PRIMERJAVA REZULTATOV DIHALNEGA TESTA ZA DOLOČANJE BAKTERIJE HELICOBACTER PYLORI IN ... · 2015....

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MOJCA LEŠNIK

DIPLOMSKA NALOGA

PRIMERJAVA REZULTATOV DIHALNEGA TESTA ZA DOLOČANJE BAKTERIJE HELICOBACTER PYLORI IN

ANTIGENA V BLATU

UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE

Ljubljana, 2015

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

MOJCA LEŠNIK

DIPLOMSKA NALOGA

PRIMERJAVA REZULTATOV DIHALNEGA TESTA ZA DOLOČANJE BAKTERIJE HELICOBACTER PYLORI IN

ANTIGENA V BLATU

COMPARISONOF THE RESULTS OF BREATH TEST FOR DETERMINATION OF HELICOBACTER

PYLORIANDANTIGEN IN STOOL

UNIVERZITETNI ŠTUDIJ FARMACIJE

Ljubljana, 2015

Diplomsko nalogo sem opravljala na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo v

Ljubljani pod mentorstvom prof. dr. Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem.

Dihalni test s sečnino in testa določanja Helicobacter pylori antigena v blatu so opravili na

Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo v Ljubljani.

Zahvala

Zahvaljujem se mentorju, prof. dr. Jošku Osredkarju, mag. farm., spec. med. biokem., za

dostopnost in pomoč pri izdelavi diplomske naloge.

Iskrena hvala Barbari in Simoni za pomoč pri pregledu prevodov iz angleškega jezika in pri

oblikovanju besedila.

Posebna zahvala gre mojim staršem, ki so mi študij omogočili ter mi nudili vso oporo in

spodbudo. Hvala, ker ste verjeli vame!

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod vodstvom mentorja prof. dr.

Joška Osredkarja, mag. farm., spec. med. biokem.

Mojca Lešnik

Ljubljana, januar 2015

Diplomska komisija:

Predsednik: izr. prof. dr. Iztok Grabnar, mag. farm.

Mentor: prof. dr. Joško Osredkar, mag. farm., spec. med. biokem.

Član: asist. dr. Rok Frlan, mag. farm.

KAZALO

KAZALO SLIK ................................................................................................ III

KAZALO TABEL ............................................................................................. IV

POVZETEK ........................................................................................................ V

ABSTRACT ....................................................................................................... VI

SEZNAM OKRAJŠAV ................................................................................... VII

1. UVOD................................................................................................................ 1

1.1 ŽELODEC .......................................................................................................................... 1 1.1.1 ZGRADBA ŽELODCA ............................................................................................................................ 1 1.1.2 DEJAVNIKI ZAŠČITE SLUZNICE ......................................................................................................... 3 1.1.3 DEJAVNIKI OKVARE SLUZNICE ........................................................................................................ 3

1.2 BAKTERIJA HELICOBACTER PYLORI ....................................................................... 5 1.2.1 MIKROBIOLOŠKE ZNAČILNOSTI BAKTERIJE ................................................................................. 5 1.2.2 VIRULENTNE ZNAČILNOSTI IN PRILAGODITVENI MEHANIZMI BAKTERIJE ......................... 7 1.2.3 NAČINI PRENOSA OKUŽBE ................................................................................................................. 8 1.2.4 EPIDEMIOLOGIJA OKUŽBE ................................................................................................................. 8 1.2.5 DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA OKUŽBO ............................................................................................ 8 1.2.6 PATOGENEZA BOLEZNI ŽELODCA IN DVANAJSTNIKA ............................................................... 9 1.2.7 DIAGNOSTIKA OKUŽBE ..................................................................................................................... 10 1.2.8 ZDRAVLJENJE OKUŽBE ..................................................................................................................... 12 1.2.9 RAZVOJ CEPIVA PROTI H. PYLORI ................................................................................................... 15

2. NAMEN DELA .............................................................................................. 15

3. MATERIALI IN METODE DELA ............................................................. 16

3.1 PRIDOBIVANJE PODATKOV ..................................................................................... 16

3.2 PROUČEVANE DIAGNOSTIČNE METODE ............................................................. 16 3.2.1 DIHALNI TEST S SEČNINO ................................................................................................................. 16 3.2.2 DOLOČANJE H. PYLORI ANTIGENA V BLATU ............................................................................... 22

