SVEUČILIŠTE U ZAGREBU

PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET

BIOLOŠKI ODSJEK

Adrijana Perković

PRIMJENA MIKRO-ČESTICA ZEOLITA A U REGULACIJI GLIKEMIJE DIJABETIČNIH MIŠEVA SOJA NOD

Diplomski rad

 

 

 

 

 

Zagreb, 2014.

 

Ovaj rad izrađen je na Zavodu za molekularnu medicinu Instituta ˝Ruđer Bošković˝ u Zagrebu u Laboratoriju za molekularnu endokrinologiju i transplantaciju pod vodstvom dr. sc. Marijane Popović Hadžija, više znanstvene suradnice IRB-a, predan je na ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra molekularne biologije.

 

Ovim putem najsrdačnije bih htjela zahvaliti svojoj mentorici dr.sc. Marijani Popović

Hadžiji na velikom povjerenju, podršci i dragocjenim savjetima prilikom izrade i pisanja ovog

rada.

Zahvljujem dr. sc. Mirku Hadžiji na stručnom vodstvu i pruženoj prilici kojom sam

stekla vrijedno iskustvo u znanstvenom radu.

Nadalje, željela bih zahvaliti Marini Marš za veliku pomoć tijekom eksperimentalnog

rada i na ugodnom društvu. Također, željela bih zahvaliti dr.sc. Alfredu Švarcu na velikoj

pomoći prilikom rada s microPET kamerom.

Ponajviše zahvaljujem svojim dragim roditeljima i obitelji koji su mi uvijek bili najveća

podrška u životu i za to sam im neizmjerno zahvalna. Bez njih ne bih bila ovdje gdje jesam,

zato; hvala vam!

 

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA ________________________________________________________________

Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Diplomski rad

Primjena mikro-čestica zeolita A u regulaciji glikemije dijabetičnih miševa soja NOD

Adrijana Perkovic

Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Hrvatska

Šećernu bolest karakterizira nemogućnost tijela da proizvodi i/ili pravilno upotrebljava

hormon inzulin. Posljedica je povećana koncentracija glukoze u krvi. U našem radu koristili

smo miševe NOD koji spontano razviju šećernu bolest tipa 1 i za regulaciju bolesti dobivaju

inzulin. Unatoč inzulinu, koncentracija glukoze je viša od preporučene, i zato za bolju

regulaciju bolesti treba iskoristiti još neki fiziološki proces. Stoga smo istražili mogućnost

(barem djelomične) inhibicije apsorpcije glukoze. Koristili smo kalcijev oblik zeolita A.

Svojstvo vezanja natrija u strukturu zeolita smo iskoristili budući se zna da je za ulazak

glukoze u stanicu i dalje u krv, potreban natrij. Hipoteza je bila da ćemo obradom sa zeolitom

smanjiti koncentraciju iona natrija u probavnom traktu. Direktan učinak zeolita na apsorpciju

glukoze pratili smo mjereći glukozu nakon hranjenja i nakon testa tolerancije glukoze.

Rezultati su u oba slučaja pokazali bolju niži nivo šećera u krvi kod dijabetičnih miševa koji

su primali zeolit A. Snimanjem anesteziranih životinja microPET metodom pokazali smo da

se radioaktivno obilježena glukoza, nakuplja u mokraćnom mjehuru u znatno većoj mjeri ako

su miševi dobili sondu Ca zeolita. Rezultati ovog rada jasno pokazuju pozitivan učinak

primjene Ca zeolita A u regulaciji glikemije kod miševa oboljelih od šećerne bolesti.

( 30 stranica, 18 slika, 31 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)

Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici Ključne riječi: Diabetes mellitus, Ca zeolit A, microPET, NOD miševi Voditelj: Dr. sc. Marijana Popović Hadžija, viša zn. suradnica Suvoditelj rada: Dr. sc. Nada Oršolić, Prof. Ocjenitelji: Dr. sc. Nada Oršolić, Prof. Dr. sc. Gordana Lacković-Venturin, Prof. Dr. sc. Dubravko Pavoković, doc.

Rad prihvaćen: 6. studenog 2014.

 

BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb Faculty of Zagreb Department of Biology Graduation Thesis

The application of zeolite A micro-particles in the regulation of glycemia in

diabetic NOD-mice

Adrijana Perković Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb, Croatia

Diabetes is characterized by the inability of the body to produce and/or properly use the

hormone insulin. The result is an increased concentration of glucose in the blood. We used

NOD mice that spontaneously developed type 1 diabetes and received insulin for the

regulation of the disease. Despite today’s therapy glucose level was higher than

recommended, and therefore it was necessary to take advantage of some other physiological

processes in order to regulate the disease more efficiently. We investigated the ability to

inhibit glucose absorption by the treatment with calcium zeolite A. The property of sodium

binding was used because it is known that sodium is required for the entry of glucose into the

cells. The hypothesis was that we would reduce the concentration of sodium ions in the

gastrointestinal tract with the help of the zeolite treatment. The direct effect of Ca zeolite at

the absorption of glucose was monitored by measuring glucose concentration after eating

and OGTT. Results have shown better disease control in diabetic mice treated with zeolite.

By recording anesthetized animals with the microPET method, we showed that radioactively

labeled glucose accumulated to a greater extent in the bladder if the mice received the

zeolite probe. The results of this study clearly demonstrate the positive effect of applying of

micro particles Ca zeolite A on blood glucose levels in mice with diabetes.

(30 pages, 18 figures, 31 references, original in: Croatian) Thesis deposited in Central Biological Library Keywords: Diabetes mellitus, Ca zeolite A, microPET, NOD mice Supervisor: Dr. sc. Marijana Popović Hadžija, senior research associate Assistant supervisor: Dr. sc. Nada Oršolić, Prof. Reviewers: Dr. sc. Nada Oršolić, Prof. Dr. sc. Gordana Lacković-Venturin, Prof. Dr. sc. Dubravko Pavoković, doc. Thesis accepted: 6th November, 2014.

 

SADRŽAJ:

1. UVOD 1 1.1. Šećerna bolest 1

1.1.1. Šećerna bolest tipa 1 1 1.2. Miševi soja NOD 2 1.3. Prijenosnici glukoze 3 1.4. Pozitronska emisijska tomografija 5 1.5. Kalcijev oblik zeolita A 6

2. HIPOTEZA I OPĆI I SPECIFIČNI CILJEVI RADA 7

3. MATERIJALI I METODE 8 3.1. Pokusne životinje 8 3.2. Određivanje koncentracije glukoze u krvi 8 3.3. Obrada miševa 9 3.4. Test tolerancije glukoze 10 3.5. Atomska apsorpcijska spektrometrija 10 3.6. Boravak miševa u metaboličkim kavezima 12 3.7. Snimanje microPET kamerom 12

4. REZULTATI 15 4.1. Pokusni model i obrada životinja 15 4.2. Test tolerancije glukoze 15 4.3. Učinak sonde Ca zeolita A na glukozu metabolizma miša 16 4.4. Mjerenje slobodnog kationa Ca2+ u in vitro uvjetima 17 4.5. Boravak miševa u metaboličkim kavezima 18 4.6. Snimanje životinja microPET kamerom 20

5. RASPRAVA 23

6. ZAKLJUČCI 26

7. LITERATURA 27 ŽIVOTOPIS 30

 

1    

1.UVOD

1.1. Šećerna bolest

Šećerna bolest (lat. Diabetes mellitus) je kronično stanje koje je uzrokovano nemogućnosti

tijela da proizvodi i/ili iskoristi inzulin [1]. Posljedica je povećana koncentracija glukoze u plazmi što čini

stanje hiperglikemije. To je stanje u kojem je koncentracija glukoze u plazmi mjerena natašte ≥7,0

mmol dm-3, odnosno ≥11,1 mmol dm-3 nakon testa tolerancije glukoze. Iako su slučajevi obolijevanja

od šećerne bolesti zabilježeni u svim dijelovima svijeta, učestalost bolesti najviša je u razvijenim

zemljama. Štoviše, globalni trend rasta broja oboljelih od šećerne bolesti poprima epidemijske

razmjere. Tako je 2010. godine u svijetu bilo 285 milijuna oboljelih, a očekuje se da će do 2030.

oboljeti gotovo 500 milijuna ljudi. Prije je razvoj šećerne bolesti bio povezan sa starijom životnom dobi,

a danas zahvaća i mlađi dio populacije te je bolest postala jedan od glavnih uzroka prerane smrtnosti

[2].

Šećerna bolest dijeli se u dvije glavne skupine:

1. Šećerna bolest tipa 1 (engl. insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) čiji je uzrok potpuni

nedostatak sinteze i sekrecije inzulina,

2. Šećerna bolest tipa 2 (engl. non-insulin-dependent diabetes mellitus, NIDDM) čiji je uzrok

promjena inzulina ili inzulinskog receptora što uzrokuje smanjenu osjetljivost ciljnog tkiva na

metaboličke učinke inzulina. Ta smanjena osjetljivost zove se inzulinska rezistencija. Šećerna

bolest tipa 2 je učestalija i zahvaća oko 90% svih bolesnika oboljelih od šećerne bolesti. U

većini slučajeva pojavljuje se u dobi između 50-60 godina starosti i u pravilu ima postupni tijek

razvoja [4].

Općenito, glavno svojstvo šećerne bolesti su stanja hiperglikemije kojima je pacijent izložen, a

povezano je s ireverzibilnim oštećenjima organa i organskih sustava, poremećajem njihovog rada i

naposljetku otkazivanjem funkcije organa od kojih su najugroženiji: oko, bubreg, živci, krvne žile itd..

To je heterogeni sindrom koji nastaje međudjelovanjem niza okolišnih čimbenika i velikog broja gena

[3].

Ovaj rad napravljen je na animalnom modelu spontano razvijene šećerne bolesti tipa 1 te će stoga

u daljnjem tekstu, ovaj tip bolesti biti detaljnije opisan.

