Prof. Vinicius Campos

Seqüenciamento

2 principais fases

1) produção de moléculas

- bibliotecas de gDNA, cDNA, etc.

2) seqüenciamento propriamente dito

- Sanger

Introdução

Maior velocidade Maior eficiência Menor custo

Ferramentas de seqüenciamento buscam:

Tecnologias de sequenciamento

- Sanger sequencing

- PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467

- Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)

- Pirosequenciamento

-Nature 437 (2005), 362-7

- Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)

Revolução...

2005 454 sequencing “Massively parallel amplification”

pyrosequencing EmPCR – “Emulsion PCR”

Inovações Comerciais

Roche 454

Princípios do Pirossequenciamento

Princípios do Pirossequenciamento

Princípios do Pirossequenciamento

Princípios do Pirossequenciamento

e.g. N at position 1

Fluorescence-labeled decoder for nucleotide

Fluorescence-labeled decoder for nucleotide

Fluorescence-labeled decoder for nucleotide

Fluorescence-labeled decoder for nucleotide

G

A

T

C

Call for base at position 1G

Princípios do Pirossequenciamento

Visão da Placa de pirossequenciamento pelo equipamento

(75,179)

(188,358)

(75,179)

(188,358)

G

G

1

(75,179)

(188,358)

(75,179)

(188,358)

G A

G A

1 2

(75,179)

(188,358)

(75,179)

(188,358)

G A T

G A T

1 2 3

(75,179)

(188,358)

(75,179)

(188,358)

G A T C

G A T C

1 2 3 4

(75,179)

(188,358)

(75,179)

(188,358)

G A T C

G A T C

1 2 3 4

T

G

5

(75,179)

(188,358)

HUMFTE1A

HSRNPA1

G A T C

G A T C

1 2 3 4

T T A C C C G T G A C A A A T

G T G A C G C T G A A T A A T

5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20

A

A

Sequencia de uma bead específica

G A T C C C A G T G A A T C C T G G G T

Signature

GATCTGCATTCGGTAACAGG 1

2 GATCTTTGTCAACCAAAACA 2

3 GATCCCTGTGAAGACCCAGG 113

4 GATCTTTCCTCCTGGTTACT 16

5 GATCCAGTCAAGGAGAAAGA 36 GATCTGATAGTCCTGAAAAC 22

7 GATCATGGTGATGTACGGGG 1

8 GATCCAGTGCTATTCTGTCA 38

9 GATCAATCCCTCAAGATTTT 312

.

.

23,685 GATCACCATCCCAGTCACCT 2,588

856,567

# of Beads

1

Vantagens

Maior rapidez no sequenciamento Sequenciamento simultâneo

Menor custo

Menos erros na leitura

Novas possibilidades Aprofundar regulação genoma Acompanhar resistência viral e bacteriana em

tempo real Ter acesso a novos genes Entender a terapêutica gênica Integrar informações biológicas com questões de

saúde e doença Avaliação genômica personalizada Avanços ainda inimagináveis

Aplicações comerciais atuais...

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