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PROCEDIMIENTO NMKL No. 5 (2003) Edición en español, 2005

Estimación y expresión de la incertidumbre de la medición en análisis químico Página: 1 (45) Versión: 2 Fecha: 2004-09-09 Aprobado: Ole Bjørn Jensen

COMITE NORDICO DE ANALISIS DE ALIMENTOS

ESTIMACION Y EXPRESION DE LA INCERTIDUMBRE DE LA MEDICION EN ANALISIS QUIMICO CONTENIDO Prólogo Introducción Definiciones Estimación de la incertidumbre de la medición Expresión de la incertidumbre de la medición Ejemplos Referencias Apéndice 1. Cómo utilizar la plantilla de Excel

Edición en idioma español, Julio 2005. La traducción ha respetado el formato y redacción del documento original de NMKL en idioma inglés. Traducido por: Lic. Nelson S. Fernández Gil, M. Sc. Especialista Principal del Grupo Gestor de la Calidad del Lab. de Supervisión de la Calidad “CUBACONTROL S.A.” Ciudad de La Habana, Cuba. Tel. +53 7 271-3346. Fax: +53 7 271-1332. Correo electrónico: [email protected] Secretario del Comité Técnico de Normalización Cubano Nº 46 “Métodos de Análisis y Toma de Muestras” Evaluador líder y Miembro del Comité Técnico Consultor del Organo Nacional de Acreditación de la República de Cuba, (ONARC). Edition in Spanish language, July 2005. The translation has retained the format and writing of the original NMKL´s document in English language. Translator: Chem. Nelson S. Fernández Gil, M. Sc. Main Specialist of the Quality Manager Group of the Quality Supervision Laboratory "CUBACONTROL Corp." Havana City, Cuba. Phone: +53 7 271-3346. Fax: +53 7 271-1332. E-mail: [email protected] Secretary of the Cuban Standardization Technical Committee Nº 46 "Methods of Analysis and Sampling" Leader assessor and Member of the Technical Committee of Consultant of the National Accreditation Organ of the Republic of Cuba, (ONARC).

PROCEDIMIENTO NMKL No. 5 (2003) Versión en español, 2005


PROLOGO Esta nueva versión ha sido revisada significativamente en comparación con la versión 1. En esta versión del procedimiento, el enfoque principal se ha modificado para referirse a la incertidumbre de la medición según el documento conocido como GUM (1), y sobre todo el nuevo documento de Eurachem (2). Muchos datos experimentales se utilizan en estos documentos. La versión anterior se ha criticado por no considerar un enfoque suficientemente amplio al referirse a la estimación de incertidumbre de la medición (3). Esto ha conducido a un enfoque más comprensivo en la presente versión del tema de la incertidumbre de la medición en análisis cuantitativo. Se menciona en la nueva norma de acreditación ISO/IEC 17025 (4), que se deben considerar la experiencia previa y los datos de validación al estimar la incertidumbre de la medición. Este tipo de datos también es más familiar y aceptado por la mayoría de los químicos analíticos. La incertidumbre total de la medición se puede simplificar utilizando estos datos. Pero también es importante intentar identificar todas las fuentes de incertidumbre en el método. Una revisión completa de todos los pasos del procedimiento, y de todas las fuentes de incertidumbre, puede darle información útil al analista acerca de dónde hallar las fuentes mayores de error, y por consiguiente un adecuado conocimiento sobre cómo minimizarlos, si fuera necesario. El propósito de este procedimiento es describir en condiciones simples y breves, cómo lograr buenas estimaciones de la incertidumbre de la medición, a través, entre otras cosas, del uso de datos producidos en las validaciones y en otras mediciones de control de la calidad. Para una descripción más detallada, recomendamos los documentos de Eurachem (2). NMKL invita a todos los lectores y usuarios de este procedimiento a enviar comentarios y puntos de vista. Las sugerencias y comentarios deben dirigirse a la Secretaría General de NMKL. Este procedimiento para la estimación y expresión de incertidumbre de la medición en análisis químico ha sido elaborado por un grupo de trabajo bajo la dirección de NMKL. El grupo de trabajo estuvo integrado por las siguientes personas: Dinamarca: Inge Meyland, Agencia Nacional de Alimentos, Finlandia: Kirsti Nuotio, Laboratorio de Costumbres, Noruega: Per Lea, Instituto Noruego de Investigaciones de Alimentos, Suecia: Joakim Engman, Oficina Nacional de Alimentos (director proyecto). El grupo del proyecto extiende su agradecimiento a los organismos nórdicos de acreditación SWEDAC y FINAS que remitieron sus valiosos comentarios sobre este procedimiento. El procedimiento está disponible a través de: Secretaría General de NMKL a/c Instituto Veterinario Nacional Apartado Postal 8156, Dep. NO-0033 Oslo, Noruega, Tel: +47 23 21 62 50. Fax: +47 23 21 62 02. Correo electrónico: [email protected] Página web: http://www.nmkl.org.



INTRODUCCION Cuando el resultado de un análisis químico se presenta en un informe analítico, es recomendable siempre informarlo como un resultado numérico, y no simplemente formulando una declaración del tipo "La concentración del analito es inferior al límite máximo". Para que el resultado esté completo también debe incluirse la incertidumbre de la medición del ensayo. En muchos casos, la interpretación de un resultado puede resultar sumamente difícil a menos que vaya acompañado de su incertidumbre asociada. Es importante comprender la diferencia entre el error de la medición e incertidumbre de la medición. El error de la medición es la diferencia entre un valor medido y un valor verdadero. La incertidumbre de la medición es la variación resultante de la medición de la concentración en el material de ensayo. El error es una diferencia, mientras que la incertidumbre es un intervalo. Para cuantificar el error de la medición, es necesario saber el valor verdadero o el valor de referencia aceptado, mientras que la estimación de la incertidumbre de la medición no exige conocer el valor verdadero. Los errores de la medición pueden ser divididos en errores sistemáticos y errores al azar. El error sistemático es posible corregirlo en alguna medida, pero los errores aleatorios nunca pueden corregirse. El resultado de la medición y la incertidumbre son siempre estimados dependiendo de, por ejemplo, el método, la matriz y la concentración del analito. Es por consiguiente importante documentar cómo se han realizado las estimaciones. Con un estudio de validación bien planificado, es a menudo posible evaluar la incertidumbre de una gran parte de los elementos de incertidumbre presentes. Es importante escoger las matrices y los niveles de concentración pertinentes para los ensayos que se van a ejecutar. Otras fuentes de incertidumbre deben ser cuantificadas en experimentos aparte en otro momento más adelante, o si posible, verificando si hay suficiente información en las especificaciones dadas o en información en la literatura. Es importante enfatizar en que el proceso analítico debe ser el foco principal, y no los procedimientos de cálculo estadísticos. Con un conocimiento sólido del ensayo, es posible identificar rápidamente las fuentes principales de incertidumbre.



DEFINICIONES Las definiciones se han tomado de los documentos GUM (1), Eurachem (2), y Vocabulario Internacional de Términos Básicos y Generales en Metrología (5). Material de referencia certificado (CRM) Es un material de referencia, acompañado por un certificado en el cuál uno o más valores de las propiedades son certificados por un procedimiento que establece su trazabilidad con una realización exacta de la unidad en la cual se expresan los valores de esas propiedades y para los cuales cada valor certificado aparece acompañado por una incertidumbre al nivel de confianza declarado (5, cap. 6.14). Error (de medición) Es el resultado de una medida menos el valor verdadero del mesurando (5, cap. 3.10). Incertidumbre de la medición Parámetro que es asociado con el resultado de una medición y qué caracteriza la dispersión de los valores que podrían atribuirse razonablemente al mesurando (5, cap. 3.9). Notas 1. El parámetro puede, por ejemplo, ser una desviación típica (o un múltiplo dado de esta), o la mitad de un intervalo con un nivel de confianza declarado. 2. La incertidumbre de la medición generalmente incluye muchos componentes que se caracterizan por sus desviaciones típicas estimadas a partir de una serie de mediciones, o de supuestas distribuciones de probabilidad basadas en la experiencia u otras informaciones. 3. Se asume que el resultado de la medición es la mejor estimación del valor del mesurando, y que todos los elementos de incertidumbre, incluyendo aquéllos que dependen de los efectos sistemáticos (por ejemplo, aquéllos que se relacionan con las correcciones y los patrones de referencia), contribuyen a la dispersión.