1.1.1. Šećerna bolest tipa 1

Šećerna bolest tipa 1 (u tekstu i dijabetes tipa 1) je kronična, autoimuna, metabolička bolest koja

nastaje zbog razaranja β-stanica Langerhansovih otočića gušterače, koje su zadužene za proizvodnju

inzulina [5]. Nedostatak inzulina u perifernoj krvi ima za posljedicu gubitak kontrole koncentracije

glukoze u krvi, što dovodi do akutnih stanja kao što su stanja ketoacidoze i stanja hiperglikemije.

Trajna hiperglikemija vodi do pojave sekundarnih komplikacija kao što su bolesti krvožilnog sustava,

sljepoća i otkazivanje bubrega [6]. Šećerna bolest tipa 1 zahvaća 5-10% ljudi od ukupnog broja

 

2    

oboljelih od šećerne bolesti. Učestalo se pojavljuje se kod djece i mlađih osoba, iako razvoj bolesti u

odrasloj doba nije isključen ako postoji genska predispozicija. Šećerna bolest tipa 1 nastaje združenim

djelovanjem genskih, imunoloških i okolišnih čimbenika [7]. Tome u prilog govori činjenica da se javlja

u genski predisponiranih osoba uz postojanje okolišnih okidača (infekcije, vakcine, toksini,

prehrambene navike itd.). Vlastiti imunološki sustav selektivno napada β-stanice Langerhansovih

otočića i oštećuje ih u toj mjeri da se reducira ili potpuno dokine proizvodnja inzulina [5]. Iako je brzina

razaranja β-stanica promjenjiva (brže je kod djece i mladih nego kod odraslih), šećerna bolesti tipa 1 u

pravilu ima agresivniji tijek bolesti od šećerne bolesti tipa 2. Klinički simptomi bolesti se pojavljuju tek

kada je uništeno 60-80% β-stanica.

Poznato je da se u autoimunom procesu tijekom razvoja šećerne bolesti tipa 1 uključuje

humoralna i stanična imunost, dok se manje zna o mehanizmu pokretanja autoimune rakcije. Teorija

molekularne mimikrije zagovara ideju istovremenog predočavanja vlastitih antigena (β-stanica) i

stranih antigena (primjerice virusnih), što čini novu „kombinaciju“ koju imunološki sustav prepoznaje

kao stranu te dovodi do gubitka tolerancije na vlastito i razvoja šećerne bolesti tipa 1. Druga,

citokinska hipoteza, smatra da promijenjena ekspresija kostimulacijskih, adhezijskih molekula ili

molekula glavnog sustava tkivne snošljivosti (engl. MHC major histocompatibility complex, HLA,

human leukocyte antigen) potakne razvoj bolesti, budući su citokini regulatori i medijatori imunoloških

procesa [8]. Bez obzira koja teorija ima relevantnije znanstvene temelje, poznato je da se u

autoimunom tipu šećerne bolesti prvo regrutiraju autoreaktivni CD4+ i CD8+ limfociti, a zatim i B

limfociti koji proizvode autoantijela, što u konačnici vodi do uništenja β-stanica [5,8]. Međutim,

nedavno su otkrivene Treg stanice, zadužene za reguliranje reakivnosti efektorskih T stanica u svrhu

zaštite vlastitog organizma [6].

Šećerna bolest tipa 1 javlja se češće u najbližih rođaka oboljelih, što samo ukazuje na važnost

naslijeđenih gena. Popis poznatih gena kandidata povezanih s oboljevanjem je prilično dug i

konstantno se povećava ukazujući na heterogenost bolesti [9]. Pri tome, utjecaj pojedinog gena na

razvoj bolesti može biti malen. Čini se da je važniji združeni učinak alela na multiplim genskim

lokusima. Tako primjerice, geni HLA regije (posebice geni klase II HLA-DR i HLA-DQ) imaju visoki

stupanj povezanosti s razvojem bolesti ali ne i presudan. Dodatni utjecaj drugih genskih lokusa, u

prvom redu INS-VNTR, CTLA-4 te PTPN22, doprinosi otpočinjaju autoimunog procesa [7].

Šećerna bolest tipa 1 javlja se u 50% jednojajčanih blizanaca, što samo pokazuje da osim

genske podloge, koja je ista u jednojajčanih blizanaca, u razvoju bolesti važnu ulogu imaju i okolišni

čimbenici (proteini iz kravljeg mlijeka, vitamin D, izlaganje suncu, česte infekcije...) [5,10].

1.2. Miševi soja NOD

Tijekom posljednjih 25 godina dva ključna (ali ne i jedina) animalna modela, NOD (engl. non-

obese diabetic) miš i BB (engl. bio breeding) štakor, su se koristili i još uvijek koriste u istraživanju

genetike, patofiziologije i okolišnih utjecaja na razvoj šećerne bolesti. Zahvaljujći istraživanjima na

 

3    

animalnom modelu puno toga se, iako ne sve, zna danas o mehanizmu nastanka i tijeka bolesti, što je

pridonijelo razvoju učinkovitije terapije [11].

Miševi soja NOD korišteni su i u ovom istraživanju. Specifični su po tome što su podložni

spontanom razvoju šećerne bolesti tipa 1, koja ima iste karakterstike kao šećerna bolesti tipa 1 u ljudi.

Patogeneza bolesti ovog soja miša također u velikoj mjeri odgovara onoj u ljudi te je stoga ovaj

animalni model znanstveno priznat. Bolest se razvija infiltracijom limfocita u Langerhansove otočiće

gušterače (Slika 1), dok se razaranje β-stanica u otočićima događa putem direktne citotoksičnosti (Fas

ligand i perforin/granzim) i preko indirektnih medijatora (proupalni citokini i nastajanje slobodnih

radikala).

Slika 1. Langerhansovi otočići gušterače miša NOD bez (a) i sa infiltracijom limfocita (strelica, b,c,d).

(Preuzeto iz Laboratorija za molekularnu endokrinologiju i transplantaciju, IRB.)

Pri tome su CD4+ i CD8+ limfociti krajnje efektorske stanice. Nakon što bude uništena većina

Langerhansovih otočića, bolest se manifestira hiperglikemijom i mora se odmah započeti terapijom

inzulinom [12].

1.3. Prijenosnici glukoze

Glukoza je glavni izvor energije (od bakterija do ljudi), a za održavanje homeostaze glukoze u

tijelu čovjeka potrebna je kompleksna, visoko integrirana međureakcija između jetre, mišića, adipocita,

gušterače, bubrega i neuroendokrinog sustava. Transport glukoze kroz plazmatsku membranu

olakšavaju prijenosnici glukoze, koji čine transmembranski proteini, a dijele se na dvije proteinske

obitelji: GLUT (engl. glucose transporter) i SGLT (engl. sodium-dependent glucose cotransporter) [13].

 

4    

Njima je koncentracija glukoze u organizmu regulirana na dva načina; kontroliraju unos glukoze

(crijevo, bubreg) ali reguliraju i otpuštanje glukoze iz jetre kada se koncentracija glukoze u krvi smanji.

Glukoza se nakon probave apsorbira u tankom crijevu i reapsorbira iz glomerularnog filtrata [14], što

čini adaptivni mehanizam koji osigurava dovoljnu količinu energije za vrijeme perioda gladovanja. Ovaj

mehanizam, koji u normalnom stanju služi za održavanje homeostaze, kod pacijenta oboljelog od

šećerne bolesti dovodi do pogoršanja kliničke slike. Naime, hiperglikemija pogoduje povećanje

ekspresije SGLT u tankom crijevu i proksimalnim tubulima bubrega [15]. Od svih opisanih izoformi

SGLT membranskih proteina, najviše su istraženi SGLT1 i SGLT2.

Protein SGLT1, kodiran genom SLC5A1, u najvećoj mjeri se nalazi u tankom crijevu iako je

nađen i u bubregu, parotidnim i submandibularnim žlijezdama i u srcu [16]. To je transmembranski

protein veličine 75 kDa koji se sastoji od 14 transmembranskih alfa podjedinica. Specifičnost ovog

prijenosnika je da ima visok afinitet za glukozu ali mali kapacitet prijenosa. Za prijenos jednog mola

glukoze pomoću ovog transportera potrebna su dva mola natrija. U novije vrijeme dokazano je kako

usporedno s prijenosom natrija i glukoze teče i prijenos vode [17]. Protein SGLT2, kodiran genom

SLC5A2, najviše je zastupljen u luminalnoj membrani proksimalnih tubula bubrega. U nekoj, ali puno

manjoj mjeri, ispoljen je i u mlječnim žlijezdama, jetri, plućima, tankom crijevu, skeletnim mišićima i

slezeni. Za SGLT2 karakteristično je da ima mali afinitet za glukozu ali zato ima veliki kapacitet

prijenosa; za prijenos jednog mola glukoze potreban je jedan mol natrija [18].

Shematski prikaz prijenosa glukoze u tankom crijevu putem SGLT/GLUT prijenosnika

prikazuje Slika 2. Na+/K+ pumpa u bazolateralnoj membrani koristi energiju iz ATP za prijenos natrija

protivno njegovom gradijentu, čime se osigurava niska koncentracija natrija u enterocitima. Nastali

elektrokemijski gradijent natrija pogoduje ko-transportu Na+ ali istovremeno i glukoze, preko

membrane epitela tankog crijeva, u enterocite [18]. Nakupljena glukoza u eneterocitima se nadalje

pasivno prenosi iz enterocita u krv preko GLUT-2 receptora koji se nalaze na bazolateralnoj

membrani.

Slika 2.. Shematski prikaz apsorpcije glukoze kroz epitel stanica tankog crijeva u krv.

(Preuzeto iz White J R Clin Diabetes 2010;28:5-10.)

