H. Prosedur Penelitian1. tahap ekstraksi Jati Belanda2. tahap persiapan DENV3. tahap uji penentuan dosis optimal4. tahap uji persen infektivitas virus

dengue

1. Tahap ekstraksi Jati Belanda

Daun Jati Belanda segar

1000 gram dikeringkan

simplisia

serbuk

Di rendam dalam 2L

etanol 96% selama 5 hari

Di saring

filtrat

Di uapkan dengan rotary

evaporator

difraksinasi dengan

200 ml etil asetat

diaduk selama 6 jam

didiamkan

selama 24 jam

diuapkan

fraksi etil

asetat kental

Dilakukan dua kali

2. Tahap persiapan DENV

a. Isolasi Virus DengueVirus dengue serotipe 2 strain New Guinea C (DENV2 NGC) diisolasi menggunakan RT-PCR.

b. Perbanyakan Virus Dengue

Virus dengue dari serum

pasien (MOI 0.5 pfu/sel)

Diisolasi ke sel HuH-7

monolayer pada tabung kultur T-75

diinkubasi 28⁰C

selama 7 hari

supernatan

dipanen

disentrifugasi 900 rpm selama 5

menit

disaring dengan syringe

driven millex GV with 0.2 um

filter unit

Disimpan di suhu

-80oC

Focus Forming Unit assay

c. Focus Forming Unit assayTujuan : untuk melihat titer virus dengue

10 ul serial pengencera

n 10 dari supernatan

diinfeksikan secara triplikat ke sel HuH-7

monolayer pada 96 well plate

Ditunggu selama 2 jam pada suhu

37oC, 5% CO2, digoyang setiap

30 menit

Ditambah 100 ul/sumur

methylcellulose overlay medium

diinkubasi pada suhu

37oC, 5% CO2, selama 3-4

hari

sel HuH-7 difiksasi dengan

PBS yang mengandung

10% formaldehide

diberi PBS tween 100 ul/sumur

ditambah serum pasien dengan IgG antidengue

dicuci dengan PBS tween

(Lanjutan Focus Forming Unit assay)

ditambah secondary

antibody (anti-human IgG yang

dilabel peroksidase)

dicuci dengan

PBS tween

penambahan substrat OPD-

DAB yang mengandung

H2O2

Interpretasi :

1) Sel yang terinfeksi akan membentuk fokus-fokus dengan warna kecoklatan

2) Satu fokus berasal dari 1 virus

Sehingga dengan cara ini kita dapat menghitung persen infektivitas virus dengue

3. Tahap Uji Penentuan Dosis Optimala. Persiapan Sel

Syarat : konfluensisel sudah mencapai 90-100%

medium sel yang lama dibuang

dicuci dengan

PBS 10 ml

ditambah 2 ml tripsin

EDTA 0,25%.

diinkubasi 3 menit

dengan suhu 37oC, CO2 5%

Sel diamati keutuhan bentuknya

menggunakan mikroskop

ditambahkan DMEM 5 ml (tanpa FBS) ke

dalam tabung berukuran 15 ml

disentrifugasi pada 1200 rpm selama 4 menit

supernatan

dibuang

sel dan medium dimasukkan ke plate

ditambahkan 10 ml DMEM komplit

(DMEM+FBS 10%)

dihomogenisasi

(Lanjutan Persiapan Sel)

dipipet 10 ul ke dalam

hemocytometer chamber

dihitung jumlah selnya

ditambahkan DMEM+10% FBS hingga

konsentrasi sel 1x106 sel/ml

dimasukkan 200

ul/sumur, sehingga

jumlah sel 2x105

sel/sumur

diamati di bawah mikroskop, apakah rata atau

belum

jika sudah, diinkubasi selama 24 jam suhu

37oC, konsentrasi CO2 5%.

b. Persiapan Penggunaan EkstrakEkstrak

dimasukkan ke dalam

tabung 1.5 ml

diencerkan dalam DMSO

hingga konsentrasinya

menjadi 100 mg/ml

dihomogenisasikan

menggunakan vortex

ekstrak yang telah dibuat konsentrasinya

menjadi 5 variasi konsentrasi yaitu 2,5 μg/ml, 5 μg/ml, 10

μg/ml, 20 μg/ml dan 40 μg/ml

dimasukkan ke dalam tube baruMasukkan DMEM medium sebanyak 1000 ul ke dalam tube kosong

Ditambahkan 0.4 ul ekstrak

Ditambahkan 1 ul DMSO (Kontrol negatif)

Ditambahkan 200 ul CyA (Kontrol Positif)

(Lanjutan Persiapan Penggunaan Ekstrak)

Penentuan jumlah ulangan mengikuti rumus penentuan replikasi yang dilakukan oleh

Montgomery (2001) yaitu dihitung berdasarkan rumus :

(t-1) (r - 1) ≥ 15

Keterangan :

t = banyaknya taraf perlakuan

r = banyaknya replikasi (ulangan)

Penelitian ini memiliki lima taraf perlakuan dalam bentuk lima variasi dosis

pemberian (t = 5) sehingga (5-1)(r-1) ≥ 15. Dari perhitungan tersebut, didapatkan r ≥

4.75 yang artinya perlakuan diulang minimal lima kali.

(Lanjutan Persiapan Penggunaan Ekstrak)

media dihangatkan

mencapai suhu ruangan

aseptis di dalam

laminar air flow

ekstrak dengan konsentrasi 2,5, 5, 10,

20, dan 40 μg/ml disiapkan

menggunakan media dengan menggunakan

tray berisi es

dicampur dengan perbandingan 1:1

Larutan ekstrak dibuat dengan konsentrasi 2x lebih tinggi dari dosis akhir yang diinginkan

Larutan virus dengue serotype 2 strain NGC dibuat dengan dosis 2x lebih tinggi dari MOI yang diinginkan

(Lanjutan Persiapan Penggunaan Ekstrak)

Sel HuH-7 disiapkan pada

plat 48 well dengan jumlah sel

5x104 sel/well sebanyak:

1) 5x jumlah natural ekstrak2) 5x perlakuan

DMSO3) 5x kontrol

positif (DENV saja)4) 5x kontrol

negatif

diinkubasi pada suhu

37oC, 5% CO2

selama 24 jam

sel 80-90%

monolayer

diamati kontaminasi, kepadatan,

dan persebaran

sel

Sel diambil

dan dibuang

mediumnya

Ditambahkan 100 ul

campuran ekstrak:viru

s (perbanding

an 1:1)

diinkubasi selama 2

jam, pengocokan setiap 30

menit

(Lanjutan Persiapan Penggunaan Ekstrak)

campuran ekstrak-virus dibuang dan

dicuci dengan medium tanpa serum sebanyak 2 kali dengan volume

masing-masing 200ul/well

400 ul/well medium lengkap

yang mengandung ekstrak dengan konsentrasi 20

ug/ml dimasukkan

diinkubasi 37oC, 5%

CO2 selama 48 jam

supernatan dipanen untuk uji focus forming assay