3.3 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV ................................................................. 32 3.3.1 DOLOČITEV MEJNE VREDNOSTI KVANTITATIVNEGA TESTA DOLOČANJA H. PYLORI ANTIGENA V BLATU S POMOČJO STATISTIČNEGA PROGRAMA MedCalc ...................................... 32 3.3.2 VREDNOTENJE DIAGNOSTIČNIH TESTOV .................................................................................... 33

I

3.3.3 DOLOČITEV MEJNE VREDNOSTI KVALITATIVNEGA TESTA DOLOČANJA H. PYLORI ANTIGENA V BLATU GLEDE NA KVANTITATIVNI TEST .................................................................... 35

4. REZULTATI .................................................................................................. 35

4.1 PRIMERJAVA DIAGNOSTIČNIH TESTOV Z DIHALNIM TESTOM S SEČNINO .................................................................................................................................................. 41

4.1.1 TEST ImmunoCard STAT! HpSA ZA KVALITATIVNO DOLOČANJE H. PYLORI ANTIGENA V BLATU ............................................................................................................................................................. 41 4.1.2 TEST DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA ZA KVANTITATIVNO DOLOČANJE H. PYLORI ANTIGENA V BLATU ..................................................................................................................... 42

4.2 DOLOČITEV MEJNE VREDNOSTI KVALITATIVNEGA TESTA DOLOČANJA H. PYLORI ANTIGENA V BLATU GLEDE NA KVANTITATIVNI TEST .................. 44

5. RAZPRAVA ................................................................................................... 47

6. SKLEP ............................................................................................................ 54

7. VIRI IN LITERATURA ............................................................................... 55

II

KAZALO SLIK

Slika 1: Shematski prikaz zgradbe želodca (povzeto po 7) ....................................................... 2

Slika 2: Shematski prikaz izločanja HCl iz parietalne celice (povzeto po 9) ............................ 3

Slika 3: Shematski prikaz uravnavanja izločanja HCl (povzeto po 10) .................................... 4

Slika 4: H. pylori (elektronski mikroskop; levo povzeto po 14, desno povzeto po 15) ............ 5

Slika 5: Naselitev H. pylori na želodčni sluznici (barvanje z Warthin Starry srebrovo metodo;

kontrast eozin-hematoksilin; 100-kratna povečava; povzeto po 17) .......................................... 6

Slika 6: Možni izidi okužbe z bakterijo H. pylori (povzeto po 2) ............................................. 9

Slika 7: Testni komplet Helicobacter INFAI (povzeto po 38) ................................................ 19

Slika 8: Postopek testiranja s testom Helicobacter INFAI (povzeto po 35) ............................ 20

Slika 9: Postopek testiranja s testom ImmunoCard STAT! HpSA (povzeto po 40) ............... 24

Slika 10: Prikaz pozitivnega rezultata ImmunoCard STAT! HpSA testa (povzeto po 41) ..... 25

Slika 11: Princip testa določanja HP Ag v blatu (povzeto po 43) ........................................... 27

Slika 12: Testni komplet DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA (povzeto po 44) ..... 29

Slika 13: Grafični prikaz rezultatov testa za kvalitativno določanje HP Ag v blatu glede na

dihalni test s sečnino ................................................................................................................ 41

Slika 14: Grafični prikaz rezultatov testa za kvantitativno določanje HP Ag v blatu glede na

dihalni test s sečnino ................................................................................................................ 42

Slika 15: Primerjava diagnostičnih testov s pomočjo krivulje ROC ....................................... 43

Slika 16: Krivulja ROC kvantitativnega testa za določitev mejne vrednosti kvalitativnega

testa ........................................................................................................................................... 47

III

KAZALO TABEL

Tabela I: Priporočena 7-dnevna shema prvega izbora (št. 1) .................................................. 14

Tabela II: Priporočena 7-dnevna shema drugega izbora (št. 2) – v primeru neuspeha sheme

št. 1 ........................................................................................................................................... 14

Tabela III: Zahtevane vrednosti OD slepega vzorca in standardov (Std.).............................. 32

Tabela IV: Rezultati neinvazivnih preiskav pacientov, narejenih na KIKKB, pred

eradikacijsko terapijo ............................................................................................................... 35

Tabela V: Rezultati izračuna mejne vrednosti kvantitativnega testa HP Ag v blatu s pomočjo

statističnega programa MedCalc .............................................................................................. 38

Tabela VI: Rezultati testa za kvalitativno določanje HP Ag v blatu glede na dihalni test s

sečnino ...................................................................................................................................... 41

Tabela VII: Rezultati testa za kvantitativno določanje HP Ag v blatu glede na dihalni test s

sečnino ...................................................................................................................................... 42

