Profilaktinis žiurkių kolageninio artrito gydymas taikant ......Viso eks-perimento metu gyvūnai...

Gerontologija 2012; 13(1): 30–45 GERONTOLOGIJA

Adresas: Laima LeonavičienėŽygimantų g. 9, 01102 VilniusTel. (8-5) 261 6703El. paštas: [email protected]

Mokslinis straipsnis

Profilaktinis žiurkių kolageninio artrito gydymas taikant įvairaus dydžio aukso nanodaleles

L. Leonavičienė1, R. Bradūnaitė1, D. Vaitkienė2, M. Kukis1, A. Vasiliauskas1, G. Kirdaitė1

1 Valstybinis mokslinių tyrimų institutas Inovatyvios medicinos centras2 Vilniaus universitetas, Medicinos fakultetas

SantraukaAukso junginiai plačiai naudojami medicinoje kaip terapi-

niai agentai mažinantys reumatoidinio artrito (RA) simptomus jau nuo 1900 metų. Atradus terapines neorganines nanodaleles (NDs), atsivėrė plati nanomedicinos tyrimų sritis, kur didelės viltys dedamos į aukso NDs (AuNDs). Dėl nanodydžio dimen-sijos (1–100 nm), leidžiančios AuNDs įsiterpti į ląsteles, jos tampa tinkamos in vitro ir in vivo vaizdinimui įvairių ligų tai-kininiam gydymui.

Darbo tikslas – įvertinti įvairaus dydžio AuNDs poveikį vertinant kolageninio artrito (KA) eigą ankstyvoje ir vėlyvoje jo stadijoje po intrasąnarinių (i.a.) jų injekcijų.

Medžiaga ir metodai. Atlikti du eksperimentai su 49 Wistar veislės patinais su sukeltu KA. AuNDs buvo leidžiamos i.a. profilaktiškai 5 kartus per savaitę. Abiejuose bandymuose žiur-kės suskirstytos į 3 grupes: I – kontrolinė, II – gaunanti i.a. 20 µL apimties 13 nm AuNDs injekcijas ir III – 50 nm AuNDs injekcijas. Pirmajame bandyme (24 žiurkės), kurio trukmė 12 dienų, įvertinti ankstyvo KA pokyčiai suleidus devynias AuNDs injekcijas. Antrame bandyme (25 žiurkės), kurio tru-kmė 28 dienos, įvertintas dvidešimt AuNDs injekcijų poveikis. Kontrolines grupes sudarė gyvūnai, kuriems sukėlus KA, vie-toj AuNDs leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo. Bandymo eigoje tirti klinikiniai ir histologiniai patologinio proceso rodikliai bei kraujo serumo pro/antioksidantinės sistemos statusas.

Rezultatai. Gauti rezultatai parodė, kad ankstyvoje patolo-ginio proceso stadijoje profilaktinis 50 nm AuNDs (6 i.a. injek-cijos) pagerino klinikinę KA eigą: sąnarių patinimas sumažėjo 30 proc. po šešių AuNDs injekcijų, o pagerėję kraujo rodikliai buvo stebimi po devynių i.a. AuNDs injekcijų. Tiriant histolo-ginius pokyčius ankstyvoje artrito stadijoje aptikta, kad 50 nm AuNDs taikymas statistiškai reikšmingai sumažino minkštųjų audinių ir sinovijos infiltraciją uždegiminėmis ląstelėmis bei angiomatozę ir minkštųjų audinių edamą bei erozijas kremz-lėje.

Antrame eksperimente, kur gydymas buvo tęsiamas iki vė-lyvos artrito stadijos, tik pirmosios trys 13 nm ir 50 nm AuNDs injekcijos reikšmingai sumažino sąnarių patinimą 25,2 proc. ir 19,13 proc., o vėliau, tęsiant gydymą, buvo stebėta tik sąnarių patinimo mažėjimo tendencija ir geresnis poveikis gautas lei-džiant mažesnio dydžio AuNDs. Histologinių rodiklių vertini-mas, suleidus dvidešimt AuNDs injekcijų, atskleidė mažesnius pokyčius gydytų gyvūnų sąnarių audiniuose. 50 nm AuNDs statistiškai reikšmingai sumažino uždegiminę infiltraciją, o minkštųjų sąnario audinių edema ir angiomatozė ženkliai su-mažėjo taikant abiejų dydžių AuNDs. AuNDs injekcijos ryš-kiai sustiprino fibrozinius procesus abiejų gydytų grupių sąna-rio audiniuose, kurie nebuvo stebėti kontrolėje, bei sumažino γ- metachromaziją, kuri ženkliai skyrėsi nuo kontrolėje grupė-je, gydytoje 50 nm AuNDs. Vertinant pokyčius sinovijoje po ilgalaikio gydymo AuNDs, rasta, kad 50 nm dydžio AuNDs reikšmingai sumažino sinovijos proliferaciją, bendrą infiltra-ciją, o ženklus edemos, angiomatozės bei γ-metachromazijos slopinimas aptiktas po abiejų dydžių AuNDs injekcijų. Po


gydymo 50 nm AuNDs 69,5 proc. sumažėjo uzurų, neaptikta fisurų ir jokio kremzlės suplonėjimo, o reikšmingas panuso su-sidarymo slopinimas 56,5 proc. ir 74,8 proc. rastas po gydymo 13 nm ir 50 nm AuNDs. Teigiamą terapinį AuNDs poveikį vi-daus organams atspindėjo sumažėjusi santykinė kepenų masė ir padidėjusi absoliuti ir santykinė čiobrialiaukės masė. Mažes-nių AuNDs poveikis buvo geresnis, nes sumažino santykinę inkstų masę ir santykinę bei absoliučią blužnies masę. Ryškus AuNDs poveikis didinant antioksidantinio fermento katalazės aktyvumą ir mažesnis lipidų peroksidacijos rodiklio MDA kie-kis parodė, kad AuNDs pasižymi antioksidantiniu poveikiu.

Išvados. Mūsų rezultatai parodė, kad i.a. 50 nm AuNDs injekcijos efektyviai slopino ankstyvą patologinį procesą. Taikant 13 ir 50 nm AuNDs ilgą laiką iki vėlyvos artrito sta-dijos stebėta tik sąnarių mažėjimo tendencija, tačiau mažėja histologiniai pokyčiai sąnariuose. Gauti rezultatai atskleidė reikšmingą AuNDs, kaip antioksidantinio agento, vaidmenį didinant katalazės aktyvumą ir iš principo pademonstravo, kad AuNDs galėtų būti naudojamos kaip naujas terapinis agentas šalia įprastinės antireumatinės terapijos.

Raktažodžiai:aukso nanodalelės, kolageninis artritas, žiurkės

ĮvadasSergančiųjų autoimuninėmis ligomis, pavyzdžiui,

reumatoidiniu artritu (RA), skaičius reikšmingai išauga su amžiumi, kas susiję su imunosenėjimu [1, 2]. Ser-gant RA išskiriami du patogenezės keliai. Pirmasis yra nuo T limfocitų priklausomas ir, manoma, kad jis lemia ankstyvus sinovito procesus ir ekstra sąnarines pažaidas. Antrasis RA patogenezės kelias yra nuo T limfocitų ne-priklausomas – tai autonominė sinovijos ląstelių proli-feracija, sukelianti lėtinį uždegiminį procesą sinovijoje ir jos hiperplaziją. Ankstyvi pokyčiai sąnario audiniuose, sergant RA, pasireiškia intensyvia šio audinio vaskulia-rizacija, kuri gali būti vėlesnių patologinių pokyčių prie-žastimi [3, 4]. Kaip žinoma, angiogenezė vaidina svarbų vaidmenį RA patogenezėje [4, 5]. Svarbūs angiogeniniai mediatoriai rasti reumatoidinių sąnarių sinovijoje ir te-nosinovijoje. VEGF (kraujagyslių endotelinis augimo faktorius) ekspresuojamas atsakant į tirpius mediatorius, tokius kaip citokinai ir augimo faktoriai ir jo receptoriai yra geriausiai apibūdinta sistema reumatoidinių sąnarių angiogenezės reguliacijoje. Naujos klasės antiangiogene-zinių agentų, kurie vienu metu slopintų daugelio augimo faktorių funkciją, atradimas būtų svarbus šios problemos sprendimo kelias. Ligoniai, sergantys RA paprastai gy-

domi sistemiškai veikiančiais vaistais arba rečiau lokalia terapija, todėl stebimi šalutiniai gydymo poveikiai. Šiuo metu didelis dėmesys skiriamas nanomedicinos sričiai, ypač atradus, kad neorganinės nanodalelės pasižymi tera-piniu poveikiu [6]. Ypač domimasi aukso nanodalelėmis (AuNDs), kurios intensyviai tyrinėjamos dėl jų panaudo-jimo biomedicininiais tikslais [7, 8], nes pasižymi puikiu biotapatumu žmogaus audiniams ir aukštu afinitetu funk-cinėms grupėms, tokioms kaip tiolai, fosfinai ir aminai [9, 10]. Kadangi aukso druska gali pristabdyti RA pro-gresavimą [11], Mukherjee su bendr. [12] argumentavo, kad AuNDs taip pat galėtų slopinti angiogenezę ir jau yra darbų, kuriuose apžvelgiami kai kurie teikiantys vilčių rezultatai [6, 13, 14]. Pažymėtina, kad jau pasirodo pir-mieji darbai, kuriuose eksperimentinio artrito gydymui naudojamos AuNDs [15, 16]. Kadangi nanoauksas slo-pina angiogeninio faktoriaus VEGF aktyvumą, įvertintas pririštų prie VEGF 13 nm AuNDs poveikis RA sinovi-nio skysčio sukeltai endotelinių ląstelių proliferacijai ir migracijai žmogaus RA sinoviniame skystyje [15] ir parodyta, kad nanoauksas surištas su VEGF slopina šių ląstelių proliferaciją ir migraciją. Be to, vienkartinė į są-narį suleistų 13 nm AuNDs injekcija pagerina žiurkių KA eigą [15]. Tai pirmieji duomenys, apie artritą slopinantį AuNDs, suleistų į sąnarį, poveikį. Autorių nuomone, tai susiję su jų sukeltu angiogeniniu aktyvumu ir sumažėju-sia makrofagų infiltracija ir uždegimu. Trijuose žiurkių artrito modeliuose jo simptomus taip pat slopino poodi-nės 27 nm dydžio AuNDs ir jos buvo efektyvesnės negu aurotiomalatas (myocrin) [16]. Be to, jau yra kai kurių nuorodų, kad AuNDs leistos Jungtinių Valstijų Maisto ir Vaistų Administracijos gydyti žmonių RA [17].

Vis dėlto, nežiūrint AuNDs naudos taikant jas biome-dicininėse ir pramoninėse srityse, nedaug težinoma apie jų toksiškumą ir AuNDs biologinį tinkamumą gyvūnams. Nors auksas kaip taurusis metalas, nepasiduoda chemi-nėms reakcijoms, neveikia toksiškai, tačiau, nepaisant to, patvirtinta keletas jo toksiškumo aspektų. AuNDs įsiurbiamos ir kaupiamos ląstelėse gali sukelti citotok-sinius poveikius, kaip efektyvūs katalizatoriai, kas taip pat priklauso ir nuo jų formos [18]. Be to, neseniai, in vivo tyrimuose nustatytas nuo jų dydžio priklausomas toksiškumas [19, 20]. Svarbų vaidmenį gali vaidinti ir jų taikymo būdas, todėl gali būti stebimas skirtingas sau-gumo poveikis duodant jas oraliai ar injekcijomis [21]. Remiantis tyrimais apie AuNDs citotoksiškumą, galima sakyti, kad šis svarbus veiksnys nėra pakankamai ištirtas ir kad naudojant AuNDs visada turėtų būti atsižvelgiama

31

L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, M. Kukis, A. Vasiliauskas, G. Kirdaitė

į galimą jų toksiškumą [22]. Akivaizdu, kad bet kokiam klinikiniam pritaikymui esminis požymis yra nanodalelių biosuderinamumas [23]. Daugumoje darbų parodyta, kad AuNDs yra inertinės ir netoksiškos ląstelėms [23–25], jos nesustiprina streso sukeltos prouždegiminių citokinų, tokių kaip TNF-α ir IL-1β, sekrecijos makrofagų ląstelė-mis, o didesnės AuNDs koncentracijos slopina reaktyvių deguonies rūšių (ROS) ir reaktyvių azoto rūšių (RNS) produkciją, tuo patvirtindamos, kad AuNDs gali būti panaudojamos klinikinei terapijai [25]. In vivo toksišku-mo tyrimai naudojant 13 nm dydžio AuNDs padengtas polietilenglikoliu [PEG (MW 5000)] buvo įvertinti Cho su bendraautoriais [26] ir nustatyta, kad AuNDs išplin-ta į kepenis ir blužnį, t. y., organus, turinčius fagocitines ląsteles. Nors gauti trumpalaikiai uždegiminiai atsakai kepenyse dėl šių AuNDs toksiškumo buvo nežymūs, ste-bima apoptozė yra svarbus padarinys, sukeltas gydant jomis. Vis tik daugumoje darbų pritariama, kad žymaus AuNDs toksiškumo nestebima.