Mesurando Cantidad específica sujeta a medición (5, cap. 2.6). Repetibilidad (de resultados de medición) Es la estrecha concordancia entre los resultados de sucesivas mediciones del mismo mesurando llevadas a cabo bajo las mismas condiciones de medición (5, cap. 3.6).



Notas 1. Estas condiciones se denominan condiciones de repetibilidad. 2. Las condiciones de repetibilidad incluyen: La misma rutina de medición, el mismo observador/analista, utilización de los mismos equipos de medición, bajo las mismas condiciones y en la misma ubicación, y repetidos en cortos intervalos de tiempo. El concepto de repetibilidad también aparece en la norma ISO 3534-1. Reproducibilidad (de los resultados de medición) Es la estrecha concordancia entre los resultados de medición sucesivos del mismo mesurando llevados a cabo bajo condiciones diferentes de medición (5, cap. 3.7). Notas 1. Al informar sobre la significación de la reproducibilidad, deben declararse las condiciones que hayan cambiado, 2. El cambio de condiciones puede involucrar: El principio del análisis, el método, el observador, el equipo, la norma de referencia, la ubicación, las condiciones de uso y el tiempo. El concepto de reproducibilidad también aparece en la norma ISO 3534-1. Incertidumbre típica, u(xi) Es la incertidumbre de un resultado de medición expresado como una desviación típica (2, cap. B.13). Incertidumbre típica combinada, uc(y) Es la incertidumbre típica del resultado de medición cuando ese resultado se obtiene a partir de varios valores de otras cantidades, igual a a la raíz cuadrada positiva de una suma de condiciones, esas condiciones son las varianzas o covarianzas de esas otras cantidades, ponderadas en la medida en que esas cantidades influyen en el resultado de la medición. (2, cap. B.14). Incertidumbre expandida, U, Cantidad que define un intervalo del resultado de una medición que puede esperarse que abarque un fragmento grande de la distribución de valores que podrían atribuirse razonablemente al mesurando (2, cap. B.15). Notas 1. El fragmento anteriormente mencionado puede comprenderse como la probabilidad de cobertura o el nivel de confianza del intervalo.



2. Para asociar un nivel específico de confianza con el intervalo definido por la incertidumbre expandida, se requiere de las presunciones explícitas o implícitas con respecto a la distribución de probabilidad caracterizada por el resultado de la medición y su incertidumbre típica combinada. El nivel de confianza que puede atribuirse a este intervalo, sólo puede conocerse en la medida en que puedan justificarse tales presunciones. 3. La incertidumbre expandida, U, se calcula en base a una incertidumbre típica combinada, uc, y un factor de cobertura k, según la fórmula siguiente: U = k . uc Error aleatorio Es el resultado de una medición menos la media que resultaría de un número infinito de mediciones del mismo mesurando, llevadas a cabo bajo condiciones de repetibilidad (5, cap. 3.13). Error sistemático Media que resultaría de un número infinito de mediciones del mismo mesurando llevadas a cabo bajo condiciones de repetibilidad, menos un valor verdadero del mesurando (5, cap. 3.14). Trazabilidad Propiedad de un resultado de medición o del valor de un patrón a través del cual es posible relacionar las referencias dadas, usualmente patrones nacionales o internacionales, a través de una cadena continua de comparaciones donde todas tienen estimadas y reportadas sus incertidumbres (5, cap. 6.10). Factor de cobertura, k, Factor numérico utilizado como un multiplicador de la incertidumbre típica combinada para obtener la incertidumbre expandida (2, cap. B.16). Nota El factor de cobertura normalmente cae en el intervalo entre 2 y 3. ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE DE LA MEDICION Trazabilidad Para poder utilizar los resultados de diferentes laboratorios de una manera razonable, dichos resultados deben ser comparables. Cuando, por ejemplo, se



realiza una pesada, la balanza debe estar calibrada contra un juego de pesas calibradas y trazables. Este conjunto de pesas ha sido calibrado contra un juego de pesas nacionales, que a su vez se calibran contra el prototipo de kilogramo internacional. La situación óptima sería poder hacer las medidas trazables a un patrón del sistema SI. En cada paso de esta cadena de comparaciones entre diferentes patrones, se calcula la incertidumbre sumando la incertidumbre de la referencia y la incertidumbre de la medición de esta referencia. El objetivo final es que todos los laboratorios utilizaran la misma escala de medición. La trazabilidad de un método de análisis puede lograrse utilizando patrones trazables para la calibración del equipo, por comparación con un método primario, utilizando materiales de referencia para sustancias puras y materiales de referencia certificados (MRC) con matrices apropiadas, y utilizando una rutina de medición exactamente definida (método de referencia). Corrección para errores sistemáticos En el documento GUM (1), se recomienda que los errores sistemáticos deben ser corregidos. Hay grandes diferencias en el área de la investigación alimenticia sobre cómo realizar en la práctica este tipo de corrección, y la pregunta se ha discutido ampliamente (6). Esto crea problemas al comparar resultados de laboratorios diferentes. Un informe analítico siempre debe declarar si los resultados se han corregido o no, e informar el factor de corrección pertinente. Hay varias maneras de revelar el error sistemático. Una técnica consiste en analizar un material de referencia certificado, o un material de control interno que se ha calibrado contra un material de referencia certificado de una manera trazable y otro es participar en esquemas de ensayos de aptitud. También es posible determinar la recuperación de un analito añadido. La desventaja de esta técnica, radica en que los resultados tienen que ser interpretados con un cierto grado de cautela. Es bastante posible obtener un 100% de recuperación del analito añadido, pero la sustancia añadida puede tener una forma diferente a aquella que está presente en la muestra. Así, una recuperación pobre es una indicación de problemas, pero una recuperación buena necesariamente no significa que el resultado es correcto. También es posible analizar las muestras auténticas en paralelo con un método de referencia bien definido. Este método es especialmente útil al determinar, por ejemplo, el contenido de grasa y de agua definidos por el método objeto de estudio. Si se ha identificado el error sistemático y se hacen las correcciones para eliminarlo, es importante tener presente que hay una incertidumbre en el factor de corrección. Esta incertidumbre debe ser incluida en la incertidumbre combinada de la medición.



El proceso de estimación de la incertidumbre de la medición

La especificación de las mediciones

El primer paso es describir las mediciones realizadas. La descripción debe describir, de una manera inequívoca, los pasos llevados a cabo en el procedimiento de medición, y las conexiones matemáticas entre los analitos y las diferentes mediciones. En la mayoría de los casos, la descripción del método debe cubrir este aspecto. Para visualizar los diferentes pasos del método, puede ser útil preparar un diagrama de flujo del mismo. Es importante determinar si el método es racional (no empírico) o empírico. Un método racional es un método que produce un resultado que es independiente del método y qué indica un contenido "verdadero". Por ejemplo, se considera que es posible determinar el contenido de metales pesados en los alimentos con muchos métodos diferentes, obteniendo aún resultados comparables. Por otro lado, un método empírico define lo que se mide. Un ejemplo de esto es el análisis del contenido de grasa en alimentos, cuyo resultado depende del tipo de método de extracción y del solvente que se utilice. En esta área, es bastante común trabajar con los supuestos métodos de referencia. Si se utiliza el método de referencia, se considera eliminado el error sistemático. Sin embargo, la ejecución del método puede producir un error sistemático. El propósito de los métodos empíricos es obtener resultados comparables entre laboratorios diferentes que empleen el mismo método, en lugar de medir el contenido absoluto, verdadero. Identificación de las fuentes de incertidumbre El próximo paso es relacionar todas las fuentes conocidas de incertidumbre. Esta revisión del método es una manera de concientizar al analista con las fuentes de incertidumbre del método. Si el muestreo es una parte de la rutina especificada, su efecto debe ser naturalmente también incluido. Las fuentes típicas de incertidumbre son: el muestreo, las condiciones de almacenamiento, los efectos del instrumento, la pureza de los reactivos, reacciones incompletas o colaterales, las condiciones de medición como temperatura y humedad del aire, los efectos de matriz, los efectos de cálculo, como por ejemplo, la selección del modelo de calibración, la corrección del blanco de muestra y, no por último menos importante, la influencia del analista. Una manera de documentar y comparar fuentes diferentes de incertidumbre es usar un diagrama de Ishikawa (diagrama de espina de pescado). En la referencia 2, apéndice D se describe cómo crear dicho diagrama. Simplificación por agrupamiento de componentes, cubiertos por información existente.



