Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek · 1.2. Genetika alkoholizma Poznato je da na...

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek

Marijo Jevtić

Polimorfizam gena GABRA2 u alkoholizmu

Diplomski rad

Zagreb, 2011. godina

Ovaj rad, izrađen na Institutu Ruđer Bošković, Zagreb, u Laboratoriju za molekularnu

neurofarmakologiju pod vodstvom dr.sc. Dubravke Švob Štrac, znanstvene suradnice IRB,

predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u

Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra eksperimentalne biologije.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu

Prirodoslovno-matematički fakultet

Biološki odsjek Diplomski rad

POLIMORFIZAM GENA GABRA2 U ALKOHOLIZMU

Marijo Jevtić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb

Alkoholizam predstavlja čest i kompleksan kronični poremećaj s brojnim genetskim i

okolišnim čimbenicima rizika. Receptori za -amino-maslačnu kiselinu (GABA) tipa A igraju

značajnu ulogu u akutnim i kroničnim učincima alkohola, uključujući pojavu tolerancije,

ovisnosti i ustezanja. Dosadašnja istraţivanja upućuju na povezanost gena za 2 podjedinicu

GABAA receptora (GABRA2) s ovisnošću o alkoholu. Cilj ovog istraţivanja bio je ispitati

povezanost polimorfizma rs279858, smještenog unutar središnje regije gena GABRA2, s

alkoholizmom i povezanim ponašanjima, poput pušenja, početka konzumacije alkohola,

suicidalnog i agresivnog ponašanja. Istraţivanje je obuhvatilo 335 osoba ovisnih o alkoholu i

230 zdravih ispitanika hrvatskog podrijetla koji su genotipizirani pomoću RT-PCR metode.

Iako rezultati nisu pokazali značajnu razliku u distribuciji genotipova i alela između

alkoholičara i kontrolnih ispitanika, unutar skupine alkoholičara dokazana je povećana

frekvencija alela T i genotipa TT kod suicidalnih u odnosu na nesuicidalne ispitanike.

Također je dokazano postojanje visoko konzerviranog haplotipskog bloka unutar 3’ regije

gena GABRA2, no ne i povezanost ovog bloka s alkoholizmom. Daljnja istraţivanja potrebna

su da bi se razjasnila povezanost gena GABRA2 s alkoholizmom, kao i primjećena

povezanost polimorfizma rs279858 sa suicidalnim ponašanjem.

(41 stranica, 18 slika, 17 tablica, 80 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjiţnici

Ključne riječi: alkohol; ovisnost; GABAA receptor; genetika; biljeg; rs279858; haplotip

Voditelj: dr.sc. Dubravka Švob Štrac, znanstvena suradnica IRB

Suvoditelj: Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, PMF

Ocjenitelji: Doc.dr.sc. Damjan Franjević, PMF

Rad prihvaćen: 11.siječnja 2012.

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb

Faculty of Science

Division of Biology Graduation thesis

GABRA2 GENE POLYMORPHISM IN ALCOHOLISM

Marijo Jevtić

Rooseveltov trg 6, 10 000 Zagreb

Alcoholism is a frequent and complex chronic disorder with a numerous genetic and

environmental risk factors. -aminobutyric acid (GABA) A receptors play a significant role in

the acute and chronic effects of alcohol, including tolerance, dependence and withdrawal.

Recent studies have suggested an association of the GABAA receptor 2 subunit gene

(GABRA2) with alcohol dependence. The aim of this study was to examine the association of

marker rs279858, located in the central region of GABRA2 gene, with alcoholism and

alcoholism-related behaviour, namely smoking, age of drinking onset, suicide attempt and

aggressive bahaviour. The study included 355 alcohol-dependent patients and 230 healthy

subjects, which were genotyped using the RT-PCR method. Although the results

demonstrated no significant differences in the frequencies of genotypes and alleles between

alcohol-dependent and control individuals, the patients with alcohol dependence who

attempted suicide had significantly higher frequency of T allele, as well as TT genotype in

relation to nonsuicidal alcoholics. Our results also confirmed the existence of highly

conserved haplotype block within the 3’ region of GABRA2 gene, however no haplotypic

association of this block and alcoholism was demonstrated. Further studies are needed to

elucidate the association of GABRA2 gene with alcoholism, as well as to explore the

observed association of marker rs279858 with suicidal behaviour.

(41 pages, 18 figures, 17 tables, 80 references, original in Croatian)

Thesis deposited in Central biological library

Keywords: alcohol; GABAA receptor; genetics; marker; rs279858; haplotype

Supervisor: Dubravka Švob Štrac, PhD, Research Associate, IRB

Co-supervisor: Asst. Prof. Domagoj Đikić, PhD, PMF

Reviewers: Asst. Prof. Damjan Franjević, PhD, PMF

Thesis accepted: January 11th

2012.

POPIS KRATICA

ABI – Applied Biosystems

ACD – dekstroza citratne kiseline (acid citrate dextrose)

ADH – alkohol-dehidrogenaza

ANOVA – jednostruka analiza varijance (one-way analysis of variance)

COGA - Collaborative Study on the Genetics of Alcoholism

dH2O – destilirana voda

DNA – deoksiribonukleinska kiselina

DSM-III - Diagnostic and Statistic Manual of Mental Disorders, 3rd. Edition

DSM-IV - Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th. Edition

EDTA – etilen-diamin-tetraoctena kiselina

EEG – elektroencefalogram

EtOH – etanol

FRET – energetski transfer tipa Förster (Förster-type energy transfer)

GABA - -amino-maslačna kiselina

GABRA1, GABRA2, GABRA5, GABRA6, GABRB1, GABRB2, GABRB3, GABRG1,

GABRG2 - geni za podjedinice GABAA receptora

HRSD - Hamilton Rating Scale for Depression

HWE – Hardy-Weinbergova ravnoteţa (Hardy-Weinberg equilibrium)

LD – neravnoteţa udruţivanja (linkage disequilibrium)

MGB – ligand manjeg utora DNA (minor groove binder)

mRNA – glasnička ribonukleinska kiselina

NAC – nucleus accumbens

NCBI – National Center for Biotechnology Information

NFQ – nefluorescencijski prigušivač (nonfluorescent quencher)

PCR – lančana reakcija polimerazom (polymerase chain reaction)

PFC – prefrontalni korteks

PTSP – posttraumatski stresni poremećaj

PŢS – periferni ţivčani sustav

RCLB – pufer za lizu eritrocita (red cell lysis buffer)

RPM – okretaj u minuti (rotation per minute)

RT-PCR – lančana reakcija polimerazom u stvarnom vremenu (real time polymerase chain

reaction)

SCID – strukturirani klinički intervju (Structured Clinical Interview)

SDS – natrij-dodecil sulfat

SE pufer – natrij-EDTA pufer

SNP – polimorfizam jednog nukleotida (single nucleotide polymorphism)

SŢS – središnji ţivčani sustav

TE pufer – tris-EDTA pufer

VTA – ventralno tegmentalno područje

WHO – Svjetska zdravstvena organizacija (World Health Organisation)

SADRŽAJ 1. UVOD ............................................................................................................................1

1.1. Alkoholizam ...........................................................................................................1

1.2. Genetika alkoholizma ..............................................................................................2

1.3. Uloga GABA sustava u djelovanju alkohola ............................................................3

1.4. Alkoholizam, mezolimbički dopaminski put i GABA sustav ...................................5

1.5. Prilagodba GABAA receptora dugotrajnim djelovanjem alkohola ............................6

1.6. Geni za podjedinice GABAA receptora i alkoholizam ..............................................8

1.7. Polimorfizmi GABRA2 gena i alkoholizam .......................................................... 10

2. Cilj istraživanja ............................................................................................................. 11

3. Materijali i metode ........................................................................................................ 12

3.1. Ispitanici ............................................................................................................... 12

3.2. Izolacija DNA iz krvi ............................................................................................ 14

3.3. OdreĎivanje genotipova ........................................................................................ 15

3.4. Statistička obrada podataka ................................................................................... 20

4. REZULTATI ................................................................................................................ 21

4.1. Informacije o ispitanicima ..................................................................................... 21

4.2. Genotipiziranje...................................................................................................... 22

4.2.1 Analiza raspodjele ispitanika prema spolu ..................................................... 22

4.2.2 Analiza ispitanika prema pušačkom statusu ................................................... 24

4.2.3 Analiza raspodjele ispitanika ovisnih o alkoholu............................................ 26

4.2.4 Analiza haplotipskog bloka polimorfizama rs567926 i rs279858 ................... 29

5. RASPRAVA ................................................................................................................. 31

6. ZAKLJUČAK............................................................................................................... 34

7. LITERATURA ............................................................................................................. 35

1

1. UVOD

1.1. Alkoholizam

Alkoholizam predstavlja naviku ili ovisnost o unošenju prekomjernih količina

alkoholnih pića. Karakterizira ga prinudna i nekontrolirana konzumacija alkohola koja dovodi

do štetnih utjecaja na zdravlje pojedinca, te na njegov socijalni i ekonomski status. Termin

alkoholizam koji je 1849. godine skovao Magnus Huss, zamijenjen je u medicini 80-ih

godina, prema tadašnjim DSM-III (eng. Diagnostic and Statistic Manual of Mental

Disorders) kriterijima, izrazima „zloupotreba alkohola“ i „ovisnost o alkoholu“ [1]. Svjetska

zdravstvena organizacija (eng. World Health Organisation, WHO) procjenjuje da na svijetu

trenutno postoji oko 140 milijuna alkoholičara [2], dok se u europskoj populaciji alkoholizam

javlja sa učestalošću izmeĎu 2 i 12% [3].

Alkoholizam karakteriziraju prekomjerna konzumacija alkohola, pojava tolerancije i

simptoma ustezanja, te nemogućnost osobe da kontrolira kompulzivno opijanje usprkos

svjesnosti o štetnosti po njegovo zdravlje [4]. Kao posljedica alkoholizma javljaju se brojni

medicinski i psihijatrijski poremećaji [5]. Naime, dugotrajna zloupotreba alkohola može

izazvati brojne zdravstvene posljedice, uključujući cirozu jetre, pankreatitis, epilepsiju,

alkoholnu demenciju, povećan rizik od nastanka kardiovaskularnih bolesti, poremećaje u

prehrani, seksualnu disfunkciju, rak, brojna oštećenja SŽS-a i PŽS-a, te u konačnici može

dovesti i do smrti [6]. Nadalje, čak oko 25% alkoholičara pati od nekog psihijatrijskog

poremećaja. Najčešći psihijatrijski poremećaji čija je pojava zamijećena zajedno s

alkoholizmom uključuju u prvom redu anksioznost i depresiju [7]. Osim anksioznosti i

depresije, žene alkoholičari najčešće imaju dodatne psihijatrijske dijagnoze kao što su napadi

panike, bulimija, PTSP ili granični poremećaj ličnosti, dok muškarci ovisni o alkoholu često

pokazuju simptome narcisoidnog ili antisocijalnog poremećaja ličnosti, bipolarnog

poremećaja, shizofrenije, impulzivnog ponašanja, manjka koncentracije, te hiperaktivnosti

[8].

Društveni problemi koji proizlaze iz alkoholizma takoĎer su ozbiljni. Zloupotreba

alkohola povezana je sa povećanim rizikom kriminalnih radnji, uključujući zlostavljanje

djece, obiteljsko nasilje, silovanje, pljačku i napade [9]. Alkoholizam je često povezan i sa

gubitkom zaposlenja, što dovodi do financijskih problema [10]. Ponašanje alkoholičara i

oslabljeno rasuĎivanje u pijanom stanju mogu imati duboki utjecaj na osobe koje ga okružuju,

2

dovesti do izolacije od obitelji i prijatelja, izazvati probleme u braku i razvod, te doprinijeti

nasilju u obitelji ili zapostavljanju djece što može imati dugotrajne posljedice na njihov

emocionalni razvoj [11].

Dokazano je da rizični čimbenici za razvoj alkoholizma uključuju društveno okruženje,

stres, mentalno zdravlje, genetsku predispoziciju, dob, spol i etničku skupinu. Manjak potpore

obitelji i vršnjaka ili ozbiljnija trauma u djetinjstvu takoĎer su povezani sa povećanim rizikom

od nastanka alkoholizma [12]. TakoĎer je pokazano da su u usporedbi s muškarcima, žene

osjetljivije na fizičke i mentalne učinke alkohola, ponajviše zbog metaboličkih i hormonalnih

čimbenika [13].