Reikia pažymėti, kad viena iš RA etiopatogenezės grandžių yra oksidacinis stresas, kuris vaidina esminį vaidmenį uždegiminiuose procesuose ir sąnarių destruk-cijoje eksperimentinio ir RA metu [27–31]. Padidėjęs oksidacinės sistemos fermentų aktyvumas, šalia suma-žėjusio antioksidacinio lygio randamas sergančiųjų RA serume ir sinoviniuose skysčiuose [32, 33]. Vienas iš oksidacinio pažeidimo rodiklių yra maloninio dialdehido (MDA), kaip galutinio lipidų peroksidacijos produkto, susidarymas [34], kuris lengvai reaguoja su baltymais ar DNR suformuodamas darinius, kurie vertinami kaip labai genotoksiški [35]. Artrito indukcija pelėms ryškiai padidina MDA kiekį kraujo serume ir inkstuose ir oksi-duotų proteinų kiekį serume, kepenyse, blužnyje ir inks-tuose [36].

Nors daugumoje darbų nurodomas ryšys tarp oksi-dacinio streso ir uždegimo, tačiau jo vaidmuo uždegi-minių ligų metu vis dar neaiškus. Tai yra svarbi tyrimų sritis vertinant nanodalelių toksikologiją [37]. Vienas plačiausiai tyrinėjamų nanodalelių toksinių mechanizmų yra reaktyvių deguonies rūšių (ROS] susidarymas. ROS vaidina centrinį vaidmenį lemiant toksiškumą susijusį su daugeliu nanodalelių [37–39]. Tačiau ryšys tarp AuNDs ir oksidacinio streso nėra pilnai įrodytas ir egzistuoja prieštaringi duomenys dėl oksidacinio streso, sukelia-mo AuNDs. Vienuose tyrimuose atskleista, kad AuNDs gali sukelti oksidacinį stresą [40–42], tačiau kituose jo-kio reikšmingo oksidacinio streso ar uždegiminio atsako dėl AuNDs neaptikta [43]. Dar daugiau, didesnių kon-

centracijų AuNDs slopina ROS produkciją ir reaktyvias azoto rūšis (RNS), tuo parodydamos įvairiapusį AuND [Au(0)]- pagrįstų sistemų panaudojimą tolimesnėje klini-kinėje terapijoje ir auksu paremtų vaistų gamyboje [23]. Todėl, nežiūrint to, ar AuNDs naudojamos tyrimams gyvame organizme, ar kaip vaistas ar papildomas kom-ponentas vaiste, jos privalo būti ištirtos ypač apdairiai, siekiant išvengti oksidacinio streso [42]. Be to, neseniai pademonstruota, kad AuNDs yra galimi antioksidantai [44, 45] malšinant ROS, įskaitant vandenilio peroksidą (H2O2) ir superoksido aniono radikalą (O2

–) nuo dozės priklausomu būdu [46].

Kadangi oksidacinį stresą sukelia disbalansas tarp pro-oksidacinių mechanizmų ir antioksidacinės apsau-gos, įdomu įvertinti įvairaus dydžio AuNDs poveikį žiurkių su kolageniniu artritu (KA) kraujo serumo pro-/antioksidacinės sistemos būklei. Be to, atsižvelgiant į duomenis, kad augimo faktorių nulemta fibroblastų pro-liferacija ir angiogenezė, vaidinančios centrinį vaidmenį RA ir lėtinio uždegimo metu, gali būti sėkmingai slo-pinamos AuNDs, kurios, remiantis dauguma literatūros šaltinių, yra netoksiškos tiek ląstelėms, tiek ir suleidus jas gyvūnams [12], o vienkartinė intrasąnarinė 13 nm ir kelios poodinės 27 nm AuNDs injekcijos slopina artrito simptomus žiurkių artrito modeliuose [15, 16], mes savo darbe įvertinome įvairaus dydžio AuNDs terapinį ir an-tioksidacinį poveikį in vivo tyrimuose KA metu, sulei-džiant jas į sąnario ertmę. Tikimės, kad šie tyrimai padės geriau įvertinti terapinį AuNDs poveikį, slopinant ląste-linius pokyčius sinovijoje ir gerinant patologinio proceso eigą.

Medžiaga ir tyrimo metodaiEksperimentiniai gyvūnaiDarbui panaudoti 49 Wistar populiacijos lytiškai su-

brendę žiurkių patinai (kūno masė 180–210 g), veisti Valstybinio mokslinių tyrimų instituto Inovatyvios me-dicinos centro (VMTI IMC) Imunologijos departamento veislyne (Vilnius, Lietuva). Gyvūnai buvo laikomi stan-dartinėmis sąlygomis plastikiniuose, žiurkėms skirtuose, narveliuose, naudojant medžio drožlių paklotus, palai-kant kambario temperatūrą ir šviesos-tamsos režimą bei šeriami kombinuotu pašaru, atitinkančiu laboratorinių gyvūnų fiziologines normas ir pagamintu laikantis ES reikalavimų pašarams (AB „Kauno grūdai“). Viso eks-perimento metu gyvūnai laisvai pasiekdavo maistą ir ge-riamą vandenį. Aklimatizacijos periodas prieš pradedant bandymą 4 dienos. Viso bandymo metu gyvūnais rūpi-

32


namasi laikantis Europos konvencijos dėl Laboratorinių gyvūnų naudojimo ir darbo su jais taisyklių bei Lietuvos Respublikos įstatymų. Eksperimentams atlikti buvo gau-tas Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos ko-misijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas.

MedžiagosKolageninio artrito (KA) sukėlimui naudotas II tipo

kolagenas iš jaučio nosies kremzlės ir nepilnas Froin-do adjuvantas (FA) (Sigma-Aldrich, Germany). Gydy-mui – 13 nm ir 50 nm aukso nanodalelės (AuNDs), sin-tezuotos VU Chemijos fakultete prof. A. Ramanavičiaus ir A. Ramanavičienės. Biocheminiams tyrimams: trich-loracto, ortofosforo, tiobarbiturinė, azoto, askorbininė rūgštys, geležies sulfatas, amonio molibdatas, vandeni-lio peroksidas gauti iš Sigma-Aldrich Chemie and Fluka Chemie GmbH (Vokietija). Histologiniams tyrimams at-likti: 10 proc. formalinas, spirit-formolas, hematoksilin-eozinas, toluidino mėlis, metil-žalias pironinas-9, safra-ninas O.

Kolageno emulsijos paruošimo metodikaStipriai išgrynintas II tipo kolagenas (CII) privalo

būti paruoštas pagal labai tikslų protokolą, kadangi jo degradacija veiks artritogeniškumą [47]. 2 mg/ml CII iš-tirpinama 0,05 M acto rūgštyje švelniai maišant per naktį 4OC temperatūroje. Imunizacijai naudojamos emulsijos kokybė yra esminis požymis skaitlingo artrito sukėlimui. Jos paruošimui naudojamas elektrinis homogenizatorius ir nupjautas 5 ml plastikinis švirkštas, kuris įtvirtinamas į žiedinį stovą ir patalpinamas į ledo vonią. Tai būtina saugant CII nuo denatūracijos, kadangi jis įšyla maišymo metu. Denatūruotas CII nesukelia KA. Į švirkštą įtrau-kiama po vienodą tūrį FA ir CII tirpalo ir lėtai maišoma. Maišymas tęsiamas 2–3 min. prie maksimalaus greičio, kol susidaro tiršta emulsija, kuri pernešama į stiklinį švirkštą.

Kolageninio artrito (KA) sukėlimas ir uždegiminio proceso rodiklių įvertinimas

Žiurkės suskirstytos į grupes (po 8 kiekvienoje) ir KA buvo sukeliamas suleidžiant į kairės užpakalinės kojos padą 0,1 ml pagamintos emulsijos (200 µg CII joje). Kadangi adjuvanto injekcijos į uodegos pagrindą sukelia silpnesnį efektą, lyginant su tiesiogine injekcija padą [48], mes taip pat pasirinkome šį leidimo būdą, tuo labiau, kad publikacijose šis būdas plačiai naudojamas [30, 49, 50].

Tirti rodikliai, apibūdinantys uždegiminio proceso aktyvumą. Artrito atsiradimas buvo vertinamas kliniškai ir histologiškai. Bandymo eigoje buvo sekama žiurkių kūno masės ir sąnarių patinimo dinamika, registruojant pokyčius 3 kartus per savaitę. Patologiniam procesui są-nariuose įvertinti naudoti du parametrai: kojų sąnarių pa-tinimas, matuojamas pletizmometriškai (PVP1001; Kent Scientific Incorporation) ir vertinamas lyginant sveikos ir pažeistos kojos apimtį, bei poliartrito atsiradimas kitose galūnėse, į kurias neleista CII emulsija. Modelis panau-dotas įvairaus dydžio AuNDs poveikiui ankstyvoje ir lė-tinėje artrito stadijoje įvertinti.

Žiurkių su kolageniniu artritu gydymas AuNDsDviejuose eksperimentuose, panaudojant žiurkių

KA modelį įvertintas įvairaus dydžio AuNDs (13 nm ir 50 nm) poveikis, suleidžiant jas į sąnario ertmę (i.a.) nuo KA sukėlimo pradžios 5 kartus per savaitę. Abiejuose bandymuose žiurkės suskirstytos į 3 grupes: I – kontro-linė, II – gaunanti i.a. 20 µL apimties 13 nm AuNDs injekcijas ir III – 50 nm AuNDs injekcijas. Pirmajame bandyme (24 žiurkės), kurio trukmė 12 dienų įvertin-ti ankstyvo KA, kol dar nepradėjo vystytis poliartritai, pokyčiai suleidus 9 AuNDs injekcijas. Antrame bandy-me (25 žiurkės), kurio trukmė 28 dienos, įvertintas 20 AuNDs injekcijų, poveikis. Kontrolines grupes sudarė gyvūnai, kuriems sukėlus KA, vietoj AuNDs leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo.

Histologiniai tyrimaiGyvūnai dekapituojami narkozės būsenoje (0,1 ml

ketamino ir ksilazino mišinio į raumenis) praėjus 12 (I eksperimentas) ir 28 (II eksperimentas) dienoms nuo bandymo pradžios. Įvertinus vidaus organų makroskopi-nį vaizdą, kepenys, blužnis, inkstai, plaučiai ir sąnariai paimami histologiniam tyrimui. Medžiaga iš pažeistų sąnarių ir vidaus organų fiksuojama spirito ir formalino (1 : 9) tirpale ir užliejama parafinu. Parafininiai 5 mikro-nų storio organų pjūviai dažomi hematoksilino ir eozino mišiniu bendram morfologiniam vaizdui nustatyti, pikro-fuksinu pagal Van-Gison – fibrozei išryškinti, toluidino mėliu (pH 3,4) – gliukozaminoglikanams nustatyti, saf-raninu O – pokyčiams kremzlėje nustatyti. Pokyčiai au-diniuose vertinami naudojant keturių balų (0–3) sistemą: ‘–’ – nėra pokyčių (0), ‘±’ – minimalūs pokyčiai (0,5), ‘+’ – nedideli (1), ‘++’ – vidutiniai (2), ‘+++’ – ryškūs pokyčiai (3).