Cuando se han identificado las fuentes de incertidumbre, su efecto debe calcularse. Esto puede hacerse evaluando el tamaño de cada fuente individual, o determinando directa y simultáneamente la contribución combinada de varias fuentes usando resultados conocidos de ese método. Las fuentes de incertidumbre incluidas en los datos disponibles, que dependen del tipo de estos datos, deben agruparse juntas. Si fallara la fiabilidad de los datos en gran parte del método, puede merecer la pena, planificar y efectuar un estudio de validación con el objetivo de cubrir tantas fuentes de incertidumbre como sea posible. La siguiente información es apropiada para utilizar: los resultados de análisis de materiales de referencia certificados, los datos de estudios colaborativos en que la repetibilidad y la reproducibilidad son normalmente determinadas, los resultados de participación en ensayos de aptitud, los ensayos de control interno, los resultados de muestras duplicadas, la recuperación de ensayos contaminados a propósito, etc., por ejemplo, al analizar un MRC, se utiliza normalmente el método íntegro, en consecuencia se suministra la trazabilidad del contenido certificado. Sin tener en cuenta el tipo de datos que se pretende utilizar, es importante pensar cuidadosamente sobre aquellas fuentes de incertidumbre que no se han incluido. Si usted, por ejemplo, está utilizando un MRC, el muestreo y la homogeneización no están incluidos. ¿Han ocurrido cambios en el ambiente del laboratorio? Si las mediciones se han efectuado sólo durante los meses de invierno, puede conllevar a una subestimación, puesto que el laboratorio puede estar mucho más caliente en verano. ¿Hasta que valor es aceptable una diferencia entre la matriz y el nivel del analito en ensayos usualmente analizados? ¿En todas las mediciones se ha utilizado la misma solución madre del patrón? Cuantificación de componentes agrupados. Si se usan resultados de estudios anteriores en la cuantificación, debe ser posible mostrar, por medio de los datos pertinentes que, por ejemplo, se aplican aún la precisión y algún error sistemático. Los gráficos de control con los resultados de una muestra control pueden demostrar si el método está bajo control estadístico (7). Cuantificación de los restantes componentes. Las fuentes de incertidumbre existentes que no fueran cubiertas por los datos disponibles, deben ser evaluadas separadamente. Esto puede hacerse de cualquiera de las maneras siguientes: efectuando estudios experimentales, recogiendo información de certificados de calibración u otra literatura, o usando



modelos teóricos, o mediante juicios personales basados en la experiencia. En el documento GUM (1), la evaluación de incertidumbre de la medición según el análisis estadístico de una serie de mediciones, se define como una evaluación tipo A. Los métodos de evaluación por medio de otras técnicas, reciben el nombre de evaluación tipo B. La forma en que tienen que ser evaluadas completamente las fuentes de incertidumbre, depende de su tamaño y número. Si es posible aproximar el tamaño de la fuente de incertidumbre, se aplica la siguiente fórmula (2): "A menos que haya un gran número de ellas, las componentes que representen menos de un tercio de la necesidad mayor no se evalúan en detalle". En (8) se declara que las componentes que no son mayores que un quinto del valor de la fuente más grande, en la mayoría de los casos pueden descartarse. No hay ningún límite exacto para esto, usted tiene que hacer una evaluación individual en cada caso por separado. Esto simplificará probablemente la evaluación, ya que varios elementos individuales de incertidumbre pueden evaluarse como insignificantes y por tanto despreciables. Conversión de todos los componentes a la incertidumbre típica Si hay cualquier fuente de incertidumbre que no se expresa como una desviación típica, deben convertirse a desviaciones típicas antes de calcular la incertidumbre combinada de la medición. Esto normalmente sólo se aplica a incertidumbres de medición tomadas de una literatura apropiada o de otros tipos de especificaciones. Por ejemplo, normalmente se expresa la incertidumbre del contenido de materiales de referencia certificados como un intervalo de confianza de 95%. Las fórmulas siguientes pueden usarse por convertir una especificación a una desviación típica: Intervalo de confianza, x ± c dónde x es el valor y c es la mitad del intervalo de confianza. En este contexto, utilizamos u(x) para designar la incertidumbre típica (la desviación típica) para los componentes. Así u(x) = c/k, es decir: u(x) = c/2 para una confianza de 95% u(x) = c/3 para una confianza de 99% Distribución rectangular, x ± a, dónde x es el valor, y los límites exteriores vienen dados por ±a. No es conocido cuál distribución se aplica. La desviación típica de esta distribución será:

3)( axu =



Distribución triangular, x ± a, dónde x es el valor, y los límites exteriores vienen dados por ±a. No se conoce exactamente cuál distribución se aplica, pero los valores están probablemente más cercanos a x que a los valores de los límites exteriores. La desviación típica de esta distribución será:

6)( axu =

Distribución semi-triangular, x - a, dónde x es el valor y el límite inferior viene dado por -a. Esta distribución no es simétrica. Esta distribución generalmente se utiliza en situaciones dónde la variación puede ocurrir sólo en un sentido. Un ejemplo de esto puede ser una caída en la temperatura. Si la temperatura de una muestra es inicialmente superior a la temperatura ambiente, la temperatura no puede aumentar; sólo puede disminuir hasta alcanzar la temperatura ambiente. La desviación típica de esta distribución será:

23)( axu =

Cálculo de la incertidumbre típica de mediciones repetidas Desviación típica, SD, se utiliza para los datos experimentales con mediciones repetidas:

1

)(1

2

−

∑ −== n

xxn

ii

SD

Error típico de la media, SEM, se usa si los componentes se basan en la formación del valor medio. Se calcula como sigue:

nSDSEM =

Donde n es el número de valores que son incluidos en la estimación de la desviación típica. Desviación típica relativa expresada en %, % RSD, se calcula como sigue:



100% ⋅=x

SDRSD

Desviación típica de determinaciones dobles, Sr, puede utilizarse para la estimación de la desviación típica de la repetibilidad, y se calcula como sigue:

n

baS

n

iii

r 2

)(1

2∑=

−=

Donde n es el número de determinaciones dobles, y a y b son los valores respectivos en la determinación duplicada Desviación típica relativa de determinaciones dobles en %, RSDr, puede usarse para estimar la desviación típica relativa de la repetibilidad, y se calcula como sigue:

n

dRSD

n

ii

r 21

2∑==

Donde,

100)(⋅

−=

i

iii x

bad

Donde ai y bi son los resultados de la respectivas determinaciones duplicadas, ix es el valor medio de la determinación duplicada, y n es el número de determinaciones duplicadas. Cálculo de la incertidumbre típica combinada Se sumarán las componentes Individuales y las agrupadas. Esto debe hacerse según un modelo de propagación de error que puede involucrar varios cálculos complicados. Hay softwares comercialmente disponibles que realizan estos cálculos. Alternativamente, es posible utilizar un método numérico en el programa de cálculo que da una solución aproximada. En la página web de NMKL, www.nmkl.org, hay una plantilla para esto (Microsoft Excel). El apéndice 1 contiene las instrucciones sobre cómo utilizar esta plantilla.



Hay dos casos dónde la suma de las incertidumbres típicas es mucho más acertada. Regla 1. El modelo contiene sólo suma o resta, y = (p + q + r +...), en cuyo caso la incertidumbre típica combinada, uc(y), se calcula como sigue:

...)()()()( 222 +++= ruqupuyuc

Regla 2. El modelo contiene sólo multiplicación y/o división, y = (p . q)/(r . t) en cuyo caso la incertidumbre típica combinada relativa, uc(y)/y, se calcula como sigue:

2222)()()()()(⎟⎠⎞

⎜⎝⎛+⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

ttu

rru

qqu

ppu

yyuc

Para obtener la incertidumbre típica absoluta; multiplique por y. Reexamen y reevalación de los componentes significativos, si es necesario. Cuando se calcula la incertidumbre típica combinada, es necesario evaluar si los cálculos proporcionan suficiente información. Algunas fuentes significativas de incertidumbre podrían necesitar ser sometidas a una revisión más completa. Si se utiliza la plantilla adjunta para calcular la incertidumbre combinada, la figura ilustrará claramente cómo se distribuyen los tamaños de los diferentes componentes. Esta figura puede revelar a menudo que las fuentes predominantes de incertidumbre son más pequeñas de lo que parecían a primera vista. Si el objetivo es minimizar la incertidumbre total de la medición, es importante tratar con las fuentes más grandes reales de error, no con aquellas fuentes que inicialmente parecían significantes. Cálculo de la incertidumbre expandida de la medición. Para hacer que la incertidumbre de la medición corresponda con un intervalo que contenga una fracción grande de la variación esperada en los resultados, la incertidumbre típica combinada se multiplica por un factor de cobertura. Este factor de cobertura normalmente es 2, pero a veces puede ser 3. Un factor de cobertura igual a 2 corresponde a un nivel de confianza de aproximadamente 95%, y un factor de cobertura igual a 3 corresponde a un nivel de confianza por encima de 99%. Se recomienda que el factor de cobertura igual a 2 se utilice de la siguiente manera:



U = 2 . uc La incertidumbre expandida de la medición calculada, U, es la mitad del intervalo de la incertidumbre de la medición. Para expresar el intervalo completo de la incertidumbre de la medición para un resultado de la medición, y, se usa normalmente la siguiente fórmula:

y ± U EXPRESION DE LA INCERTIDUMBRE DE LA MEDICION.