Iako je poznato da su razvoj tolerancije i fizičke ovisnosti nakon dugotrajne zloupotrebe

alkohola rezultat fizioloških promjena u mozgu koje stvaraju prinudnu nemogućnost da se

prestane piti i rezultiraju sindromom ustezanja nakon prekida konzumacije alkohola, biološki

mehanizmi koji objašnjavaju nastanak alkoholizma nisu u potpunosti razjašnjeni.

1.2. Genetika alkoholizma

Poznato je da na rizik od nastanka alkoholizma utječe kompleksno meĎudjelovanje

genetskih i okolišnih čimbenika. Istraživanja provedena na blizancima pokazala su da se sve

vrste ovisnosti općenito nasljeĎuju izmeĎu 40% i 70%, dok genetička predispozicija za

nastanak alkoholizma iznosi oko 50% [14]. Iz toga proizlazi da genetska podloga i okolišni

čimbenici imaju podjednak utjecaj na razvoj alkoholizma, iako taj odnos varira izmeĎu

različitih populacija u svijetu. Naime, poznato je da izmeĎu različitih populacija u svijetu

postoje genetske razlike koje utječu na rizik nastanka ovisnosti o alkoholu [15].

Postoje, primjerice, razlike izmeĎu odreĎenih grupa naroda u načinu na koji

metaboliziraju alkohol. OdreĎeni aleli za alkohol-dehidrogenazu (ADH), enzim koji je

primaran u metabolizmu alkohola, uzrokuju bržu razgradnju alkohola i brže nakupljanje

toksičnih nusprodukata metabolizma (acetaldehid), zbog čega takve osobe imaju teže

simptome opijanja i duže se oporavljaju, čime se smanjuje rizik od nastanka alkoholizma.

Takve alele posjeduju ljudi afričkog porijekla i neka indijanska plemena u Americi, te je

dokazano da osobe s ovim alelima imaju smanjeni rizik od razvoja alkoholizma [15]. Slična

stvar je i kod azijskih populacija, kod kojih odreĎena varijacija enzima aldehid-

dehidrogenaze, koji je odgovoran za razgradnju toksičnih nusprodukata metabolizma

alkohola, uzrokuje sporiju razgradnju tih produkata i samim time produženo vrijeme oporavka

3

od opijanja [16]. MeĎutim, ovi genetski čimbenici samo djelomice objašnjavaju različite stope

ovisnosti o alkoholu izmeĎu različitih populacija.

Činjenica da u slučaju alkoholizma ne postoji jednostavan obrazac nasljeĎivanja

upućuje na meĎudjelovanje brojnih gena kao i na složenu interakciju izmeĎu gena i okoliša.

Za razliku od drugih supstanci koje izazivaju ovisnost i imaju vrlo specifično djelovanje,

alkohol ima široko djelovanje u cijelom mozgu, te djeluje na više različitih ciljeva smještenih

u staničnim membranama i uključenih u unutarstanični prijenos signala, uključujući receptore

za neurotransmitore i neurohormone, te ionske kanaliće [17]. Stoga je identifikacija gena koji

utječu na rizik razvoja ovisnosti o alkoholu izuzetno teška i zahtjevna. Smatra se da su za

genetsku predispoziciju za razvoj alkoholizma vjerojatno odgovorni brojni geni koji imaju

relativno skromne učinke u mnogim neurotransmitorskim sustavima i putovima prijenosa

signala.

Zaista, iako su sve do nedavno jedini geni za koje je utvrĎeno da utječu na rizik

razvoja alkoholizma bili oni koji su kodirali enzime uključene u metabolizam alkohola, danas

je primjenom novih metoda pokazana povezanost i drugih gena s ovim poremećajem,

uključujući gene dopaminskog, GABA, glutamatnog, opioidnog, kolinskog i serotoninskog

neurotransmitorskog sustava [18].

1.3. Uloga GABA sustava u djelovanju alkohola

Brojni dokazi upućuju da GABA sustav ima posebnu ulogu u djelovanju alkohola na

mozak. Alkohol mijenja ravnotežu izmeĎu -amino-maslačne kiseline (GABA), glavnog

inhibicijskog neurotransmitera, i glutamata, glavnog ekscitacijskog neurotransmitora u

središnjem živčanom sustavu sisavaca. Smatra se da su GABAA receptori uključeni u brojne

akutne i kronične učinke alkohola, uključujući sedaciju, anksiolizu, poremećaj motoričke

koordinacije, kao i pojavu tolerancije, ovisnosti i ustezanja. Naime osim GABA-e, putem

GABAA receptora djeluje i velik broj različitih strukturno nesrodnih supstanci, kao što su

benzodiazepini, barbiturati, anestetici, endogeni neurosteroidi, te alkohol [19](Slika 1).

GABAA receptori su heterooligomerni transmembranski glikoproteini, sastavljeni od 5

podjedinica koje formiraju centralnu poru ionskog kloridnog kanalića [20]. Aktivacija ovih

receptora uslijed vezanja GABA-e omogućava ulazak iona Cl- u stanicu i povećanje njihove

unutarstanične koncentracije, što dovodi do hiperpolarizacije neurona, nemogućnosti

stvaranja akcijskog potencijala i prekida signala. Na taj način ovi ionotropni receptori

4

posreduju brzu sinaptičnu inhibiciju [19]. Do danas je poznato 19 različitih mogućih

podjedinica (α1-6, β1-3, γ1-3, ε, π, θ, ρ1-3) koje mogu ući u sastav GABAA receptora. Veliki

broj podjedinica upućuje na ogroman broj mogućih podtipova receptora, meĎutim, u

stvarnosti mali broj kombinacija čini većinu GABAA receptora, od kojih su najčešće: α1β2γ2

(60%), α2β2γ2 (15%) i α3β3γ2 (10%) [21]. Sastav podjedinica receptora razlikuje se s obzirom

na smještaj GABAA receptora u mozgu, kao i na stupanj razvoja mozga.

Slika 1. GABAA receptor s mjestima djelovanja različitih supstanci (prilagoĎena slika sa interneta:

http://bernirey80.files.wordpress.com/2007/12/gaba_receptor.gif)

Kombinacija podjedinica unutar receptora utječe u velikoj mjeri i na farmakološka i

funkcionalna (elektrofiziološka) svojstva tog receptora [22]. Rezultati su pokazali da su

aminokiselinski ostaci serin-270 i alanin-291 1 podjedinice esencijalni ne samo za vezanje

alkohola već i za alkoholom-inducirane konformacijske promjene unutar GABAA receptora

[23, 24]. MeĎutim, ova istraživanja koristila su vrlo visoke koncentracije alkohola i do sada

nema jasnih dokaza da se alkohol veže za GABAA receptore u fiziološkim koncentracijama.

Mnogi bihevioralni učinci alkohola rezultat su pojačanja GABAergične

neurotransmisije, iako točan mehanizam na koji alkohol pojačava GABA odgovore ostaje

nepoznat. Nedavna istraživanja su pokazala da u nekoliko moždanih regija uključujući mali

http://bernirey80.files.wordpress.com/2007/12/gaba_receptor.gif

5

mozak i mezolimbički put nagrade, alkohol može pojačavati GABAergičnu transmisiju

djelovanjem na pre- i post-sinaptične GABAA receptore putem složenih mehanizama [25, 26].

Učinci alkohola mogu biti potencirani agonistima GABAA receptora, odnosno smanjeni

antagonistima i inverznim agonistima [27].

Pojedina istraživanja utvrdila su takoĎer razvoj križne tolerancije izmeĎu alkohola,

benzodiazepina i barbiturata [28]. Ova križna tolerancija, zajedno s djelotvornošću

benzodiazepina u liječenju i anksioznosti i ustezanja od alkohola, upućuje da GABAA

receptori vjerojatno igraju važnu ulogu u podložnosti alkoholizmu i anksioznosti, posebice u

mezolimbičkom dopaminskom putu nagrade i moždanim strukturama uključenim u odgovor

na stres [29].

1.4. Alkoholizam, mezolimbički dopaminski put i GABA sustav

Kao i ostale ovisnosti i alkoholizam je usko povezan s dijelom mozga koji se naziva

mezolimbički dopaminski sustav ili „put nagrade“. OdreĎeni oblici ponašanja aktiviraju ovaj

sustav, čime se stvara osjećaj zadovoljstva, odnosno „nagrade“. Ovaj put aktiviraju prirodni

stimulansi, kao što su hrana, voda, seks ili majčina njega, ali i umjetni kao što su alkohol i

droge. Ponovljena stimulacija ovog sustava stvara osjećaj euforije koji osobe žele ponovno

iskusiti. Evolucijski gledano, „put nagrade“ nam omogućava da se osjećamo ugodno kada

činimo stvari koje su bitne za naše preživljavanje, kao što su hranjenje i razmnožavanje. Ovaj

put povezan je sa različitim područjima u mozgu koja omogućavaju prikupljanje vanjskih

informacija (dobivenih iz naših osjetila), što dodatno pojačava i kontrolira željeno ponašanje

[30].

Ovaj „put nagrade“ započinje u ventralnom tegmentalnom području (VTA) srednjeg

mozga i nastavlja se dalje u nucleus accumbens (NAC), limbički sustav i prefrontalni korteks

(PFC) (Slika 2.). U VTA se otpušta dopamin, koji je primarni neurotransmitor ovog sustava,

dok NAC sadrži neurone koji su osjetljivi na dopamin. Amigdala i hipokampus (limbički

sustav) igraju ulogu u memoriji i odreĎivanju da li je iskustvo zadovoljavajuće, dok PFC

koordinira sve informacije i odreĎuje ponašanje. Iako brojne droge i alkohol djeluju na

različite načine i u različitim regijama mozga, sve u konačnici rezultiraju povećanom

sinaptičnom koncentracijom dopamina u putu nagrade. MeĎutim, ono je popraćeno i s

kompleksnim promjenama u brojnim drugim neurotransmitorima, uključujući i GABA-u [31].

GABAA receptori smješteni u amigdali su vjerojatno uključeni u samo-administraciju

alkohola u glodavaca [32]. Iako GABAergične projekcije dolaze u VTA iz različitih regija,

6

uključujući i NAC, primarnu inhibicijsku regulaciju dopaminskih neurona vrše GABA

interneuroni unutar VTA. Najčešće podjedinice GABAA receptora eksprimirane u VTA su 2,

3, 4, 1, 3 i 2 [33]. Akutno izlaganje alkoholu pobuĎuje dopaminske neurone u putu

nagrade izravno, ali i neizravno smanjujući brzinu okidanja GABA neurona u VTA. S druge

strane kronično izlaganje alkoholu pojačava aktivnost GABA neurona i inducira toleranciju

na alkoholnu inhibiciju brzine okidanja neurona [34].

Slika 2. Dopaminski put nagrade i povezane strukture (slika sa intreneta:

http://drugabuse.gov/pubs/teaching/teaching2/largegifs/slide11.gif)

1.5. Prilagodba GABAA receptora dugotrajnim djelovanjem alkohola

OdreĎene prilagodbe GABAA receptora primijećene su za vrijeme kronične

konzumacije alkohola, kao i nakon njenog prekida. Primijećene promjene prvenstveno

uključuju promjene u ekspresiji gena za pojedine podjedinice GABAA receptora, promjene u

raspodjeli i broju GABAA receptora na staničnoj membrani, te promjene u funkciji receptora

[29, 35, 36].

Naime, dosadašnja istraživanja na životinjskim modelima i ljudskim postmortalnim

uzorcima mozga potvrdila su da dugotrajna upotreba alkohola, te nagli prekid njegove

konzumacije, rezultiraju promjenama u ekspresiji pojedinih podjedinica za GABAA receptore

u različitim moždanim regijama. Primijećene su promjene mRNA za pojedine podjedinice

GABAA receptora za vrijeme dugotrajne izloženosti alkoholu i/ili za vrijeme naglog prekida,

u korelaciji sa količinom odgovarajućih proteina [29, 35, 36]. Iako su dobiveni rezultati

http://drugabuse.gov/pubs/teaching/teaching2/largegifs/slide11.gif

7

prilično nekonzistentni, u nekoliko istraživanja utvrĎeno je da kronična konzumacija alkohola

smanjuje razine mRNA i proteina 1 podjedinice, ali povisuje 4, 1 i 2s podjedinice [27, 37].

Nadalje, zabilježena je i promjena afiniteta vezivanja odreĎenih liganada GABAA

receptora, primjerice benzodiazepina, odnosno promjena farmakoloških svojstava GABAA

receptora, što upućuje na preraspodjelu podjedinica unutar receptora (Slika 3.). Primijećena je

takoĎer i smanjena količina protoka Cl‾ iona kroz staničnu membranu za koju se smatra da je

posljedica smanjenog broja receptora na staničnoj membrani. Potencijalni mehanizmi učinaka

kroničnog alkohola na GABAA receptore uključuju modifikaciju genske transkripcije ili

posttranslacijske modifikacije, sinaptičnu ili ekstrasinaptičnu lokalizaciju i alkoholom-

inducirane neurosteroidne promjene [28, 35].

