) y 4 (Pepstatina A).
5.5 Identificación de proteasas mediante proteómica shotgun (LC-MSMS)
Las bandas que mostraron actividad proteasa más intensa fueron cortadas de los zimogramas (Figura
6A, B y D) y analizadas mediante técnicas de proteómica shotgun (LC-MSMS). De un total de 814
proteínas identificadas, 75 correspondían a proteasas y 3 a inhibidores de proteasa (Tabla 4). El mayor
número de las proteasas identificadas pertenecían a la familia serino proteasas (38), seguido de las
métalo (14), asparto (11) y cisteino proteasas (4). Estos resultados son consistentes con los obtenidos en
la búsqueda in silico, donde el 49% del total de proteasas son incluidas dentro del grupo de las serino
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proteasas, frente al 40% que representa este grupo en las identificaciones realizadas. Una gran
proporción de las serino proteasas identificadas son secretadas (14 proteasas), dentro de ellas, 10
proteínas pertenecen a la familia S10 y han sido identificadas principalmente en extractos de hoja y
bellota de Q. ilex y Q. coccifera. Estas identificaciones corresponden con las bandas recortadas entre 50-
70 KDa para cada uno de estos órganos (Figura 7A y D), siendo identificadas proteínas con pesos
moleculares próximos a los 50-60KDa, con lo cual se puede establecer una buena relación entre las
bandas de actividad observadas en los zimogramas y las proteínas identificadas. Las métalo proteasas se
han encontrado indistintamente en hoja, bellota completa, cotiledón y embrión de ambas especies,
cuya localización principal es el cloroplasto y con un peso molecular promedio entre las identificaciones
de 75 KDa, coincidente con la mayoría de las bandas recortadas en cada uno de los geles (Figura 7A y D).
En relación a las asparto proteasas, tampoco se ha encontrado un patrón de expresión en cuanto a
órgano o especie, sin embargo, la mitad de estas identificaciones correspondían a proteasas secretadas
con un peso molecular promedio de 50 KDa.
La proteasa registrada con la entrada “qilex_74150” en la base de datos de Q. ilex corresponde a una
“Aminoluecin peptidase (AtLAP2, EC: 3.4.11.1)”, siendo la única proteína de identificación común a
todos los órganos analizados y a su vez fue registrada con un “score” superior a 300, muy por encima del
registrado para el resto de las proteasas e IPs. Esta métalo proteasa clasificada dentro de la familia M17,
presenta un dominio chaperona independiente al dominio proteasa, que cumple un papel clave en la
reducción de daños generados por estreses en las plantas (Scranton et al., 2012). Atendiendo a estas
características, “AtLAP2” se constituye como una proteasa candidata para ser estudiada a nivel de
expresión génica en la encina y poder a su vez ser utilizadas como marcador molecular ante situaciones
de estrés en esta especie. Las proteínas “HSP70” (Heat Shock Protein) es la segunda proteína mejor
identificada con un “score” de 59. Estas fueron descritas en bibliografía (Mayer & Bukau, 2005) como
chaperonas cuya función es proteger la estructura tridimensional de las proteínas frente situaciones de
estrés abiótico para evitar la desnaturalización y a su vez participan en el marcaje e hidrólisis de aquellas
que se encuentran desnaturalizadas.
Las proteínas como “AED3” (Aspartyl Protease, EC: 3.4.23) y “SCP18” (Serine Carboxipeptidase-Like 18
EC: 3.4.16), con una alta confianza en la identificación, son clasificadas como secretadas al espacio
extracelular y pertenecen al grupo de las asparto (A1) y serino proteasas (S10) respectivamente. Estas
han sido descritas como proteínas de defensa frente a patógenos (Golldack et al., 2003).
En general se han identificado un mayor número de proteasas en los órganos de Q. ilex, siendo 38 de
ellas específicamente encontradas en los extractos correspondientes para esta especie, y 13 se
identificaron exclusivamente en Q. coccifera.