La incertidumbre de la medición debe informarse como una incertidumbre expandida, pero el cliente y el laboratorio pueden acordar por escrito, mediante una declaración, que no se reporte ninguna incertidumbre de la medición (5, cap. 5.10.1). Sin embargo, al laboratorio se le exige tener esta información disponible. Por ejemplo, si se informa un volumen total de aflatoxinas (B1+B2+G1+G2), debe combinarse la incertidumbre de la medición de cada analito individual según la Regla 1 antes mencionada. Ejemplo. Se suman los contenidos siguientes y las incertidumbres típicas:

Analito Resultado (µg/kg) Incertidumbre típica (µg/kg)

B1 11.32 0.72 B2 2.65 0.29 G1 4.66 0.32 G2 0.54 0.28 Total 19.2 0.89 La incertidumbre total de la medición se calcula de la siguiente manera:

89,028,032,029,072,0 2222 =+++=u

Si se utiliza un factor de cobertura igual a 2 para calcular la incertidumbre expandida de la medición, la suma de los contenidos y la incertidumbre expandida de la medición será:



19,2 ± 2 · 0,89 = 19,2 ± 1,8 µg/kg Expresión de la incertidumbre de la medición en los informes de ensayo. La incertidumbre de la medición debe declararse de una manera normalizada en los informes de ensayo. El resultado, y, debe informarse junto con la incertidumbre expandida de la medición, U, la cual es calculada utilizando un factor de cobertura k=2. Se recomienda el siguiente formato:

(Analito): y ± U (unidad) * * La incertidumbre de la medición reportada es [una incertidumbre expandida de la medición según la definición de la Guía para la Expresión de la Incertidumbre de la Medición. ISO, Ginebra, Suiza 1993] calculada utilizando 2 como factor de cobertura, [el cual proporciona un nivel de confianza de aproximadamente 95%] El texto entre corchetes [ ] puede omitirse o puede abreviarse según sea necesario. Ejemplo:

Plomo: 0,025 ± 0,006 mg/kg * * La incertidumbre de la medición reportada se calcula utilizando el factor de cobertura igual a 2, el cual proporciona un nivel de confianza de aproximadamente 95%. Los valores numéricos de resultados e incertidumbres de la medición no deben expresarse utilizando una cantidad innecesariamente elevada de cifras. Normalmente es suficiente reportar la incertidumbre de la medición con dos cifras significativas, y así redondear el resultado de la medición de manera que corresponda con la incertidumbre de la medición declarada.



EJEMPLOS Ejemplo 1. Estimación de la incertidumbre de la medición utilizando información de validación. Introducción Este ejemplo utiliza la información existente sobre la validación del método, y análisis de muestras de control y muestras auténticas. La incertidumbre de la medición se calcula para tres niveles diferentes de concentración. La exactitud se determina contaminando muestras y calculando su recuperación. Un error sistemático significativo se revela en el ejemplo, y los resultados se han corregido con respecto a este error. La incertidumbre causada por la homogeneización de las muestras se estima en un experimento aparte. La incertidumbre de la solución madre patrón se calcula separadamente para el método espectrofotométrico, el cual se utiliza una vez al año para verificar la concentración de la solución madre patrón. La incertidumbre combinada de la medición, uc, se calcula sumando las incertidumbres relativas de los parámetros de la tabla, de la siguiente manera:

22hom

22strecrc uuuuu +++=

Parámetro Fuente

Repetibilidad/Reproducibilidad interna, ur/uiR

• Determinaciones duplicadas de muestras diferentes.

• Análisis de cuatro muestras de control diferentes.

• Determinaciones duplicadas repetidas de una muestra auténtica.

Exactitud (Recuperación), urec • Adición de sustancia a una

muestra/contaminación.

Homogeneización, uhom

• Experimento aparte con análisis repetido de muestras homogeneizadas (no-homogeneidad y repetibilidad de la muestra dentro de una serie).

Solución madre patrón, ust • Control realizado anualmente con

un método epectrofotométrico. Los principios deben ser similares para la mayoría de los métodos químicos instrumentales.



Método de análisis: Ocratoxina A (OTA) en maíz. Tipo de método: racional, HPLC La incertidumbre, u, se expresa como desviación típica relativa (%). A. Descripción del procedimiento de medición. 1. Homogeneización de la muestra 2. Pesada de la porción de ensayo (muestra) 3. Extracción 4. Filtración 5. Dilución 6. Columna de purificación IA 7. Evaporación 8. Disolución 9. Material de referencia para sustancias puras: Ocratoxina A 10. Calibración de HPLC 11. Análisis HPLC 12. Cálculo

InjVVWVVVZgngOTA⋅⋅⋅⋅⋅⋅

=42

531)/(

Z = contenido de muestra de OTA (pg), a partir de la curva de calibración W = muestra (g) V1 = extracción (ml) V2 = muestra para dilución (ml) V3 = muestra diluida (ml) V4 = muestra diluida en la columna (ml) V5 = extracto de muestra en la columna de purificación IA (ml) Inj = volumen de muestra inyectada (µl) B. Identificación de las fuentes de incertidumbre Se piensa que las mayores fuentes de incertidumbre y los factores que influyen en la incertidumbre de la medición sean: Nivel del analito Nivel de máximo contenido permisible, 1-10 ng/g Contenido de nivel bajo, <1 ng/g Contenido de nivel elevado, <10 ng/g



Homogeneización Grandes cantidades de maíz son difíciles de homogeneizar.

Las determinaciones duplicadas no se realizan sistemáticamente.

Columna de purificación IA Nueva columna para cada muestra, recuperación requerida 85%. Incluido en la repetibilidad/reproducibilidad interna. Calibración de HPLC Incluido en la repetibilidad/reproducibilidad interna. Contenido de Ocratoxina A en la solución madre patrón La solución madre patrón se verifica una vez al año con un espectrofotómetro.

C. Datos de validación y experimentos separados que cubren una gran parte de las fuentes de incertidumbre del método

Repetibilidad, ur Se incluyen en esta incertidumbre las determinaciones duplicadas de muestras auténticas, diferentes productos del maíz. El efecto de la matriz de la muestra y la no homogeneidad.

Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g Incertidumbre de la repetibilidad, ur (%) 13.8 11.2 7.4

ur (%) calculada como la desviación típica relativa RSDr (%) según:

n

dRSD

n

ii

r 21

2∑==

donde

100)(⋅

−=

i

iii x

bad



Donde ai y bi son los resultados de las respectivas determinaciones dobles, ix es el valor medio de las determinaciones duplicadas, y n es el número de determinaciones duplicadas. Análisis de muestras control. No suministra datos para la no homogeneidad en muestras auténticas. Muestras control No. 1 No. 2 No. 3 No. 4

Valor medio, X (ng/g) 0.91 2.31 3.53 5.39

Desviación típica, SD (ng/g) 0.155 0.205 0.218 0.57

Número, n 14 39 36 23

SD Relativa, RSD (%) 17 8.9 6.2 10.7 No. 2, No. 3 y No. 4 son concentradas según:

3)1()1()1(

432

244

233

222

234 −++−+−+−

=nnn

RSDnRSDnRSDnRSD

Resultando en RSD234(%)= 8.5

Contenido de OTA

< 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Incertidumbre de la repetibilidad, ur (%)

17 (RSD1) 8.5 (RSD234)

Reproducibilidad Interna, uiR 3kg de trigo, homogeneizado, contaminado de forma natural. Determinaciones duplicadas (a, b) doce veces en diferentes días (doce series n=12)

2

22 rxiR

sss +=

sr = 0.694 desviación típica de determinaciones duplicadas sx = 0.683 desviación típica de series de valores medios siR = 0.841 desviación típica de la reproducibilidad interna Xm = 8.5 valor medio de todas las determ. (m=2x12= 24) RSDiR (%) = 9.9



(También puede ser calculada según ISO 5725, sR

2 = sL

2+ sr2 donde sL es la

desviación típica entre series, y sr es la desviación típica dentro de las series.)