GABA GABA+EtOH GABA+EtOH

Bez alkohola Akutna intoksikacija Kronična intoksikacija

Slika 3. Prikaz smanjenja osjetljivosti GABAA receptora nakon kronične izloženosti alkoholu (prilagoĎena slika sa interneta: http://www.med.unc.edu/alcohol/demo/images/ion.gif)

Kao i sa sličnim supstancama koje imaju sedativno-hipnotičko djelovanje, kao što su

primjerice barbiturati i benzodiazepini, nagli prekid konzumacije alkohola može biti

smrtonosan ako se pravilno ne kontrolira. Naime, primarni učinak alkohola je povećana

stimulacija GABAA receptora što vodi do inhibicije SŽS-a. Kao što je već opisano, nakon

dugotrajnog uzimanja alkohola, ovim receptorima se smanjuje osjetljivost i broj. Kada se

konzumacija alkohola prekine prenaglo, uslijed nedovoljne inhibicije, sinapse u živčanom

sistemu alkoholičara počinju nekontrolirano okidati, što rezultira simptomima kao što su

http://www.med.unc.edu/alcohol/demo/images/ion.gif

8

anksioznost, delirium tremens, halucinacije, drhtavica i mogući zastoj u radu srca [38]. Na

sreću, simptomi ustezanja počinju se postupno smanjivati i nestajati uspostavljanjem

normalne funkcije GABA sustava [28]. Naime, promijenjeni broj GABAA receptora na

staničnoj membrani, kao i ekspresija pojedinih receptorskih podjedinica vraćaju se na

normalne vrijednosti odreĎeno vrijeme nakon prestanka izlaganja alkoholu [29, 35, 36].

1.6. Geni za podjedinice GABAA receptora i alkoholizam

Pored već spomenutih gena za enzime uključene u metabolizam alkohola koji mogu

imati odreĎeni utjecaj na rizik razvoja alkoholizma, geni koji kodiraju podjedinice receptora

za neurotransmitore poput GABA-e identificirani su kao prvi kandidati uključeni u rizik

razvoja ovisnosti o alkoholu [18]. Geni za podjedinice GABAA receptora rasporeĎeni su u

klasterima na nekoliko kromosoma i to kromosomu 4 (α2, α4, β1, γ1), kromosomu 5 (α1, α6, β2,

γ2), kromosomu 15 (α5, β3, γ3) i X kromosomu (α3, β4, ε1) [20] (Slika 4.). Ovakva organizacija

gena u klastere povezana je sa zajedničkom ekspresijom tih gena, pa je tako

najrasprostranjenija kombinacija podjedinica α1β2γ2 (60% svih receptora u mozgu) sastavljena

od podjedinica čiji se geni nalaze na kromosomu 5 [39]. Receptori čije podjedinice potječu od

gena sa kromosoma 4 (α2β2γ2, 15%) najčešće su eksprimirani za vrijeme embrionalnog

razvoja mozga, no kod odraslih jedinki najrasprostranjeniji su u hipokampusu i većini

dopaminskih neurona u supstanciji nigri i ventralnom tegmentalnom području (VTA). To

upućuje da su GABAA receptorski geni na kromosomu 4 povezani s ovisnostima i

anksioznošću, te da su osjetljivi na epigenetske učinke tijekom ranog embrionalnog razvoja.

[39, 40]. Anksiolitički učinci benzodiazepina i barbiturata, kao i hipnotički učinci

kombiniranog izlaganja alkoholu i benzodiazepinima, takoĎer su posredovani α2

podjedinicom GABAA receptora, čiji gen se nalazi u klasteru na kromosomu 4 [36, 41].

9

Slika 4. Kromosomi 4, 5, 15 i X i položaj gena za podjedinice GABAA receptora [19]

Nezavisne studije cijelog genoma utvrdile su povezanost ovisnosti o alkoholu sa

regijom na kromosomu 4p u kojoj se nalazi klaster gena koji kodira za podjedinice GABAA

receptora (γ1, α2, α4 i β1). Rezultati velike studije (eng. Collaborative Study on the Genetics of

Alcoholism, COGA) čiji je cilj bio identificirati gene koji doprinose podložnosti alkoholizmu i

alkoholizmu srodnim fenotipovima takoĎer su sugerirali povezanost alkoholizma i gena na

kromosomu 4p13-12 koji kodiraju za podjedinice GABAA receptora [42, 43]. Fino mapiranje

spomenute genske regije utvrdilo je značajnu povezanost alkoholizma i brojnih biljega u genu

koji kodira 2 podjedinicu GABAA receptora i to u različitim populacijama [44-50] upućujući

na GABRA2 kao ključni gen koji utječe na rizik razvoja alkoholizma. Osim gena GABRA2,

pojedina istraživanja pokazala su povezanost gena GABRG1 i GABRB1 s ovisnošću o

alkoholu [51, 52].

S druge strane, klasteri gena za GABAA receptore na kromosomima 5 i 15 izgleda nisu

povezani sa alkoholizmom u tolikoj mjeri kao geni na kromosomu 4. Iako su rezultati ovih

istraživanja raznoliki, neka istraživanja pokazala su povezanost odreĎenih gena iz ovih

klastera, poput GABRA1, GABRG2, GABRB2, GABRA6, GABRA5 i GABRB3 sa

različitim aspektima rizika od alkoholizma [53, 54].

10

1.7. Polimorfizmi GABRA2 gena i alkoholizam

Polimorfizam jednog nukleotida tj. SNP (eng. Single Nucleotide Polymorphism)

predstavlja najčešći oblik varijacije (90%) u odsječku DNA. Ukoliko se manje zastupljen alel

nalazi u najmanje 1% ispitivane populacije, promjena u jednom nukleotidu može se nazvati

SNP-om. Pojavnost SNP-ova u genomu je otprilike 1 na 1000 parova baza. Do danas je

otkriveno preko 3 milijuna SNP-ova koji su pohranjeni u baze podataka dostupne javnosti. Od

ukupnog broja dosad otkrivenih SNP-ova, u genomu čovjeka najviše pažnje pobuĎuje njih 50

000 - 250 000 koji utječu na funkciju ili ekspresiju gena. SNP-ovi predstavljaju potencijalno

veliko područje u otkrivanju genetskih razlika izmeĎu pojedinaca koje bi mogle biti

odgovorne za različitu sklonost obolijevanja od pojedinih bolesti [55].

Brojna istraživanja utvrdila su povezanost pojedinih polimorfizama gena za

podjedinice GABAA receptora sa rizikom razvoja alkoholizma u ljudi. Tako je u istraživanju

provedenom 2004. godine ispitano 69 SNP-ova unutar genskog klastera za GABAA receptore

na kromosomu 4, te je utvrĎeno da su SNPovi u genu koji kodira za α2 podjedinicu GABAA

receptora (GABRA2) povezani i s ovisnošću o alkoholu i promjenama u frekvencijama

EEG-a [44]. Brojna druga istraživanja, provedena nakon toga na različitim populacijama

potvrdila su povezanost brojnih polimorfizama gena GABRA2 i ovisnosti o alkoholu,

meĎutim funkcionalni SNP-ovi unutar gena GABRA2 tek se trebaju identificirati [44-50].

Polimorfizam rs279858, smješten u središnjem dijelu gena GABRA2 (slika 5.) u mnogim je

istraživanjima pokazao jaku povezanost sa alkoholizmom (pojedinačno i u haplotipskom

bloku sa drugim SNP-ovima), kao i povezanost sa većom konzumacijom alkohola, težim

opijanjem i subjektivnim doživljajima alkohola. Upravo iz tih razloga biljeg rs279858 gena

GABRA2 odabran je i za ovo istraživanje [44-50].

Slika 5. Gen GABRA2 i položaj polimorfizma rs279858 (prilagoĎena slika) [46]

11

2. Cilj istraživanja

Genetska istraživanja alkoholizma provode se iz više razloga. Razjašnjavanje genetske

podloge ovisnosti o alkoholu olakšalo bi identificiranje osoba sa visokim rizikom razvoja

alkoholizma, što bi omogućilo pravovremenu reakciju odnosno prevenciju, kako bi se izbjegli

problemi vezani uz prekomjernu konzumaciju alkohola. Nadalje, na temelju rezultata

genetskih studija dobio bi se i bolji uvid u ulogu okolišnih čimbenika ključnih u razvoju

alkoholizma. Bolje razumijevanje fizioloških mehanizama razvoja alkoholizma u konačnici bi

moglo dovesti do razvoja novih, uspješnijih pristupa u liječenju ovog kompleksnog

poremećaja.

Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi postoji li povezanost polimorfizma rs279858

(hCV 2073557), smještenog unutar središnje regije gena koji kodira 2 podjedinicu GABAA

receptora (GABRA2), sa rizikom razvoja ovisnosti o alkoholu u hrvatskoj populaciji, te

istražiti moguće razlike u distribuciji GABRA2 genotipova i alela s obzirom na spol, početak

konzumiranja alkohola, te agresivno i suicidalno ponašanje, a u svrhu stjecanja novih

spoznaja o genetskim čimbenicima uključenima u etiologiju alkoholizma.

12

3. Materijali i metode

3.1. Ispitanici

Istraživanje je obuhvatilo 355 osoba (280 muškaraca i 75 žena) ovisnih o alkoholu i

230 zdravih osoba (203 muškarca i 27 žena), hrvatskog podrijetla (Tablica 1).

Tablica 1. Informacije o ispitanicima

Muškarci Žene Ukupno Dob Kontrola

Alkoholičari 203 88.26% 27 11.74% 230 100% 40.47 ± 0.81

280 78.87% 75 21.13% 355 100% 49.82 ± 0.54

Sudionici istraživanja bili su bijelci koji su potjecali iz iste geografske regije

Republike Hrvatske, odnosno iz Zagrebačke županije. Svi ispitanici pristali su dati uzorak

krvi i sudjelovati u istraživanju, što su i potvrdili svojim pismenim informativnim pristankom.

Demografske i kliničke osobine osoba uključenih u kontrolnu skupinu i u skupinu ovisnika o

alkoholu navedene su u Tablicama 2 i 3.

Osobe ovisne o alkoholu primljene su na liječenje u Psihijatrijsku bolnicu Vrapče zbog

sindroma ustezanja koji je povezan s alkoholizmom, a koji se javlja nakon prekida

konzumiranja alkohola. Simptomi ustezanja bili su nepsihotičnog tipa, čiji je intenzitet

dosegao najveću razinu oko tjedan dana prije prijema u bolnicu. Mnogo ispitanika prilikom

prijema u bolnicu bilo je akutno intoksicirano alkoholom. Stoga su se intervju i uzimanje

uzoraka krvi primjenjivali najmanje 12 sati nakon prijema na bolnički odjel, tj. kada su

ispitanici bili trijezni, te prije nego što primili terapiju psihoaktivnim lijekovima. S

ispitanicima je napravljen Strukturirani klinički intervju (eng. Structured Clinical Interview;

SCID) [56], a dijagnoza ovisnosti o alkoholu postavljena je prema DSM-IV dijagnostičkim

kriterijima Američke Psihijatrijske Udruge [4].

Ispitanici ovisni o alkoholu razvrstani su u nesuicidalne (koji nikada nisu pokušali

izvršiti samoubojstvo) i suicidalne (koji su pokušali samoubojstvo). Pokušaj suicida utvrĎivan

je primjenom dvaju mjerila: primjenom pitanja 4 stavke 3 Hamiltonove ocjenske ljestvice za

depresiju (eng. Hamilton Rating Scale for Depression, HRSD 17-item scale) [57] i primjenom

strukturiranog psihijatrijskog intervjua, s pitanjem koje se odnosi na pokušaj samoubojstva

tijekom života.

Uz primjenu Strukturiranog kliničkog intervjua (SCID) i psihijatrijskog intervjua,

simptomi agresije tijekom života procjenjivani su primjenom Brown-Goodwinove skale (eng.

13

Brown–Goodwin Scale) [58]. Primjenjivani upitnik prilagoĎen iz Brown-Goodwinove skale i

preveden na hrvatski jezik sastojao se od sedam bihevioralnih kategorija (prema Buydens-

Branchey [59]: problemi s disciplinom u vojsci; problemi s disciplinom na poslu; napadi na

druge osobe; uništavanje imovine (vlasništva, nekretnine); uhićenje radi napadačkog

ponašanja; uhićenje radi drugih zločina; zločini koji nisu rezultirali uhićenjem. Ove kategorije

procijenjene su skalom od 0 do 4 (0, bez problema; 1, jedan problematični dogaĎaj; 2, dva ili

malo problematičnih dogaĎaja; 3, tri ili nekoliko odnosno česti problematični dogaĎaji; 4,

četiri ili više odnosno brojni problematični dogaĎaji). Ukupni maksimalni zbroj bodova bio je

28, i prema Buydens-Branchey i sur. [59], granični zbroj od 8 bodova označen je kao

agresivno ponašanje.