33


Kiti tyrimaiEksperimento pabaigoje įvertinta bendra gyvūnų

būklė, vidaus organų masė ir makroskopiniai pokyčiai juose, uždegiminio proceso rodikliai. Nustatytas eritro-citų nusėdimo greitis (ENG), leukocitų ir eritrocitų skai-čius, panaudojant kraujo analizatorių Picoscale (Vengri-ja). Tyrimų rezultatai palyginti su kontrolinių gyvūnų grupių rezultatais. Įvertinti patomorfologiniai pokyčiai kepenyse, blužnyje, inkstuose ir plaučiuose. Ištirta ma-londialdehido (MDA) koncentracija ir katalazės aktyvu-mas ir bendras antioksidantinis aktyvumas (AOA) kraujo serume pagal aprašytas metodikas [51–54].

StatistikaDuomenų statistinė analizė atlikta panaudojant pro-

gramą STATISTIKA. Išskaičiuodavome V ± SN ir pa-tikimumą, naudojant Stjudento t testą. Duomenys buvo statistiškai reikšmingi, esant P < 0,05. Histologiniai duo-menys vertinami naudojant neparametrinį Mann-Whi-tney U testą.

Rezultatai1. Bendra gyvūnų būklė, kūno masės ir organų bei

kraujo rodiklių pokyčiai sukėlus kolageninį artritą ir gydant gyvūnus AuNDs

Kūno ir organų masės pokyčiaiTiriant kūno masės pokyčius bandymo eigoje abie-

juose eksperimentuose, stebėtas jų didėjimas visose ti-riamosiose grupėse. Bandymo pabaigoje, lyginant su jo pradžia, kūno masė 12 tyrimų dieną pirmame eksperi-mente, kai gyvūnai buvo dekapituoti ankstyvoje artrito stadijoje buvo 18,3 proc., 22,8 proc. ir 20,85 proc. dides-nė atitinkamai kontrolinėje ir gydytose AuNDs grupėse. Antrame eksperimente tiriant kūno masės pokyčius ban-dymo eigoje, taip pat stebėtas jų didėjimas visose trijo-se KA gyvūnų grupėse, o bandymo pabaigoje, lyginant su jo pradžia, kūno masė buvo 27,4 proc., 27,35 proc. ir 27,7 proc. didesnė atitinkamai kontrolinėje ir gydytose AuNDs grupėse, t. y. beveik vienodai padidėjo visose ti-riamosiose grupėse. Kadangi jokių reikšmingų skirtumų tarp tiriamųjų grupių neaptikta, todėl duomenys nepatei-kiami.

Bandymo pabaigoje, tiriant organų masę anksty-vo KA metu nustatyta, kad tik absoliuti blužnies masė statistiškai reikšmingai padidėjo II gyvūnų grupėje (P < 0,05), gavusioje devynias 13 nm AuNDs injekcijas (1 lentelė). Vėlyvoje artrito stadijoje, po dvidešimties 13 nm ir 50 nm dydžio AuNDs injekcijų tik absoliu-ti ir santykinė čiobrialiaukės masė buvo statistiškai reikšmingai didesnė (76 proc. ir 92 proc. – absoliuti; 90 proc. – santykinė) negu kontrolinės grupės gyvūnų (P < 0,02–0,01). Tiriant visų kitų vidaus organų absoliu-čią ir santykinę masę, tarp grupių reikšmingų skirtumų nerasta.

1 lentelė. Kūno masė ir absoliuti bei santykinė blužnies ir čiobrialiaukės masė po profilaktinio žiurkių gydymo įvairaus dydžio AuNDs ankstyvoje ir vėlyvoje kolageninio artrito stadijoje

Organas Masė(g, g/kg-1)

Artrito stadija

Ankstyvas Vėlyvas

Grupės

I kontrolė(KA + fiz. tirp.)

II (KA + 13 nm AuNDs)

III (KA + 50 nm AuNDs)




Kūnas 222,81 ± 9,19 234,07 ± 8,85 224,08 ± 12,85 240,70 ± 9,90 238,31 ± 16,97 240,88 ± 10,17

Blužnis Absoliuti 0,99 ± 0,05 1,44 ± 0,20* 0,975 ± 0,06 0,99 ± 0,09 1,12 ± 0,06 1,05 ± 0,06

Santykinė 0,45 ± 0,03 0,63 ± 0,10 0,44 ± 0,02 0,41 ± 0,03 0,48 ± 0,03 0,44 ± 0,036

Čiobrialiaukė Absoliuti 0,57 ± 0,05 0,51 ± 0,03 0,64 ± 0,04 0,25 ± 0,05 0,44 ± 0,05* 0,48 ± 0,06*

Santykinė 0,256 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,29 ± 0,01 0,10 ± 0,02 0,19 ± 0,02* 0,19 ± 0,02*

Pastaba: Kolageninis artritas (KA) sukeltas suleidus 0,1 ml II tipo kolageno (CII) emulsijos FA (200 µg CII joje) į užpakalinės kairės kojos padą. Gydymas 13 nm (pradinė aukso koncentracija 50 µg/ml) ir 50 nm (pradinė aukso koncentracija 188 µg/ml) AuNDs pradėtas nuo kolageninio artrito sukėlimo pradžios. Atliktos devynios (ankstyva artrito stadija) ir dvidešimt (vėlyva artrito stadija) AuNDs injekcijų 20 µL apimtyje, suleidžiant, jas 5 kartus per savaitę į pažeisto sąnario ertmę (i.a.). I grupė – KA kontrolė, kuriai vietoj AuNDs atitinkamomis dienomis leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo, II grupė – devynios arba dvidešimt 13 nm AuNDs injekcijų, III grupė – devynios arba dvidešimt 50 nm AuNDs injekcijų. * – skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su kontroline grupe.

Kraujo rodiklių pokyčiaiBandymo pabaigoje tiriant kraujo rodiklius anksty-

voje artrito stadijoje stebėtas tik statistiškai reikšmingas

eritrocitų kiekio padidėjimas grupėse, gydytose 13 nm (P < 0,002) ir 50 nm (P < 0,01) AuNDs (2 lentelė). Nors po devynių AuNDs injekcijų ENG ir leukocitų kiekis

34


kraujyje tarp grupių reikšmingai nekito, tačiau gydytose gyvūnų su KA grupėse lyginant su kontrole buvo aptiktas 13,9 proc. ir 29,9 proc. ENG ir 4,5 proc. ir 11,2 proc. leu-kocitų kiekio sumažėjimas, o grupėje, gavusioje 50 nm AuNDs, šis ENG sumažėjimas buvo artimas reikšmin-gam (t = 1,91). Vėlyvoje artrito stadijoje žiurkėms su KA po dvidešimties AuNDs injekcijų stebėtas statistiškai

reikšmingas leukocitų kiekio sumažėjimas 16,4 proc. ir 13 proc. grupėse, gydytose atitinkamai 13 nm (P < 0,01) ir 50 nm (P < 0,05) AuNDs. Nors ENG buvo atitinkamai 22,3 proc. ir 28 proc. mažesnis grupėse, gavusiose 13 nm ir 50 nm dydžio AuNDs, o eritrocitų kiekį 7,7 proc. di-dino 50 nm AuNDs, tačiau reikšmingų skirtumų lyginant su kontrole nerasta (2 lentelė).

2 lentelė. Žiurkių kraujo rodikliai po gydymo įvairaus dydžio AuNDs ankstyvoje ir vėlyvoje kolageninio artrito stadijoje

Rodiklis

Artrito stadija

Ankstyvas Vėlyvas

Grupės







ENG (mm/val)

18,00 ± 2,15 15,50 ± 1,39 12,62 ± 1,82 13,88 ± 1,61 10,78 ± 1,51 10,00 ± 1,29

Leukocitai (109L) 13,34 ± 0,61 12,74 ± 0,33 11,84 ± 0,86 14,28 ± 0,48 11,94 ± 0,43* 12,42 ± 0,60*

Eritrocitai (1012L) 4,62 ± 0,11 5,21 ± 0,10* 5,00 ± 0,06* 4,82 ± 0,147 4,80 ± 0,15 5,19 ± 0,20

Pastaba: Kolageninis artritas (KA) sukeltas suleidus 0,1 ml II tipo kolageno (CII) emulsijos FA (200 µg CII joje) į užpakalinės kairės kojos padą. Gydymas 13 nm (pradinė aukso koncentracija 50 µg/ml) ir 50 nm (pradinė aukso koncentracija 188 µg/ml) AuNDs pradėtas nuo kolageninio artrito sukėlimo pradžios. Atliktos devynios (ankstyva artrito stadija) ir dvidešimt (vėlyva artrito stadija) AuNDs injekcijų 20 µL apimtyje, suleidžiant, jas 5 kartus per savaitę į pažeisto sąnario ertmę (i.a.). I grupė – KA kontrolė, kuriai vietoj AuNDs atitinkamomis dienomis leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo, II grupė – devynios arba dvidešimt 13 nm AuNDs injekcijų, III grupė – devynios arba dvidešimt 50 nm AuNDs injekcijų. Ankstyvoje artrito stadijoje grupėje gavusioje 50 nm AuNDs ENG sumažė-jimas artimas statistiškai reikšmingam (t = 1,91). * – skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su kontroline grupe.

Žiurkių kraujo serumo pro-/antioksidacinis akty-vumas po gydymo įvairaus dydžio AuNDs ankstyvo-je ir vėlyvoje kolageninio artrito stadijoje

MDA kiekis kraujo serume Wistar žiurkėms su anks-tyvu KA gydytoms 13 nm ir 50 nm AuNDs lyginant su kontrole sumažėjo atitinkamai 17,5 proc. ir 20,34 proc. (3 lentelė). Antioksidacinės organizmo būklės įvertini-mui buvo matuojamas katalazės (KAT) aktyvumas, ka-dangi tai pirminis antioksidantas atsakingas už tiesioginį

susidariusių reaktyvių deguonies rūšių pašalinimą. Po devynių AuNDs injekcijų aptiktas statistiškai reikšmin-gas KAT aktyvumo padidėjimas 39,7 proc. (P < 0,01) taikant 13 nm AuNDs ir 34,6 proc. (P < 0,02) – 50 nm AuNDs.

Tiriant MDA koncentraciją kraujo serume žiurkėms su vėlyvu KA, gavusioms dvidešimt AuNDs injekcijų, nors ir negauta statistiškai reikšmingų skirtumų lyginant su kontroline grupe, tačiau nustatyta, kad 13 nm AuNDs

3 lentelė. Žiurkių kraujo serumo pro-/antioksidacinis aktyvumas po gydymo įvairaus dydžio AuNDs ankstyvoje ir vėlyvoje kolageninio artrito stadijoje

Rodiklis KA stadijaGrupės

I kontrolė(KA + fiz. tirpalas)

II(KA + 13 nm AuNDs)

III(KA + 50 nm AuNDs)

MDA(nmol/ml)

Ankstyvas 13,08 ± 1,46 10,79 ± 0,23 10,42 ± 0,45

Vėlyvas 11,88 ± 1,30 10,01 ± 0,46 12,36 ± 0,90

Katalazė(nmol/L/min)

Ankstyvas 60,38 ± 5,64 84,34 ± 4,26* 81,27 ± 5,01*

Vėlyvas 62,13 ± 6,89 68,36 ± 5,71 70,49 ± 6,85

AOA(sumažėjimas proc.)