Contenido de OTA

< 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Incertidumbre de la reproducibilidad interna, uiR (%)

9.9

Recuperación Los experimentos de recuperación se realizan contaminando muestras con la solución madre patrón.

Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Añadido, T (ng/g) 0.58 5.8 29

Valor medio, X (ng/g) 0.45 4.64 26.1

Desviación típica, SD (ng/g) 0.0545 0.251 0.809

Número, n 6 30 12

SD Relativa, RSD (%) 12.1 5.4 3.1

Recuperación (%) 77 80 90 La incertidumbre típica de la recuperación, en %, se calcula como (SEM) según lo siguiente:

nRSDu c

(%)Re =

Esta incertidumbre se utiliza en la incertidumbre combinada sin tener en cuenta si el resultado es corregido o no por la recuperación. Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g Incertidumbre de recuperación, uRec (%) 4.94 0.99 0.89

Para evaluar si la recuperación es significativa, se realiza la prueba-t (grado de libertad, n-1)



nSD

TXt ⋅

−=

Los valores para tcrit (se toman de la tabla de 2-colas, 95% confianza, número de grados de libertad = (n-1), por ejemplo, del Procedimiento N° 9 de NMKL (9).

Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Valor de la tabla, tcrit 2.571 2.042 2.201

Valor del ensayo, t 5.84 25.3 12.4 Cuando se obtiene que t > tcrit significa que la diferencia es significativa. Los resultados de ensayo deben ser corregidos por recuperación. Homogeneización Se analizaron varias muestras idénticas de maíz contaminado de forma natural en el mismo día. Los resultados suministraron los datos sobre la no homogeneidad de la muestra y la repetibilidad en el mismo día. Valor medio = 9.45 ng/g Número, n=6 Desviación típica relativa, RSD = 8.0% Resultando uhom = 8.0% Contenido de Ocratoxina A en la solución madre patrón El volumen de la solución madre patrón debe verificarse anualmente. El volumen de Ocratoxina A en la solución debe ser tal que la absorbancia medida, A, esté entre 0.07 - 0.10. Al medir el contenido de Ocratoxina A mediante un espectrofotómetro en la solución madre patrón, se aplica lo siguiente:

eMWAC ⋅

=

donde C es el contenido en µg/ml, A es la absorbancia a 333 nm, MW es el peso molar en g/mol, y e es la absortividad molar en m2/mol. Materiales de referencia para sustancias puras: la incertidumbre típica combinada se calcula sumando las incertidumbres relativas según la siguiente fórmula:



222espAst uuuu ++=

donde uA = repetibilidad estimada de la absorbancia medida, que incluye el efecto de cuán exitosa ha sido la medición total; se realizan tres mediciones, y se utiliza el valor medio (= 0.7%). usp = repetibilidad del espectrofotómetro = 0.3% ue = incertidumbre del factor de absortividad molar (de la literatura) = 2%

222 23,07,0 ++=stu

La contribución a la incertidumbre de la concentración de la solución madre patrón es ust = 2.1%. Calibración de HPLC La calibración se realiza de nuevo para cada serie de análisis. La serie incluye una muestra control. Incertidumbre estimada de la curva de la calibración (en el centro), ucc <2%, incluida en la repetibilidad. D. Incertidumbre de la medición combinada y expandida (95%) Para calcular la incertidumbre combinada, sume las incertidumbres relativas de la repetibilidad/reproducibilidad interna, recuperación, homogeneización y solución madre patrón como sigue:

22hom

22strecrc uuuuu +++=

Es importante evitar la inclusión repetida (varias veces) de los mismos componentes de incertidumbre en la incertidumbre combinada. Por ejemplo, la incertidumbre de no homogeneidad se incluye en las determinaciones duplicadas de muestras auténticas, y por consiguiente no debe usarse uhom en este caso. Ver debajo la tabla para la Combinación I. La incertidumbre expandida de la medición se calcula como: U = 2 · uc En las tablas siguientes, se presentan tres combinaciones diferentes.



Combinación I (ur = determinaciones duplicadas) Incertidumbre relativa (%) Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Incertidumbre de la repetibilidad, ur 13.8 11.2 7.4

Incertidumbre de recuperación, uRec 4.94 0.99 0.89

Incertidumbre de homogeneización, uhom - - -

Incertidumbre de soln. madre patrón, ust 2.1 2.1 2.1

Incertidumbre combinada, uc 14.8 11.4 7.7

Incertidumbre expandida, U = 2uc 30 23 15

Combinación II (ur = muestras control) Incertidumbre relativa (%) Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Incertidumbre de la repetibilidad, ur1 17

Incertidumbre de la repetibilidad, ur234 8.5

Incertidumbre de recuperación, uRec 4.94 0.99

Incertidumbre de homogeneización, uhom (8.0) 8.0

Incertidumbre de soln. madre patrón, ust 2.1 2.1

Incertidumbre combinada, uc 19.5 11.9

Incertidumbre expandida, U = 2uc 39 24



Combinación III (ur = reproducibilidad interna) La repetibilidad ur se reemplaza con la reproducibilidad interna RSDiR (%). ur incluye el efecto de matrices diferentes, RSDiR solamente de trigo. Incertidumbre relativa (%) Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

Incertidumbre de la repetibilidad, uiR 9.9

Incertidumbre de recuperación, uRec 0.99

Incertidumbre de homogeneización, uhom -

Incertidumbre de soln. madre patrón, ust 2.1

Incertidumbre combinada, uc 10.2

Incertidumbre expandida, U = 2uc 20

Resumen La estimación de la incertidumbre varía algo dependiendo de cuáles datos de validación sean utilizados. Redondeando las cifras, la incertidumbre expandida de la medición (95%) de la Ocratoxina A en el maíz es: Contenido de OTA < 1 ng/g 1-10 ng/g < 10 ng/g

U 40 % 25 % 20 %

La Figura 1 muestra que la incertidumbre de la repetibilidad (incluyendo la no homogeneidad) constituye una gran parte de la incertidumbre para contenidos <1 ng/g.



Uncertainty

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

ur

urec

ust

Com

pone

nt

Contribution

Figura 1. Distribución de los componentes de incertidumbre para la combinación I, contenido < 1 ng/g. E. Utilización de la incertidumbre de la medición. Material de referencia Material de referencia, OTA en maíz Contenido certificado (8.2 ± 1.0) ng/g (95% confianza) corresponde a 7.2 – 9.2 ng/g. Resultado de ensayo, OTA 7.4 ng/g con incertidumbre expandida de la medición 25% (7.4 ± 1.9) ng/g (95% confianza) corresponde a 5.5 -9.3 ng/g El resultado es aceptable.



Ejemplo 2. Estimación de la incertidumbre de la medición utilizando el método paso-a-paso, y comparación con un método de referencia. Introducción La primera parte de este ejemplo muestra cómo utilizar el método paso a paso para estimar la incertidumbre de la medición. Esto puede ser útil si el método es suficientemente sencillo. En este ejemplo, la mayoría de las fuentes de incertidumbre son de naturaleza física, como el volumen y las lecturas de incertidumbre. La incertidumbre del volumen total de leche y de grasa se calculan por separado. Más adelante, estas incertidumbres se combinan. Otra manera de estimar la incertidumbre, consiste en utilizar los datos de validación de una comparación con un método de referencia. En este caso, es sencillo combinar la incertidumbre del método de referencia con la incertidumbre medida durante la comparación. Este ejemplo se ha tomado de un informe publicado por Acreditación Noruega (10), con unas pequeñas modificaciones. Método de ensayo: Determinación de grasa en leche por el método Gerber. (Método NMKL N° 40 - bajo revisión). Tipo de método: empírico Principio Una cantidad medida de leche se transfiere a un butirómetro (tubo de ensayo especial con una escala calibrada para la lectura directa de g grasa/100 g leche, es decir por ciento de grasa). Se añade ácido sulfúrico y 3/2-metil butanol. La grasa en la muestra se libera mediante agitación y centrifugación. El por ciento de grasa se lee directamente en la escala. Función de medición F = (Vf/0.125)/(Vm/10.73)F = (Vf/0.125)/(Vm/10.73) donde F = contenido de grasa en la leche (en %) Vf = volumen de grasa liberada en la escala del butirómetro (en ml) Vm = volumen de leche añadida (en ml) Según la descripción de trabajo (y la calibración del butirómetro), el volumen de la muestra de leche debe ser 10.73 ml. Así la expresión (Vm/10,73) se reduce a 1. Correspondientemente, el volumen entre dos líneas graduadas con una distancia de 1%, debe ser 0.125 ml en un butirómetro calibrado. Por consiguiente: F = (Vf/0.125)/1 = lectura de la escala