Osobe ovisne o alkoholu takoĎer su grupirane prema dobi u kojoj su započele piti

alkohol, na osobe s ranijim početkom konzumacije alkohola odnosno prije 25 godine starosti

ispitanika i na osobe s kasnijim početkom zlouporabe alkohola koji se javlja nakon 25 godine

života.

Tablica 2. Informacije o ispitanicima ovisnim o alkoholu

Skupine Muškarci Žene Ukupno

Rani početak konzumiranja alkohola

(< 25 godine života)

105 16 121

Kasniji početak konzumiranja alkohola

(> 25 godine života)

175 59 234

Prisutnost agresivnog ponašanja 82 6 88

Odsutnost agresivnog ponašanja 198 69 267

Pokušaj samoubojstva tijekom života 38 17 55

Bez pokušaja samoubojstva tijekom života 242 58 300

Ovisnost o pušenju 162 42 204

Bez ovisnosti o pušenju 118 33 151

Ispitanici kontrolne skupine sakupljani u periodu izmeĎu 2005. i 2009. godine u

Kliničkom Bolničkom Centru Zagreb. Sve osobe kontrolne skupine ispunile su upitnik kojime

odgovaraju na pitanja o svojoj povijesti bolesti, te navikama pušenja i konzumacije alkohola.

Kriteriji za uključivanje u istraživanje bili su: da osobe trenutno ne primaju nikakvu

medicinsku terapiju, da su bez trenutnih i prijašnjih psihijatrijskih poremećaja, da nisu

zloupotrebljavale alkohol ili sredstva ovisnosti, da nisu pokušale samoubojstvo, da u njihovim

obiteljima nije bilo psihijatrijskih poremećaja (što je utvrĎeno odgovorima sudionika o

mentalnom zdravlju njihovih roditelja, baka i djedova, braće i sestara, te djece), da nisu u

srodstvu sa drugim ispitanicima, te da pripadaju nativnoj etničkoj grupi, odnosno da

predstavljaju najmanje treću generaciju koja živi o ovoj regiji. Osobe kontrolne skupine, kao i

osobe ovisne o alkoholu, takoĎer su grupirane i prema pušačkom statusu u pušače i nepušače.

14

Tablica 3. Informacije o kontrolnim ispitanicima

Skupine Muškarci Žene Ukupno



Istraživanje je provedeno u skladu sa Helsinškom deklaracijom, te je odobreno od

strane Etičkog povjerenstva Psihijatrijske bolnice Vrapče i Etičkog povjerenstva Kliničkog

Bolničkog Centra Zagreb.

3.2. Izolacija DNA iz krvi

Uzorci krvi (8 ml) osobama kontrolne skupine kao i osobama ovisnim o alkoholu

izvaĎeni su u plastične šprice sa 2 ml ACD (eng. acid citrate dextrose) antikoagulansa. Uzorci

krvi su se pohranjivali u plastičnim epruvetama u zamrzivaču na -20°C. Izolacija genomske

DNA iz leukocita periferne krvi napravljena je primjenom metode isoljavanja [60]. U tu svrhu

bile su potrebne slijedeće kemikalije:

Pufer za lizu eritrocita (eng. Red cell lysis buffer, RCLB) 5 M NaCl

10 mM Tris, 5 mM MgCl2, 10 mM NaCl, pH=7.6

Natrij-EDTA pufer (eng. Sodium EDTA, SE-buffer) Proteinaza K (20 mg/kg)

75 mM NaCl, 25 mM Na2EDTA, pH=8.0

Natrij dodecil sulfat (SDS), 10 %, pH=7.2 Etanol, 96 % i 70%

Tris-EDTA pufer (eng. TE buffer) Izopropanol

10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH=8.0

Epruvete sa smrznutim uzorcima krvi izvana se dobro obrišu etanolom. Nakon

odmrzavanja uzorci krvi miješaju se na valjkastoj miješalici oko 20 minuta. 300 l krvi odvoji

se u sterilnu Eppendorf mikroepruvetu od 1.5 ml, doda se 900 l hladnog pufera za lizu

eritrocita (eng. Red cell lysis buffer, RCLB), dobro promiješa na vorteks miješalici i ostavi 10

minuta stajati na ledu. Nakon toga slijedi postupak centifugiranja (2 minute, 13 400 x g, 4° C)

pri čemu lizirani eritrociti ostanu u supernatantu, dok se netaknuti leukociti istalože.

Mikropipetom se supernatant odvoji i baci. Talog se pročišćava tako da se navedeni postupak

resuspendiranja u puferu za lizu eritrocita i centrifugiranja ponovi još 3 puta. Na dovoljno

pročišćeni talog doda se 300 l natrij-EDTA pufera (eng. Sodium EDTA, SE-buffer), 30 l 10

% SDS-a, lagano promiješa te doda 1.5 l proteinaze K. Nakon laganog miješanja, slijedi

inkubacija uzoraka 1.5 do 2 h na 56° C uz miješanje (700 rpm) (u termomikseru), pri čemu se

15

liziraju leukociti i membrana jezgre. Nakon inkubacije i hlaĎenja uzoraka na sobnu

temperaturu, doda se 160 l 5 mM NaCl i sve se promiješa na vorteks miješalici 10 s. Slijedi

centrifugiranje (5 minuta, 13 400 x g, 20 °C), nakon kojeg se DNA nalazi u supernatantu, a

ostali dijelovi stanične strukture u talogu. Supernatant se prelije u novu sterilnu

mikroepruvetu od 1.5 ml i doda se 800 l hladnog izopropanola. Pri laganom miješanju dolazi

do zgušnjavanja DNA, te ona postaje vidljiva u obliku netopivog spleta. Slijedi

centrifugiranje (2 minute, 12 000 x g, 20 °C), nakon čega se odlije supernatant, a na talog se

doda 250 l 75% etanola. Nakon još jednog centifugiranja (2 minute, 12 000 x g, 20 °C)

supernatant se odlije, a talog se suši na zraku 15-30 minuta. Na talog se zatim dodaje 100 l

Tris-EDTA pufera (eng. TE buffer), te se ostavi oko sat vremena na 37° C uz trešnju (u

termomikseru) kako bi se DNA dobro otopila. Nakon toga uzorci DNA se pohranjuju u

hladnjak na 4° C.

3.3. Određivanje genotipova

Prisutnost baze C ili T na mjestu polimorfizma rs279858 smještenog unutar središnje

regije (u eksonu 5) gena GABRA2 koji se nalazi na kromosomu 4p12, a koji kodira za 2

podjedinicu GABAA receptora (Tablica 4) utvrĎivana je pomoću ureĎaja «ABI Prism 7000

Sequencing Detection System apparatus» (ABI, Foster City, SAD) prema protokolu koji

predlaže Applied Biosystems [61].

Tablica 4. Informacije o markeru

Broj SNP-a

(NCBI baza

podataka)

Broj SNP-a

(Celera baza

podataka)

Položaj SNP-a

(GenBank baza

podataka)

Smještaj SNP-a na

kromosomu 4p

Promjena

nukleotida

u SNP-u

rs279858 hCV2073557 46,155,521 ekson 5 gena GABRA2 C/T

U tu svrhu primjenjivana je tzv. alelna diskriminacija polimorfizama u slučaju jedne

promijenjene baze (tzv. SNP; eng. single nucleotide polymorphism) uz pomoć tzv. 5'

nukleazne reakcije (eng. 5' nuclease assay) [62]. Primjenom flourogenih proba ova metoda

(Slika 6.) kombinira umnažanje specifičnih odsječaka DNA lančanom reakcijom polimeraze

(PCR, eng. polymerase chain reaction) i detekciju u jednom jedinom koraku.

16

Slika 6. Prikaz principa alelne diskriminacije SNP-ova 5' nukleaznom reakcijom [61]

U ovoj metodi, kao što su to prvi opisali Holland i suradnici [62], hibridizacijska proba

uključena u lančanu reakciju polimeraze cijepa se 5’ nukleaznom aktivnošću Taq DNA

polimeraze samo u slučaju kada se umnaža ciljana sekvenca probe. Korištenjem flourogene

probe, koju su prvi sintetizirali Lee i suradnici [63], cijepanje probe može se utvrditi bez

naknadne obrade rezultata PCR-a. Fluorogena proba sastoji se od oligonukleotida označenih

sa fluorescencijskom obilježavajućom bojom (eng. reporter) i prigušujućom bojom (eng.

quencher), koji se nalaze na suprotnim stranama probe. U intaktnoj probi, blizina prigušujuće

boje smanjuje fluorescencijski signal koji daje obilježavajuća boja, kao rezultat energetskog

transfera Förster-tipa (eng. Förster-type enery transfer, FRET) [64, 65]. Cijepanje flourogene

probe tijekom lančane reakcije polimerazom oslobaĎa obilježavajuću boju i uzrokuje

povećanje u intenzitetu njezine fluorescencije. «ABI Prism 7000 Sequencing Detection

System» mjeri pojačanje u fluorescenciji tijekom ciklusa lančane reakcije polimerazom,

detektirajući akumulaciju PCR produkata u realnom vremenu (eng. real-time PCR) izravno u

PCR reakcijskim jažicama. Za sustav u kojem postoje 2 alela, probe specifične za svaki alel

obilježene su različitim fluorescentnim obilježavajućim bojama. Nepodudaranje izmeĎu probe

i ciljne sekvence značajno smanjuje efikasnost hibridizacije i cijepanja probe. Prema tome,

17

značajno povećanje u FAM ili VIC fluorescentnim signalima upućuje na homozigotnost za

FAM- ili VIC-specifične alele, dok povećanje u oba signala upućuje na heterozigotnost.

Za odreĎivanje genotipa u slučaju jedne promijenjene baze (SNP) u ovom istraživanju

korišteni su predizajnirani Taqman uzorci (eng. Taqman SNP Genotyping assay). Svaki takav

uzorak sadrži kombinaciju dvaju početnica za umnažanje ciljane polimorfne sekvence i dvaju

Taqman MGB proba za razlikovanje izmeĎu dvaju alela. Svaka od Taqman MGB proba

sastoji se od obilježavajuće VIC boje na 5' kraju probe za alel 1 i obilježavajuće FAM boje na

5' kraju probe za alel 2. MGB (eng. minor groove binder) na 3' kraju svake probe je

modifikacija koja povećava temperaturu mekšanja (Tm) za danu dužinu proba [66] koja

dozvoljava dizajn kraćih proba. Kraće probe rezultiraju u većim razlikama u vrijednostima

temperatura mekšanja izmeĎu odgovarajućih i neodgovarajućih proba, proizvodeći jasnu

alelnu diskriminaciju. Čak i nepodudarnost u samo jednom nukleotidu izmeĎu probe i ciljane

sekvence smanjuje efikasnost hibridizacije probe, što zauzvrat smanjuje količinu

obilježavajuće boje koja se odcjepljuje od stišavajuće probe. TakoĎer, AmpliTaq Gold DNA

polimeraza vjerojatnije zamjenjuje neodgovarajuću probu bez cijepanja. Svaki od tih

čimbenika smanjuje proizvodnju nespecifičnih fluorescencijskih signala. Na 3' kraju svake

probe nalazi se i neflourescencijski prigušivač (eng. nonflourescent quencher, NFQ).

Sam postupak genotipizacije prikazan je na slici 7., a započinje odmrzavanjem

uzoraka genomske DNA i pripremom odgovarajućih razrjeĎenja u destiliranoj vodi, kako bi u

konačnici u PCR reakciji bilo izmeĎu 1-20 ng DNA. Nakon toga, u jažice reakcijske pločice

(eng. 96-well reaction plate) odpipetira se po 4.5 l tako pripremljenih uzoraka DNA. Zatim

se u jažice odpipetira po 5.5 l reakcijske mješavine u kojoj se nalazi po 5 l TaqMan glavne

univerzalne mješavine i 0.5 l 40 x Taqman mješavine za genotipizaciju ciljanog SNP-a

(Tablica 5).