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Los IPs han sido identificados en embrión y bellota de Q. ilex y se corresponden en sus pesos
moleculares con las bandas recortadas para estos órganos (Figura 7A). Por otro lado, hay que destacar
que en la muestra procedente de los IPs (Figura 7C) no se obtuvieron identificaciones. Esto podría tener
su explicación en la escasa representación de estas proteínas en la base de datos utilizada.
Mediante este trabajo se ha abordado por primera vez un análisis para la búsqueda e identificación de
proteasas y sus inhibidores en encina utilizando una aproximación in-silico combinada con estudios de
actividad enzimática.
Tabla 4. Proteasas e IPs identificados mediante análisis proteómico shotgun de los diferentes órganos de Q. ilex y Q. coccifera.
Entrada Q.ilex DB Entrada UniProtKB Nombre de la Proteína
Genes Ortólogos en A. thaliana
MW (Da) Muestra* Familia Proteica
(MEROPS) Localización
celular
qilexprot_6894 Q9LST0_ARATH Aspartyl aminopeptidase AT5G60160 52426 Q.c.B, Q.c.H, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase M18 family
Citoplasma
qilexprot_19725 APM1_ARATH Aminopeptidase M1 AT4G33090 98179 Q.i.C Peptidase M1 family Membrana plamática
qilexprot_64383 COPDA_ARATH Probable cytosolic oligopeptidase A (EC 3.4.24.70)
AT5G10540 79044 Q.i.C Peptidase M3 family Citoplasma
qilexprot_13782 PSA_ARATH Puromycin-sensitive aminopeptidase (PSA) (EC 3.4.11.14)
AT1G63770 99159 Q.i.B, Q.i.H, Q.i.E
Peptidase M1 family Cloroplasto
qilexprot_16827 PSA_ARATH Puromycin-sensitive aminopeptidase (PSA) (EC 3.4.11.14)
AT1G63770 99159 Q.i.B, Q.i.E Peptidase M1 family Cloroplasto
qilexprot_14069 AED3_ARATH Aspartyl protease AED3 (EC 3.4.23.-) AT5G53350 61964 Q.i.B, Q.c.H, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase A1 family Secretadas
qilexprot_22106 AMPP2_ARATH Aminopeptidase P2 (AtAPP2) (EC 3.4.11.9)
AT3G05350 78709 Q.i.B Peptidase M24B family
Cloroplasto
qilexprot_78873 A0A1B1W4W5_ARATH
ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit (EC 3.4.21.92)
AT2G47940 22128 Q.i.H Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_10205 RDL4_ARATH Cysteine protease RDL4 (EC 3.4.22.-) AT4G11310 39925 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.C, Q.c.C,Q.i.E
Peptidase C1 family Pared Celular
qilexprot_19599 DEGP8_ARATH Protease Do-like 8, chloroplastic (EC 3.4.21.-)
AT5G39830 47493 Q.i.H Peptidase S1C family Cloroplasto
qilexprot_4241 FTSH1_ARATH ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH 1 (EC 3.4.24.-)
AT1G50250 76759 Q.c.H Peptidase M41 family
Cloroplasto
qilexprot_67342 FTSH1_ARATH ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH 1 (EC 3.4.24.-)
AT1G50250 76759 Q.c.H Peptidase M41 family
Cloroplasto
qilexprot_74150 AMPL2_ARATH Leucine aminopeptidase 2 AT4G30920 61307 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.C, Q.c.C, Q.i.E
Peptidase M17 family
Cloroplasto
qilexprot_61535 MPPB_ARATH Probable mitochondrial-processing peptidase subunit beta, mitochondrial (EC 3.4.24.64) (Beta-MPP)
AT1G76140 89405 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.C
Peptidase M16 family
Mitocondria
qilexprot_64729 MPPA2_ARATH Probable mitochondrial-processing peptidase subunit alpha-2 (EC 3.4.24.64)
AT3G16480 54053 Q.c.H, Q.i.E Peptidase M16 family
Cloroplasto
qilexprot_61192 Q94CC6_ARATH Serine carboxypeptidase S28 family protein
AT4G36195 54774 Q.c.H Peptidase S28 family Pared Celular
qilexprot_70775 SCP17_ARATH Serine carboxypeptidase-like 17 (EC 3.4.16.)