 

5    

U stanju hiperglikemije, što karakterizira šećernu bolest, ekspresija prijenosnika glukoze

SGLT/GLUT je znatno povećana. Neki radovi navode čak i do 4 puta [19,20]. Kao rezultat toga,

kapacitet apsorpcije glukoze u krv je znatno veći u odnosu na normoglikemično stanje, što dodatno

doprinosi povećanju ionako visoke koncentracije glukoze u plazmi. Prema nekim istraživanjima

apsorpcija/reapsorpcija glukoze u oboljelih od šećerne bolesti je čak 20% - 40% viša nego u zdravih

osoba [17]. Stoga, ne čude mnogobrojna istraživanja u kojima se spomenuti prijenosnici glukoze

nastoje iskoristiti kao ciljna mjesta terapije, a sve u svrhu bolje regulacije glikemije a time i prevencije

kasnih komplikacija.

1.4. Pozitronska emisijska tomografija

Pozitronska emisijska tomografija (engl. Positron Emission Tomography, PET) je relativno

nova dijagnostička metoda u nuklearnoj medicini koja daje trodimenzionalnu sliku funkcionalnih

procesa u tijelu. Osobitost ove metode je što se njome prati metabolizam (dinamika) obilježene

biomolekule in vivo u realnom vremenu [21]. Zbog tog svojstva, PET metoda čini zapravo poveznicu

između metoda kompjutorske tomografije (engl. computed tomography, CT) i nuklearne magnetske

rezonancije (engl. Magnetic Resonance Imaging, MRI) koje se koriste za analizu tvrdih odnosno

mekih tkiva (Slika 3).

Slika 3. Usporedba CT, MRI i PET dijagnostičkih metoda korištenih u medicini.

(Dobiveno ljubaznošću dr. sc. Švarca, znanstvenog savjetnika, IRB). CT- kompjutorska tomografija, MRI – nuklearna magnetska rezonancija, PET – pozitronska emisijska tomografija

 

6    

Bio-molekulu čiju aktivnost želimo pratiti PET metodom, potrebno je radioaktivno obilježiti.

Jedna od najčešće upotrebljavanih biomolekula je molekula glukoze. Na nju se veže radioizotop.

Fluor-18 je jedan od nekoliko izotopa fluora koji se rutinski koristi za radioaktivno označavanje

biomolekula za PET analizu zbog sposobnosti emitiranja pozitrona i poluživota od 109,8 minuta.

Naime, izotopi su nestabilni te u nastojanju da budu stabilni emitiraju pozitrone, koji pak u spoju sa dva

elektrona emitiraju dva fotona koja se detektiraju. Korištenjem odgovarajućeg računalnog programa

zabilježeni signali daju kvalitativnu i kvantitativnu informaciju o metaboličkoj aktivnosti praćene

biomolekule u određenom tkivu. Ovo je bitno kod praćenja tumora prije i poslije obrade ili može

specificirati regije povećanog nakupljanja biomolekula. Ova metoda je neinvazivna, specifična i može

se ponoviti na istoj jedinki [22].

1.5. Kalcijev oblik zeolita A

Zeoliti su hidratizirani kristalni alumosilikati koji imaju prostorno-mrežnu strukturu sastavljenu

do SiO4 i AlO4 tetraedara međusobno povezanih preko zajedničkih atoma kisika. Specifičnost strukture

zeolita je u postojanju strukturnih šupljina međusobno povezanih kanalima određenog oblika i veličine.

Oblik i veličina šupljina i kanala, kao i njihovi međusobni odnosi su konstantni i točno definirani kao

strukturni parametri određenog tipa zeolita. U svoju poroznu strukturu, zeoliti mogu vezati različite

vrste kationa (Na+, K+, Ca2+, Mg2+..), koji se pak mogu zamijeniti s drugim ionima iz otopine. Brojne

vrste zeolita mogu se naći u prirodi ali se mogu i sintetizirati čime je moguće specificirati a tako i

poboljšati njihova svojstva (veličina, oblik, kapacitet adsorpcije…). Upotreba zeolita je velika; u

industriji za pročišćavanje vode, za ekstrakciju dušika iz zraka te u poljoprivredne i medicinske svrhe.

Poznata je tako upotreba QuickClot (Z-Medica, SAD) preparata za zaustavljanje velikog krvarenja iz

vanjskih rana.

U ovom istraživanju korišten je sintetski zeolit A kalcijevog oblika (Ca zeolit A), koji nema

svog prirodnog analoga a dobiven je u Laboratoriju za sintezu novih materijala, Instituta „Ruđer

Bošković“. Uvjeti sinteze strogo su definirani i opisani u znanstvenim radovima članova navedenog

laboratorija [23,24]. Specifičnost i jedinstvenost ovog zeolita je da su čestice okrugle (Slika 4A) s

velikom aktivnom površinom, da su čestice mikro veličine (1-6 µm) (Slika 4B) te da u svojoj poroznoj

strukturi imaju vezan lako zamjenjiv kation kalcija (Ca2+).

Slika 4. A) Eelektronsko-mikrografska slika čestica kalcijevog oblika zeolita A, B) postotak čestica

definirane mikro veličine. (Preuzeto iz Laboratorija za sintezu novih mateijala, IRB).

 

7    

2. HIPOTEZA I OPĆI I SPECIFIČNI CILJEVI RADA

Učestalost pojave šećerne bolesti dobiva epidemijske razmjere i u projekciji Svjetske

zdravstvene organizacije je da će 2030. godine broj oboljelih u svijetu biti oko 500 milijuna. Danas su

u upotrebi brojne vrste inzulina bez kojeg bi terapija, posebice šećerne bolesti tipa 1, bila nezamisliva.

Međutim, u kombinaciji s inzulinom u upotrebi su još oralni antidijabetici te ostali dijetetski/dijabetološki

preparati. Ali i unatoč tome nije postignuta takva regulacija glikemije koja bi dosegnula stupanj

regulacije jednak onom u zdravom organizmu što bi samim time preveniralo i razvoj kasnih

komplikacija, a što bitno narušava kvalitetu života oboljelih te izaziva preranu smrt.

Brojna istraživanja stoga ulažu velike napore kojima se nastoji pronaći i/ili testirati nove

spojeve (prirodne ili sintetske) koji bi djelovali na već poznata ili nova terapijska mjesta kako bi,

poštujući normalne metaboličke procese, regulacija glukoze u krvi bila što bliža fiziološkim uvjetima.

Ovaj rad predstavlja jedno takvo istraživanje u kojoj je ispitano da li se specifična svojstva

sintetske supstance mogu iskoristiti u svrhu regulacije fiziološkog procesa. Detaljnije, u ovom radu

korišten je sintetski kalcijev oblik zeolita A, koji zbog specifičnih i strogo definiranih uvjeta sinteze

(Laboratorij za sintezu novih materijala, IRB) ima jedinstvene karakteristike; čestice su mikroveličine,

okruglog oblika u čiju poroznu strukturu je vezan kation Ca2+. U otopinama je dokazan veliki kapacitet

zamjene kationa Ca2+ s nekim drugim kationima, posebice s kationima natrija. S druge pak strane je

poznato, da prijenosnici glukoze u tankom crijevu i proksimalnim tubulima bubrega (SGLT) koriste

gradijent kationa Na+ za apsorpciju/reapsorpciju glukoze. Drugim riječima, kationi Na+ su potrebni da

bi glukoza ušla u stanicu, a zatim i u krv. Naša je hipoteza stoga bila, da se in vivo korištenjem

kalcijevog oblika zeolita A, kationi Na+ iz lumena crijeva mogu vezati u mikropore zeolita i tako

smanjiti koncentraciju kationa Na+ potrebnih za aktivni transport glukoze. To bi posljedično trebalo

doprinijeti boljoj regulaciji glukoze. U svrhu ispitivanja postavljene hipoteze koristili smo mišji model

(NOD miševi) spontane šećerne bolesti tipa 1.

Ciljevi ovog rada bili su:

1. ispitati ima li primjena kalcijevog oblika zeolita A tijekom 14 dana učinak na smanjenu

apsorpciju glukoze a time i na njenu nižu koncentraciju u krvi dijabetičnih miševa

2. in vitro ispitati je li dobiveni učinak (između ostalog) posljedica zamjene kationa Ca2+ iz

zeolita A s kationima tankog crijeva

3. ispitati ima li obrada miševa Ca zeolitom A učinak na metaboličke parametre tijekom 24

sata

4. snimiti smještaj radioizotopom obilježene glukoze (microPET) u miševa koji su tretirani Ca

zeolitom A i utvrditi postoje li razlike u odnosu na miševe koji nisu bili tretirani.

 

8    

3.MATERIJAL I METODE 3.1. Pokusne životinje

U ovom radu korišteni su miševi soja NOD/ShiLtJ (H-2d) (engl. non-obese diabetic), ženskog

spola, uzgojeni u Pogonu laboratorijskih životinja, Instituta „Ruđer Bošković“. Miševi ovog soja, i to

najčešće ženke (do 70%), spontano razvijaju šećernu bolest tipa 1, pri starosnoj dobi od 8 do 12

tjedana. Stoga je NOD ženkama te starosne dobi, jednom tjedno, testiran urin test trakicama (Keto-

Diabur test 5000, Roche) na prisutnost glukoze. Životinje koje su bile pozitivne na prisutnost glukoze u

urinu uzete su u pokus, a točna koncentracija glukoze određena je u uzorku krvi uzetog iz repne vene.

Istovremeno je uspostavljena i kontrolna skupina miševa. Tu skupinu čine NOD miševi iste starosne

dobi i spola koji, međutim, nisu imali glukozu u urinu a niti povišenu koncentraciju glukoze u krvi. Svim

životinjama praćena je i tjelesna težina. Životinje ne razvijaju šećernu bolest sinhrono, te su stoga

životinje ulazile u studiju sukcesivno kada je bolest otkrivena. Svakoj grupi dijabetičnih životinja

pridružena je i skupina kontrolnih miševa. Ova studija trajala je u periodu od listopada 2012. do travnja

2013. godine.

Etičko povjerenstvo Instituta „Ruđer Bošković“ odobrilo je provođenje pokusa na animalnim

modelima prilikom odobravanja MZOŠ projekata broj 098-0982464-2460 te su svi pokusi u cijelosti

provedeni sukladno Zakonu o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe.