Tablica 5. Kemikalije potrebne za genotipizaciju SNP-ova

Sastojci reakcije Volumen u jažici Konačna koncentracija

TaqMan glavna univerzalna mješavina 5 l 1 x

40 x Taqman mješavina za

genotipizaciju ciljanog SNP-a 0.5 l 1 x

Genomska DNA razrijeĎena u dH2O1 4.5 l /

Ukupni reakcijski volumen 10 l

1 1-20 ng genomske DNA

18

Slika 7. Prikaz postupka genotipizacije SNP-ova [61]

Nakon zatvaranja reakcijske pločice i centrifugiranja 1-2 minute na oko 5000 rpm,

odreĎivanje genotipova provodi se primjenom ureĎaja «ABI Prism 7000 Sequencing

Detection System apparatus». Uvjeti lančane reakcije polimerazom navedeni su u Tablici 6.

Tablica 6. Uvjeti PCR reakcije

Vrijeme i temperatura pojedine faze reakcije

Početni korak Denaturacija Vezanje/Produžavanje

40 ciklusa

10 min 95°C 15 sec 92°C 1 min 60°C

19

Tijekom lančane reakcije polimerazom odvijaju se slijedeći koraci:

1. Svaka Taqman MGB proba veže se specifično za svoju komplementarnu sekvencu izmeĎu

mjesta za «forward» i «reverse» početnice.

2. Kada je oligonukleotidna proba intaktna, blizina obilježavajuće (eng. reporter) boje

prigušivačkoj boji rezultira u prigušivanju fluorescencije obilježavajuće boje primarno

putem energetskog transfera Förster-tipa [64, 65].

3. AmpliTaq Gold DNA polimeraza produžava početnice vezane uz kalup DNA.

4. AmpliTaq Gold DNA polimeraza cijepa samo one probe koje su hibridizirale sa metom.

5. Cijepanjem se odvaja obilježavajuća od prigušujuće boje što rezultira u pojačanoj

fluorescenciji obilježavajuće boje.

6. Pojačanje fluorescencijskog signala dogaĎa se kada su pocijepane probe koje su

hibridizirale sa komplementarnom sekvencom. Fluorescencijski signal nastao umnažanjem

lančanom reakcijom polimeraze ukazuje na alele prisutne u uzorku (Tablica 7 i Slike 8. i 9.).

Slika 8. Primjer prikaza amplifikacijskih krivulja (izvorna slika)

Tablica 7. Korelacija izmeĎu fluorescencijskih signala i sekvenca u uzorku

Značajan porast u ... Upućuje na...

Fluorescenciji samo VIC-boje Homozigotnost za alel 1

Fluorescenciji samo FAM-boje Homozigotnost za alel 2

Fluorescenciji i VIC- i FAM-boje Alel 1- alel 2 heterozigotnost

20

Slika 9. Primjer prikaza rezultata genotipizacije SNP-ova (izvorna slika)

3.4. Statistička obrada podataka

Za statističku obradu podataka korišten je računalni program «GraphPad Prism version

4.00 for Windows» (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Skupine uključene u

istraživanje usporeĎivane su prema dobi student t-testom, te primjenom jednostruke analize

varijance (ANOVA) i Newman-Keuls testom. Značajnost odstupanja raspodjele genotipova

od očekivane (Hardy-Weinbergova distribucija) odreĎena je pomoću χ2-testa. Razlike u

raspodjeli genotipova i alela u osoba ovisnih o alkoholu i zdravih osoba odreĎivane su

pomoću χ2 test-a ili Fisher-ovog testa (eng. Fischer exact test). Statistički značajnim smatrane

su one razlike kod kojih je vjerojatnost p bila manja od 0.05. Frekvencije haplotipova

polimorfizma rs279858 i polimorfizma rs567926 procijenjene su korištenjem tzv. Bayesian

pristupa primijenjenog u programu PHASE [67]. Program «Haploview version 4.2» korišten

je za izradu LD (eng. linkage disequilibrium) matrice i utvrĎivanje haplotipskog bloka

polimorfizma rs279858 s polimorfizmom rs567926 s minimalnom D' vrijednošću podešenom

na 0.80, kao i za usporedbu procijenjenih frekvencija haplotipova u osoba ovisnih o alkoholu i

zdravih osoba [68].

21

4. REZULTATI

4.1. Informacije o ispitanicima

Analizirano je 355 uzoraka osoba ovisnih o alkoholu, od čega 280 muškaraca i 75

žena, te 230 zdravih kontrolnih ispitanika, od čega 203 muškarca i 27 žena. Ispitanici ovisni o

alkoholu podijeljeni su u odvojene skupine na osnovu dobi početka konzumacije alkohola,

prisustva agresivnog ponašanja, pokušaja samoubojstva i ovisnosti o pušenju, dok su

kontrolni ispitanici podijeljeni samo na osnovu ovisnosti o pušenju. Osnovne informacije o

ispitanicima prikazane su u tablici 8.

Tablica 8. Informacije o ispitanicima

Muškarci Žene Ukupno

Kontrola 203 (88.26%) 27 (11.74%) 230 (100%)

Starost 40.19 ± 0.86 42.59 ± 2.56 40.47 ± 0.81



Alkoholičari 280 (78.87%) 75 (21.13%)** 355 (100%)

Starost 49.49 ± 0.58** 51.03 ± 1.35* 49.82 ± 0.54 ***



Rani početak konzumiranja alkohola

(< 25 godine života) 105 16 121


(> 25 godine života) 175 59 234

Prisutnost agresivnog ponašanja 82 6 88

Odsutnost agresivnog ponašanja 198 69 267

Pokušaj samoubojstva tijekom života 38 17 55

Bez pokušaja samoubojstva tijekom života 242 58 300

*p < 0.01; **p < 0.001 or p< 0.004; ***p< 0.0001 u odnosu na kontrolu

Grupa ispitanika ovisnih o alkoholu bilo je statistički značajno starija od kontrolne

grupe (p<0,0001; Student’t-test). Jednostruka analiza varijance (eng. One-way analysis of

variance, ANOVA; p<0,0001), te Newman-Keuls test pokazali su da su i muškarci (p<0,001)

i žene (p<0,01) u skupini ovisnika o alkoholu bili značajno stariji od zdravih pripadajućih

kontrolnih ispitanika. Iako su u obje skupine većinu sačinjavali muškarci (ovisnici 88,26%,

kontrole 78,87%), u grupi alkoholičara bilo je značajno više žena nego u kontrolnoj grupi

(p<0,004; Fisherov test). TakoĎer, postojala je i značajna razlika u frekvenciji pušača i

nepušača izmeĎu alkoholičara i zdravih ispitanika (p<0,0001, Fisherov test), odnosno u

22

skupini kontrolnih ispitanika postojao je manji broj pušača nego u skupini ispitanika ovisnih o

alkoholu. Unutar grupe ovisnika o alkoholu, većina ispitanika započela je opijanje nakon 25.

godine života (65,92%). Nadalje, osobe ovisne o alkoholu uglavnom nisu pokazivale

agresivno ponašanje (75,21%) i nisu nikada pokušale samoubojstvo (84,51%).

4.2. Genotipiziranje

U uzorcima DNA od svih ispitanika genotipiziran je SNP rs279858 (hCV2073557)

koji je smješten u središnjem dijelu gena GABRA2 (ekson 5) na kromosomu 4p.

Učestalost opaženih genotipova i u skupini ovisnika o alkoholu i u kontrolnoj skupini

bile su u skladu s Hardy-Weinberg ravnotežom (Tablica 9.).

Tablica 9. Dobivene i očekivane vrijednosti za genotipove polimorfizma rs279858

Genotipovi TT TC CC

Kontrola Dobiveno 95 119 25

Očekivano 97,8 104,3 27,8

p=0,41*

Alkoholičari Dobiveno 122 181 52

Očekivano 127,2 170,6 57,2

p=0,25

*ukoliko je p<0,05 rezultat nije u skladu sa HW ravnotežom

4.2.1 Analiza raspodjele ispitanika prema spolu

Učestalosti opaženih genotipova, alela i nosioca alela za polimorfizam rs279858 u

skupini ispitanika ovisnih o alkoholu i kontrolnih ispitanika, te u obje skupine ispitanika

podijeljene s obzirom na spol, navedene su u tablicama 10. i 11, te grafički prikazane na

slikama 10 i 11.

Tablica 10. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs279858 po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i

ispitanika ovisnih o alkoholu

CC CT TT C T

Kontrola Muškarci 19 9.36% 97 47.78% 87 42.86% 135 33,25% 271 66,75%

Žene 6 22.22% 13 48.15% 8 29.63% 25 46,30% 29 53,70%

Ukupno 25 10.87% 110 47.83% 95 41.30% 160 34,78% 300 65,22%

Alkoholičari Muškarci 39 13.93% 143 51.07% 98 35.00% 221 39,46% 339 60,54%

Žene 13 17.33% 38 50.67% 24 32.00% 64 42,67% 86 57,33%

Ukupno 52 14.65% 181 50.98% 122 34.37% 285 40,14% 425 59,86%

23

muški ženski0

50

100

150

TT

CC

CTb

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

muški ženski0

50

100

150

200CC

CT

TT

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m

muški ženski0

50

100

150

200

250

300 C

Ta

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

s p

oje

din

im a

leli

ma

muški ženski0

50

100

150

200

250

300

350C

T

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

Slika 10. Raspodjela genotipova (lijevo) i alela (desno) po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika

ovisnih o alkoholu

Tablica 11. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela T i nosioca genotipa TT u

odnosu na nosioce alela C po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnika o alkoholu

CC T TT C

Kontrola Muškarci 19 9.36% 184 90.64% 87 42.86% 116 57.14%

Žene 6 22.22% 21 77.78% 8 29.63% 19 70.37%

Ukupno 25 10.87% 205 89.13% 95 41.30% 135 58.70%

Alkoholičari

Muškarci 39 13.93% 241 86.07% 98 35.00% 182 65.00%

Žene 13 17.33% 62 82.67% 24 32.00% 51 68.00%

Ukupno 52 14.65% 303 85.35% 122 34.37% 233 65.63%

S obzirom da nisu pronaĎene razlike u raspodjeli genotipova, alela i nosioca alela s

obzirom na spol, ni u kontrolnoj skupini, ni u grupi ovisnika o alkoholu, u daljnjim analizama

ispitanici nisu bili dijeljeni u odnosu na spol. Obrada dobivenih podataka genotipizacije

pokazala je da ne postoji statistički značajna razlika u raspodjeli pojedinih genotipova, alela i

nosioca alela polimorfizma rs279858 izmeĎu ispitanika ovisnih o alkoholu i zdravih osoba.

24

muški ženski0

50

100

150

200CC

Ta

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa C

C n

asp

ram

T

muški ženski0

25

50

75

100

125TT

Cc

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa T

T n

asp

ram

C

muški ženski0

50

100

150

200

250CC

Tb

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa C

C n

asp

ram

T

muški ženski0

50

100

150

200 TT

Cd

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa T

T n

asp

ram

C

Slika 11. Raspodjela nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela T (a i b) odnosno nosioca genotipa TT u

odnosu na nosioce alela C (c i d) po spolu u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o alkoholu

4.2.2 Analiza ispitanika prema pušačkom statusu

Brojnost i frekvencije genotipova, alela i nosilaca alela za zdrave ispitanike i ovisnike

o alkoholu, podijeljene prema tome jesu li pušači ili nepušači, navedeni su u tablicama 12. i

13, te grafički prikazani na slikama 12 i 13.

Tablica 12. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs279858 kod pušača i nepušača unutar skupina

alkoholičara i kontrolnih ispitanika

CC CT TT C T

Kontrola pušači 6 8.00% 33 44.00% 36 48.00% 45 30.00% 105 70.00%

nepušači 19 12.26% 77 49.68% 59 38.06% 115 37.10% 195 (62.90%

Alkoholičari pušači 24 11.76% 105 51.47% 75 36.76% 153 37.50% 255 62.50%

nepušači 28 18.54% 76 50.33% 47 31.12% 132 43.71% 170 56.29%

25

pušači nepušači0

25

50

75

100

125 CC

CT

TT

ab

ro

j ko

ntro

lnih

oso

ba

s p

oje

din

im g

en

otip

om


25

50

75

100

125 CC

CT

TT

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

otip

om


50

100

150

200

250

300 C

Ta

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

s p

oje

din

im a

leli

ma


50

100

150

200

250

300C

Tb

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

Slika 12. Raspodjela genotipova (lijevo) i alela (desno) izmeĎu pušača i nepušača u skupini kontrolnih ispitanika

i ispitanika ovisnih o alkoholu

Tablica 13. Brojnost i frekvencije nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela T i nosioca genotipa TT u

odnosu na nosioce alela C kod pušača i nepušača u kontrolnoj grupi i grupi alkoholičara

CC T TT C

Kontrola

pušači

nepušači

6 8.00% 69 92.00% 36 48.00% 39 52.00%

19 12.26% 136 87.74% 59 38.06% 96 61.94%

Alkoholičari

pušači

nepušači

24 11.77% 180 88.23% 75 36.77% 129 63.23%

28 18.54% 123 (81.46% 47 31.13% 104 68.87%

Dobiveni podaci nisu pokazali statistički značajnu razliku u raspodjeli odreĎenih

genotipova, alela i nosioca alela izmeĎu alkoholičara i zdravih kontrola u ovisnosti o tome

jesu li pušači ili nepušači.