Descripción de trabajo: Los puntos se referidos en el presupuesto de incertidumbre seguirán. 5) Si es necesario, atempere la muestra a 40 ºC en un baño de agua. Voltee el recipiente que contiene la muestra al revés 4-5 veces durante el atemperamiento. 6) Enfríe la muestra a 20 ºC en un baño de agua. 7) Voltee el recipiente con la muestra al revés unas veces, y extraiga una muestra inmediatamente. 8) Añada10 ml de ácido sulfúrico al butirómetro de leche con un dispensador. 9) Transfiera 10.73 ml de leche al butirómetro utilizando una jeringuilla verificada y aprobada. No debe haber ninguna burbuja de aire en la jeringuilla. 10) Añada 1 ml de metil butanol al butirómetro utilizando un dispensador. 11) Inserte el tapón en el butirómetro y agite vigorosamente durante ½ minuto aproximadamente con el tapón apuntando hacia arriba. 12) Luego voltee el butirómetro al revés varias veces para lograr una mezcla homogénea. 13) Sostenga el butirómetro con el tapón hacia abajo y ajuste el tapón hasta que la columna de grasa entre en la escala. 14) Centrifugue el butirómetro durante 7 minutos en un centrífuga con calor. 15) Coloque el butirómetro, con el tapón hacia abajo, en un baño de agua a 65 ºC durante 5 minutos. Ajuste el borde inferior de la columna de grasa con la línea de número entero más próxima de la escala graduada y coloque el butirómetro en el baño de agua durante 1 - 2 minutos. 16) Seque exteriormente el tubo. Rápidamente lea el volumen de grasa al 0.05 porciento más próximo. Utilice el borde inferior del menisco como punto de lectura. Método paso a paso Las operaciones descritas anteriormente cubren los principales pasos del método. En la tabla de abajo, "N°" se refiere a las diferentes operaciones de este método. Algunos de los pasos en la descripción de operaciones (1-4, 13, 17-19) no involucran directamente mediciones de análisis y no se incluyen por consiguiente en la tabla. Se han omitido también los pasos que se considera que no contribuyen a la incertidumbre durante el "uso normal". Los pasos 9 y 16 han sido incluidos dos veces, ya que ellos pueden causar errores de dos tipos, A y B. El paso 15 se ha incluido dos veces porque realmente cubre 2 operaciones de trabajo separadas. Como 1 porciento de grasa corresponde a un volumen de grasa en el butirómetro de 0.125 ml, un volumen de grasa de 1 ml corresponde a un porciento de grasa de 8. Esto se ha tenido en cuenta en el paso 15. Puesto que algunas de las contribuciones a la incertidumbre aparecen como igual a 0 con un número "natural" de decimales, hemos tenido, por esta causa, que verificar de nuevo y utilizar muchos más decimales en este ejemplo.



Descripción de los cálculos Muchos de los pasos del análisis en las operaciones descritas son despreciables, y no se incluyen en los cálculos siguientes. En este caso particular, debemos estar claro sobre el significado de expresiones como "despreciable durante el uso normal". Significa que cualquier error hará que el material de muestra sea imposible de analizar o procesar más allá de la manera normal, y un analista calificado para realizar el ensayo, sería también capaz fundamentalmente de revelar en una fase temprana, que algo está equivocado. El coeficiente de expansión por temperatura para la leche (k1) se asume igual que el del agua:

C/102.1k -41 °⋅= .

The temperature expansion coefficient for milk fat (k2) is:

Cgmmk °= //88.0 32

(H. Mulder, R. Klomp: Neth. Milk. Dairy J., 10, 123 (1956)). La densidad de la grasa es 0.85 g/cm3. Como peso = densidad . volumen, se puede reemplazar "g" en la expresión de k2 con densidad . cm3 = densidad .1000 mm3, quedando el coeficiente así:

CCCmm

mmk °⋅=°⋅

=°⋅

= − /10035.1/100085.088.0/

100085.088.0 3

3

3

2

es decir, 12 5kk ≈

Cálculo de la incertidumbre en el volumen de leche, Vm=10.73 ml Paso 5: Atemperando a 40 ºC Se considera que éste hace una contribución despreciable a la incertidumbre cuando se ha realizado normalmente. Paso 6: Enfriando a 20 ºC Las variaciones en la temperatura, T, debe esperarse que fluctúen dentro de 3 ºC con una confianza de 95%, y con una distribución aproximadamente normal. La incertidumbre asociada a la variación de temperatura de la muestra de leche es por consiguiente:



00337995.02

101.2373.102

41

6 =⋅⋅⋅

=⋅⋅

=−kTV

u m ml

Donde se divide entre 2 para convertir un intervalo de confianza de 95% a una incertidumbre típica. La incertidumbre relativa en % se calcula como sigue:

031500.010073.10

00337995.010066 =⋅=⋅=

mr V

uu %

En los pasos siguientes, no se muestra el cálculo de la incertidumbre relativa. Paso 7: Volteo del recipiente con la muestra Se puede asumir que cualquier error puede ser visto por el ejecutor del ensayo, quienquiera que sea, siendo fácilmente descubierto (aparecen capas diferentes, grumos, etc.) y se comenzaría nuevamente el ensayo. Esto no debe contribuir por consiguiente a la incertidumbre. Paso 8: Adición de 10 ml de ácido sulfúrico El método de ensayo requiere el uso de un equipo que descargue 10,0 ± 0,2 ml a 20 ºC. Sin embargo, errores en este volumen - con tal de que no sean graves - carecen de importancia en la lectura del contenido final de grasa. El ácido sulfúrico se agrega para separar la grasa de la leche; la cantidad de ácido sulfúrico no es crítica. La contribución del ácido sulfúrico a la incertidumbre del cálculo del contenido de grasa, es por consiguiente despreciable. Paso 9: Medición de 10.73 ml utilizando una jeringuilla especial Error tipo A: Dos series-control producen una desviación típica estimada de la lectura en ml, o expresada como incertidumbre relativa: % Error tipo B: El error máximo inherente a la jeringuilla es de 0.03 ml (declarado en el texto del método). Se asume que este error esté distribuido rectangularmente así que la



contribución a la incertidumbre será 01732.0303.0

9 ==bu ml, o expresada como

incertidumbre relativa: 161400.09 =bru %. Incertidumbre combinada de Vm La incertidumbre combinada se calcula sumando las incertidumbres relativas de la manera siguiente:

22229

29

26 161400.0079500.0031500.0 ++=++= brarrrVm uuuu

181116.0=rVmu % Incertidumbre en el volumen de leche, Vm=10.73 ml.

Cálculo de la incertidumbre del volumen de grasa, Vf=0.125 ml, el cual corresponde a 1 porciento de grasa Paso 10: Adición de 1 ml de metil butanol El método de ensayo requiere el uso de un equipo que lea 1.0 ± 0.05 ml a 20 ºC. Sin embargo, al igual que la medición de 10 ml de ácido sulfúrico en el paso 8, éste no tiene real importancia en la lectura final del contenido de grasa. Se considera por consiguiente que la contribución a la incertidumbre es despreciable.