Osoblje koje je provodilo i nadziralo eksperimente i vodilo brigu o životinjama ima položen program

osposobljavanja (brojevi potvrde: 5.2-13, HR 191/02/P i 17.3-13, HR 191/02/P).

3.2. Određivanje koncentracije glukoze u krvi

Za određivanje točne koncentracije glukoze u krvi korištena je metoda glukoza-oksidaza-

peroksidaza [25]. Metoda se temelji na enzimskoj oksidaciji glukoze iz krvi pomoću glukoza oksidaze

pri čemu nastaje vodikov peroksid. U sljedećem koraku nastali vodikov peroksid uz peroksidazu i

supstrat formira crvenu boju. Intenzitet obojenja, koji je proprocionalan koncentraciji glukoze, mjeri se

spektrofotometrijski (Slika 5).

Glukoza + O2 + H2O oksidaza glukoze glukonska kiselina + H2O2

H2O2 + HBA + 4-AAP peroksidaza quinoneimin + H2O

HBA – 4-  hidroksibenzojeva kiselina

4-APP- 4-aminoantipirin

Slika 5. Shematski prikaz reakcije oksidacije glukoze.

 

9    

Miševima je određena koncentracija glukoze u krvi nakon perioda gladovanja od 12 sati. To

znači da miševi nisu imali pristup hrani noću, kada su ove životinje vrlo aktivne i intezivno se hrane.

Miševi su ostavljeni samo kratko vrijeme pod lampom da se zagriju, a krvne žile dilatiraju. Svaki miš

pojedinačno je potom smješten na stalak koji ostavlja tijelo životinje slobodno, dok se rep provuče kroz

prorez i lagano zareže. Svakoj životinji je pipetom, iz repne vene, uzet uzorak krvi od 0,025 mL.

Uzorak krvi se prebaci u prethodno pripremljenu epruvetu sa 1 mL 3% trikloroctene kiseline (TCA,

Kemika, Republika Hrvatska). Svi uzorci stoje najmanje 10 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim se

centrifugiraju 10 minuta na 1500 g. 200 µL supernatanta se prebaci u novu epruvetu te se u sve

uzorke uključujući i standard (0.1% otopina glukoze u 3% TCA) i slijepu probu (reH2O) doda 2 mL

enzimskog reagensa (Thermo Scientific, Velika Britanija). Enzimska reakcija razvija se kroz 30 minuta

u mraku, nakon čega se mjeri apsorbancija uzoraka na spektrofotometru (Camspec M 330, Velika

Britanija) kod valne duljine 540 nm.

Koncentracija glukoze se izračunava prema formuli:

Uzorak/standard*100/18,02= mmol dm-3

Koncentracija glukoze natašte, viša ili jednaka 7.0 mmol dm-3, karakterizira prisutnost šećerne

bolesti.

3.3. Obrada miševa

Nakon što je životinjama izmjerena koncentracija glukoze u krvi a time potvrđena

normoglikemija odnosno hiperglikemija, miševi su raspoređeni u tri skupine. U prvoj skupini bili su

kontrolni miševi, bez simptoma hiperglikemije (Kon), dok su dijabetične životinje nasumično

raspoređene u dvije skupine različitog načina obrade(D, D+Zeo).

1. Kontrolna skupina + sonda fiziološke otopine (Kon)

2. Dijabetični miševi + sonda fiziološke otopine (D)

3. Dijabetični miševi + sonda Ca forme zeolita A (D+Zeo)

Sve životinje uključene u ovo istraživanje su svakodnevno primali sondom 0,5 mL fiziološke

otopine ili 50 mg Ca forme zeolita A u volumenu od 0,5 mL reH2O. Obrada je trajala 14 dana.

Dijabetičnim miševima smo nakon testiranja dali 0,25 U inzulina intra muskularno, kako bi im olakšali

regulaciju glikemije.

Princip sondiranja: Intragastralnu sondu čini tanka silikonska plastična i savitljiva cjevčica

promjera 0.25 mm koja je dostatne dužine da može doći do želuca. Cjevčica je pričvršćena na špricu

od 2 mL koja omogućuje aplikaciju te je dovoljno nježna da ne ošteti probavni put miša. Sondiranje

životinja provodili smo u paru – jedna osoba fiksira glavu i trup životinje te drugom rukom, pomoću

plastične pincete, otvori usta životinje koristeći pri tome prednje zube miša. Druga osoba nježno unese

 

10    

sondu u probavni sustav miša i aplicira sadržaj sonde. Budući smo sondiranje miševa dobro uvježbali,

za potrebe ovog pokusa nismo anestezirali životinje. Cijelo vrijeme pokusa miševi su imali slobodan

pristup konvecionalnoj, peletiranoj hrani (Mucedol, Italija) i vodovodnoj vodi, živjeli su u

konvencionalnim kavezima i uvjetima (260C i 55% vlage) s periodičnim izmjenama dana i noći od po

12 sati.

3.4. Test tolerancije glukoze

Ovaj test proveden je na kontrolnim te na dijabetičnim NOD ženkama. Svi miševi su prethodno

bili na gladovanju kroz 12 sati. Nakon toga uzet je prvi uzorak krvi (bazalna vrijednost) na način kako

je prethodno opisano. Nakon toga kontrolni i dijabetični miševi skupine D su sondom dobili otopinu

glukoze (Sigma, Njemačka) finalne koncentracije 1 mg glukoze / g tjelesne težine miša u volumenu od

0,5 mL. Dijabetični miševi skupine D+Zeo su najprije sondom dobili suspenziju Ca zeolita A (25

mg/0,5 mL), a 5 minuta kasnije i otopinu glukoze. Krv iz repne vene miševima vađena je nakon 15, 30,

60 i 120 minuta, a koncentracija glukoze u krvi određena metodom glukoza-oksidaza-peroksidaza.

3.5. Atomska apsorpcijska spektrometrija

To je metoda za kvantitativnu analizu određenog elementa u uzorku, mjerenjem apsorpcije

upadne energije zračenja određene valne duljine koja je specifična i karakteristična za određivani

element. Osnovni elementi ove metode su: izvor zračenja, uređaj za rastavljanje ispitivanog uzorka u

plinovite, slobodne atome i sistem za mjerenje apsorbiranog zračenja (Slika 6).

Slika 6. Shematski prikaz osnovnih elemenata atomske apsorpcijske spektrometrije.

 

11    

Princip metode: izvor zračenja je lampa sa šupljom katodom kojom se dobiva energija vrlo

specifične valne duljine zračenja karakterističnog za određeni element. Upadna energija iz jedne takve

šuplje katode ulazi u oblak atoma u plinovitom stanju. Taj oblak atoma je nastao uvođenjem

analizirane otopine u plamen. Plamen uklanja otapalo i prevodi uzorak, koji se ispituje, u slobodne

plinovite atome. Taj oblak slobodnih atoma sposoban je apsorbirati zračenje određene valne duljine.

Mjeri se intenzitet apsorbirane energije i on je proporcionalan s koncentracijom mjerenog elementa u

uzorku. U svrhu mjerenja zamjene kationa Ca2+ iz zeolita s kationima Na+ iz tankog crijeva miša u in

vitro uvjetima, korišten je aparat Analyst 200 (Perkin Elmer).

Korištene su dijabetične ženke NOD miša (N=2). Životinja je eutanazirana plinom u CO2

komori, a potom je tanko crijevo izvađeno u cijelosti. Nakon nježnog potiskivanja crijevnog sadržaja,

crijevo je tri puta isprano u Krebs Ringerovoj otopini pH 7,4, a zatim je (uzdužno) longitudinalno

prerezano škaricama kako bi površina, gdje dolazi do aktivnog transporta glukoze, bila veća (Slika 7).

Tako obrađeno crijevo inkubirano je u Petrijevoj posudici 40 minuta na 37ºC uz 5% CO2 kako bi se

postiglo stanje ravnoteže (engl. steady state) s uvjetima okoline nakon vađenja iz životinje. Nakon

toga su u Petrijevu posudu dodane mikro čestice Ca oblika zeolita A u finalnoj koncentraciji 50 mg mL-

1 . Inkubacija sa zeolitom trajala je 15 minuta prije nego je pokupljeni supernatant centrifugiran 5

minuta na 550 g kako bi se očistio od zaostalih krupnijih čestica koje bi mogle smetati kod mjerenja.

Bistri dio supernatanta prebačen je u novu epruvetu.

Slika 7. Longitudinalni prerez tankog crijeva miša NOD snimljen stereo lupom (Discovery V8, Zeiss,

povećanje 10x).

Bazalna vrijednost kationa Ca2+ mjerena je u Krebs Ringerovoj otopini bez ili sa zeolitom.

Utjecaj biološkog materijala (tankog crijeva) na koncentraciju kationa kalcija također je mjerena bez ili

sa dodatkom zeolita. Svi uzorci nakon inkubacije obrađeni su istovjetno mjereni tri puta, a rezultati su

prikazani kao srednja vrijednost ±standardna devijacija.

 

12    

3.6. Boravak miševa u metaboličkim kavezima

Na kraju perioda obrade miševa kroz 14 dana, miševi su pojedinačno boravili u metaboličkim

kavezima 24 sata. To su posebno dizajnirani kavezi (Slika 8) koji omogućuju praćenje metaboličkih

aktivnosti životinja kroz mjerenje: težine pojedene hrane, volumena izlučenog urina, volumena

popijene vode, težine fecesa. Sve životinje su stavljane u metaboličke kaveze u gotovo isto vrijeme,

nakon obrade (sonda fiziološke otopine, sonda Ca oblik zeolita A). Nakon boravka u metaboličkim

kavezima životinje su premještene u konvencionalne kaveze a parametri izmjereni i zapisani.

Slika 8. Metabolički kavez korišten u ovom istraživanju.