26


50

100

150

200CC

Ta

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba

no

sio

ca g

en

oti

pa C

C n

asp

ram

T


50

100

150TT

Cc

bro

j ko

ntr

oln

ih o

so

ba n

osio

ca

gen

oti

pa T

T n

asp

ram

C


50

100

150

200

250 CC

Tb

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa C

C n

asp

ram

T


100

200TT

Cd

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa T

T n

asp

ram

C

Slika 13. Raspodjela nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela T (a i b) odnosno nosioca genotipa TT u

odnosu na nosioce alela C (c i d) izmeĎu pušača i nepušača u skupini kontrolnih ispitanika i ispitanika ovisnih o

alkoholu

4.2.3 Analiza raspodjele ispitanika ovisnih o alkoholu

Ispitanici ovisni o alkoholu dalje su razvrstani u podskupine s obzirom na raniji

odnosno kasniji početak konzumiranja alkohola, te s obzirom na prisutnost agresivnog i

suicidalnog ponašanja. Brojnost i frekvencije genotipova alela i nosioca alela unutar svake od

pojedinih podskupina ispitanika ovisnih o alkoholu navedene su u tablicama 14 i 15.

Raspodjela genotipova, alela i nosioca alela u navedenim podskupinama ispitanika

ovisnih o alkoholu grafički je prikazana na slikama 14, 15 i 16.

27

Tablica 14. Brojnost i frekvencije genotipova i alela za SNP rs279858 u različitim podskupinama ispitanika

ovisnih o alkoholu

Alkoholičari CC CT TT C T Rani početak

konzumiranja alkohola 16 13.22% 66 54.55% 39 32.23% 98 40.50% 144 59.50%


36 15.39% 115 49.14% 83 35.47% 187 39.96% 281 60.04%

Prisutnost agresivnog

ponašanja 9 10.23% 52 59.09% 27 30.68% 70 39.77% 106 60.23%

Odsutnost agresivnog

ponašanja 43 16.10% 129 48.32% 95 35.58% 215 40.26% 319 59.74%

Pokušaj samoubojstva

tijekom života 5 9.09% 23 41.82% 27 49.09% 33 0.30% 77 0.70%

Bez pokušaja

samoubojstva tijekom života

47 15.66% 158 52.67% 95 31.67% 252 42.00% 348 58.00%

Analiza ovih podataka otkrila je da postoji statistički značajna razlika u frekvenciji

genotipa (*p= 0,0378) i alela (*p= 0.0198) u skupini ovisnika o alkoholu koji su pokušali

izvršiti samoubojstvo tijekom života u odnosu na alkoholičare koji nikada nisu pokušali

samoubojstvo. Naime rezultati su pokazali da ispitanici ovisni o alkoholu koji su pokušali

samoubojstvo tijekom života imaju značajno veću frekvenciju T alela, kao i veću frekvenciju

homozigotnog TT genotipa u odnosu na nosioce alela C, nego zdravi kontrolni ispitanici.

Tablica 15. Brojnost i frekvencije nosilaca genotipa CC u odnosu na nosioce alela T i nosilaca genotipa TT u

odnosu na nosioce alela C u različitim podskupinama ispitanika ovisnih o alkoholu

Alkoholičari CC T TT C Rani početak konzumiranja alkohola

(< 25 godine života)

16 13.22% 105 86.78% 39 32.23% 82 67.77%


(> 25 godine života)

36 15.39% 198 84.61% 83 35.47% 151 64.53%

Prisutnost agresivnog ponašanja 9 10.23% 79 89.77% 27 30.68% 61 69.32%

Odsutnost agresivnog ponašanja 43 16.10% 224 83.90% 95 35.58% 172 64.42%

Pokušaj samoubojstva tijekom života 5 9.09% 50 90.91% 27 49.09% 28 50.91%

Bez pokušaja samoubojstva tijekom

života

47 15.67% 253 84.33% 95 31.67% 205 68.33%

* frekvencija nosioca TT naspram C je značajno različita (p=0,0198) izmeĎu grupe alkoholičara sa pokušajem

samoubojstva i alkoholičara koji nisu pokušali samoubojstvo tijekom života

28

rani početak kasni početak0

50

100

150

200

250CC

CT

TT

ab

roj

oso

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

m


100

200

300

400

500C

Tb

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma


100

200

300CC

Ta

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa C

C n

asp

ram

T


100

200

300TT

Cb

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa T

T n

asp

ram

C

Slika 14. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (lijevo dole) i nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela

T, odnosno nosioca genotipa TT u odnosu na nosioce alela C (desno) prema početku konzumiranja alkohola u

skupini ispitanika ovisnih o alkoholu

agresija bez agresije0

100

200

300CC

CT

TT

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im g

en

oti

po

vim

a


100

200

300

400

500C

Tb

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma


100

200

300

400CC

Ta

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa C

C n

asp

ram

T


100

200

300TT

C

b

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca g

en

oti

pa T

T n

asp

ram

C

Slika 15. Raspodjela genotipova (lijevo gore), alela (lijevo dole) i nosioca genotipa CC u odnosu na nosioce alela

T odnosno nosioca genotipa TT u odnosu na nosioce alela C (desno) s obzirom na prisutnost agresivnog

ponašanja u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu

29

suicid bez suicida0

100

200

300CC

CT

TT

a

*

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

m g

en

oti

po

m

suicid bez suicida0

100

200

300

400

500C

T

b

*

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

s p

oje

din

im a

leli

ma

suicid bez suicida0

100

200

300

400CC

T

a

bro

j o

so

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca C

C n

asp

ram

T

suicid bez suicida0

100

200

300TT

C

b

*b

roj

oso

ba o

vis

nih

o a

lko

ho

lu

no

sio

ca T

T n

asp

ram

C

Slika 16. Raspodjela genotipova (lijevo gore, *p<0,04), alela (lijevo dole, *p<0,02) i nosioca genotipa CC u

odnosu na nosioce alela T, odnosno nosioca genotipa TT u odnosu na nosioce alela C (desno, *p<0,02) (χ2 –test)

s obzirom na pokušaj suicida u skupini ispitanika ovisnih o alkoholu

4.2.4 Analiza haplotipskog bloka polimorfizama rs567926 i rs279858

Za odreĎivanje strukture haplotipskog bloka unutar regije GABRA2, kao i haplotipske

povezanosti polimorfizama gena GABRA2 s ovisnošću o alkoholu, u analizu je uključen još

jedan GABRA2 polimorfizam, rs567926 (G/A), koji se nalazi u intragenskoj regiji izmeĎu

gena GABRA2 i GABRG1 (slika 17), te je set od ova dva SNP-a analiziran kao haplotip.

Slika 17. Položaj polimorfizama rs567926 i rs279858 unutar gena GABRA2 (prilagoĎena slika) [46]

30

Program «Haploview version 4.2» korišten je za izradu LD matrice i utvrĎivanje

haplotipskog bloka polimorfizma rs279858 s polimorfizmom rs567926. U skladu sa

dosadašnjim podacima [17], zabilježen je visok stupanj «neravnoteže udruživanja» (eng.

linkage disequilibrium, LD) za spomenute biljege unutar centralne i 3’ regije gena GABRA2

(slika 18), upućujući na veliku vjerojatnost (92%) da se polimorfizmi rs279858 i rs567926

naslijeĎuju zajedno u bloku. Slični obrasci LD-a zabilježeni su i za kontrolnu grupu i grupu

ovisnika o alkoholu prilikom zasebne analize (nije prikazano).

Slika 18. Prikaz vrijednosti LD-a izmeĎu SNP-a rs279858 i rs567926 gena GABRA2 dobiven pomoću programa

Haploview 4.2 u cijelom ispitivanom uzorku (A) (izvorna slika), prikaz vrijednosti LD-a izmeĎu do sada

istraženih polimorfizama unutar genskog klastera na kromosomu 4 uzet iz HapMap baze podataka [17]

Koristeći softver za analizu haplotipova PHASE 2.0.2. [67] izračunate su frekvencije

najčešćih haplotipova ova dva polimorfizma, za koje se pokazalo da nisu značajno različite

izmeĎu kontrolne skupine i skupine ispitanika ovisnih o alkoholu (Tablica 16.).

Tablica 16. Brojnost i frekvencije haplotipova za polimorfizme rs567926 i rs279858 unutar skupina kontrolnih

ispitanika i ovisnika o alkoholu, dobiveni pomoću programa PHASE

PHASE

Haplotipovi Kontrola Alkoholičari

Broj Frekvencija Broj Frekvencija p (Fisher’s exact test)

GC 156 0,338 270 0,379 p=0,1712

GT 18 0,040 26 0,038 p =0,8754

AC 3 0,007 15 0,022 p= 0,0529

AT 283 0,614 399 0,560 p= 0,0784

31

5. RASPRAVA

Dosadašnja istraživanja povezanosti gena koji kodiraju za podjedinice GABAA

receptora s rizikom razvoja alkoholizma dala su različite rezultate u ovisnosti od populacije na

kojoj je istraživanje izvršeno, različitog odabira ispitanika, njihovih karakteristika i broja,

gena koji su konkretno uvršteni u istraživanje, odabranih polimorfizama, načina na koji je

istraživanje isplanirano, itd. MeĎutim, mnoga istraživanja na različitim populacijama

pokazala su povezanost polimorfizama unutar gena GABRA2 s alkoholizmom [44-50], kao i s

ponašanjem povezanim s alkoholizmom [69], endofenotipom EEG valova kod alkoholičara

[44], subjektivnim učincima alkohola [70, 71], različitim odgovorom na alkohol, te obrascima

opijanja [69]. Mnogi od navedenih autora u svoje istraživanje uvrstili su upravo polimorfizam

rs279858. Tako je npr. nekoliko istraživanja koja su se bavila utjecajem markera rs279858

unutar gena GABRA2 na subjektivni doživljaj alkohola pokazalo da su nosioci genotipa AG

manje osjetljivi na akutne subjektivne učinke alkohola u odnosu na homozigotne pojedince,

odnosno da imaju manji rizik razvoja alkoholizma, te u ovom slučaju AG predstavlja

protektivni genotip za nastanak alkoholizma [29, 72].

Tablica 17. Dosadašnja istraživanja povezanosti polimorfizma rs279858 s alkoholizmom

Genotip alkoholičara Genotip kontrolnih

ispitanika

Autor Populacija TT CT CC TT CT CC 1 Edenberg i sur. 2004 Amerikanci europskog porijekla 0,37 0,49 0,15

2 Covault i sur. 2004 Amerikanci europskog porijekla 0,29 0,50 0,21 0,37 0,46 0,16

3 Lappalainen i sur. 2005 Rusi 0,25 0,52 0,23 0,38 0,48 0,15

4 Fehr i sur. 2006 Nijemci 0,31 0,49 0,20 0,45 0,41 0,14

5 Enoch i sur. 2006 Finci 0,44 0,38 0,18 0,34 0,50 0,16

6 Enoch i sur. 2006 Sjevernoamerički Indijanci 0,14 0,43 0,43 0,06 0,62 0,32

7 Covault i sur. 2008 Amerikanci europskog porijekla 0,30 0,49 0,21 0,36 0,46 0,17

8 Covault i sur. 2008 Amerikanci afričkog porijekla 0,57 0,38 0,05 0,61 0,30 0,09

U tablici 17. prikazani su rezultati nekih dosadašnjih istraživanja koja su se izmeĎu

ostalog bavila i polimorfizmom rs279858, te njegovom povezanošću sa alkoholizmom. U

studijama pod rednim brojem 1, 5 i 7 [44, 48, 47] pronaĎena je povećana frekvencija alela T

unutar grupe alkoholičara, dok je u studijama pod rednim brojevima 2, 3 i 4 [46, 49, 45], alel

C bio učestaliji unutar skupine ispitanika ovisnih o alkoholu. U istraživanju Enoch i suradnika

pod brojem 6 [48], frekvencija alela C bila je na granici sa statističkom značajnosti (p=

0,097). Istraživanje Edenberga i suradnika vršeno je na ispitanicima unutar iste obitelji, te

zbog toga nisu uključene frekvencije u kontrolnim ispitanicima [44]. Za razliku od ovih

32

istraživanja, postoje i istraživanja koja nisu prikazana u tablici 17. a koja nisu pronašla

povezanost navedenog polimorfizma s ovisnošću o alkoholu [50, 73]. Rezultati našeg

istraživanju nisu pokazali povezanost ovisnosti o alkoholu sa navedenim polimorfizmom, bez

obzira da li su ispitivane skupine podijeljene prema spolu ili ne. Ta razlika u odnosu na

istraživanja koja su našla povezanost biljega rs279858 s alkoholizmom može se pripisati

genetskim razlikama izmeĎu ispitivanih populacija. Naime, koliko nam je poznato ovo je prva

studija koja istražuje povezanost alkoholizma i biljega gena GABRA2, te općenito gena koji

kodiraju za podjedinice GABAA receptora, u hrvatskoj populaciji. I druga su ranija

istraživanja povezanosti gena GABRA2 s rizikom razvoja alkoholizma [47, 48] takoĎer

dobila različite rezultate ovisno o populacijama na kojima je istraživanje provedeno. Nadalje,

razlog što u našem istraživanju nismo primijetili značajnu razliku u frekvencijama genotipova

i alela izmeĎu osoba ovisnih o alkoholu i zdravih osoba mogao bi ležati i u nedovoljnom

broju ispitanika ili u odabiru uzorka koji možda nije bio dovoljno reprezentativan s obzirom

na cijelu populaciju.