Ankstyvas 39,26 ± 1,89 34,68 ± 3,30 41,19 ± 2,40

Vėlyvas 27,40 ± 5,83 30,10 ± 4,92 31,57 ± 5,68

Pastaba: Kolageninis artritas (KA) sukeltas suleidus 0,1 ml II tipo kolageno (CII) emulsijos FA (200 µg CII joje) į užpakalinės kairės kojos padą. Gydymas 13 nm (pradinė aukso koncentracija 50 µg/ml) ir 50 nm (pradinė aukso koncentracija 188 µg/ml) AuNDs pradėtas nuo kolageninio artrito sukėlimo pradžios. Atliktos devynios (ankstyva artrito stadija) ir dvidešimt (vėlyva artrito stadija) AuNDs injekcijų 20 µL apimtyje, suleidžiant, jas 5 kartus per savaitę į pažeisto sąnario ertmę (i.a.). I grupė – KA kontrolė, kuriai vietoj AuNDs atitinkamomis dienomis leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo, II grupė – devynios arba dvidešimt 13 nm AuNDs injekcijų, III grupė – devynios arba dvidešimt 50 nm AuNDs injekcijų.MDA – maloninis dialdehidas, KAT – katalazė, AOA – antioksidantinis aktyvumas. * – skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su kontroline grupe.

35


sumažino MDA 15,74 proc., o antioksidantinio fermen-to KAT aktyvumas padidėjo 10,03 proc. ir 13,45 proc. grupėse, gydytose atitinkamai 13 nm ir 50 nm AuNDs (3 lentelė). Tiriant AOA negauta reikšmingų skirtumų tarp kontrolės ir tiriamųjų grupių tiek ankstyvoje, tiek ir vėly-voje artrito stadijose, nors stebėta jo didėjimo tendencija taikant gydymą 50 nm AuNDs, kur ankstyvoje stadijoje jis buvo didesnis 4,9 proc., o vėlyvoje – 15,2 proc.

Histologiniai pokyčiai vidaus organuoseGydant ankstyvą KA AuNDs nestebėta jokio jų toksi-

nio poveikio kepenims. Abiejose tiriamosiose grupėse ir kontrolinėje grupėje jų struktūra skiltelinė, stebėta centri-lobulinė sinusų pilnakraujystė, negausi MMN leukocitų infiltracija portiniuose traktuose. Statistiškai reikšmingų pokyčių lyginant su kontrole neaptikta, išskyrus nekrozi-nius procesus kepenų parenchimoje, kurie buvo reikšmin-gai mažesni taikant 50 nm AuNDs (0,94 ± 0,17 – kontro-lė ir 0,37 ± 0,18 – bandomoji grupė; P < 0,05).

Plaučiuose taip pat nestebėta jokio toksinio AuNDs poveikio taikant jas KA gydymui. Po gydymo ankstyvo-je artrito stadijoje sumažėjo infiltracija limfocitais, kuri reikšmingai skyrėsi nuo kontrolės taikant abiejų dydžių AuNDs (1,86 ± 0,09 – kontrolė; 1,31 ± 0,09 – 13 nm AuNDs ir 1,25 ± 0,16 – 50 nm AuNDs; P < 0,01–0,001).

Visų tiriamųjų grupių gyvūnų blužnies audinyje išli-kęs raudonosios ir baltosios pulpos santykis, nepakitusi eritrocitų būklė ir limfocitų persiskirstymas. Aptikta tik nežymi sinusų pilnakraujystė, arteriolohialinozė (krau-jagyslės sklerozuotos), limfoidinių folikulų hiperplazija, tačiau jokių esminių skirtumų tarp kontrolinės ir tiriamų-jų grupių nerasta.

Neaptikta esminių skirtumų tarp tiriamųjų ir kontroli-nės grupės gyvūnų ir tiriant inkstų audinio histologinius pokyčius. Nestebėta jokių uždegimo požymių, tik kana-lėliai visose tiriamosiose grupėse vietomis edemiški.

Vertinant kepenų parenchimos alteraciją vėlyvoje ar-trito stadijoje po gydymo AuNDs aptikta, kad nekroziniai procesai lyginant su kontroline grupe buvo 56,05 proc. (1,57 ± 0,27 kontrolinė grupė ir 0,69 ± 0,19 13 nm AuNDs; P < 0,02) ir 44,6 proc. (0,87 ± 0,18 – 50 nm AuNDs; P < 0,05) mažesni. 50 nm AuNDs reikšmingai sumažino V. centralis pilnakraujystę (1,64 ± 0,21 kontro-linė grupė ir 1,00 ± 0,13 bandomoji grupė; P < 0,05), o 13 nm AuNDs – uždegiminę kepenų stromos infiltraciją limfocitais (1,43 ± 0,27 kontrolinė, 0,69 ± 0,16 bando-moji grupė; P < 0,05) ir uždegiminių ląstelių skverbimąsi

į skiltelę (1,71 ± 0,28 kontrolinė, 0,75 ± 0,25 bandomoji grupė; P < 0,05).

Analizuojant pokyčius plaučiuose, pastebėta, kad po gydymo 50 nm AuNDs reikšmingai sumažėjo hemoragi-jos plaučių alveolėse (1,43 ± 0,13 kontrolinė, 0,86 ± 0,14 bandomoji grupė; P < 0,01), o uždegiminių ląstelių infil-tracija (alveolitas) buvo mažesnė, taikant abiejų dydžių AuNDs (1,57 ± 0,13 kontrolinė, 1,12 ± 0,15 – 13 nm AuNDs ir 0,78 ± 0,15 – 50 nm AuNDs; P < 0,05–0,002). Statistiškai reikšmingas fibrinoidinės kraujagyslių ne-krozės sumažėjimas buvo rastas po gydymo 13 nm (1,50 ± 0,15 kontrolinė, 0,75 ± 0,30 bandomoji gru-pė; P < 0,05) ir 50 nm (0,50 ± 0,22 bandomoji grupė; P < 0,01) AuNDs.

Visų tiriamųjų grupių gyvūnų blužnies audinyje vė-lyvoje artrito stadijoje stebėtas išlikęs raudonosios ir baltosios pulpos santykis, aptikta sinusų pilnakraujystė, arterijų sienelės sustorėjusios, fibrozuotos, randama me-gakariocitų. 3 iš 9 gyvūnų, gavusių 13 nm AuNDs stebi-mi tik pavieniai megakariocitai, o 6 iš 9 – gausesnis jų kiekis, tuo tarpu taikant 50 nm AuNDs tik 2 iš 8 žiurkių jų kiekis didesnis, bet 6 iš 8 gyvūnų randama limfoidinių folikulų hiperplazija. Esminių skirtumų tarp kontrolinės ir tiriamųjų grupių, vertinant pokyčius blužnyje, nerasta. Nerasta skirtumų tiriamiesiems ir kontrolinės grupės gy-vūnams ir tiriant inkstų audinio histologinius pokyčius. Visose tirtose grupėse neaptikta jokių uždegimo požymių (nei mezangiumo išsiplėtimo, nei folikulinės sklerozės ar uždegimo glomeruluose), rasta tik kraujagyslių pilna-kraujystė ir inkstų kanalėlių edema, kuri taikant 50 nm AuNDs buvo mažesnė (2 šios grupės gyvūnams nerasta jokių edemos požymių, o 6 iš 8 žiurkių inkstų kanalėliai tik vietomis buvo edemiški). Taigi, AuNDs taikymas ar-trito gydymui tiek iki ankstyvos, tiek iki vėlyvos artrito stadijos nesukėlė jokio toksinio poveikio tirtiems vidaus organams.

2. Pokyčiai sąnariuoseSąnarių tinimo dinamika ir poliartritų atsiradimas

žiurkėms su kolageniniu artritu (KA) gydytoms AuNDsSąnarių tinimo dinamika ankstyvoje artrito stadijoje

pavaizduota A pav. Palyginus jų kitimo dinamiką, matyti, kad tik 50 nm AuNDs reikšmingai mažino sąnarių tinimą iki 10 tyrimų dienos (P < 0,05–0,01) ir šis sumažėjimas siekė virš 30 proc. lyginant su kontroline grupe. Bandymo pabaigoje šioje grupėje rastas 17,3 proc. mažesnis sąnarių patinimas. Reikia pastebėti, kad nė vienam iš gydytų grupių gyvūnų

36


neatsirado poliartritų, tuo tarpu kai kontrolinėje grupėje jie išsivystė 12,5 proc. žiurkių.

Sąnarių tinimo dinamika stebint artrito eigą iki vė-lyvos jo išsivystymo stadijos pavaizduota B pav. Paly-ginus jų kitimą, matyti, kad tik 8 tyrimų dieną, t. y. po trijų AuNDs injekcijų, gautas statistiškai reikšmingas lyginant su kontroline grupe sąnarių patinimo sumažėji-mas 25,2 proc. ir 19,13 proc. taikant atitinkamai 13 nm (P < 0,02) ir 50 nm (P < 0,001) AuNDs. Nors bandymo

pabaigoje po dvidešimties AuNDs injekcijų sąnarių pa-tinimas buvo 19,26 proc. (13 nm AuNDs) ir 12,1 proc. (50 nm AuNDs) mažesnis negu kontrolinėje grupėje, ta-čiau reikšmingų skirtumų lyginant su kontrole neaptik-ta. Taigi, pradėjus gydyti artritą nuo jo sukėlimo dienos, tik pirmosios trys abiejų dydžių AuNDs injekcijos turėjo reikšmingos įtakos jį slopinant, o vėliau iki 10 tyrimų stebėta tik sąnarių patinimo mažėjimo tendencija iki ban-dymo pabaigos.

Pav. Sąnarių patinimas žiurkėms su ankstyvu (A) ir vėlyvu (B) kolageniniu artritu (KA) profilaktiškai gydant jį įvairaus dydžio AuNDsKolageninis artritas (KA) sukeltas suleidus 0,1 ml II tipo kolageno (CII) emulsijos FA (200 µg CII joje) į užpakalinės kairės kojos padą. Gydymas 13 nm (pradinė aukso koncentracija 50 µg/ml) ir 50 nm (pradinė aukso koncentracija 188 µg/ml). AuNDs pradėtas nuo kolageninio artrito sukėlimo pradžios. Atliktos devynios (ankstyva artrito stadija) ir dvidešimt (vėlyvas artritas) AuNDs injekcijos 20 µL apimtyje į pažeisto sąnario ertmę (i.a.). * – skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su kontroline grupe.

Reikia pastebėti, kad poliartritai tiek kontrolinėje, tiek bandomosiose grupėse pradėjo atsirasti nuo 13 tyrimų dienos (12,5 proc. kontrolinėje ir gavusioje 50 nm AuNDs grupėje bei 22,2 proc. žiurkių, gydytų 13 nm AuNDs). Tęsiantis bandymui didėjo ir gyvūnų su poliartritais skai-čius ir bandymo pabaigoje jie atsirado 75 proc. žiurkių, gydytų 13 nm AuNDs, ir 77,8 proc. – 50 nm AuNDs. Kontrolinėje grupėje poliartritai atsirado 87,5 proc. gy-vūnų.

Histologiniai pokyčiai sąnariuoseTiriant histologinius pokyčius ankstyvoje artrito sta-

dijoje aptikta, kad 50 nm AuNDs taikymas statistiškai reikšmingai sumažino minkštųjų audinių infiltraciją lim-focitais (P < 0,001), leukocitais (P < 0,02), makrofagais (P < 0,002) bei bendrą uždegiminę reakciją (P < 0,02), tuo tarpu taikant 13 nm AuNDs stebėtas tik reikšmingas infil-tracijos limfocitais (P < 0,001) ir makrofagais (P < 0,05)

slopinimas. Ryškus minkštųjų audinių edemos (P < 0,01) bei angiomatozės (P < 0,05) sumažėjimas rastas taikant 50 nm AuNDs, o silpna fibrozė minkštuosiuose sąnario audiniuose aptikta tik vienam gyvūnui, gydytam 13 nm AuNDs (4 lentelė).

Tiriant ankstyvus histologinius pokyčius sinovijoje aptiktas reikšmingas uždegiminės infiltracijos limfoci-tais (P < 0,01) bei angiomatozės (P < 0,002) ir artimas reikšmingam bendros uždegiminės reakcijos (t = 1,985) sumažėjimas, naudojant 50 nm AuNDs. Nors šių gyvūnų grupėje, lyginant su kontroline grupe, sinovijos gaurelių proliferacija buvo 34,8 proc., o edema 25,3 proc. mažes-nė, o uždegiminė infiltracija granuliocitais bei makrofa-gais atitinkamai 16,7 proc. ir 68,75 proc. silpnesnė, ta-čiau reikšmingų skirtumų tarp grupių neaptikta.