3.7. Snimanje microPET kamerom

Nakon obrade od 14 dana, jedna, nasumično odabrana životinja iz svake eksperimentalne

grupe snimljena je microPET kamerom. Za tu svrhu korišten je 2-deoksi-2-(18F) fluoro-D-glukoza

(18FDG). To je analog glukoze, s pozitronskim zračenjem radioaktivnog izotopa fluora-18, koji je u

sintezi supstituirao hidroksilnu skupinu na 2' položaju u molekuli glukoze (Slika 9).

Slika 9. Molekula glukoze koja na položaju 2' ima zamijenjenu OH-skupinu radioaktivnim

18Fluorom (18FDG).

 

13    

U pokusu je korišten uređaj za anesteziju laboratorijskih životinja (Anesthesia Systems for

Rodents and Small Animals, Kent Scientific, SAD) (Slika 10A) te 2%-tna smjesa inhalatornog

anestetika izoflurana (Forane, Abbott, Velika Brtanija) sa zrakom (Slika 10B).

Slika 10. A) Uređaj za anesteziju miševa. B) Komora za anesteziju miševa u smjesi zraka i izoflurana

18FDG se aplicira u repnu venu ansesteziranog miša (Slika 11). Primjenjeni volumen ovisio je o

intezitetu zračenja sintetiziranog 18FDG, i on je u većini slučajeva bio 200 µL.

Slika 11.. Intravensko ubrizgavanje radioaktivne glukoze u repnu venu miševa.

 

14    

Za praćenje raspodjele 18FDG u tijelu anesteziranog miša u realnom vremenu korišten je

kompletan uređaj za pozitronsku emisijsku tomografiju (Raytest ClearPET, kristal Lyso&LuYAP,

detektor Hamamatsu R7600M64, Njemačka), osjetljivosti 5,7 nano sekundi, namijenjen za predklinička

istraživanja na animalnim modelima (Slika 12 A, B).

Računalnom obradom rezultata snimanja, odredi se raspodjela 18FDG po pojedinim organima, što se

nadalje može koristiti u komparativne svrhe s drugim jedinkama ili u ponovljenom snimanju iste

jedinke.

Slika 12. A) ClearPET uređaj za snimanje animalnih modela. B) Miš tijekom snimanja.

Po završetku snimanja životinje su ostale u posebnoj prostoriji do pada radioaktivnosti na neškodljivu

mjeru, kada se mogu ponovo smjestiti u konvencionalne uvjete animalne jedinice.

 

15    

4. REZULTATI

4.1. Pokusni model i obrada životinja

U ovom radu korišteni su miševi soja NOD karakteristični po svojstvu spontanog razvijanja

šećerne bolesti tipa 1. Životinje su bile raspoređene u tri grupe (Kon, D, D+Zeo) temeljem

koncentracije glukoze u perifernoj krvi koja je na istovjetan način određena svim životinjama.

Početne karakteristike svake grupe miševa prikazuje Tablica 1.

Tablica 1. Karakteristike miševa soja NOD korištenih u ovom radu

Grupe Kon D D+ Zeo

N 10 8 6

Spol ♀ ♀ ♀

Težina tijela (g) 19,2±1,6 16,9±0,65 19,23±1,7

Glukoza u krvi

(mmol dm-3) 6,6±0,4 15,5±3,2 20,7±5,5

Rezultati prikazani kao srednja vrijednost± st. devijacija.

Sve životinje bile su ženskog spola, budući je učestalost bolesti češća u ženki. Tako smo

ujedno eliminirali potencijalne razlike mjerenih parametara koje bi mogle biti ovisne o spolu. Početna

težina miševa bila je podjednaka (Tablica 1). Približna starosna dob miševa bila je od 8 do 12 tjedana,

što je povezano sa spontanim razvojem bolesti.

Miševi kontrolne grupe imali su dobru regulaciju glikemije (početna vrijednost glukoze 6,6

mmol dm-3), dok su miševi obje dijabetične grupe razvili stanje hiperglikemije (Tablica 1). Dijabetični

miševi raspoređeni su nasumično u dvije skupine, i pri tome grupa D+Zeo ima veći raspon u

koncentraciji glukoze (Tablica 1, D vs. D+Zeo).

4.2. Test tolerancije glukoze

Nakon 12-satnog gladovanja, miševima (N=3) svih grupa je određena početna koncentracija

glukoze u krvi (nulta vrijednost). Potom su miševi dobili otopinu glukoze (1 mg g-1 tjelesne težine)

 

16    

apliciranu intraželučanom sondom (Kon, D). Samo D+Zeo grupa dijabetičnih miševa je dobila naprije

sondu Ca zeolita (25 mg/0,5 mL), a 5 minuta kasnije i sondu glukoze. Koncentracija glukoze u krvi

određivana je u vremenskim intervalima 15, 30, 60 i 120 minuta nakon davanja sonde.

Sukladno očekivanjima zdravi miševi nakon primljene glukoze i početnog povećanja glikemije

na 11 mmol dm-3, uspješno reguliraju glikemiju nakon 120 minuta (6,8 mmol dm-3 ), što govori u prilog

dobre homeostaze glukoze (Slika 13, Kon).

Međutim, za dijabetične miševe obje skupine je važno uočiti da koncentracija glukoze u krvi

počne padati nakon 30-te minute, a u zdravom mišu već nakon 15 minuta te da regulacija glukoze nije

tako rapidni proces kao u zdravih miševa (Slika 13, usporedba Kon vs. D, D+Zeo). Pri tome je

smanjenje razine glukoze jače kod dijabetičnih miševa koji su dobili sondu Ca zeolita A (oko 5 mmol

dm-3), nego kod dijabetičnih miševa bez obrade sa zeolitom (oko 4 mmol dm-3). Nakon 120-te minute

od apliciranja egzogene glukoze, koncentracija glukoze u krvi svih testiranih miševa bila je za oko 2

mmol dm-3 viša od početne vrijednosti (Slika 13).

Ovi in vivo rezultati sugerirali su pozitivan učinak luminalno primjenjenog Ca zeolita A na

apsorpciju egzogene otopine glukoze (Slika 13, usporedba D i D+Zeo).

0 20 40 60 80 100 1200

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

gluk

oza

(mm

ol d

m-3)

vrijeme (minute)

Kon D D+Zeo

Slika 13. Vrijednosti koncentracije glukoze u krvi miševa nakon testa tolerancije glukoze.

4.3. Učinak sonde Ca zeolita na glukozu metabolizma miša

Da bi ispitali kakav je direktan učinak sonde Ca zeolita A na apsorpciju glukoze kod normalnih

fizičkih i fizioloških aktivnosti, miševima smo nakon aktivnog dijela dana od 12 sati, kada oni

konzumiraju hranu, maknuli hranu 4 sata te izmjerili bazalnu vrijednost glukoze. Nakon toga su miševi

 

17    

dobili sondu ili Ca zeolita A ili fiziološke otopine te smo mjerili koncentraciju glukoze u vremenskim

intervalima 30, 60, 90, 120 i 180 minuta.

Zdravi NOD miševi bili su početno normoglikemični (6 mmol dm-3) i zadržali su dobru

regulaciju glikemije do kraja mjerenja (do 180 minute) (Slika 14, Kon).

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

68

101214161820222426283032343638404244

gluk

oza

(mm

ol d

m-3)

vrijeme (minute)

D D+Zeo Kon

Slika 14. Učinak sonde Ca zeolita A na glukozu iz metabolizma miša.

Nasumično izabrani dijabetični miševi (N=3) obje grupe imali su početno visoku koncentraciju

glukoze (21,2 mmol dm-3 i 39 mmol dm-3) čija se vrijednost tijekom mjerenja dodatno mijenjala (Slika

14, D, D+Zeo). Međutim, treba uočiti da je ta promjena u koncentraciji glukoze bila manje izražena u

dijabetičnim miševima koji su obrađeni sa sondom Ca zeolita A (19-24 mmol dm-3) nego s „lažnom“

sondom fiziološke otopine (34-42-27 mmol dm-3) (Slika 14, usporedba D i D+Zeo). To zapravo moglo

značiti da je Ca zeolit A snizio, početno visoku vrijednost glukoze dijabetičnih miševa te njenu

vrijednost održavao tijekom 180 minuta mjerenja stabilnijom.

Ovi rezultati su dakle pokazali, da Ca zeolit A pridonosi smanjenoj apsorpciji glukoze i nakon

normalnih fizioloških procesa (hranjenje). Štoviše, zapazili smo da razinu glikemije održava stabilnijom

(oscilacije u koncentraciji glukoze su manje).

4.4. Mjerenje slobodnog kationa Ca2+ u in vitro uvjetima

Predhodni rezultat je pokazao da sonda Ca zeolita A može doprinijeti regulaciji glikemije u in

vivo uvjetima. Kako bi ispitali da li bi ta aktivnost barem djelomično mogla ići preko pretpostavljenog

mehanizma zamjene kationa Ca2+, tanko crijevo 2 dijabetična miša smo inkubirali u Krebs-Ringerovoj

otopini sa Ca oblikom zeolita A (15 min), a potom u mediju mjerili koncentraciju slobodnog kationa

Ca2+ atomskom apsorpcijskom spektrometrijom.

 

18    

Med. Med. + Ca Med. + Ca + t.c. Med. + t.c. 0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ca2+

(ppm

)

Slika 15. Koncentracija kationa Ca2+ u Krebs Ringerovoj otopini nakon različitih obrada u in vitro

uvjetima.

Krebs Ringerova otopina (Slika 15) imala je, prema očekivanju, gotovo neznatni sadržaj

kationa Ca2+ (0,02 ppm). Međutim, dodavanjem Ca zeolita A u Krebs Ringerovu otopinu, koncentracija

slobodnih iona Ca2+ naglo se povećala (2,7 ppm) (Slika 15). U otopini u kojem je tanko crijevo miša

inkubirano s Ca zeolitom A, slobodnih iona Ca ima znatno više nego u Krebs Ringerovoj otopini, a s

druge strane manje nego u Krebs Ringerovoj otopini sa Ca zeolitom A (2,2 ppm) (Slika 15). To bi

moglo značiti da se jedan dio iona Ca vezao za membranu tankog crijeva, što treba dalje istražiti.