AT1G33540 52300 Q.i.E Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_52204 SCP18_ARATH Serine carboxypeptidase-like 18 (EC 3.4.16.)
AT1G33540 52300 Q.c.H Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_13102 SCP18_ARATH Serine carboxypeptidase-like 18 (EC 3.4.16.)
AT1G33540 52300 Q.c.B, Q.i.E Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_32015 SCP3_ARATH Serine carboxypeptidase-like 3 (EC 3.4.16.)
AT1G73280 50279 Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.E
Peptidase S10 family Secretadas
37 de 49
qilexprot_52554 SCP40_ARATH Serine carboxypeptidase-like 40 (EC 3.4.16.)
AT3G63470 56240 Q.c.H Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_1346 SCP46_ARATH Serine carboxypeptidase-like 46 (EC 3.4.16.)
AT2G33530 51883 Q.c.H Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_17949 SCP7_ARATH Serine carboxypeptidase-like 7 (EC 3.4.16)
AT3G10450 49565 Q.i.H Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_50660 SPPA1_ARATH Serine protease SPPA (EC 3.4.21.) AT1G73990 75095 Q.i.H, Q.c.H Peptidase S49 family Cloroplasto
qilexprot_9885 SPZX_ARATH Serpin-ZX AT1G47710 42639 Q.i.E Serpin family Secretadas
qilexprot_15638 SBT36_ARATH Subtilisin-like protease SBT3.6 (EC 3.4.21.)
AT4G10550 83654 Q.i.H Peptidase S8 family Secretadas
qilexprot_7150 EDA2_ARATH Probable serine protease EDA2 (EC 3.4)
AT2G18080 55807 Q.i.B Peptidase S28 family Secretadas
qilexprot_46235 EGY2_ARATH Probable zinc metalloprotease EGY2 (EC 3.4.24)
AT5G05740 60064 Q.c.H Peptidase M50B family
Cloroplasto
qilexprot_3902 SBT17_ARATH Subtilisin-like protease SBT1.7 (EC 3.4.21)
AT5G67360 79415 Q.i.B, Q.c.B Peptidase S8 family Secretadas
qilexprot_14018 SBT16_ARATH Subtilisin-like protease SBT1.6 (EC 3.4.21)
AT4G34980 81046 Q.c.H Peptidase S8 family Membrana plamática
qilexprot_12941 AED3_ARATH Aspartyl protease AED3 (EC 3.4.23) AT5G53350 61964 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase A1 family Secretadas
qilexprot_17113 APA2_ARATH Aspartic proteinase A2 (EC 3.4.23.) AT1G62290 55748 Q.i.B, Q.c.B, Q.c.H, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase A1 family Vacuola
qilexprot_22274 CDR1_ARATH Aspartic proteinase CDR1 (EC 3.4.23.) AT5G33340 46819 Q.i.B Peptidase A1 family Secretadas
qilexprot_64279 ASPA_ARATH Aspartyl protease family protein (EC 3.4.23.)