Gydytų AuNDs gyvūnų kremzlėje ankstyvoje artrito stadijoje 31,5 proc. ir 50 proc. mažiau erozijų, taikant 13 nm ir 50 nm AuNDs, tačiau tik pastarosios statistiškai

A B

37


4 lentelė. Histologiniai pokyčiai sąnario audiniuose gydant žiurkių KA įvairaus dydžio AuNDs

Audinys Rodiklis KA stadijaGrupės

I (KA kontrolė) II (KA + 13 nm AuNDs) III (KA + 50 nm AuNDs)

Minkštieji sąnario audiniai

Uždegiminė infiltracija Limfocitai Ankstyvas 2,00 ± 0,00 1,13 ± 0,13* 0,75 ± 0,25*

Vėlyvas 1,10 ± 0,10 1,10 ± 0,29 0,83 ± 0,21

Leukocitai Ankstyvas 2,70 ± 0,12 2,25 ± 0,25 1,75 ± 0,32*

Vėlyvas 2,40 ± 0,24 1,40 ± 0,40 0,67 ± 0,36*

Makrofagai Ankstyvas 1,80 ± 0,20 1,25 ± 0,14* 0,50 ± 0,25*

Vėlyvas 0,80 ± 0,20 1,60 ± 0,29 1,00 ± 0,13

Bendra Ankstyvas 2,70 ± 0,12 2,25 ± 0,25 1,75 ± 0,32*

Vėlyvas 2,50 ± 0,16 2,00 ± 0,16 1,33 ± 0,16*

Edema Ankstyvas 2,20 ± 0,12 1,87 ± 0,24 1,37 ± 0,24*

Vėlyvas 2,30 ± 0,12 1,10 ± 0,10* 0,75 ± 0,11*

Angiomatozė Ankstyvas 2,10 ± 0,24 1,62 ± 0,12 1,37 ± 0,24*

Vėlyvas 1,80 ± 0,12 1,00 ± 0,31* 0,67 ± 0,16*

Fibrozė Ankstyvas – 0,25 ± 0,25 –

Vėlyvas – 1,20 ± 0,37* 1,83 ± 0,17*

γ-metachromazija Ankstyvas – – –

Vėlyvas 1,00 ± 0,27 0,50 ± 0,22 0,17 ± 0,16*

Sinovija Uždegiminė infiltracija Limfocitai Ankstyvas 1,40 ± 0,24 0,75 ± 0,25 0,37 ± 0,24*

Vėlyvas 1,10 ± 0,33 0,70 ± 0,34 0,50 ± 0,18

Granulocitai Ankstyvas 1,80 ± 0,25 2,12 ± 0,31 1,50 ± 0,35

Vėlyvas 1,60 ± 0,37 0,90 ± 0,37 0,75 ± 0,21

Makrofagai Ankstyvas 0,80 ± 0,37 0,50 ± 0,29 0,25 ± 0,25

Vėlyvas 1,20 ± 0,31 0,90 ± 0,33 1,25 ± 0,11

Bendra Ankstyvas 2,30 ± 0,20 2,12 ± 0,31 1,50 ± 0,35

Vėlyvas 2,00 ± 0,16 1,40 ± 0,29 1,33 ± 0,10*

Proliferacija Ankstyvas 2,10 ± 0,24 2,25 ± 0,14 1,37 ± 0,37

Vėlyvas 2,30 ± 0,20 1,60 ± 0,29 1,41 ± 0,15*

Edema Ankstyvas 1,50 ± 0,22 1,62 ± 0,24 1,12 ± 0,42

Vėlyvas 1,90 ± 0,10 0,70 ± 0,30* 0,66 ± 0,10*

Angiomatozė Ankstyvas 1,80 ± 0,12 1,63 ± 0,24 0,75 ± 0,25*

Vėlyvas 1,90 ± 0,19 0,80 ± 0,12* 0,67 ± 0,10*

Fibrozė Ankstyvas – 0,25 ± 0,25 0,25 ± 0,25

Vėlyvas – 1,10 ± 0,33* 1,66 ± 0,21*

γ-metachromazija Ankstyvas – – –

Vėlyvas 1,30 ± 0,20 0,10 ± 0,10* 0,16 ± 0,16*

Kremzlė Erozija Ankstyvas 2,00 ± 0,00 1,37 ± 0,47 1,00 ± 0,41*

Vėlyvas 0,40 ± 0,40 1,20 ± 0,49 1,67 ± 0,33*

Uzura Ankstyvas 0,60 ± 0,40 0,75 ± 0,48 0,75 ± 0,48

Vėlyvas 1,90 ± 0,10 1,00 ± 0,45 0,58 ± 0,27*

Fisura Ankstyvas – – 0,25 ± 0,25

Vėlyvas 1,90 ± 0,35 0,40 ± 0,40* –

Panusas Ankstyvas 1,00 ± 0,45 1,25 ± 0,25 1,25 ± 0,48

Vėlyvas 2,30 ± 0,20 1,00 ± 0,42* 0,58 ± 0,27*

Kremzlės suplonėjimas Ankstyvas 0,20 ± 0,20 0,25 ± 0,25 0,50 ± 0,29

Vėlyvas 2,10 ± 0,19 0,80 ± 0,37* –

Pastaba: Kolageninis artritas (KA) sukeltas suleidus 0,1 ml II tipo kolageno (CII) emulsijos FA (200 µg CII joje) į užpakalinės kairės kojos padą. Gydymas 13 nm (pradinė aukso

koncentracija 50 µg/ml) ir 50 nm (pradinė aukso koncentracija 188 µg/ml). AuNDs pradėtas nuo kolageninio artrito sukėlimo pradžios. Atliktos devynios (ankstyva artrito stadija) ir

dvidešimt (vėlyva artrito stadija) AuNDs injekcijų 20 µL apimtyje, suleidžiant jas 5 kartus per savaitę į pažeisto sąnario ertmę (i.a.). I grupė – KA kontrolė, kuriai vietoj AuNDs atitin-

kamomis dienomis leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo, II grupė – devynios arba dvidešimt 13 nm AuNDs injekcijų, III grupė – devynios arba dvidešimt 50 nm AuNDs injekcijų.

Pažeistų sąnarių medžiaga fiksuojama spirito ir formalino (1 : 9) tirpale ir užliejama parafinu. Parafininiai 5 mikronų storio organų pjūviai dažomi hematoksilino ir eozino mišiniu

bendram morfologiniam vaizdui nustatyti, pikrofusinu pagal Van-Gison – fibrozei išryškinti, toluidino mėliu (pH 3,4) – gliukozaminoglikanams nustatyti, safraninu O – pokyčiams

kremzlėje nustatyti. Pokyčiai audiniuose vertinami naudojant keturių balų (0–3) sistemą: ‘–’ – nėra pokyčių (0), ‘±’ – minimalūs pokyčiai (0,5), ‘+’ – nedideli (1), ‘++’ – vidutiniai (2),

‘+++’ – ryškūs pokyčiai (3). * – skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su kontroline grupe.

38


reikšmingai, lyginant su kontroline grupe, jas sumažino (P < 0,05), o vienai šios grupės žiurkei aptikta nežymi fisura.

Tęsiant eksperimentą iki vėlyvos artrito stadijos ir vertinant sąnarių patinimą eigoje nebuvo neaptikta esmi-nių skirtumų tarp kontrolės ir gydytų AuNDs grupių, ta-čiau histologinių rodiklių vertinimas, suleidus dvidešimt AuNDs injekcijų, atskleidė mažesnius pokyčius šių gyvū-nų sąnarių audiniuose (4 lentelė). Minkštuosiuose sąnario audiniuose taikant 13 nm AuNDs stebėtas artimas reikš-mingam infiltracijos leukocitais sumažėjimas 41,7 proc. (t = 2,14) ir 20 proc. mažesnė bendra uždegiminė reakcija (t = 2,21) bei dvigubai didesnė makrofagų (t = 2,27) infil-tracija. 50 nm AuNDs statistiškai reikšmingai sumažino uždegiminę infiltraciją leukocitais 72,1 proc. (P < 0,01) ir bendrą uždegiminę reakciją 46,8 proc. (P < 0,001). Minkštųjų sąnario audinių edema (P < 0,0001) ir angio-matozė (P < 0,05; P < 0,01) ženkliai sumažėjo taikant abiejų dydžių AuNDs, nors didesnės AuNDs ryškiau ma-žino minėtus rodiklius (edemos sumažėjimas 52,2 proc. ir 67,3 proc., o angiomatozės – 44,4 proc. ir 62,8 proc. po gydymo 13 nm ir 50 nm AuNDs). AuNDs injekcijos ryškiai (P < 0,02; P < 0,0001) sustiprino fibrozinius pro-cesus abiejų gydytų gyvūnų grupių sąnario audiniuose, kurie nebuvo stebėti kontrolėje, bei sumažino γ- meta-chromaziją, kuri ženkliai skyrėsi nuo kontrolės grupėje, gydytoje 50 nm AuNDs (P < 0,05).

Vertinant pokyčius sinovijoje po ilgalaikio gydy-mo AuNDs (4 lentelė), reikia pastebėti, kad 50 nm dydžio AuNds reikšmingai sumažino sinovijos proli-feraciją (P < 0,01), o taikant 13 nm AuNDs stebėtas tik artimas reikšmingam jos sumažėjimas (t = 1,99). Ženklus edemos (P < 0,01–0,0001) bei γ-metachromazijos (P < 0,001–0,002) slopinimas aptiktas po abiejų dydžių AuNDs injekcijų, o bendrą uždegiminę infiltraciją reikš-mingai mažino 50 nm AuNDs (P < 0,01). Taikant pasta-rąsias stebėtas ir artimas reikšmingam (t = 1,998) infil-tracijos granulocitais sumažėjimas. Tačiau abiejų dydžių AuNDs skatino fibrozinius procesus (P < 0,02–0,001), kurie nebuvo stebėti kontrolinėje žiurkių grupėje ir ryš-kiai slopino angiomatozę Pastaroji lyginant su kontro-line grupe buvo 57,9 proc. mažesnė po gydymo 13 nm AuNDs (P < 0,002) ir 64,7 proc. – po 50 nm AuNDs in-jekcijų (P < 0,001).

Nors eroziniai procesai kremzlėje lyginant su kon-troline grupe ir sustiprėjo, ypač taikant 50 nm dydžio daleles (P < 0,05), tačiau uzurų buvo 69,5 proc. mažiau (P < 0,002), o fisurų šioje grupėje aplamai neaptikta

(P < 0,001). Gydant 13 nm AuNDs uzurų rasta 47,4 proc. mažiau (skirtumas artimas reikšmingam lyginant su kon-trole; t = 1,95), o fisuros rastos tik vieno gyvūno (2+) kremzlėje (P < 0,05). Aptiktas ir reikšmingas panuso su-sidarymo slopinimas 56,5 proc. ir 74,8 proc. po gydymo 13 nm (P < 0,05) ir 50 nm (P < 0,001) AuNDs. Pastaro-joje gyvūnų grupėje nerasta jokio kremzlės suplonėjimo (P < 0,0001), o gydytiems 13 nm AuNDs gyvūnams jis buvo 61,9 proc. mažesnis nei kontrolėje (P < 0,02).

