Principi di Oncologia Sperimentale METASTASI SPERIMENTALI RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO IN...
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Principi di Oncologia Sperimentale
METASTASI SPERIMENTALIRIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO
IN VIVO
5° S. Beninati
Modelli sperimentali in vivo
• Permettono di valutare due parametri:
• proliferazione
• Colonizzazione/invasione
IL MODELLO ANIMALE
• SONO UTILIZZATI DIVERSI MODELLI ANIMALI PER RIPRODURRE IL PROCESSO METASTATICO E LA SUCCESSIVA INVASIONE E COLONIZZAZIONE DELL’ORGANO BERSAGLIO
• I MODELLI CHE SI USANO COMUNEMENTE PERMETTONO DI INOCULARE CELLULE TUMORALI DIRETTAMENTE NELL’ANIMALE IN DIVERSE PARTI DEL CORPO:
• INTRAMUSCOLO INTRASPLENICA• INTRAPERITONEALE ENDOVENA• INTRAOCULARE SOTTOCUTANEA
Tumore primario indotto con inoculo intramuscolare di cellule di melanoma murino
Parametri:
Volume,Peso,Aspetto, angiogenesi, necrosi
MODELLI ANIMALE DI MELANOMA
• Due modelli animali sono utilizzati per lo studio del melanoma:
• Il modello polmonare
• Il modello splenico
Animali
• I topi del ceppo C57BL/6 sono utili se si usano linee cellulari di melanoma murino (B16-F10;B16-FLr6)
• Utilizzando topi singenici, cioè dai quali sono state ottenute le linee tumorali, è ridotto drasticamente il fenomeno del rigetto.
• *individui della stessa specie che sono geneticamente identici, per esempio animali dello stesso ceppo consanguineo. Cellule proveniente da individui singenici possono essere usate per modelli di trapianto d'organo e tumorali.
C57BL/6
Modello splenico
• Una sospensione di cellule di melanoma viene iniettata direttamente nella milza dell’animale.
• Le cellule di melanoma passano in circolo e invadono il fegato.
• Le metastasi sono visibili poichè ricche di melanina nera.
Modello Polmonare
• Le cellule di melanoma murino C57BL/6 sospese nel mezzo di coltura vengono iniettate endovena nella vena caudale dell’animale.
• Attraverso il circolo raggiungono un solo organo bersaglio: il polmone
• Anche in questo caso le metastasi sono visibili poiché ricche di melanina.
metastasi
Polmone di topo C57BL/6 invaso da cellule tumorali di melanoma B16-F10
Valutazione del potere metastatico
• E’ possibile valutare il numero di metastasi superficiale per mezzo di una conta visiva. Il metodo risulta empirico e poco preciso in particolare in presenza di un alto numero di metastasi.
• E’ necessario considerare che l’organo bersaglio è invaso anche nel suo stroma interno.
• Quindi la conta superficiale è sicuramente poco significativa
Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10
Polmone di topo C57BL/6 invaso da metastasi di cellule B16-F10 trattato con antineoplastici
Modello istologico di valutazione del potere metastatico
• Per poter effettuare una conta delle metastasi attendibile è necessario considerare anche le metastasi interne.
• A tal fine l’organo bersaglio viene sezionato in sottili fettine, per mezzo di un microtomo.
• Il microtomo permette di ottenere fettini sottilissime e trasparenti, denominate “sezioni istologiche seriate”
Sezioni istologiche seriate di polmone di topo C57BL/6 inoculato con cellule B16-F10
Analisi di immagine computerizzata
• Ogni singola sezione viene analizzata al computer con un software adatto per la misura di cinque parametri principali:
• 1. area della sezione istologica
• 2. area delle metastasi
• 3. numero di metastasi
• 4. area occupata dalle metastasi
• 5. percentuale di colonizzaione
Elaborazione morfometrica
• Il computer elabora i parametri precedenti e il risultato permette di valutare:
• 1. area totale della sezione istologica (TA)
• 2. area media di una metastasi (AAMF)
• 3. area metastatica totale (TMA)
Invasione e proliferazione
• IL modello di calcolo nasce da due considerazioni:
• La cellula tumorale invade l’organo bersaglio e quindi inizia a proliferare.
• L’invasione può essere valutata considerando il numero di metastasi
• Mentre la proliferazione valutando le dimensioni delle metastasi
Elaborazione dei dati
• L’analizzatore di immagini permette quindi di calcolare:
• L’area totale della sezione istologica TA
• L’area metastatica totale MTA
• L’area media di una metastasi AAMF.
• Attraverso questi parametri si ricavano tre indici.
Indice di invasione
• Il rapporto • TMA/AAMF
• Si definisce Indice di Invasione o “Invasion Index” (II)
• II=TMA/AAMF
• TMA= area metastatica totale• AAMF= area media di una metastasi
Invasione
• Infatti il rapporto TMA/AAMF definisce il numero di metastasi totale, poiché deriva da:
• TMA= area metastatica totale
• AAMF= area media di una metastasi
Indice di proliferazione
• Il rapporto
• AAMF/TA• Si definisce come indice di crescita o “Growth
Index” (GI)
• GI=AAMF/TA
• AAMF= area media di una metastasi• TA= area totale della sezione istologica
Indice di colonizzazione
• Il rapporto
• TMA/TA x 100
• Esprime la percentuale di colonizzazione, indicando quanta area è stata occupata dalle metastasi. Si indica come %CI
• TMA= area metastatica totale• TA= area totale della sezione istologica
Applicazione praticaDue molecole con potenziale attività antineoplastica sono state saggiate e hanno dato i seguenti indici:
Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index)
Controllo 33,6 110 30,6
Teofillina (TH) 7,9 90 7,5
Controllo 33,2 110 150,0
Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0
Colonizzazione proliferazione invasione
teofillina
• Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index)
• Controllo 33,6 110 30,6
• Teofillina (TH) 7,9 90 7,5
• -76,5% -18% -75,5%
• % di: colonizzazione proliferazione invasione
• La molecola risulta essere antimetastatica e poco antiproliferativa
Beta-teofillina
• Molecola %CI (col. Index) GI(growth index) II (invasion index)
• Controllo 33,2 110 150,0
• Βeta-teofillina (HET) 5,7 120 24,0
• % di: -82,8% 0% -84%
• colonizzazione proliferazione invasione
• La molecola risulta essere altamente antimetastatica e non influenza la crescita tumorale
Confronto fra molecole
• E’ possibile comparare gli indici di varie molecole potenzialmente antineoplastiche.
• In tal modo si può utilizzare un farmaco mirato per il tipo di tumore.