AT5G10770 49864 Q.i.H, Q.c.H, Q.i.E
Peptidase A1 family Membrana plamática
qilexprot_73159 7SB1_SOYBN Basic 7S globulin (SBg7S) KRH68584; 46393 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.E
Peptidase A1 family Citoplasma
qilexprot_42997 A8MQE3_ARATH Alpha/beta-Hydrolases superfamily protein
AT5G25770 47637 Q.i.E, Q.i.H Peptidase A1 family Citoplasma
qilexprot_19725 AMPP1_ARATH Aminopeptidase P1(EC 3.4.11.9) AT4G36760 71993 Q.i.C Peptidase M24 Citoplasma
qilexprot_38437 BAS1A_ARATH 2-Cys peroxiredoxin BAS1 (EC 1.11.1.15)
AT3G11630 29092 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.E
Peptidase C1 Cloroplasto
qilexprot_71168 CD48D_ARATH Transitional endoplasmic reticulum ATPase D
AT3G53230 90340 Q.i.E AAA Hidrolasas dependientes de la Hidrólisis de ATP
Núcleo y Citoplasma
qilexprot_67732 CD48D_ARATH Transitional endoplasmic reticulum ATPase D
AT3G53230 90340 Q.i.H, Q.i.E AAA Hidrolasas dependientes de la Hidrólisis de ATP
Núcleo y Citoplasma
qilexprot_55872 CDR1_ARATH Aspartic proteinase CDR1 (EC 3.4.23) AT5G33340 46819 Q.i.H Peptidase A1 family Secretadas
qilexprot_50467 CLPB1_ARATH Chaperone protein ClpB1 (ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpB)
AT1G74310 101295 Q.i.B Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_77273 CLPB1_ARATH Chaperone protein ClpB1 (ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpB)
AT1G74310 101295 Q.i.B, Q.i.H, Q.i.H
Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_8964 CLPB2_ARATH Chaperone protein ClpB2 (ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpB homolog 2)
AT4G14670 68898 Q.i.B Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_50 CLPB3_ARATH Chaperone protein ClpB3 (ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpB homolog 3)
AT5G15450 108943 Q.i.B Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_48074 CYPR1_CYNCA Cyprosin (EC 3.4.23) AT3G48870 51564 Q.i.B Peptidase A1 family Secretadas
qilexprot_67241 CYSEP_RICCO Vignain (EC 3.4.22) 40111 Q.c.H Peptidase C1 family Citoplasma
qilexprot_29180 EF2_ARATH Elongation factor 2 AT3G51800 93891 Q.i.B, Q.c.C, Q.i.E
AAA Hidrolasas dependientes de la Hidrólisis de ATP
Citoplasma
qilexprot_58945 EGY3_ARATH Probable zinc metallopeptidase AT1G56070 62718 Q.i.B Peptidase M50 Secretadas
38 de 49
EGY3, chloroplastic (EC 3.4.24) family
qilexprot_3345 HS901_ARATH Heat shock protein 90 AT5G52640 80635 Q.i.B, Q.i.C, Q.i.E Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_34679 HS901_ARATH Heat shock protein 90 AT5G52640 80635 Q.i.B, Q.i.C, Q.i.E Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_22841 HS901_ARATH Heat shock protein 90 AT5G52640 80635 Q.i.B, Q.i.C, Q.i.E Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_23203 HSP7G_ARATH Heat shock protein 70 AT5G49910 76997 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_4538 HSP7G_ARATH Heat shock protein 70 AT5G49910 76997 Q.i.B, Q.c.B, Q.c.C
Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_27298 HSP7G_ARATH Heat shock protein 70 AT5G49910 76997 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_76191 HSP7G_ARATH Heat shock protein 70 AT5G49910 76997 Q.c.B Peptidase S14 family Cloroplasto
qilexprot_37118 HSP83_ARATH Heat shock protein 83 AT5G52640 80635 Q.i.B Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_77892 HSP83_ARATH Heat shock protein 83 AT5G52640 80635 Q.i.B Peptidase S14 family Citoplasma
qilexprot_73389 PLP1_ARATH Patatin-like protein 1 (EC 3.1.1) AT4G37070 45824 Q.i.E Patatin family Citoplasma
qilexprot_19957 PLP2_ARATH Patatin-like protein 2 (EC 3.1.1) AT2G26560 44239 Q.i.B Patatin family Citoplasma
qilexprot_18055 PSA7A_ARATH Proteasome subunit alpha type-7-A (EC 3.4.25.1)
AT3G51260 27337 Q.i.H, Q.i.E Peptidase T1 family Citoplasma
qilexprot_51657 PSD7A_ARATH 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7 homolog A