AptarimasAukso junginiai, kaip plačiai paplitę terapiniai agen-

tai, mažinantys reumatoidinio artrito (RA) simptomus, yra plačiai naudojami medicinoje jau nuo 1900 metų [55]. Ryšium su jų ilgamečiu taikymu žmonėms, jau yra gautas leidimas naudoti AuND-konjuguotas sistemas I fazės tyrimuose, gydant kietuosius auglius. Kadangi RA metu išvešėjęs sinovinis audinys primena vėžinį darinį, tikėtina, kad AuNDs, galėtų sėkmingai pasitarnauti ir gydant šią ligą, o eksperimentai panaudojant laboratori-nius gyvūnus, kuriems sukeltos autoimuninės ligos, ga-lėtų pagilinti mūsų žinias apie AuNDs panaudojimą jų gydymui. Jau pirmuose pasirodančiuose darbuose buvo parodyta, kad vienkartinė į sąnarį suleistų 13 nm AuNDs injekcija pagerina žiurkių kolageninio artrito (KA) eigą [15]: slopinamas sąnarių patinimas, artritinis indeksas, radiografiniai rodikliai, reikšmingai mažėja histologiniai pokyčiai sąnariuose (sinovijos hiperplazija, kremzlės erozijos, leukocitų infiltracija), mikrokraujagyslių tankis, makrofagų infiltracija bei TNF-α ir IL1β kiekiai kulkš-nies sąnariuose. Tai pirmieji duomenys apie AuNDs, su-leistų į sąnarį, slopinantį poveikį ir autorių nuomone, tai susiję su jų sukeltu angiogeniniu aktyvumu bei sumažė-jusia makrofagų infiltracija ir uždegimu.

Remiantis šiais pastebėjimais mūsų tyrimuose buvo pasirinktos 13 nm ir 50 nm AuNDs ir intrasąnarinis jų suleidimo būdas gyvūnams su KA. Reikia pažymėti, kad mūsų pateikiamas darbas skiriasi nuo jau aukščiau mi-nėtų kitų autorių darbų [15, 16], kuriuose tirtas AuNDs poveikis KA eigai. Tsai su bendr. [13] KA artritą sukel-davo suleidžiant po oda 400 µg ir 240 µg CII emulsijos nepilname FA 0 ir 7 tyrimų dieną, o vienkartinė 13 nm AuNDs injekcija į sąnarį buvo atlikta prieš atsirandant artritui, t. y., suleidus antrą kolageno emulsijos dozę.

Brown su bendr. [16] darbe KA sukeltas suleidžiant į uodegos pagrindą 200 µg jaučio kremzlės kolageno emulsijos nepilname FA dozę, padalintą per keletą kar-tų, o 27 nm koloidinis auksas disperguotas izotoniniame

39


sorbitolyje buvo leidžiamas kas antrą dieną po oda nuo artrito sukėlimo dienos, vertinant artrito požymius nuo 11 tyrimų dienos, o sąnarių patinimo matavimus patei-kiant tik vieną kartą, t. y., 15 tyrimų dieną, kaip manome, atlikus 7 AuNDs injekcijas, nes straipsnyje tikslesni duo-menys nepateikti.

Mes savo darbe KA sukėlėme suleidžiant į kairės už-pakalinės kojos padą 0,1 ml pagamintos kolageno emul-sijos (200 µg CII joje) FA. Šis sukėlimo būdas buvo pasirinktas todėl, kad eilėje publikacijų jis plačiai naudo-jamas [30, 49, 50] ir pasiteisino, nes vystosi stiprus KA su poliartritais kitose galūnėse ir net uodegoje.

Ankstyvojo KA metu šešios 50 nm AuNDs intrasą-narinės injekcijos reikšmingai sumažino sąnarių pati-nimą iki 10 tyrimų dienos ir šis sumažėjimas siekė virš 30 proc. lyginant su kontroline grupe, tuo tarpu, taikant 13 nm AuNDs šiuo laikotarpiu rastas tik nereikšmingas 12,3 proc. sumažėjimas. Didinant injekcijų skaičių iki 9, aptikta tik sąnarių patinimo mažėjimo tendencija, bandy-mo pabaigoje siekianti 17,3 proc., taikant 50 nm AuNDs, ir 5,5 proc. 13 nm AuNDs. Reikia pastebėti, kad nė vie-nam gydytų grupių gyvūnų neatsirado poliartritų, tuo tar-pu kontrolinėje grupėje jie išsivystė 12,5 proc. žiurkių.

50 nm AuNDs ženkliai sumažino minkštųjų audinių infiltraciją uždegiminėmis ląstelėmis, bendrą uždegiminę reakciją, edemą bei angiomatozę, tuo tarpu taikant 13 nm AuNDs stebėtas tik reikšmingas infiltracijos limfocitais ir makrofagais slopinimas. Naudojant 50 nm AuNDs si-novijoje aptiktas reikšmingas uždegiminės infiltracijos limfocitais bei angiomatozės sumažėjimas, o kremzlėje ženkliai mažiau erozijų.

Artritinių gyvūnų gydymas AuNDs gerino sistemi-nius patologinio proceso parametrus, tokius kaip kraujo rodikliai ir organų masė. Žinoma, kad eksperimentinio artrito metu žiurkėms mažėja čiobrialiaukės masė [56], o sisteminės uždegiminės ligos, įskaitant RA, susiję su limfoidinių organų, tokių kaip blužnis, padidėjimu ir šis rodiklis yra esminis parametras vertinant KA patologiją [57, 58].

Devynios AuNDs injekcijos neturėjo reikšmingos įtakos tirtų grupių kūno ir organų masei ir tik absoliuti blužnies masė statistiškai reikšmingai padidėjo gyvūnų grupėje, gavusioje devynias 13 nm AuNDs injekcijas, matomai dėl didesnės gyvūnų kūno masės, nes tiriant santykinę masę nestebėta reikšmingų skirtumų lyginant su kontrole. Gydant ankstyvą KA AuNDs nestebėta jokio jų toksinio poveikio vidaus organams. Visose tirtose gru-pėse kepenų struktūra skiltelinė, stebėta centrilobulinė

sinusų pilnakraujystė, negausi MMN leukocitų infiltraci-ja portiniuose traktuose. Reikšmingų pokyčių lyginant su kontrole neaptikta, išskyrus nekrozinius procesus kepenų parenchimoje, kurie reikšmingai sumažėjo po gydymo 50 nm AuNDs. Naudojant AuNDs aptiktas mažesnis nei kontrolėje peribronchiolitas ir ženkliai sumažėjusi infil-tracija limfocitais vertinant intersticinį plaučių pažeidi-mą bei silpnesnis alveolitas ir kraujagyslių pažeidimas. Visų tiriamųjų grupių gyvūnų blužnies esminių skirtumų tarp kontrolinės ir tiriamųjų grupių nerasta: audinyje iš-likęs raudonosios ir baltosios pulpos santykis, nepakitusi eritrocitų būklė ir limfocitų persiskirstymas. Aptikta tik sinusų pilnakraujystė ir kraujagyslių sklerozė bei lim-foidinių folikulų hiperplazija. Nerasta esminių skirtumų tarp tiriamųjų ir kontrolinės grupės gyvūnų ir tiriant his-tologiškai inkstų audinį, kur nestebėta jokių uždegimo požymių, tik vietomis kanalėliai edemiški, bei aptikta kraujagyslių pilnakraujystė.

Gyvūnams su KA po AuNDs injekcijų sumažėjo ENG ir leukocitų kiekis bei stebėtas reikšmingas eritrocitų kie-kio padidėjimas.

Apibendrinant galima teigti, kad ankstyvojo KA metu gautas ryškesnis didesnių AuNDs poveikis, stipriau ma-žinantis sąnarių patinimą ir ryškiau gerinantis kraujo rodiklius. Be to, šio dydžio AuNDs šiek tiek stipriau ma-žino MDA kraujo serume ir reikšmingai didino KAT ak-tyvumą, nors žymus pastarosios aktyvumo padidėjimas buvo stebėtas ir taikant 13 nm AuNDs.

Antrame eksperimente, pradėjus gydyti artritą nuo jo sukėlimo dienos ir tęsiant jį iki vėlyvos artrito stadijos, tik pirmosios trys abiejų dydžių AuNDs injekcijos turėjo reikšmingos įtakos jį slopinant: sąnarių patinimas suma-žėjo 25,2 proc. ir 19,13 proc. taikant atitinkamai 13 nm ir 50 nm AuNDs. Vėliau stebėta tik sąnarių patinimo ma-žėjimo tendencija, o bandymo pabaigoje po 20 AuNDs injekcijų sąnarių patinimas buvo 19,26 proc. ir 12,1 proc. mažesnis negu kontrolinėje grupėje taikant atitinkamai 13 nm ir 50 nm AuNDs.

Bandymo pabaigoje poliartritai atsirado 75 proc. ir 77,8 proc. gyvūnų, gydytų 13 nm ir 50 nm AuNDs, ir 87,5 proc. kontrolinėje žiurkių grupėje, t. y., taikant AuNDs stebėtas mažesnis gyvūnų su poliartritais skaičius. Nors esminių skirtumų vertinant sąnarių patinimą tarp kontrolinės ir gydytų AuNDs grupių nebuvo rasta, tačiau histologinių rodiklių vertinimas atskleidė mažesnius pokyčius gydytų gyvūnų sąnariuose. Minkštuosiuose sąnario audiniuose 50 nm AuNDs ženkliai sumažino uždegiminę infiltraciją leukocitais ir bendrą uždegiminę

40


reakciją. Taikant abiejų dydžių AuNDs ryškiai sumažėjo minkštųjų sąnario audinių edema ir angiomatozė, sustiprėjo fibroziniai procesai, o sumažėjusi γ-metachromazija po 50 nm AuNDs injekcijų ženkliai skyrėsi nuo kontrolinės grupės. 50 nm dydžio AuNDs reikšmingai sumažino sinovijos proliferaciją ir bendrą uždegiminę infiltraciją, o ženklus edemos bei γ-metachromazijos slopinimas aptiktas panaudojus abiejų dydžių AuNDs injekcijas, kurios skatino fibrozinius procesus ir ryškiai slopino angiomatozę. Nors eroziniai procesai kremzlėje lyginant su kontrole ir sustiprėjo, ypač taikant 50 nm dydžio daleles, tačiau ženkliai sumažėjo uzurų, neatsirado fisurų, nerasta jokio kremzlės suplonėjimo. Gydant 13 nm AuNDs taip pat aptikta mažiau uzurų, o fisuros atsirado tik vienam gyvūnui bei stebėtas ryškiai mažesnis kremzlės suplonėjimas. Kremzlėje aptiktas ir reikšmingas panuso susidarymo slopinimas po gydymo abiejų dydžių AuNDs.

Tiriant organų masę tik absoliuti ir santykinė čiobria-liaukės masė buvo statistiškai reikšmingai didesnė abie-jose grupėse, gavusiose 13 nm ir 50 nm dydžio AuNDs, kas parodo teigiamą jų poveikį gyvūnams. Kepenų pa-renchimoje po gydymo AuNDs sumažėjo distrofiniai ir nekroziniai procesai. 50 nm AuNDs reikšmingai su-mažino v. centralis pilnakraujystę, o uždegiminę kepe-nų stromos infiltraciją limfocitais ir uždegiminių ląste-lių skverbimąsi į skiltelę – 13 nm AuNDs. Po gydymo 50 nm AuNDs stebėta žymiai mažiau hemoragijų plaučių alveolėse, reikšmingai sumažėjo uždegiminių ląstelių in-filtracija (alveolitas) ir fibrinoidinė kraujagyslių nekro-zė, taikant abiejų dydžių AuNDs. Esminių skirtumų tarp kontrolinės ir tiriamųjų grupių, vertinant histologinius pokyčius blužnyje ir inkstuose, nerasta. Po 20 AuNDs in-jekcijų stebėtas ir statistiškai reikšmingas leukocitų kie-kio sumažėjimas 16,4 proc. ir 13 proc., grupėse gydytose atitinkamai 13 nm ir 50 nm AuNDs, o ENG sumažėjo 22,3 proc. ir 28 proc. Tik 13 nm AuNDs sumažino MDA 15,74 proc., o KAT aktyvumas padidėjo 10–13,5 proc., taikant abiejų dydžių AuNDs.