Ovi rezultati jasno su pokazali da oslobađanje iona Ca2+ iz zeolita zaista postoji u uvjetima

inkubacije u Krebs Ringerovoj otopini, da je mjera slobodnih iona Ca2+ manja u prisustvu tankog

crijeva dijabetičnog miša te da se koncentracija iona kalcija može mjeriti atomskom apsorpcijskom

spektrometrijom. Temeljem prijašnjih navedenih rezultata koji opisuju i bolju regulaciju glikemije uz

sondu Ca zeolita A, potencijalni mehanizam djelovanja uključio bi blokadu aktivnog prijenosa glukoze.

4.5. Boravak miševa u metaboličkim kavezima

Prethodno dobiveni rezultati sugerirali su inhibiciju apsorpcije bar jednog dijela glukoze iz

tankog crijeva, što bi se moralo odraziti na metaboličke parametre. Stoga su miševi svih skupina na

kraju perioda obrade, boravili u metaboličkim kavezima 24 h kako bi se utvrdilo da li postoje razlike u

mjerenim (metaboličkim) parametrima.

Prosječna tjelesna težina miševa na kraju studije bila je neznatno promijenjena u odnosu na

početnu težinu (usporedba Tablice 1 i 2).

 

19    

Tablica 2. Metabolički parametri miševa nakon boravka u metaboličkim kavezima

Kon

D

D+ Zeo

Težina tijela (g)

21±0,62

15,4±0,5

17,2±2,5

Popijena voda(mL)

4±1,6

16 (12-34)

20 (18-40)

Pojedena hrana

(g)

3,05±1,2

3,3±1,7

5,6 (3,2-11,9)

Težina fecesa (g)

0,6±0,1

0,9±0,3

1,4 (1-4,2)

Volumen urina

(mL)

1,8±0,4

13,8±8,7

26,5±5,2

Rezultati prikazani kao srednja vrijednost± st. devijacija ili kao medijan (raspon)

Iz Tablice 2 jasno se vide razlike u volumenu popijene vode između kontrolnih miševa (4 mL) i miševa

oboljelih od šećerne bolesti (prosječno više od 16 mL). Raspon vrijednosti popijene vode bio je veći u

grupi miševa tretiranih sondom Ca zeolita A nego sondom fiziološke otopine, što je moguća posljedica

različitog stupnja razvijenosti bolesti i/ili izlučivanjem veće količine urina zbog neapsorbirane glukoze

(Tablica 2). Veće promjene u težini pojedene hrane i težini fecesa zamijećene su samo u grupi

dijabetičnih miševa koji su tretirani Ca zeolitom A (Tablica 2).

Međutim, treba uočiti značajnu razliku između ispitivanih grupa u volumenu izlučenog urina

(Tablica 2). Zdravi miševi, prema očekivanju, izlučili su značajno manje urina tijekom 24 sata u

usporedbi s bolesnim miševima obje skupine (Tablica 2). Štoviše, dijabetični miševi obrađeni sondom

Ca zeolita A izlučili su značajno više urina (26,5 mL) u usporedbi s dijabetičnim miševima koji su dobili

sondu fiziološke otopine (13,8 mL). (Tablica 2).

Evidentno je da miševi obrađeni sondom Ca zeolitom izlučuju više urina što bi moglo značiti

da se glukoza, koja nije apsorbirana, skuplja u mokraćnom mjehuru.

 

20    

4.6. Snimanje životinja microPET kamerom

Da bi ispitali da li obrada sondom Ca zeolita A zaista ima utjecaj na veće nakupljanje glukoze

u mokraćnom mjehuru koristili smo snimanje microPET kamerom. Snimani su miševi svake

eksperimentalne skupine. Snimalo se u jutarnjim satima a miševi su prije toga bili 2 sata na

gladovanju. Miš iz skupine D+Zeo je dobio sondu Ca zeolita A, a miševi iz preostale dvije skupine su

dobili sondu fiziološke otopine i to neposredno prije pripreme životinja za snimanje. Nakon

inhalatornog anesteziranja svaki miš je dobio 35 MBq µCi radioaktivne glukoze.

Pratili smo raspodjelu radioaktivno obilježene glukoze u realnom vremenu. Uz pomoć

odgovarajućeg programa izmjerena je količina radioaktivne glukoze nakupljene u organu od interesa,

mokraćnom mjehuru.

Slika 16. A) microPET snimka zdravog NOD miša. B) micro PET snimka NOD miša oboljelog od

šećerne bolesti koji je primao sondu Ca zeolita.C) micro PET snimka NOD miša oboljelog od

šećerne bolesti.

Strelicom je označen mokraćni mjehur.

A   B  

C  

 

21    

Tijekom mjerenja od 30 minuta, radioaktivna glukoza u mokraćnom mjehuru nakupljala se u

najmanjoj mjeri u zdravom NOD mišu (Slika16A) te više u dijabetičnim miševima; najviše u mišu koji

je dobio sondu Ca zeolita A (Slika 16B).

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

2

3

4

5

6

7

8G

luko

za (g

/ml)

vrijeme (sekunde)

Kon D D + Zeo

Slika 17. Dinamika nakupljanja 18FDG-a u mokraćnom mjehuru zdravih (Kon) miševa,

miševa oboljelih od šećerne bolesti (D) i miševa oboljelih od šećerne bolesti koji su

primli Ca zeolit (D+Zeo).

Osim navedenog, pronašli smo da postoje razlike i u dinamici nakupljanja radioaktivno

obilježene glukoze obzirom na prethodni tretman miša. Naime, krivulja nakupljanja glukoze u

mokraćnom mjehuru zdravog miša ima rastući tijek; početno rapidniji rast, a kasnije umjereniji (Slika

17 Kon). Dijabetični miš (bez obrade) ne uspijeva u velikoj mjeri izlučiti radioaktivnu glukozu u

mokraćni mjehur (Slika 17 D) već glukoza ostaje u cirkulaciji. Međutim, miš koji je prvo dobio sondu

Ca zeolita A a tek potom radioaktivnu glukozu, ima početno vrlo snažno odlaganje glukoze u

mokraćnom mjehuru (Slika 17 D+Zeo), a kasnije ta dinamika nakupljanja ostaje i dalje vrlo jaka. Pri

tome treba zamijetiti da je početno nakupljanje glukoze u mjehuru miša koji je tretiran Ca zeolitom

rapidnije čak i u usporedbi sa zdravim mišem (Slika 17 usporedba K i D+Zeo).

 

22    

0 5 10 15 20 25 30

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

5,0

5,5

20,7428,02

34,28

38,04

31,9Glu

koza

(g/m

l)

minute

D + Zeo D

Slika 18. Razlike koncentracije 18FDG u mokraćnom mjehuru miševa oboljelih od šećerne bolesti te

miševa oboljelih od šećerne bolesti koji su primili Ca zeolit A.

Rezultati su neupitno ukazali da među ove tri grupe miševa postoje razlike u sposobnosti

odlaganja glukoze u mokraćni mjehur. Ta razlika bila je evidentna kod usporedbe dijabetičnih i

kontrolnih miševa, što je bilo i za očekivati. Međutim, treba naročito istaknuti da razlika postoji i

između dijabetičnih miševa koji su različito obrađeni. Da bi kvantificirali razliku u izlučivanju glukoze u

mokraćni mjehur između dijabetičnih miševa sa i bez Ca zeolita A, koristili smo računalni program koji

je sastavni dio microPET sistema.

Razlika u dinamici nakupljanja glukoze u mokraćni mjehur postoji cijelo vrijeme snimanja

(Slika 18). Međutim, u prvih 5 minuta od injiciranja, ta razlika doseže svoju najveću vrijednost i iznosi

čak 38%. U 25-toj minuti od injiciranja glukoze, miš koji je tretiran sondom Ca zeolita i dalje efikasnije

(za oko 20%) „sprema“ glukozu u mjehur (Slika 18).

Tretman miševa oboljelih od šećerne bolesti tipa 1 sa sondom Ca forme zeolita A ima

pozitivan učinak na regulacije glikemije: smanjenjem apsorpcije/reapsorpcije glukoze i odvođenjem

glukoze u mokraćni mjehur odnosno urin (oslobađanje periferije od hiperglikemije).

 

23    

5. RASPRAVA

Broj oboljelih od šećerne bolesti u neprestanom je porastu, posebice u razvijenim zemljama.

Prema službenom registru, u Republici Hrvatskoj od šećerne bolesti boluje oko 300 000 ljudi. Kod

šećerne bolesti tipa 1 odmah se primjenjuje terapija inzulinom i traje tijekom cijelog života. Pri tome

inzulin regulira primarni uzrok bolest budući su autoimunim procesom uništene β stanice

Langehransovih otočića. Ovo vrijedi i za ljude ali i za ekvivalentni animalni model, miševe soja NOD,

koji smo koristili u ovom radu. U terapiji šećere bolesti tipa 2 može se na početku bolesti primijeniti

neki oralni antidijabetik [30,31] koji uz pravilnu prehranu može dobro regulirati glikemiju. Međutim, s

pogoršanjem bolesti terapija završava uvođenjem inzulina.

Često uz oralne antidijabetike i inzulin nije postignuta takva regulacija glukoze koja bi u

potpunosti odgovarala fiziološkoj regulaciji zdravog organizma. Kao posljedica dugotrajne bolesti javlja

se inzulinska rezistencija i sekundarne komplikacije. Čini se da većina sekundarnih komplikacija

nastaje upravo zbog neprestanih skokova (promjena) koncentracije glukoze u krvi što pridonosi

oštećenju endotelnih stanica krvnih žila [5]. Stoga se u nastojanju što bolje regulacije glikemije

pokušavaju iskoristi i/ili blokirati neki dodatni mehanizmi uključeni u reguliranje koncentracije glukoze.