Pušenje se često javlja uz prisustvo alkoholizma, a kao i za alkoholizam, i za pušenje

je prethodno dokazano da je barem djelomično uvjetovano genetskim čimbenicima. Tako je

pokazano da postoje specifične kromosomske regije koje su uključene u razvoj ovisnosti o

nikotinu, kao i neke koje su povezane sa rizikom i od alkoholizma i pušenja [74-76].

UtvrĎeno je takoĎer da je oko 35% alkoholičara ovisno i o nikotinu [77]. U skladu s tim, u

našem istraživanju utvrĎena je značajno veća učestalost pušenja u skupini alkoholičara u

odnosu na kontrolnu skupinu. Osim povezanosti s alkoholizmom, u literaturi je pokazana i

povezanost polimorfizma rs279858, kao i haplotipskih blokova unutar gena GABRA2 s

ovisnošću o nikotinu [78]. U našem istraživanju, analiza genotipova i alela u skupini

alkoholičara i kontrolnih ispitanika u ovisnosti o tome jesu li pušači ili nepušači, nije pokazala

značajnu razliku u njihovoj raspodjeli, kao niti naknadna usporedba frekvencija genotipova i

alela izmeĎu pušača i nepušača, neovisno o tome jesu li alkoholičari ili ne. Na temelju ovih

rezultata možemo zaključiti da u našem uzorku ispitanika nije utvrĎena značajna povezanost

polimorfizma rs279858 sa ovisnošću o alkoholu i nikotinu.

S obzirom na ostale ispitivane karakteristike osoba ovisnih o alkoholu, nisu naĎene

nikakve značajne razlike u frekvencijama genotipova i alela u ispitanika ovisnih o alkoholu s

obzirom na početak zlouporabe alkohola kao niti s obzirom na prisutnost agresivnog

ponašanja. Statistički značajna razlika u raspodjeli genotipova i alela utvrĎena je samo izmeĎu

skupine alkoholičara koji su pokušali samoubojstvo tijekom života, u odnosu na ovisnike o

alkoholu koji nisu suicidalni. Naime, utvrdili smo da je alel T i genotipa TT prisutan u

33

značajno većoj frekvenciji u suicidalnih alkoholičara nego kod osoba ovisnih o alkoholu koji

nisu nikada pokušali samoubojstvo. Dosadašnja istraživanja pokazuju da je stopa pokušaja

samoubojstva u korelaciji sa konzumacijom alkohola i brojem alkoholičara u odreĎenim

državama svijeta. [79]. Nadalje, rezultati pojedinih istraživanja takoĎer upućuju na moguću

uključenost gena za podjedinice GABAA receptora, i općenito ulogu GABAA receptora u

suicidalnom ponašanju [80]. MeĎutim, koliko nam je poznato do sada se nijedno istraživanje

nije bavilo istraživanjem povezanosti pojedinih biljega gena GABRA2 s rizikom

samoubojstva kod alkoholičara, kao niti sa suicidalnim ponašanjem općenito. S obzirom da je

ovo ispitivanje provedeno samo na skupini ispitanika ovisnih o alkoholu, potrebna su daljnja

istraživanja kako bi se utvrdilo da li postoji povezanost varijacija ovog polimorfizma sa

suicidom, ne samo u alkoholičara već i općenito.

U više navrata potvrĎeno je i postojanje haplotipskog bloka unutar središnje i 3' regije

gena GABRA2 i njegova povezanost s alkoholizmom [42, 46, 50]. Istraživanja pokazuju da

su brojni SNP-ovi nizvodno od introna 3 u genu GABRA2 organizirani u 2 komplementarna

haplotipa koja predstavljaju preko 90% haplotipske raznolikosti kod bijelaca i Azijata [42]. U

naše istraživanje je u svrhu odreĎivanja haplotipske strukture i povezanosti s alkoholizmom

osim polimorfizma rs279858 (T/C) uključen i marker rs567926 (G/A), te su ova dva SNP-a

analizirana kao haplotip. U skladu s literaturnim podacima i naši rezultati su pokazali da se

izmeĎu ta dva polimorfizma, od četiri moguće kombinacije haplotipova, dvije javljaju u preko

90% uzoraka. TakoĎer naše istraživanje je pokazalo da izmeĎu ova dva polimorfizma postoji

visoki stupanj «neravnoteže udruživanja» (D’=0,92). Usporedbom haplotipova dobivenih u

našem istraživanju sa haplotipovima utvrĎenim u prijašnjim studijama u koje su uključeni

polimorfizmi rs279858 i rs567926 potvrĎena je njihova podudarnost, meĎutim za razliku od

literaturnih podataka, naši rezultati nisu utvrdili povezanost dobivenih haplotipova s rizikom

razvoja alkoholizma. Ovo može biti posljedica mogućih genetskih razlika izmeĎu različitih

populacija, ali i nedovoljno velikog broja ispitanika, ili nedovoljno velikog broja SNP-ova

uključenih u istraživanje.

S obzirom da je razvoj alkoholizma rezultat kompleksnih genetskih utjecaja, brojnih

okolišnih čimbenika i združenih meĎugenskih i gensko-okolišnih interakcija, potrebna su

brojna daljnja istraživanja, na različitim populacijama, koja će obuhvatiti veći broj ispitanika i

ispitivanih parametara, kako bi se razjasnili složeni biološki mehanizmi u pozadini ovisnosti o

alkoholu.

34

6. ZAKLJUČAK

Istraživanje povezanosti polimorfizma rs279858, smještenog u središnjem području

gena koji kodira za 2 podjedinicu GABAA receptora (GABRA2), s rizikom razvoja

alkoholizma u ispitanika hrvatskog podrijetla, nije utvrdilo značajne razlike u

raspodjeli genotipova i alela izmeĎu ispitanika ovisnih o alkoholu i zdravih kontrolnih

ispitanika.

Frekvencije genotipova i alela polimorfizma rs279858 nisu se značajno razlikovale u

odnosu na spol u skupini ovisnika o alkoholu, kao ni u skupini zdravih osoba

kontrolne skupine.

Rezultati istraživanja nisu pokazali razlike u raspodjeli varijanti polimorfizma

rs279858 gena GABRA2 u skupinama alkoholičara i kontrolnih ispitanika podijeljenih

prema pušačkim statusu. TakoĎer nije utvrĎena povezanost spomenutog biljega sa

razvojem ovisnosti o nikotinu.

Analizom genotipova i alela polimorfizma rs279858 u skupini ispitanika ovisnih o

alkoholu podijeljenih prema početku konzumacije alkohola, odnosno prema prisustvu

agresivnog ponašanja, nisu utvrĎene statistički značajne razlike izmeĎu ispitivanih

skupina.

Unutar skupine alkoholičara dokazana je značajno povećana frekvencija alela T i

genotipa TT za polimorfizam rs279858 gena GABRA2 u ispitanika koji su pokušali

samoubojstvo u odnosu na nesuicidalne ovisnike o alkoholu. Koliko nam je poznato,

ovi rezultati po prvi puta sugeriraju moguću povezanost ovog biljega sa suicidalnim

ponašanjem u alkoholizmu.

Haplotipska analiza polimorfizama rs279858 i rs567926 utvrdila je visoki stupanj

«neravnoteže udruživanja» (LD) za spomenute biljege smještene unutar središnje i 3’

regije gena GABRA2, upućujući na veliku vjerojatnost da se spomenuti biljezi

nasljeĎuju zajedno u bloku. MeĎutim, nije utvrĎena povezanost najčešćih haplotipova

s ovisnošću o alkoholu.

Daljnja istraživanja potrebna su da bi se razjasnila povezanost gena GABRA2 s

alkoholizmom, kao i primijećena povezanost polimorfizma rs279858 sa suicidalnim

ponašanjem.

35

7. LITERATURA

1. American Psychiatric Association (1987): Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders. 3rd ed. American Psychiatric Association Press, Washington DC.

2. Gro Harlem Brundtland (2001): WHO European Ministerial Conference on Young

People and Alcohol. World Health Organization.

3. World Health Organization (2011): Global status report on alcohol, Geneva,

Switzerland.

4. American Psychiatric Association (1994): Diagnostic and Statistical Manual of Mental

Disorders. 4th ed. American Psychiatric Press, Washington DC.

5. Caan W., Belleroche J.D. (2002): Drink, Drugs and Dependence: From Science to

Clinical Practice (1st ed.). Routledge, 19–20.

6. Testino G. (2008): Alcoholic diseases in hepato-gastroenterology: a point of view.

Hepatogastroenterology 55, 371–377.

7. Wetterling T., Junghanns K. (2000): Psychopathology of alcoholics during withdrawal

and early abstinence. Eur Psychiatry 15, 483–488.

8. Karrol Brad R. (2002): Women and alcohol use disorders: a review of important

knowledge and its implications for social work practitioners. Journal of social work 2,

337–356.

9. Isralowitz R. (2004): Drug use: a reference handbook. ABC-CLIO, Santa Barbara,

CA, 122–123.

10. Langdana Farrokh K. (2009): Macroeconomic Policy: Demystifying Monetary and

Fiscal Policy (2nd ed.). Springer, 81.

11. Schadé J.P. (2006): The Complete Encyclopedia of Medicine and Health. Foreign

Media Books, 132–133.

12. Enoch M.A. (2006): Genetic and environmental influences on the development of

alcoholism: resilience vs. risk. Ann N Y Acad Sci 1094, 193–201.

13. Walter H., Gutierrez K., Ramskogler K., Hertling I., Dvorak A., Lesch O.M. (2003):

Gender-specific differences in alcoholism: implications for treatment. Archives of

Women's Mental Health 6, 253–258.

14. Goldman D., Oroszi G., Ducci F. (2005): The genetics of addictions: uncovering the

genes. Nat Rev Genet 6, 521–532.

36

15. Radel M., Goldman D. (2001): Pharmacogenetics of alcohol response and alcoholism:

the interplay of genes and environmental factors in thresholds for alcoholism. Drug

Metab Dispos 29, 489-94.

16. Thomasson H.R., Edenberg H.J., Crabb D.W., Mai X.L., Jerome R.E., Li T.K., et al.

(1991): Alcohol and aldehyde dehydrogenase genotypes and alcoholism in Chinese

men. Am J Hum Genet 48, 677-681.

17. Enoch M.A. (2008): The role of GABAA receptors in the development of alcoholism.

Pharmacology, Biochemistry and Behavior 90, 95–104.

18. Bierut J.L., Agrawal A., Bucholz K.K., et al. (2010): A genome-wide association

study of alcohol dependence. PNAS 107, 5082-5087.

19. Enna,S.J., Mohler H. (2007): The GABA receptors, 3rd edition. Humana press,

Totowa, NJ.

20. Barnard E.A., Skolnick P., Olsen R.W., Mohler H., Sieghart W., Biggio G., et al.

(1998): Subtypes of gamma-aminobutyric acid A receptors: classification on the basis

of subunit structure and receptor function. Pharmacol Rev 50, 291–313.

21. Benke D., Fritschy J.M., Trzeciak A., Bannwarth W., Mohler H. (1994): Distribution,

prevalence, and drug binding profile of gamma-aminobutyric acid type A receptor

subtypes differing in the beta-subunit variant. J Biol Chem 269, 100–107.