Taigi, mažesnio dydžio AuNDs, taikant jas ilgą laiką, vei-kė šiek tiek geriau klinikinius patologinio proceso rodiklius, nei didesnio diametro AuNDs: šiek tiek ryškiau mažino są-narių patinimą ir poliartritų skaičių, didesniu laipsniu geri-no kraujo rodiklius ir mažino kraujo serumo MDA. Tačiau vertinant histologinius rodiklius sąnariuose stebėtas geres-nis didesnio dydžio AuNDs poveikis, nes daugiau vertintų rodiklių reikšmingai skyrėsi nuo kontrolės. Apibendrinant galima konstatuoti, kad AuNDs nepasižymi toksiniu povei-

kiu vidaus organams, teigiamai veikia patologinio proceso klinikinę eigą, gerindamos bendrą gyvūnų būklę, kraujo ir antioksidantinės sistemos rodiklius, slopindamos sąnarių patinimą bei patomorfologinius pokyčius juose. Nors tyri-muose su ląstelėmis parodyta, kad didesnio dydžio AuNDs veikia stipriau, slopindamos jų funkcijas, savo atliktuose in vivo tyrimuose, mes nustatėme, kad poveikis priklauso ne tik nuo jų dydžio, bet ir naudojimo trukmės, t. y., trum-palaikis didesnių AuNDs, mūsų atveju 50 nm, naudojimas ryškiau slopina artritą ankstyvoje jo vystymosi stadijoje, tuo tarpu ilgesnis vartojimas susijęs su palankesniu mažesnių, t. y., 13 nm, AuNDs poveikiu klinikiniams, bet ne histolo-giniamas artrito rodikliams. Mūsų darbe nustatytas ženklus angiomatozės slopinimas tiek minkštuosiuose sąnario au-diniuose, tiek ir sinovijoje po AuNDs injekcijų. Teigiamas AuNDs poveikis matomai yra labiausiai susijęs su jo anti-angiogeneziniu poveikiu, kurį lemia jo galimybė nutraukti/slopinti proangiogeninių citokinų, tokių kaip VEGF165 ir pagrindinio fibroblastų augimo faktoriaus (bFGF), aktyvu-mą [6, 59] ir šis poveikis gaunamas vartojant tik AuNDs su nepadengtu jokiais ligandais paviršiumi [6], t. y. grynas AuNDs, o anti-angiogenezinės AuNDs savybės priklau-so nuo jų dydžio ir paviršiaus krūvio [6]. VEGF vaidmuo ištirtas ir naudojant gyvūnų artrito modelius, kuriuose an-ti-VEGF sumažina artrito ataką ir jo stiprumą bei sąnarių angiogenezę pelių KA metu [60, 61].

Kadangi nanodalelių indukuotas oksidacinis stresas gali būti labai svarbus ir susijęs su nanomedžiagos tok-siškumu [62], ją taikant kaip terapinę priemonę gyvuo-se organizmuose, šiame darbe buvo palyginta gydytų ir negydytų žiurkių su KA pro-/antioksidacinė kraujo se-rumo būklė. Nors yra duomenų, kad mažos AuNDs, to-kios kaip 1,4 nm dydžio gali sukelti oksidacinį stresą ir reaktyvių deguonies darinių (ROS) gamybą [40], mūsų darbe jokios reikšmingos oksidacinio streso indukcijos dėl AuNDs naudojimo nebuvo stebėta. Atvirkščiai, jos mažino lipidų peroksidacijos rodiklio MDA lygį gydy-tų gyvūnų kraujo serume ir reikšmingai didino fermen-to KAT, kuri pripažįstama kaip pirminis antioksidantas, atsakingas už tiesioginį susidariusių ROS pašalinimą, aktyvumą. Šie mūsų duomenys parodantys, kad AuNDs veikia kaip antioksidantai ir nėra toksiškos sutampa su kitų autorių atradimais [25, 44, 63].

Gautieji rezultatai leidžia teigti apie nanoauksą, kaip naują terapinį agentą bei galimą jo panaudojimą gydant RA. Tačiau reikia pažymėti, kad egzistuoja du pagrindi-niai veiksniai, liečiantys NDs-pagrįstų vaistų apdorojimą ir pasišalinimą: pirma, greitas ND pasišalinimas reika-

41


lautų didelių dozių, tam kad būtų efektyvus, ir, antra, pernelyg didelis dalelių sugėrimas gali stipriai įtako-ti imuninės sistemos ląsteles ir/ar organus, sukeldamas pašalinius imunologinius poveikius (imunosupresiją ar imunostimuliaciją) ir galimai sukelti organų pažeidi-mą [64]. Todėl būtini tolimesni tyrimai, norint įvertinti AuNDs panaudojimą RA gydymui.

IšvadosReikšmingas sąnarių patinimo sumažėjimas virš

30 proc. ankstyvojo KA metu gautas po šešių i.a. 50 nm AuNDs injekcijų, o devynios i.a. šių AuNDs injekcijos ženkliai slopino mikštųjų sąnario audinių ir sinovijos infiltraciją uždegiminėmis ląstelėmis, edemą bei angio-matozę ir kremzlės erozijas. Po gydymo 13 nm AuNDs sumažėjo tik minkštųjų sąnario audinių infiltracija limfo-citais ir makrofagais.

Profilaktinis 13 nm dydžio AuNDs taikymas iki vėly-vos artrito stadijos geriau veikė klinikinius patologinio proceso rodiklius, nei 50 nm AuNDs naudojimas: ryškiau sumažėjo sąnarių patinimas ir gyvūnų su poliartritais skaičius, kraujo serumo MDA, labiau pagerėjo kraujo rodikliai. Bet histologiniai sąnarių tyrimai atskleidė ryš-kesnį 50 nm AuNDs poveikį mažinant pokyčius juose.

Dvidešimt 50 nm AuNDs injekcijų ženkliai sumaži-no uždegiminę infiltraciją, γ-metachromaziją minkštuo-siuose sąnario audiniuose, sinovijos proliferaciją ir ben-drą uždegiminę infiltraciją, kremzlėje sumažėjo uzurų, neatsirado fisurų, nerasta jokio kremzlės suplonėjimo. Abiejų dydžių AuNDs ryškiai sumažino minkštųjų sąna-rio audinių ir sinovijos edemą ir angiomatozę, sustiprino fibrozinius procesus bei reikšmingai slopino panuso su-sidarymą.

AuNDs pasižymėjo antioksidaciniu poveikiu: stebė-tas reikšmingas katalazės aktyvumo padidėjimas ir ma-loninio dialdehido kiekio kraujo serume sumažėjimas žiurkių, gydytų AuNDs.

Tolimesni tyrimai būtini patvirtinti mūsų duomenis dėl nanoaukso, kaip galimo naujo terapinio agento, pa-naudojimo gydant žmonių RA.

Padėka. Mokslinių tyrimų medžiaga surinkta ir api-bendrinta, vykdant projektą, kurį pagal sutartį Nr. MIP-74/2010 finansavo Lietuvos mokslo taryba. Autoriai reiškia didžiulę padėką prof. Arūnui Ramanavičiui ir dr. Almyrai Ramanavičienei už maloniai suteiktą gali-mybę pasinaudoti jų susintetintomis aukso nanodalelė-mis atliekant šį darbą.

LiteratūraGoronzy JJ, Shao L, Weyand CM. Immune aging 1.

and rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am. 2010; 36(2): 297–310.

Wagner U. Immune senescence and autoimmuni-2. ty. Does the immune system really age, or just the organs which supply it? Z Rheumatol. 2011; 70(2): 95–8.

Koch AE. Angiogenesis: implication of rheuma-3. toid arthritis. Arthritis Rheum. 1998; 41: 951–62.

Maruotti N, Cantatore FP, Crivellato E, Vacca A, 4. Ribatti D. Angiogenesis in rheumatoid arthritis. Histol Histopathol. 2006; 21(5): 557–66.

Lee JH, Canny MD, De Erkenez A, et al. A the-5. rapeutic aptamer inhibits angiogenesis by specifically targeting the heparin binding domain of VEGF165. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(52): 18902–7.

Arvizo RR, Rana S, Miranda OR, et al. Mecha-6. nism of antiangiogenic property of gold nanoparticles role of nanoparticle size and surface charge. Nanomedi-cine. 2011; 7(5): 580–7.

Sperling RA, Rivera Gil P, Zhang F, et al. Biolo-7. gical applications of gold nanoparticles. Chem Soc Rev. 2008; 37(9): 1896–908.

Wilson R. The use of gold nanoparticles in dia-8. gnostics and detection. Chem Soc Rev. 2008; 37(9): 2028–45.

Yang DP, Cui DX. Advances and prospects of 9. gold nanorods. Chem Asian J. 2008; 3(12): 2010–22.

Zhang G, Yang Z, Lu W, et al. Influence of an-10. choring ligands and particle size on the colloidal stability and in vivo biodistribution of polyethylene glycol-coated gold nanoparticles in tumor-xenografted mice. Biomate-rials. 2009; 30(10): 1928–36.

Pincus T, Ferraccioli G, Sokka T, et al. Evidence 11. from clinical trials and long-term observational studies that disease-modifying anti-rheumatic drugs slow radio-graphic progression in rheumatoid arthritis: updating a 1983 review. Rheumatology. 2002; 41(12): 1346–56.

Mukherjee P, Bhattacharya R, Wang P, et al. Anti-12. angiogenic properties of gold nanoparticles. Clin Cancer Res. 2005; 11(9): 3530–4.

Boisselier E, Astruc D. Gold nanoparticles in na-13. nomedicine: preparations, imaging, diagnostics, thera-pies and toxicity. Chem Soc Rev. 2009; 38(6): 1759–82.

Kemp MM, Kumar A, Mousa S, et al. Gold and 14. silver nanoparticles conjugated with heparin derivative possess anti-angiogenesis properties. Nanotechnology. 2009; 20(45): 455104.

42


Tsai CY, Shiau AL, Chen SY, et al. Amelioration 15. of collagen-induced arthritis in rats by nanogold. Arthri-tis Rheum. 2007; 56(2): 544–54.

Brown CL, Bushell G, Whitehouse MW, et al. 16. Nanogold-pharmaceutics. Gold Bulletin. 2007; 40(3): 245–250.

Shan L. Polyethylene glycol–coated (PEG5000) 17. gold nanoparticles. In: Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [Internet]. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2004–2010.

Chithrani BD, Ghazani AA, Chan WC. Determi-18. ning the size and shape dependence of gold nanoparti-cle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 2006; 6(4): 662–8.

Chen Y-S, Hung Y-C, Liau I, Huang GS. Asses-19. sment of the in vivo toxicity of gold nanoparticles. Na-noscale Res Let. 2009; 4(8): 858–64.

Bar-Ilan O, Albrecht RM, Fako VE, Furgeson DY. 20. Toxicity assessments of multisized gold and silver na-noparticles in zebrafish embryos. Small. 2009; 5(16): 1897–910.

Semmler-Behnke M, Kreyling WG, Lipka J, et al. 21. Biodistribution of 1.4- and 18-nm gold particles in rats. Small. 2008; 4(12): 2108.

Rivera Gil P, Hühn D, del Mercato LL, et al. Na-22. nopharmacy: Inorganic nanoscale devices as vectors and active compounds. Pharmacol Res. 2010; 62(2): 115–25.

Shukla R, Bansal V, Chaudhary M, et al. Biocom-23. patibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: a microscopic overview. Langmuir. 2005; 21(23): 10644–54.

Merchant B. Gold, the noble metal and the para-24. doxes of its toxicology. Biologicals. 1998; 26(1): 49–59.

Connor EE, Mwamuka J, Gole A, et al. Gold na-25. noparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 2005; 1(3): 325–7.

Cho WS, Cho M, Jeong J, et al. Acute toxicity 26. and pharmacokinetics of 13 nm-sized PEG-coated gold nanoparticles. Toxicol Appl Pharmacol. 2009a; 236(1): 16–24.

Sarban S, Kocyigit A, Yazar M, et al. Plasma total 27. antioxidant capacity, lipid peroxidation, and erythrocyte antioxidant enzyme activities in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Clin Biochem. 2005; 38(11): 981–6.

Tsuji G, Koshiba M, Nakamura H, et al. Thioredo-28.

xin protects against joint destruction in a murine arthritis model. Free Radic Biol Med. 2006; 40(10): 1721–31.