AT5G05780 34278 Q.i.E, Q.c.B Peptidase S5 family Citoplasma
qilexprot_45544 PSMD4_ARATH 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4
AT4G38630 40757 Q.i.E Peptidase S5 family Citoplasma
qilexprot_68821 PTPA_ARATH Prolyl tripeptidyl peptidase AT4G37070 45824 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H
Peptidase S9 family Cloroplasto
qilexprot_61489 Q5E916_ARATH ATP-dependent protease LON. AT2G25740 62051 Q.c.B Peptidase S16 family Mitocondria
qilexprot_33905 Q9C864_ARATH Aspartyl protease AT1G31450 47908 Q.i.H Peptidase A1 family Citoplasma
qilexprot_34839 Q9C864_ARATH Aspartyl protease AT1G31450 47908 Q.i.H Peptidase A1 family Citoplasma
qilexprot_77826 RCA_ARATH RuBisCO activase AT2G39730 51981 Q.i.H, Q.c.H AAA Hidrolasas dependientes de la Hidrólisis de ATP
Cloroplasto
qilexprot_45790 RCA_ARATH RuBisCO activase AT2G39730 51981 Q.i.H, Q.c.H AAA Hidrolasas dependientes de la Hidrólisis de ATP
Cloroplasto
qilexprot_11388 RD23D_ARATH Ubiquitin receptor RAD23D AT5G38470 40066 Q.i.E RAD23 family Núcleo
qilexprot_16206 RS81_ARATH 40S ribosomal protein S8-1 AT5G20290 15479 Q.i.E Peptidase S8 family Cloroplasto
qilexprot_29321 RUB1_ARATH Ubiquitin-NEDD8-like protein RUB1 AT1G31340 17397 Q.i.B, Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.C, Q.i.E
Peptidase C12 family Cloroplasto
qilexprot_52755 SAT1_ARATH Serine acetyltransferase 1(EC 2.3.1.30)
AT1G55920 34251 Q.i.E Peptidase S1 family Cloroplasto
qilexprot_14018 SBT12_ARATH Subtilisin-like protease SBT1.2 (EC 3.4.21)
AT1G04110 83776 Q.c.B Peptidase S8 family Secretadas
qilexprot_13571 SCP40_ARATH Serine carboxypeptidase-like 40 (EC 2.3.1)
AT2G23000 49785 Q.i.E Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_52204 SCP18_ARATH Serine carboxypeptidase-like 18 (EC 3.4.16)
AT1G33540 52300 Q.c.H, Q.i.E Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_32015 SCP18_ARATH Serine carboxypeptidase-like 18 (EC 3.4.16)
AT1G33540 52300 Q.c.B, Q.i.H, Q.c.H, Q.i.E
Peptidase S10 family Secretadas
qilexprot_58269 VATB1_ARATH V-type proton ATPase subunit B1 AT1G76030 54108 Q.i.E AAA Hidrolasas dependientes de la Hidrólisis de ATP
Vacuola
39 de 49
*Hoja (H), embrión (E), cotiledón (C), bellota (B), Q. ilex (Qi), Q. coccifera (Qc).
6. Conclusiones
1. Mediante análisis in-silico en la base de datos especie-específica de Q. ilex se han
encontrado 657 proteasas y 12 IPs, lo que representa menos del 0.8 % del total de proteínas
anotadas en dicha especie.
2. La búsqueda de genes ortólogos en Arabidopsis thaliana y Populus trichocarpa reveló que
las proteasas e IPs encontradas correspondieron a 225 y 200 genes, de los 723 y 955 que
codifican para estas proteínas en dichas especies respectivamente.
3. Los grupos más abundantes de proteasas fueron las serino y metalo con 273 y 119
representantes, respectivamente. Del total de proteasas, 189 fueron clasificadas como
secretadas, con 103 conteniendo péptido señal.
4. La búsqueda de secuencias homologas en Q. robur, reveló un 72% de homología, lo que
indica un alto grado de conservación dentro del género Quercus.
5. Se encontraron diferencias significativas en los niveles de actividad total proteasa entre
especies del género Quercus, encontrándose los mayores niveles de actividad en embriones
de Q. suber. No se encuentran diferencias significativas entre los distintos órganos de Q.
ilex.
6. Los ensayos de actividad en gel mostraron un patrón de bandas diferente entre órganos y
especies del género Quercus, siendo el del embrión, con 5 bandas el más complejo. Las dos
bandas de mayor intensidad, comunes a todos los órganos, se encontraron en torno a 50-70
KDa.
7. Mediante análisis de proteómica shotgun (LC-MSMS) de las bandas del gel que presentaron
actividad, se identificaron 814 proteínas, de las que 75 correspondieron a proteasas (39
serino, 14 metalo proteasas y 21 secretadas) y 3 a IPs.