Mi smo u ovom radu istražili mogu li se jedinstvena svojstva Ca oblika zeolita A iskoristiti za

blokadu prijenosa glukoze u krv. Značaj ove studije je da je provedena in vivo modelu spontane

šećerne bolesti (NOD miševi) te da je Ca zeolit A apliciran sondiranjem. Ovdje treba naglasiti da je

moguća toksičnost njegove primjene in vivo ispitana u ranijim eksperimentima u istom laboratoriju te

istovremeno određena doza koja ima učinak. Također je potvrđeno da najveći afinitet zamjene kationa

kalcija postoji s kationima natrija.

Već nakon kratkotrajnog tretmana od 14 dana rezultati su jasno pokazali kako primjenom

sonde Ca zeolita A dolazi do efektivnijeg sniženja koncentracije glukoze u krvi. Taj učinak, Ca zeolit je

imao bez obzira da li se radi otopini glukoze koju smo miševima dali intragastralnom sondom (test

opterećenja glukoze) ili se radi o glukozi koja je rezultat normalnog fiziološkog procesa; hranjena i

probave. Naravno da regulacija koncentracije glukoze nije tako rapidna kod dijabetičnih miševa (bez

obzira na tretman) kao kod zdravih miševa, što je sukladno prijašnjim istraživanjima [26]. Međutim,

osim ovog učinka, naša istraživanja su pokazala da je uz primjenu Ca zeolita regulacija glikemije više

uravnotežena nego kod miševa koji nisu dobili ovu sondu. Ovo možemo navesti kao dodatni pozitivan

učinak sonde iako moramo biti oprezni kada je riječ o dugoročnom učinku sonde. Naime, mi smo

koncentraciju glukoze u krvi kontrolirali kroz period od najduže 180 minuta. Suprotno tome,

koncentracija glukoze u miševa koji nisu dobili ovu vrstu sonde imali su velike oscilacije u stupnju

hiperglikemije. Prema literaturnim navodima i kliničkim studijama upravo ti nagli skokovi glikemije su

odgovorni za kasne komplikacije. Naime, efektivnom regulacijom glukoze dolazi do znantnog

smanjenja razvoja nefropatije i retinopatije kod bolesnika sa šećernom bolesti tipa 1 [27]. Također,

važno je naglasiti da je većina smrtnih slučajeva kod bolesnika s dijabetesom povezana upravo s

kasnim komplikacijama i prevencijom istih dolazi do znantog produženja života te do znatnog

poboljšanja same kvalitete života bolesnika [28].

 

24    

Do oslobađanja periferije od glukoze može doći zbog inhibicije prijenosa glukoze putem

prijenosnika SGLT 1 za koji je već prijašnjim istraživanjima dokazano da se u najvećoj mjeri nalazi u

tankom crijevu te nešto manje u bubregu [18]. Pretpostavljeni mehanizam inhibicije u našim pokusima

bio bi aktivna zamjena kationa kalcija (Ca2+) iz zeolita sa ionima natrija (Na+) iz probavnog trakta

(Na/K ATP pumpa osigurava ione natrija). Na taj način bi nižom koncentracijom raspoloživih slobodnih

kationa natrija bila i manja apsorpcija glukoze, što bi omogućilo regulaciju bližu homeostazi.

Inkubiranjem tankog crijeva dijabetičnog miša u in vitro uvjetima i mjerenjem koncentracije

zamijenjenih iona Ca iz zeolita nedvojbeno smo pokazali kako aktivna zamjena iona zaista postoji u

tankom crijevu te da je ona mjerljiva atomskom apsorpcijskom spektrofotometrijom. U ovom trenu ne

možemo govoriti koliko se kationa kalcija može vezati ili veže za tanko crijevo dijabetičnog miša,

budući u in vitro pokusima nismo koristili dovoljan broj dijabetičnih jedinki. To treba u budućim

istraživanjima točno definirati.

Treba, međutim, istaknuti da smo ovim našim radom testirali aktivnost u in vitro i u in vivo

uvjetima te su u oba slučaja rezultati sugerirali mogući mehanizam putem aktivnih prijenosnika

glukoze koji su ovisni o ionima natrija (SGLT). Inhibicija ovog mehanizma važna je zbog toga što je

novijim studijama pokazano da se njihova ekspresija povećava uslijed hiperglikemije, što dovodi do

dodatnog pogoršanja kliničke slike pacijenata s dijabetesom. Povećana ekspresija ovih prijenosnika

dovodi do dodatne apsorpcije i reapsorpcije glukoze te dolazi do dodatnog koncentriranja glukoze u

već ionako preopterećenoj periferiji. Najveća prednost inhibitora SGLT je ta da je mehanizam inhibicije

u poptunosti neovisan o cirkulirajućoj koncentraciji inzulina i o inzulinskoj osjetljivosti. To nadalje daje

mogućnost kombiniranja inhibitora SGLT-a sa svim ostalim antidijabetičnim lijekovima, uključujući i

inzulin. Zbog navedenih svojstava SGLT prijenosnici postali su ciljna mjesta terapija. U mnogim

istraživanjima istražuju se inhibitori SGLT-a te su neki već u primjeni kao što je phlorizin [6]. Međutim,

glavnina inhibitora blokira reapsorpciju glukoze u renalnim kanalićima bubrega [30]. Prema našim

saznanjima niti jedan od korištenih lijekova ne koristi mehanizam zamjene iona kalcija i natrija. Osim

toga, primijećeno je da dolazi do brze disocijacije ovakvih inhibitora sa SGLT prijenosnika te ujedno i

do kratkotrajnog djelovanja [29]. Prema nekim radovima, postoje nuspojave kada se inhibitori SGLT-a

daju intravenski zbog inhibicije tih prijenosnika na ostalim mjestima u organizmu [18]. Zato svakako

treba istaknuti prednost korištenja Ca zeolita koji se miševima davao putem sonde. Tijekom naše

studije primijetili smo male razlike u konzistenciji fecesa kod dijabetičnih miševa koji su dobili sondu

Ca zeolita A odnosu na miševe koji nisu dobili. Ti miševi su izlučili više urina što je vjerojatno

posljedica popratnog prijenosa vode uz glukozu [29]. Međutim, treba naglasiti kako nije došlo do

dehidracije životinja.

Neki radovi govore o tome kako se i mehanizam aktivnosti SGLT2 prijenosnika temelji na

Ca/Na izmjeni te stoga postoji mogućnost da je Ca zeolit, koji smo koristili u ovom radu, djelovao i na

taj prijenosnik u bubregu. Međutim, ovo pitanje ostaje za istražiti u budućim istraživanjima kako in vivo

tako i korištenjem staničnih linija.

Budući su rezultati pokazali da se tretmanom sa Ca zeolitom A glukoza apsorbira/reapsorbira

u manjoj mjeri, onda je bilo za očekivati da se i miševi dvije dijabetične skupine razlikuju po

 

25    

metaboličkim parametrima nakon boravka u metaboličkim kavezima. Parametar koji se najviše

razlikovao u dvije skupine dijabetičnih miševa bio je količina izlučenog urina. Naime, dijabetični miševi

koji su dobivali Ca zeolit izlučivali su značajno više urina (26,5 mL) u usporedbi s dijabetičnim

miševima koji su dobili sondu fiziološke otopine (13,8 mL). Ovakvi rezultati dali su nam naslutiti kako

inhibicija SGLT-a i blokiranje apsorpcije glukoze dovodi do nakupljanja glukoze u mokraćnom mjehuru

te njenog izlučivanja putem urina što za posljedicu ima efikasniju regulaciju glikemije. Kako bi to

provjerili, miševi sve tri skupine snimane su microPET kamerom kojom smo pratili distribuciju

radioaktivne glukoze po tijelu miševa u realnom vremenu. Dijabetični miševi koji su intragastralnom

sondom dobivali Ca zeolit nakupljali su znatno više glukoze u mokraćnom mjehuru nego dijabetični

miševi koji nisu dobili zeolit. Računalnim metodama pokazali smo da je ta razlika u odlaganju glukoze

u mokraćni mjehur brža odmah po davanju Ca zeolita A i tada je ona viša čak 38%. Stoga se tako

tretirani miševi efikasnije rješavaju viška glukoze i osobađaju periferiju od „pritiska“ hiperglikemije.

Budući je metoda microPET uspostavljena neposredno prije završetka eksperimentalnog dijela ovog

rada i budući zahtijeva veća financijska ulaganja, nismo bili u mogućnosti snimiti veći broj životinja.

U zaključku ovog rada, želimo istaknuti kako sintetski dobivena kalcijev oblik zeolita A u strogo

definiranim uvjetima ima jedinstvena svojstva koja smo „iskoristili“ u terapijske svrhe šećerne bolesti,

naglašavajući pri tome da smo poštovali fiziološke procese mehanizma apsorpcije/reapsorpcije

glukoze. Radili smo sa in vivo modelu koji je svjetski prihvaćen model za istraživanje ove kronične

bolesti. Time naravno nije eliminirana upotreba inzulina, već je ova vrsta terapije jedan korak do

uspostavljanja homeostaze i nadamo se prevenciji kasnih komplikacija za koje se zna da nastaju

uslijed kontinuiranih „skokova“ u koncentraciji glukoze u plazmi [5]. Ovaj rad predstavlja dio studije

koja će biti provedena, a rezultati ove studije dali su smjernice istraživanja u budućnosti.

 

26    

6. ZAKLJUČCI

Temeljem rezultata dobivenih u ovom radu, moguće je zaključiti sljedeće:

• Kalcijeva forma zeolita A (Ca zeolit A), aplicirana intragastralnom sondom, doprinosi sniženju

koncentracije glukoze u krvi dijabetičnih miševa soja NOD. Pozitivan učinak primjene Ca

zeolita A dokazan je u testu tolerancije na glukozu (egzogena glukoza) te na glukozi koja se

oslobodi iz hrane (endogena glukoza).

• Bolja regulacija glikemije posljedica je (barem djelomično) smanjenje apsorpcije glukoze, a

pretpostavljeni mehanizam bi mogao uključiti zamjenu kationa kalcija i natrija. Uz nižu

koncentraciju raspoloživog natrija manja je apsorpcija glukoze.