Choi EM. Oxidative status of DBA/1J mice with 29. type II collagen-induced arthritis. J Appl Toxicol. 2007; 27(5): 472–81.

Leonavičienė L, Bradūnaitė R, Vaitkienė D, et al. 30. Collagen-induced arthritis and pro-/antioxidant status in Wistar and Lewis rats. Biologija. 2008; 54(4): 290–300.

Sharma S, Sahu D, Das HR, Sharma D. Amelio-31. ration of collagen-induced arthritis by Salix nigra bark extract via suppression of pro-inflammatory cytokines and oxidative stress. Food Chem Toxicol. 2011; 49: 3395–406.

Taysi S, Polat F, Gul M, et al. Lipid peroxidation, 32. some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol Int. 2002; 21(5): 200–4.

Ozturk HS, Cimen MY, Cimen OB, et al. Oxi-33. dant/antioxidant status of plasma samples from patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol Int. 1999; 19(1–2): 35–7.

Ozkan Y, Yardym-Akaydyn S, Sepici A, et al. 34. Oxidative status in heumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 2007; 26(1): 64–8.

Li JJ, Hartono D, Ong CN, et al. Autophagy and 35. oxidative stress associated with gold nanoparticles. Bio-materials. 2010; 31(23): 5996–6003.

Choi EM. Ligularia fischeri leaf extract prevents 36. the oxidative stress in DBA/1J mice with type II collagen-induced arthritis. J Appl Toxicol. 2007; 27(2): 176–82.

Park EJ, Park K. Oxidative stress and pro-inflam-37. matory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro. Toxicol Lett. 2009; 184(1): 18–25.

Pan Y, Neuss S, Leifert A, et al. Size-dependent 38. cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 2007; 3(11): 1941–9.

Thakor AS, Paulmurugan R, Kempen P, et al. 39. Oxidative stress mediates the effects of Raman-active gold nanoparticles in human cells. Small. 2011; 7(1): 126–36.

Pan Y, Leifert A, Ruau D, et al. Gold nanopar-40. ticles of diameter 1.4 nm trigger necrosis by oxidative stress and mitochondrial damage. Small. 2009; 5(18): 2067–76.

Tedesco S, Doyle H, Redmond G, Sheehan D. 41. Gold nanoparticles and oxidative stress in Mylitus edulis. Marine Environ Res. 2008; 66: 131–3.

Jia HY, Liu Y, Zhang XJ, et al. Potential oxi-42.

43


dative stress of gold nanoparticles by induced-NO releasing in serum. J Am Chem Soc. 2009; 131(1): 40–1.

Brandenberger C, Rothen-Rutishauser B, Mühl-43. feld C, et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicol Appl Pharmacol. 2010; 242(1): 56–65.

Sul OJ, Kim JC, Kyung TW, et al. Gold nanopar-44. ticles inhibited the receptor activator of nuclear factor-κb ligand (RANKL)-induced osteoclast formation by acting as an antioxidant. Biosci Biotechnol Biochem. 2010; 74(11): 2209–13.

Barathmanikanth S, Kalishwaralal K, Sriram M, 45. et al. Anti-oxidant effect of gold nanoparticles restrains hyperglycemic conditions in diabetic mice. J Nanobio-technology. 2010; 8: 16.

Kajita M, Hikosaka K, Iitsuka M, Kanayama A, 46. Toshima N, Miyamoto Y. Platinum nanoparticle is a use-ful scavenger of superoxide anion and hydrogen peroxi-de. Free Radic Res. 2007; 41(6): 615–26.

Michaelsson E, Malmstrom V, Reis S, et al. T cell 47. recognition of carbohydrates on type II collagen. J Exp Med. 1994; 180(2): 745–9.

Weithmann KU, Schlotte V, Jeske V, et al. Effect 48. of tiaprofenic acid on urinary pyridinium crosslinks in adjuvant arthritic rats: Comparison with doxycycline. Inflamm Res. 1997; 46: 246–52.

Li S, Lu A, Li B, Wang Y. Circadian rhythms on 49. hypothalamic-pituitary-adrenal axis hormones and cyto-kines of collagen induced arthritis in rats. J Autoimmun. 2004; 22(4): 277–85.

Kumar DA, Settu K, Raju KV, et al. Inhibition of 50. nitric oxide and caspase-3 mediated apoptosis by a te-trapeptide derivative (PEP1261) in cultured synovial fi-broblasts from collagen-induced arthritis. Mol Cell Bio-chem. 2006; 282(1–2): 125–39.

Gavrilov VB, Gavrilova AR, Mazhul LM. Met-51. hods of determining lipid peroxidation products in the serum using a thiobarbituric acid test. Vopr Med Khim. 1987; 33(1): 118–22.

Arutiunian AV, Dubinina EE, Zibina NN. Methods 52. for evaluation of organism free radical oxidation and an-tioxidant system. St. Petersburg. 2000; 49–51.

Koroliuk MA, Ivanova LI, Maiorova IG, Toka-53.

rev VE. A method of determining catalase activity. Lab Delo. 1988; (1): 16–9.

Galaktionova LP, Molchanov AV, El’chaninova SA, 54. Varshavskii B. Lipid peroxidation in patients with gas-tric and duodenal peptic ulcers. Klin Lab Diagn. 1998; 6: 10–4.

Buckley RG, Elsome AM, Fricker SP, et al. An-55. titumor properties of some 2-[(dimethylamino)methyl]phenylgold(III) complexes. J Med Chem. 1996; 39(26): 5208–14.

Bruot BC, Clemens JW. Effect of adjuvant-in-56. duced arthritis on serum luteinizing hormone and tes-tosterone concentrations in the male rat. Life Sci. 1987; 41(13): 1559–65.

Paulos CM, Varghese B, Widmer WR, et al. Fo-57. late-targeted immunotherapy effectively treats establis-hed adjuvant and collagen-induced arthritis. Arthritis Res Ther. 2006; 8(3): 1–10.

Sahu D, Sahora A, Roy S, et al. Suramin amelio-58. rates collagen induced arthritis. Int Immunopharmacol. 2011, doi:10.1016/j.intimp.2011.12.003.

Bhattacharya R, Mukherjee P. Biological proper-59. ties of “naked” metal nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev. 2008; 60(11): 1289–306.

Lu J, Kasama T, Kobayashi K, et al. Vascular 60. endothelial growth factor expression and regulation of murine collagen-induced arthritis. J Immunol. 2000; 164(11): 5922–7.

Sone H, Kawakami Y, Sakauchi M, et al. Neutra-61. lization of vascular endothelial growth factor prevents collagen-induced arthritis and ameliorates established disease in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 281(2): 562–8.

Nel A, Xia T, Mädler L, Li N. Toxic potential of 62. materials at the nanolevel. Science. 2006; 311(5761): 622–7.

Paciotti GF, Myer L, Weinreich D, et al. Colloidal 63. gold: a novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery. Drug Deliv. 2004; 11(3): 169–83.

Hall JB, Dobrovolskaia MA, Patri AK, McNe-64. il SE. Characterization of nanoparticles for therapeutics. Nanomedicine. 2007; 2(6): 789–803.

Straipsnis įteiktas redakcijai 2012 m.sausio 11 d.,priimtas spaudai 2012 m. vasario 23 d.

44


PROPHYLACTIC TREATMENT OF RAT COLLAGEN-

INDUCED ARTHRITIS WITH VARIOUS SIZES OF GOLD

NANOPARTICLES

L. Leonavičienė1, R. Bradūnaitė1, G. Kirdaitė1, D. Vaitkienė2,

M. Kukis1, A. Vasiliauskas1

1 State Research Institute Centre of Innovative medicine2 Faculty of Medicine of Vilnius University

AbstractMetallic gold compounds are widely used in medicine,

with the most common being a therapeutic agent for reducing rheumatoid arthritis (RA) symptoms since the early 1900s. Discovering therapeutic inorganic nanoparticles (NPs) is envolving as an important area of research in the emerging field of nanomedicine. Gold NPs (AuNPs) have also demonstrated some promising outcomes. The nanosized dimension (1–100 nm) allows AuNPs to be incorporated into cells, makes them suitable for in vitro and in vivo imaging and targeted treatment of various disease.

The aim of this study was to evaluate the influence of AuNPs of various sizes on the treatment of rat collagen-induced arthritis (CIA) in the early and late stages of pathological process after their intraarticular (i.a.) injections.

Material and methods. Two experiments were performed on 49 male Wistar rats with CIA. AuNPs were injected i.a. to groups of eight rats 5 times a week by using prophylactic treatment protocol. In both experiments animals were divided into 3 groups: I – control, II – group, received i.a. 20 µL volume injections of 13 nm AuNPs, and III – injected with 50 nm AuNPs. In the first experiment (24 rats), which lasted 12 days, early CIA changes were investigated after 9 injections of AuNPs. In the second experiment (25 rats), which lasted 28 days, the effect of 20 i.a. injections of AuNPs was evaluated. Animals of the control groups with CIA were injected with the same volume of saline solution. Clinical and histological indices of pathological process and pro-/antioxidant status of blood serum were investigated during the experiment.

Results. Our results showed that in the early stage of pathological process the prophylactic i.a. administration of 50 nm AuNPs (6 i.a. injections) ameliorated the clinical course CIA and joint swelling decreased by 30%. Improved blood indices were observed after 9 i.a. injections of AuNPs and more pronounced effect was observed under the treatment with 50 nm AuNPs. Histopathological analysis of the AuNPs-treated joint tissues revealed that 50 nm AuNPs significantly decreased inflammatory infiltration and angiomatosis in soft

periarticular tissues and synovium, edema in soft tissues, and erosion in cartilage.

In the second experiment only 3 injections of 13 nm and 50 nm AuNPs administered prophylactically significantly decreased joint swelling respectively by 25.2% and 19.13%. The tendency of joint swelling inhibition was revealed by using the prophylactic treatment with both sizes of AuNPs (20 i.a. injections) till late stage of CIA, but better effect was seen by using AuNPs of smaller size. Lower histological changes in joint tissues of treated animals were revealed after 20 injections of AuNPs. 50 nm AuNPs significantly decreased inflammatory infiltration, and both sizes of AuNPs suppressed edema and angiomatosis in soft periarticular tissues. Injections of AuNPs enhanced fibrotic processes in articular tissues of both treated groups and decreased γ- metachromasia in the group treated with 50 nm AuNPs.

Evaluation of the changes in synovium after long treatment with AuNPs showed that 50 nm AuNPs significantly decreased synovium proliferation, general infiltration, and a marked suppression of edema, angiomatosis and γ-metachromasia was observed after injections of AuNPs of both sizes. Treatment with 50 nm AuNPs decreased usuries by 69.5%, and no fissures and any thinning of cartilage were observed in this group. A significant decrease of pannus formation by 56.5% ir 74.8% was found after the treatment with 13 nm and 50 nm AuNPs. The positive therapeutic effect of AuNPs on the internal organs showed a decrease of relative liver weight, and increase of absolute and relative weight of the thymus. Effect of smaller size AuNPs was better, because also a decrease of relative weight of the kidney and absolute and relative weight of the spleen was revealed. The profound effect of AuNPs over the anti-oxidant enzyme CAT and inhibition of lipid peroxidation determined by MDA level showed their antioxidant effect.

Conclusion. Our results show that i.a. delivery of 50 nm is an effective treatment strategy for early pathological process. Long use of 13 and 50 nm AuNPs till late stage of CIA showed only a tendency of joint swelling inhibition, but decreased histological changes in joint. The results obtained disclose the effectual role of AuNPs as an anti-oxidative agent generated the increased activity of anti-oxidant enzyme CAT. Obtained results demonstrate proof of principle for the use of AuNPs as a novel therapeutic agent for the treatment of RA besides conventional antirheumatic therapy.

Keywords:gold nanoparticles, collagen-induced arthritis, rats

45

Profilaktinis žiurkių kolageninio artrito gydymas taikant ......Viso eks-perimento metu gyvūnai...

Documents

Transcript of Profilaktinis žiurkių kolageninio artrito gydymas taikant ......Viso eks-perimento metu gyvūnai...