No. Operación Tipo Comentario u, ml u relativa, %

6 Enfriamiento a 20 °C B Con variaciones de temperatura de ±3°C:

0.0033799 0.031500

9a Medición de 10.73 ml de leche utilizando una jeringuilla

A Desviación típica de n repeticiones

0.00814 0.075900

9b Medición de 10.73 ml de leche utilizando una jeringuilla

B Inherente a la jeringuilla: 0,03/ 3

0.01732 0.161400

Incertidumbre combinada relativa, u(Vm=10.73 ml) in %

0.181116



Paso 11: Agitación vigorosa del butirómetro durante ½ minuto aproximadamente Puede ocurrir un grave error, por ejemplo que el tapón sea expulsado durante la agitación, en cuyo caso el analista debe comenzar nuevamente el ensayo. Por consiguiente no se considera que contribuya a la incertidumbre. Paso 12: Volteo del butirómetro Paso 13: Volteo del butirómetro y ajuste del tapón Paso 14: Centrifugación Cualquier error sería tan grave que se manifestaría inmediatamente, implicando recomenzar el ensayo. No se considera por consiguiente que ellos contribuyan a la incertidumbre. Paso 15: El posible error estimado en la temperatura del baño de agua es ± 2°C con una confianza del 95%. La máxima disminución de temperatura durante el tiempo que transcurre desde que la muestra se retira del baño de agua hasta el momento de la lectura se estima que sea de 1°C. Las contribuciones serán entonces:

50.000129372

10035.12125.02

32

15 =⋅⋅⋅

=⋅⋅

=−kTV

u fa ml

y expresada como incertidunbre relativa: 103500.015 =aru %

Para el error en el baño de agua se convierte el intervalo de confianza del 95% a incertidumbre típica. y:

40.0000304923

10035.11125.023

32

15 =⋅⋅⋅

=⋅⋅

=−kTV

u fb ml

y 024395.015 =bru %



Para la disminución de temperatura se convierte la distribución semi-triangular en incertidumbre típica. Paso 16a: La desviación típica del % de grasa 086666.0=s está sustentada en lecturas repetidas (n=20). Esta cifra se convierte en volumen de grasa de acuerdo con la siguiente expresión:

0108325.0125.0086666.0125.016 =×=⋅= lecturau a ml

y 666600.816 =aru %

Paso 16b: La incertidumbre de la exactitud de las lecturas es una distribución rectangular que representa un porciento de la grasa igual a 0.05. La contribución a la incertidumbre se convierte a volumen de grasa según la ecuación siguiente:

0.00360843

125.005.016 =

⋅=bu ml

y 886751.216 =bru %

Incertidumbre combinada de Vf = 0.125 ml (1% grasa) La incertidumbre combinada se calcula sumando las incertidumbres relativas de la siguiente manera:

135349.9216

216

215

215 =+++= brarbrarrVf uuuuu %



Incertidumbre del volumen de grasa, Vf = 0.125 ml (1% grasa)

N° Operación Tipo Comentario U, ml u relativa, %

15a Baño de agua, 5 minutos, 65 oC

B ±2 °C en el baño de agua

0.000129375 0.103500

15b Retirada de la muestra del baño de agua para leer

B Máx. descenso de temperatura de 1 °C

0.000030494 0.024395

16a Incertidumbre de la lectura

A s = 0.086666 % grasa calculado en volumen

0.010833250 8.666600

16b Error del butirómetro B 0.05 % grasa calculado en volumen

0.003608439 2.886751

Incertidumbre combinada relativa, u(Vf = 0,125 ml) en %

9.135349

Incertidumbre combinada de Vf = 1 ml (8% grasa) Los cálculos se efectúan como se ha descrito arriba. La incertidumbre combinada relativa es 1.1467819 %.

Incertidumbre del volumen de grasa, Vf = 1 ml (8% grasa) N° Operación Tipo Comentario u, ml u relativa,

% 15a Baño de agua, 5

minutos, 65 oC B ±2 °C en el baño

de agua 0.001035000 0.103500



0.000243952 0.024395



0.010833250 1.083325


0.003608439 0.3608439



Incertidumbre combinada relativa, u(Vf = 0,125 ml) en %

1.1467819

Incertidumbre combinada y expandida para el procedimiento completo La incertidumbre combinada se calcula según sigue:

22VfVmrtot uuu +=

Y la incertidumbre expandida relativa rtotrel uU ×= 2

La tabla de abajo contiene el resultado de los cálculos basado en 1 y 8 porciento de grasa. Una incertidumbre absoluta de la medición de 0.18% de grasa puede lograrse para contenidos entre 1 y 8% de grasa.

Incertidumbre para la determinación del porciento de grasa según Gerber. % Grasa

Incertidumbre combinada relativa, urtot, %

Incertidumbre expandida relativa, urtot, %

Incertidumbre absoluta, U, % grasa

1 9.14 18.3 0.183

8 1.16 2.32 0.186

Elevando al cuadrado las incertidumbres relativas y luego dividiendo las contribuciones respectivas entre la suma de éstas, se halla el aporte respectivo en la incertidumbre combinada de la medición.



Contribución de las respectivas fuentes de incertidumbre a la incertidumbre total de la medición, en % N° Operación Tipo Comentario 1% grasa 8% grasa

6 Enfriamiento a 20 °C B Con variaciones de temperatura de ±3°C:

0.001 0.074

9a Medición de 10.73 ml de leche utilizando una jeringuilla

A Desviación típica de n repeticiones

0.007 0.427

9b Medición de 10.73 ml de leche utilizando una jeringuilla

B Inherente a la jeringuilla: 0,03/ 3

0.031 1.933

15a Baño de agua, 5 minutos, 65 oC

B ±2 °C en el baño de agua

0.013 0.795



0.001 0.044



89.966 87.067


9.982 9.660

Incertidumbre combinada relativa

100 100

La tabla muestra que las fuentes más grandes de incertidumbre están en los pasos lejanos 16a y 16b, es decir, la incertidumbre de la lectura del butirómetro y la exactitud de la lectura. Determinación de grasa en leche según el método Gerber. Método directo (análisis paralelo con un método de referencia):



Para estimar la incertidumbre, también es posible realizar un análisis en paralelo con muestras utilizando un método de referencia; el resultado de este método se define como "valor verdadero" (método de definición). No es necesario considerar el efecto de la matriz ya que la misma muestra se analiza por ambos métodos. La tabla de abajo presenta los resultados de los ensayos de muestras de leche semi-descremada utilizando el método Gerber y el método de definición.



N° Marca de la

muestra % Grasa Gerber

% Grasa Referencia

Diferencia % Grasa

1 03.11.94 1.15 1.23 -0.08 2 03.11.94 1.58 1.50 0.08 3 15.03.95 1.45 1.41 0.04 4 20.04.95 1.50 1.51 -0.01 5 26.04.95 1.48 1.46 0.02 6 23.05.95 1.48 1.45 0.03 7 11.08.94 1.93 1.83 0.10 8 03.11.94 1.70 1.64 0.06 9 10.01.95 1.38 1.44 -0.06 10 21.01.95 1.50 1.53 -0.03 11 20.04.95 1.65 1.68 -0.03 12 26.04.95 1.58 1.58 0.00 13 23.05.95 1.50 1.50 0.00 14 12.01.96 1.65 1.63 0.02 15 25.01.96 1.48 1.50 -0.02 16 25.01.96 1.30 1.33 -0.03 17 08.02.96 1.43 1.44 -0.01 18 08.02.96 1.53 1.52 0.01 19 24.05.96 1.70 1.66 0.04 20 24.05.96 1.50 1.48 0.02 21 07.06.96 1.55 1.53 0.02 22 07.06.96 1.70 1.73 -0.03 23 04.07.96 1.45 1.45 0.00 24 22.06.96 1.58 1.61 -0.03 25 22.06.96 1.53 1.57 -0.04 26 27.07.96 1.58 1.58 0.00 27 27.07.96 1.48 1.48 0.00 28 29.09.96 1.45 1.45 0.00 29 29.09.96 1.44 1.50 -0.06 30 15.12.96 1.60 1.67 -0.07 31 15.12.96 1.35 1.39 -0.04 32 12.01.96 1.48 1.45 0.03 33 08.02.96 1.48 1.46 0.02 34 08.02.96 1.40 1.39 0.01 35 12.04.96 1.55 1.57 -0.02 36 07.06.96 1.60 1.65 -0.05 37 07.06.96 1.33 1.37 -0.04 38 07.06.96 1.80 1.80 0.00 39 12.08.96 1.28 1.26 0.02 40 11.10.96 1.40 1.38 0.02 41 11.10.96 1.50 1.44 0.06 Media 1.512 1.513 -0.00122 SD 0.03964



Estos datos proporcionan una buena estimación de la incertidumbre de la medición cuando el método Gerber se utiliza para análisis de productos similares (es decir, los productos lácteos líquidos, dulces, con un contenido de grasa entre 1-7%). Primeramente, se observa que la diferencia media entre los "valores verdaderos" y los resultados de ensayo son prácticamente igual a cero. Esto significa que no hay ningún error sistemático que necesite ser considerado y corregido al calcular la incertidumbre.