22. Minier F., Sigel E. (2004): Positioning of the alpha-subunit isoforms confers a

functional signature to gamma-aminobutyric acid type A receptors. Proc Natl Acad

Sci USA 101, 7769 –7774.

23. Jung S., Akabas M.H., Harris R.A. (2005): Functional and structural analysis of the

GABAA receptor alpha1 subunit during channel gating and alcohol modulation. J Biol

Chem 280, 308–316.

24. Mihic S.J., Ye Q., Wick M.J., Koltchine V.V., Krasowski M.D., Finn S.E., et al.

(1997): Sites of alcohol and volatile anaesthetic action on GABA(A) and glycine

receptors. Nature 389, 385–389.

25. Ming Z., Criswell H.E., Yu G., Breese G.R. (2006): Competing presynaptic and

postsynaptic effects of ethanol on cerebellar purkinje neurons. Alcohol Clin Exp Res

30, 1400 –1407.

26. Siggins G.R., Roberto M., Nie Z. (2005): The tipsy terminal: presynaptic effects of

ethanol. Pharmacol Ther 107, 80–98.

37

27. Grobin A.C., Matthews D.B., Devaud L.L., Morrow A.L. (1998): The role of

GABA(A) receptors in the acute and chronic effects of ethanol. Psychopharmacology

139, 2–19.

28. Kumar S., Fleming R.L., Morrow A.L. (2004): Ethanol regulation of gamma-

aminobutyric acid A receptors: genomic and nongenomic mechanisms. Pharmacol

Ther 101, 211–226.

29. Enoch M.A. (2008): The role of GABAA receptors in the development of alcoholism.

Pharmacology, Biochemistry and Behavior 90, 95–104.

30. Wise R.A. (1998): Drug-activation of brain reward pathways. Drug and Alcohol

Dependence 51, 13-22.

31. Lowinson J., Ruiz P., Millman R., Langrod J. (1997): Substance Abuse: A

comprehensive Textbook 3rd

Edition. Williams & Wilkens.

32. McBride W.J. (2002): Central nucleus of the amygdala and the effects of alcohol and

alcohol-drinking behavior in rodents. Pharmacol Biochem Behav 71, 509 –515.

33. Okada H., Matsushita N., Kobayashi K., Kobayashi K. (2004): Identification of

GABAA receptor subunit variants in midbrain dopaminergic neurons. J Neurochem

89, 7–14.

34. Gallegos R.A., Lee R.S., Criado J.R., Henriksen S.J., Steffensen S.C. (1999):

Adaptive responses of gamma-aminobutyric acid neurons in the ventral tegmental area

to chronic ethanol. J Pharmacol Exp Ther 291, 1045 –1053.

35. Sanna E., Mostallino M.C., Busonero F., Talani G., Tranquilli S., Mameli M., Spiga

S., Follesa P. and Biggio G. (2003): Changes in GABAA Receptor Gene Expression

Associated with Selective Alterations in Receptor Function and Pharmacology after

Ethanol Withdrawal. The Journal of Neuroscience 23, 11711–11724.

36. Davies M. (2003): The role of GABAA receptors in mediating the effects of alcohol in

the central nervous system. J Psychiatry Neurosci 28, 263-274.

37. Matthews D.B., Devaud L.L., Fritschy J.M., Sieghart W., Morrow A.L. (1998):

Differential regulation of GABA(A) receptor gene expression by ethanol in the rat

hippocampus versus cerebral cortex. J Neurochem 70, 1160 –1166.

38. Chastain G. (2006): Alcohol, neurotransmitter systems, and behavior. The Journal of

general psychology 133, 329–35.

39. Wisden W., Laurie D.J., Monyer H., Seeburg P.H. (1992): The distribution of 13

GABAA receptor subunit mRNAs in the rat brain. I. Telencephalon, diencephalon,

mesencephalon. J Neurosci 12, 1040–1062.

38

40. Hsu F.C., Zhang G.J., Raol Y.S., Valentino R.J., Coulter D.A., Brooks-Kayal A.R.

(2003): Repeated neonatal handling with maternal separation permanently alters

hippocampal GABAA receptors and behavioral stress responses. Proc Natl Acad Sci

USA 100, 12213–12218.

41. Low K., Crestani F., Keist R., Benke D., Brunig I., Benson J.A., et al. (2000):

Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety. Science 290,

131–134.

42. Reich T., Edenberg H.J., Goate A., Williams J.T., Rice J.P., Van Eerdewegh P., et al.

(1998): Genome-wide search for genes affecting the risk for alcohol dependence. Am

J Med Genet 81, 207–215.

43. Zinn-Justin A., Abel L. (1999): Genome search for alcohol dependence using the

weighted pairwise correlation linkage method: interesting findings on chromosome 4.

Genet Epidemiol 17, 421–426.

44. Edenberg H.J., Dick D.M., Xuei X., Tian H., Almasy L., Bauer L.O., et al. (2004):

Variations in GABRA2, encoding the alpha 2 subunit of the GABA(A) receptor, are

associated with alcohol dependence and with brain oscillations. Am J Hum Genet 74,

705–714.

45. Fehr C., Sander T., Tadic A. , Lenzen K.P., Anghelescu I., Klawe C., et al. (2006):

Confirmation of association of the GABRA2 gene with alcohol dependence by

subtype-specific analysis. Psychiatr Genet 16, 9–17

46. Covault J., Gelernter J., Hesselbrock V., Nellissery M., Kranzler H.R. (2004): Allelic

and haplotypic association of GABRA2 with alcohol dependence. Am J M ed Genet B

Neuropsychiatr Genet 129, 104–109.

47. Covault J., Gelernter J., Jensen K., Anton R., Kranzler H.R. (2008): Markers in the 5'

region of GABRG1 associate to alcohol dependence and are in linkage disequilibrium

with markers in the adjacent GABRA2 gene. Neuropsychopharmacology 33, 837–848

48. Enoch M.A., Schwartz L., Albaugh B., Virkkunen M., Goldman D. (2006):

Dimensional anxiety mediates linkage of GABRA2 haplotypes with alcoholism. Am J

Med Genet B Neuropsychiatr Genet 141, 599–607.

49. Lappalainen J., Krupitsky E., Remizov M., Pchelina S., Taraskina A., Zvartau E.,

Somberg L.K., Covault J., Kranzler H.R., Krystal J.H., Gelernter J. (2005):

Association between alcoholism and gamma-amino butyric acid alpha2 receptor

subtype in a Russian population. Alcohol Clin Exp Res 29, 493–498.

39

50. Soyka M., Preuss U.W., Hesselbrock V., Zill P., Koller G., Bondy B. (2008): GABA-

A2 receptor subunit gene (GABRA2) polymorphisms and risk for alcohol dependence.

J Psychiatr Res 42, 184 –191.

51. Ray L.A., Hutchinson K.E. (2009): Associations Among GABRG1, Level of

Response to Alcohol, and Drinking Behaviors. Alcohol Clin Exp Res. 33, 1382–1390.

52. Enoch M.A., et al. (2009): GABRG1 and GABRA2 as Independent Predictors for

Alcoholism in Two Populations. Neuropsychopharmacology 34, 1245–1254.

53. Dick D.M., Plunkett J., Wetherill L.F., Xuei X., Goate A., Hesselbrock V., et al.

(2006: Association between GABRA1 and drinking behaviors in the collaborative

study on the genetics of alcoholism sample. Alcohol Clin Exp Res 30, 1101–1110.

54. Radel M., Vallejo R.L., Iwata N., Aragon R., Long J.C., Virkkunen M., et al. (2005):

Haplotype-based localization of an alcohol dependence gene to the 5q34 {gamma}-

aminobutyric acid type A gene cluster. Arch Gen Psychiatry 62, 47–55.

55. Shastry B.S. (2002): SNP allels in human disease and evolution, J Hum Genet 47,

561-566

56. First M.B., Spitzer R.L., Williams J.B.W., Gibbon M. (2000): Structured clinical

interview for DSM-IV Axis I disorders (SCID-I). In A. J. Rush, H. A. Pincus, M. B.

First, D. Blacker, J. Endicott, & S. J. Keith, et al., (Eds.), Handbook of psychiatric

measures (49–53). Washington, DC: American Psychiatric Association.

57. Hamilton M. (1960): A rating scale for depression. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr.

23, 56–62.

58. Brown G.L., Goodwin F.K., Ballenger J.C., Goyer P.F., Major L.F. (1979): Aggresion

in humanst correlates with cerebrospinal fluid amine metabolites. Psychiatry Res 1,

131-139.

59. Buydens-Branchey L., Branchey M. H. and Noumair D. (1989): Age of alcoholism

onset I: relationship to psychopathology. Archives of General Psychiatry 46, 225–230.

60. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. (1988): A simple salting out procedure for

extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 16, 1215.

61. TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol (2006): Applied Biosystems, 1-50.

62. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. (1991): Detection of specific

polymerase chain reaction product by utilizing the 5'----3' exonuclease activity of

Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. 88, 7276-7280.

63. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. (1993): Allelic discrimination by nick-

translation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Res. 21, 3761-3716.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Holland%20PM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Abramson%20RD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Watson%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gelfand%20DH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Holland%20PM%201991

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lee%20LG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Connell%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bloch%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lee%20LG%201993%20PCR

40

64. Förster V.Th. (1948): Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.

Phys. Annalen der Physik 437, 55–75.

65. Lakowicz J.R. (1983): Energy transfer. In Principles of fluorescent spectroscopy, 303-

339. Plenum Press, New York, NY.

66. Afonina I., Zivarts M., Kutyavin I., Lukhtanov E., Gamper H, Meyer R.B. (1997):

Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove

binder Nucleic Acids Research 25, 2657–2660.

67. Stephens M., Donnelly P. (2003): A comparison of Bayesian methods for haplotype

reconstruction from population genotype data. American Journal of Human Genetics,

73, 1162-1169.

68. Barrett J.C., Fry B., Maller J., Daly M.J. (2005): Haploview: analysis and

visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21, 263-265.

69. Bauer L.O., Covault J., Harel O., Das S., Gelernter J., Anton R., et al. (2007) Variation

in GABRA2 predicts drinking behavior in project MATCH subjects. Alcohol Clin Exp

Res 31, 1780–1787.

70. Pierucci-Lagha A., Covault J., Feinn R., Nellissery M., Hernandez-Avila C., Oncken

C., et al. (2005): GABRA2 alleles moderate the subjective effects of alcohol, which

are attenuated by finasteride. Neuropsychopharmacology 30, 1193 –1203.

71. Roh S. et al. (2011): Role of GABRA2 in moderating subjective responses to alcohol.

Alcohol Clin Exp Res. 35, 400-407.

72. Haughey H.M., et al. (2008): Human g-aminobutyric acid A receptor a2 gene

moderates the acute effects of alcohol and brain mRNA expression. Genes, Brain and

Behavior 7, 447–454.

73. Drgon T., D'Addario C., Uhl G.R. (2006): Linkage disequilibrium, haplotype and

association studies of a chromosome 4 GABA receptor gene cluster: candidate gene

variants for addictions. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 141, 854–860.

74. Bierut L.J. et al. (2004): A Genomic Scan for Habitual Smoking in Families of

Alcoholics: Common and Specific Genetic Factors in Substance Dependence.

American Journal of Medical Genetics 124, 19–27.

75. Schlaepfer I.R., Hoft N.R., Ehringer M.A. (2008): The genetic components of alcohol

and nicotine co-addiction: From genes to behavior. Curr Drug Abuse Rev. 1, 124–

134.

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/andp.v437:1/2/issuetoc

41

76. Bierut L.J. et al. (2000): Co-Occurring Risk Factors for Alcohol Dependence and

Habitual Smoking. Results From the Collaborative Study on the Genetics of

Alcoholism. Alcohol Research & Health, 24.

77. Grant B.F., Hasin D.S., Chou S.P., Stinson F.S., Dawson D.A. (2004): Nicotine

dependence and psychiatric disorders in the United States: results from the national

epidemiologic survey on alcohol and related conditions. Arch Gen Psychiatry 61,

1107–1115.

78. Agrawal A. et al. (2008): Gamma-aminobutyric acid receptor genes and nicotine

dependence: evidence for association from a case-control study. Addiction. 103, 1027-

1038.

79. Borges G., Loera C.R. (2010): Alcohol and drug use in suicidal behaviour. Current

Opinion in Psychiatry 23, 195–204.

80. Gorwood P. (2001): Biological markers for suicidal behavior in alcohol dependence.

Eur Psychiatry 16, 410-417.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18482426

Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek · 1.2. Genetika alkoholizma Poznato je da na...

Documents

Transcript of Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek · 1.2. Genetika alkoholizma Poznato je da na...