8. La proteína “Aminoleucine peptidase” (AtLAP2), descrita como marcador de respuesta a
estrés abiótico, identificada con los parámetros de confianza más altos y presente en todos
los órganos analizados, es una candidata ideal para investigaciones posteriores. Otras dos
buenas candidatas serían la “Aspartyl protease” (AED3) y “Serine Carboxipeptidase-like 18”
(SCP18) también identificadas con parámetros de confianza altos y que han sido descritas en
la literatura como proteínas de defensa frente a patógenos.
40 de 49
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8. Anexos
Figura S1. Diagramas de Venn de la localización a nivel celular de las enzimas proteasas e IPs de Q. ilex. El diagrama establece los conjuntos e interacciones en función de la ubicación múltiple de las proteínas a partir de sus genes codificantes.
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Figura S2. Número de transcritos de genes ortólogos en A. thaliana y P. trichocarpa que codifican para proteasas e IPs.
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Figura S3. Actividad proteasa in vitro en diferentes órganos y especies del género Quercus utilizando 1.5% de Azocaseina a los tiempos de reacción 30, 60, 90 y 120 minutos. Se representan los valores de actividad catalítica media normalizada en escala logarítmica y sus respectivas desviaciones estándar.
Figura S4. Actividad proteasa in vitro en diferentes órganos y especies del género Pinus, Actinidia, Ananas y Arachis utilizando 1.5% de Azocaseina durante un tiempo de reacción de 30 minutos. Se representan los valores de actividad catalítica media normalizada en escala logarítmica y sus respectivas desviaciones estándar. Las letras en común no son significativamente diferentes (p > 0.05). Embrión (E), cotiledón (C), semilla (S), Arachis hypogaea (Ah) curltivar INTA 400 (1) y cultivar Granoleico (2), Pinus pinaster (Pp), Ananas comosus (Ac) y Actinidia deliciosa (Ad).
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Tabla S1. Enzimas proteasas e inhibidores de proteasas secretadas al apoplasto celular. Se indica la probabilidad de que presenten un péptido señal (Sec/SPI), la probabilidad de que no exista ese péptido señal y la posición del sitio de corte del péptido señal; revelando a su vez entre que aminoácidos se hidroliza el enlace peptídico. En la tabla únicamente se representan proteínas con una probabilidad de ser secretadas superior al 0.80 y por genes codificantes y ortólogos en A. thaliana. Únicos.
Genes Cod. Únicos # ID Probabiliada Péptido Señal (Sec/SPI) Probabilidad Sin Péptido Señal Sitio de corte
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EDA2_ARATH qilexprot_7150 0.836237 0.163763 CS pos: 27-28. SHG-FL. Pr: 0.7356
GAGT1_ARATH qilexprot_8152 0.994286 0.005714 CS pos: 21-22. STS-TP. Pr: 0.3205
GAGT2_ARATH qilexprot_14018 0.825287 0.174713 CS pos: 25-26. SLS-AD. Pr: 0.2893
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SBT15_ARATH qilexprot_21070 0.984795 0.015205 CS pos: 27-28. AMA-KQ. Pr: 0.6347
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SCP7_ARATH qilexprot_76094 0.984011 0.015989 CS pos: 23-24. TRT-AV. Pr: 0.4343
KTI1_ARATH qilexprot_20893 0.982070 0.017930 CS pos: 28-29. AYG-AV. Pr: 0.8458
CATB1_ARATH qilexprot_51231 0.943161 0.056839 CS pos: 27-28. VVA-VK. Pr: 0.5974
Q9LNC1_ARATH qilexprot_43428 0.952513 0.047487 CS pos: 31-32. SYA-SD. Pr: 0.8472
RDL4_ARATH qilexprot_3576 0.952513 0.047487 CS pos: 31-32. SYA-SD. Pr: 0.8472
RDL5_ARATH qilexprot_20143 0.972218 0.027782 CS pos: 21-22. STA-LD. Pr: 0.7103
RDL3_ARATH qilexprot_68408 0.995522 0.004478 CS pos: 18-19. SFA-VD. Pr: 0.8813