• Neapsorbirana glukoza nakuplja se u mokraćnom mjehuru i dalje izlučuje urinom što oslobađa

periferiju od visoke koncentracije glukoze i/ili naglih promjena u koncentraciji glukoze. To bi

ujedno moglo prevenirati razvoj kasnih komplikacija što ima svoj značaj u praktičnom smislu.

 

27    

7. LITERATURA

1.   Abebe,   S.M.,   et   al.,   Increasing   trends   of   diabetes   mellitus   and   body   weight:   a   ten   year  observation   at   gondar   university   teaching   referral   hospital,   northwest   ethiopia.   PLoS   One,  2013.  8(3):  p.  e60081.  

 2.   Starup-­‐Linde,  J.,  Diabetes,  biochemical  markers  of  bone  turnover,  diabetes  control,  and  bone.  

Front  Endocrinol  (Lausanne),  2013.  4:  p.  21.    3.   Korolija,  M.,  Utjecaj   hiperglikemije   na   ekspresiju   gena   u   zamecima   ženki  miša   oboljelih   od  

šećerne  bolesti.  2010,  Doktorska  disertacija.    4.   Hall,  G.a.,  Medical  Physiology.  Vol.  12.  2011.:  Elsevier.    5.   Bluestone,   J.A.,   K.   Herold,   and   G.   Eisenbarth,   Genetics,   pathogenesis   and   clinical  

interventions  in  type  1  diabetes.  Nature,  2010.  464(7293):  p.  1293-­‐300.    6.   Csorba,  T.R.,  A.W.  Lyon,  and  M.D.  Hollenberg,  Autoimmunity  and  the  pathogenesis  of  type  1  

diabetes.  Crit  Rev  Clin  Lab  Sci,  2010.  47(2):  p.  51-­‐71.    7.   Kim,  M.S.  and  C.  Polychronakos,  Immunogenetics  of  type  1  diabetes.  Horm  Res,  2005.  64(4):  

p.  180-­‐8.    8.   Gilliam  L.K.,  L.A.,  Diabetes  Type  1  (Insulin-­‐Dependent  Diabetes  Mellitus),  ed.  H.  H.  Vol.  Three-­‐

Volume  Set.  Elsevier  Science  1.  2003.    9.   Al-­‐Mutairi  H.F.,  M.A.M.,  Al-­‐Mazidi  Z.M.  ,  Genetics  of  Type  1  Diabetes  Mellitus.  Kuwait  Medical  

Journal,  2007.  39:  p.  107-­‐115.    10.   Tisch,  R.  and  H.  McDevitt,  Insulin-­‐dependent  diabetes  mellitus.  Cell,  1996.  85(3):  p.  291-­‐7.    11.   Chaparro,  R.J.  and  T.P.  Dilorenzo,  An  update  on  the  use  of  NOD  mice  to  study  autoimmune  

(Type  1)  diabetes.  Expert  Rev  Clin  Immunol,  2010.  6(6):  p.  939-­‐55.    12.   von  Herrath,  M.   and  G.T.  Nepom,  Animal  models  of  human   type  1  diabetes.  Nat   Immunol,  

2009.  10(2):  p.  129-­‐32.    13.   Ferrannini,   E.,   Sodium-­‐glucose   transporter-­‐2   inhibition   as   an   antidiabetic   therapy.   Nephrol  

Dial  Transplant,  2010.  25(7):  p.  2041-­‐3.    14.   Krimi,   R.B.,   et   al.,  Resistin-­‐like  molecule-­‐beta   inhibits   SGLT-­‐1   activity   and   enhances   GLUT2-­‐

dependent  jejunal  glucose  transport.  Diabetes,  2009.  58(9):  p.  2032-­‐8.    15.   DeFronzo,   R.A.,   J.A.   Davidson,   and   S.   Del   Prato,   The   role   of   the   kidneys   in   glucose  

homeostasis:  a  new  path  towards  normalizing  glycaemia.  Diabetes  Obes  Metab,  2012.  14(1):  p.  5-­‐14.  

 16.   Wright,   E.M.,   B.A.   Hirayama,   and   D.F.   Loo,  Active   sugar   transport   in   health   and   disease.   J  

Intern  Med,  2007.  261(1):  p.  32-­‐43.  

 

28    

 17.   Liang,   Y.,   et   al.,   Effect   of   canagliflozin   on   renal   threshold   for   glucose,   glycemia,   and   body  

weight  in  normal  and  diabetic  animal  models.  PLoS  One,  2012.  7(2):  p.  e30555.    18.   Sabino-­‐Silva,  R.,  et  al.,  The  Na(+)/glucose  cotransporters:  from  genes  to  therapy.  Braz  J  Med  

Biol  Res,  2010.  43(11):  p.  1019-­‐26.    19.   Dyer,  J.,  et  al.,  Expression  of  monosaccharide  transporters  in  intestine  of  diabetic  humans.  Am  

J  Physiol  Gastrointest  Liver  Physiol,  2002.  282(2):  p.  G241-­‐8.    20.   Vidotti,   D.B.,   et   al.,   Effect   of   long-­‐term   type   1   diabetes   on   renal   sodium   and   water  

transporters  in  rats.  Am  J  Nephrol,  2008.  28(1):  p.  107-­‐14.    21.   Alauddin,  M.M.,  Positron  emission  tomography  (PET)  imaging  with  (18)F-­‐based  radiotracers.  

Am  J  Nucl  Med  Mol  Imaging,  2012.  2(1):  p.  55-­‐76.    22.   Kumar,  R.,  et  al.,  Role  of  modern   imaging  techniques  for  diagnosis  of   infection  in  the  era  of  

18F-­‐fluorodeoxyglucose   positron   emission   tomography.   Clin   Microbiol   Rev,   2008.   21(1):   p.  209-­‐24.  

 23.   Kosanovic,  C.,  et  al.,  Chemically  controlled  particulate  properties  of  zeolites  Towards  the  face-­‐

less  particles  of  zeolite  A  Part  1  Influence  of  the  batch  molar  ratio  [SiO2/Al2O3](b)  on  the  size  and  shape  of   zeolite  A  crystals.  Microporous  and  Mesoporous  Materials,  2011.  137(1-­‐3):  p.  72-­‐82.  

 24.   Bosnar,  S.,  et  al.,  Chemically   controlled  particulate  properties  of   zeolites:  Towards   the   face-­‐

less  particles  of  zeolite  A.  2.  Influence  of  aluminosilicate  batch  concentration  and  alkalinity  of  the  reaction  mixture  (hydrogel)  on  the  size  and  shape  of  zeolite  A  crystals.  Microporous  and  Mesoporous  Materials,  2011.  142(1):  p.  389-­‐397.  

 25.   Burrin,   J.M.  and  C.P.  Price,  Measurement  of  Blood-­‐Glucose.  Annals  of  Clinical  Biochemistry,  

1985.  22(Jul):  p.  327-­‐342.    26.   Squadrito,  G.  and  D.  Cucinotta,  The  late  complications  of  diabetes  mellitus.  Ann  Ital  Med  Int,  

1991.  6(1  Pt  2):  p.  126-­‐36.    27.   Wang,   P.H.,   J.   Lau,   and   T.C.   Chalmers,  Meta-­‐analysis   of   effects   of   intensive   blood-­‐glucose  

control  on  late  complications  of  type  I  diabetes.  Lancet,  1993.  341(8856):  p.  1306-­‐9.    28.   Malmberg,  K.,  et  al.,  Glycometabolic  state  at  admission:  important  risk  marker  of  mortality  in  

conventionally  treated  patients  with  diabetes  mellitus  and  acute  myocardial  infarction:  long-­‐term   results   from   the   Diabetes   and   Insulin-­‐Glucose   Infusion   in   Acute  Myocardial   Infarction  (DIGAMI)  study.  Circulation,  1999.  99(20):  p.  2626-­‐32.  

 29.   Hummel,  C.S.,  et  al.,  Structural  selectivity  of  human  SGLT  inhibitors.  Am  J  Physiol  Cell  Physiol,  

2012.  302(2):  p.  C373-­‐82.  

30.     Sakar,   Y.,   et   al.,   Metformin-­‐induced   regulation   of   the   intestinal   D-­‐glucose   transporters.  Journal  of  Physiology  and  pharmacology,  2010,  61,  3,  301-­‐307.  

 

29    

31.   Baldea,   A.N.L.,   et   al.,   Inhibition   of   intestinal   glucose   absorption   by   anti-­‐diabetic   medicinal  plants   derived   from   the   James   Bay   Cree   traditional   pharmacopeia.   Journal   of  Ethnopharmacology  132,  2010,  473-­‐482.  

 

 

 

 

 

 

30    

 

 

ŽIVOTOPIS

 

Osobni podaci:

Prezime: Perkovic Ime: Adrijana Adresa: Ivana Vencla 38, 10290 Zaprešić E-Mail: adrijana_perkovic@hotmail.com Datum rođenja: 02.08.1990.    Stručno iskustvo:

09/2014- MR1 restricted antigen recognition by non-specific T cells Experimental Immunology, DBM, Basel (Prof. Dr. med. Gennaro de Libero) 03/2014-09/2014 ERASMUS stručna praksa HNO Clinic, University Hospital of Basel (Prof. Dr. med. Dr. sc. Daniel Bodmer) 09/2012-02/2014 Studentska praksa, Diplomski rad

Laboratorij za molekularnu endokrinologiju i transplantaciju, Institut Ruđer Bošković, Zagreb (Dr. sc. Marijana Popović Hadžija)

   Akademsko obrazovanje:

2012-2014 PMF (Biološki odsjek) M.Sc. Molecular Biology Sveučilište u Zagrebu 2009-2012 PMF (Biološki odjsjek) B.Sc. Molecular Biology Sveučilište u Zagrebu 2004-2009 Opća gimnazija «Ban Josip Jelačić»