Así es posible calcular una incertidumbre expresada como una desviación típica basada en las diferencias, usualmente:

039636.0=Gerberu % grasa Además, se tiene la incertidumbre (en este caso, la precisión) de los resultados del método de referencia (método de definición). Esta puede calcularse en base al resultado de un estudio colaborativo, el cual es referido en la descripción del método (requisito para la aprobación como norma internacional): El parámetro de precisión reproducibilidad se calcula en base a datos a partir del uso del método de referencia en varios laboratorios y se define como:

R = 2.8 . SR

Donde SR es la desviación típica de la reproducibilidad. En el método de referencia, se aplica lo siguiente: R = 0.03 % grasa Es posible, por consiguiente, calcular una incertidumbre expresada como una desviación típica del resultado de referencia basado en lo siguiente:

01071.08.2

03.08.2Re ====

RSu Rf % grasa

Dando así una incertidumbre total de

04106.001071.0039636.0 222Re

2 =+=+= fGerbertot uuu % grasa

y con un factor de cobertura de k = 2:



082.004106.022 =⋅=⋅= totuU % grasa Esta incertidumbre de la medición es más pequeña que la incertidumbre calculada utilizando el método paso a paso. Esto probablemente puede explicarse por el hecho de que cuando el analista hizo la comparación con el método de referencia, realizó tres mediciones repetidas que dieron valores de 1.48 y 1.53. Tales valores no pueden obtenerse en un análisis de la muestra dónde sólo es posible leer el % de grasa con una aproximación de 0.05. Debido a que la mayor fuente de incertidumbre es la desviación típica de la lectura (paso 16a), sería más pertinente en el método paso a paso, hacer los cálculos partiendo de la desviación típica del valor medio basado en tres mediciones, según SEM:

0.006254587320508.1

010833250.0===

nSDSEM ml

Esta presunción produce una incertidumbre expandida de la medición de 0.12 % de grasa por el método paso a paso, que es más próxima al 0.082 % de grasa reportado por el método directo.

Figura 2. Fuentes de incertidumbre del método Gerber.



REFERENCIAS 1. Guía para la Expresión de la Incertidumbre de la Medición. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement, ISO, 1 ed. 1993, ISBN 92-67-10188-9. 2. Cuantificación de la Incertidumbre en Mediciones Analíticas. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, 2nd Edition EURACHEM/CITAC Guide, QUAM:2000.P1, 2000, Internet: http://www.eurachem.bam.de/guides/quam.htm 3. E. Hund, D.L. Massart, J. Smeyers-Verbeke, Definiciones operacionales de la incertidumbre, tendencias en la química analítica. Operational definitions of uncertainty, trends in analytical chemistry, vol. 20, no. 8, 2001. 4. Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories, ISO/IEC 17025:1999(E), 1999. 5. Vocabulario Internacional de términos estándares básicos y generales en Metrología. International Vocabulary of basic and general standard terms in Metrology. 1993, ISBN 92-67-10175-1. 6. Incertidumbre de la medición – un concepto confiable en análisis de alimentos y para el uso de información de recobrado? Measurement uncertainty - a reliable concept in food analysis and for the use of recovery data? Paul Willetts, Roger Wood, Accred Qual Assur (1998) 3:231-236. 7. NMKL PROCEDURE N° 3 (1996) Gráficos de control y materiales de control en el control interno de la calidad en laboratorios químicos de alimentos. Control charts and control materials in internal quality control in food chemical laboratories. 8. EAL-G23, La expression de la incertidumbre en ensayos cuantitativos, la nueva referencia oficial es EA-3/02, Internet: http:// www.european-accreditation.org. The expression of uncertainty in quantitative testing, new official reference is EA-3/02, Internet: http:// www.european-accreditation.org. 9. NMKL Procedure No. 9, 2nd Ed. (2002) Evaluación de resultados a partir de ensayos de materiales de referencia certificados. Evaluation of results derived from the analysis of certified reference materials.



10. Informe del comité sectorial P4, Acreditación Noruega. Måleusikkerhet for kjemiske analyser, report from the sector committee P4, Norwegian Accreditation. 11. Calculando desviaciones típicas e intervalos de confianza mediante una técnica con hoja de cálculo electrónica, de aplicación universal. Calculating standard deviations and confidence intervals with a universally applicable spreadsheet technique, J. Kragten, Analyst, 1994, 119, 2161-2166.



APENDICE 1. COMO UTILIZAR LA PLANTILLA DE EXCEL El archivo puede descargarse de la página web de NMKL, www.nmkl.org. Contiene una plantilla para calcular la incertidumbre combinada sumando las diferentes componentes de incertidumbre. Se creó en Microsoft Excel. El proceso operativo se basa en un método de aproximación por diferenciación numérica. Se describe en el documento de Eurachem, y está basado en (11). Los únicos elementos necesarios para poder usar la plantilla son, la expresión matemática del mesurando (y), y el tamaño (el valor) y la incertidumbre típica (u(x)) de las mediciones incluidas. Además, es necesario estar familiarizado con la operación de fórmulas en Excel. La plantilla puede operar un máximo de 15 componentes, las cuales son suficientes en la mayoría de los casos. Por supuesto, es posible modificar la plantilla para operar con más componentes. Si tal modificación fuera necesaria, es importante que se lleve a cabo por alguien que conozca exactamente cómo se realizan los cálculos, y que sea un usuario experimentado de Excel, para evitar los riesgos de introducir errores en la plantilla. La plantilla contiene el ejemplo en texto azul para ilustrar donde deben entrarse los diferentes elementos y valores de texto. La mayoría de las otras celdas contienen fórmulas que no deben modificarse. A continuación se describe paso a paso cómo utilizar la plantilla.

• Inicie Excel y abra el archivo "Incertidumbre combinada de la medición NMKL 2003.xls."

• Entre un título conveniente en la celda A1. • Entre las denominaciones de las mediciones en la fila 3 (celdas C3 a Q3),

los valores en la fila 4, y las incertidumbres típicas, u, en la fila 5. • Entre la fórmula para calcular el mesurando en la celda B21 entrando las

referencias relativas a los valores de las mediciones en la columna B (B6 a B20). La figura 1 muestra cómo se entra una fórmula para calcular una suma para micotoxinas.

• Entonces copie esta fórmula en cada columna a la derecha y en la misma fila hasta la columna Q (arrastre la celda por la esquina inferior derecha con el ratón). La figura 2 ilustra cómo esto se puede apreciar. Ahora se calcula lo siguiente: Diagonalmente de la celda C6 hacia abajo y a la derecha hasta la celda Q20, se suman las incertidumbres de la medición de cada componente. La fila 22 de la columna B da al resultado sin la incertidumbre, y las columnas a la derecha, muestran los resultados con la incertidumbre de la medición añadida a cada componente a la vez. La desviación con la incertidumbre se visualiza en la fila 23. En la fila 24, estas desviaciones se elevan al cuadrado, y la celda B24 contiene la suma de estos cuadrados. Las filas 25 y 26 contienen los datos del aporte proporcional de cada componente con relación a la incertidumbre total de



la medición. Esto también puede presentarse gráficamente, por ejemplo en la figura 3. La celda B26 contiene la incertidumbre total de la medición.

• Salve el archivo con un nombre diferente, protegido contra escritura. Si se correlacionan dos componentes, la expresión siguiente debe añadirse a la suma en la celda B23:

)2,()1,(2 yuyur ⋅⋅⋅

donde r es el coeficiente de correlación para las dos componentes, y u(y,1) y u(y,2) son las incertidumbres que las respectivas componentes dan al mesurando y. Los valores de u(y,1) y u(y,2) se obtienen entrando una referencia relativa a la respectiva fuente de incertidumbre que se calcula en la fila 22.



Figura 1. Entrar la fórmula en la celda B21 para calcular la incertidumbre combinada de la medición de micotoxinas, la cual se reporta como una suma.

Figura 2. Cuando la fórmula se copia a la derecha, se completa el cálculo.



Uncertainty

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

B1

B2

G1

G2

Com

pone

nt

Contribution

Figura 3. Presentación gráfica de la distribución del tamaño de componentes. Título del gráfico: Incertidumbre. Eje de las abscisas (x): Contribución. Eje de las ordenadas (y): Componente.

PROCEDIMIENTO NMKL Estimación y expresión de la ... · dependen de los efectos sistemáticos (por...

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