Tabela VIII: Rezultati izračuna mejne vrednosti kvalitativnega testa HP Ag v blatu glede na

kvantitativni test s pomočjo statističnega programa MedCalc ................................................. 44

IV

POVZETEK Bakterija Helicobacter pylori (H. pylori) je odgovorna za razvoj različnih bolezni zgornjega

dela prebavil, vključno z rakom želodca. Okužba z njo je zelo vztrajna in lahko traja celo

življenje. Zgodnje odkrivanje in zdravljenje te okužbe ima zato velik pomen. Za ugotavljanje

prisotnosti te bakterije v človeškem želodcu in spremljanje uspešnosti protimikrobne terapije

imamo na voljo več različnih diagnostičnih metod.

Z namenom ovrednotiti diagnostično uporabnost testov določanja H. pylori antigena v blatu

smo zbrali podatke o 100 pacientih v starosti od 10 do 85 let. Ugotavljali smo diagnostične

vrednosti (občutljivost, specifičnost, pozitivno in negativno napovedno vrednost ter točnost)

kvalitativne in kvantitativne metode določanja H. pylori antigena v blatu v primerjavi z

dihalnim testom s sečnino ter povezavo med kvalitativnimi vrednostmi določanja H. pylori

antigena v blatu in koncentracijo H. pylori antigena v blatu. Z raziskavo smo hoteli ugotoviti,

ali lahko metoda določanja H. pylori antigena v blatu nadomesti do sedaj uporabljano metodo

– dihalni test s sečnino.

Na naši skupini bolnikov smo ugotovili 90,32% občutljivost in 81,40% specifičnost

ImmunoCard STAT! HpSA testa za kvalitativno določanje H. pylori antigena v blatu.

Njegova pozitivna napovedna vrednost je 77,78%, negativna napovedna vrednost 92,11% in

točnost 85,14%. Občutljivost DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA testa za

kvantitativno določanje H. pylori antigena v blatu je 87,10%, specifičnost 97,67%, pozitivna

napovedna vrednost znaša 96,43%, negativna napovedna vrednost 91,30% in točnost 93,24%.

Pri kvalitativnem testu smo izračunali razmejitveno vrednost 0,910 μg/l.

Z raziskavo smo dokazali, da sta oba testa določanja H. pylori antigena v blatu primerljiva z

dihalnim testom s sečnino, zaradi česar se lahko uporabljata kot njegov cenejši nadomestek

pri ocenjevanju uspešnosti protimikrobne terapije proti H. pylori. Testa sta primerljiva tudi

med seboj, vendar služi kvalitativen test le za ugotavljanje prisotnosti bakterije, s

kvantitativnim testom pa določimo tudi količino prisotne bakterije.

V

ABSTRACT Helicobacter pylori (H. pylori) bacterium is responsible for the development of various

diseases of the upper gastrointestinal tract, including cancer of the stomach. Infection can be

very resilient and can last a lifetime. Therefore early detection and treatment of this infection

is of great importance. There are several different methods of diagnosis which can be used to

detect the presence of this bacterium in the human stomach and to monitor the success of

antimicrobial therapy.

In order to evaluate the diagnostic utility of testing for the determination of H. pylori antigen

in stool we collected data on 100 patients aged 10 to 85 years. We assessed the diagnostic

values (sensitivity, specificity, positive and negative predictive value and accuracy)

qualitative and quantitative methods for the determination of H. pylori antigen in stool

compared with the urea breath test and the link between the values of qualitative

determination of H. pylori antigen in stool and the concentration of H. pylori antigen in stool.

With this research, we wanted to determine whether the method of determining the H. pylori

antigen in stool can replace the urea breath test used so far.

On our group of patients, we found 90,32% sensitivity and 81,40% specificity of

ImmunoCard STAT! HpSA test for the qualitative determination of H. pylori antigen in stool.

Its positive predictive value was 77,78%, negative predictive value of 92,11% and accuracy

85,14%. The sensitivity of Helicobacter Pylori DRG® Ag (stool) ELISA test for the

determination of H. pylori antigen in stool is 87,10% and specificity 97,67%, positive

predictive value is 96,43%, negative predictive value of 91,30% and accuracy 93,24%. In the

qualitative test we calculated cut-off value of 0,910 μg/l.

With this research we demonstrated that both tests intended for determining the presence of

H. pylori antigen in stool, are comparable with the urea breath test, and can therefore be used

as a cheaper substitute in assessment of the effectiveness of antimicrobial therapy against H.

pylori. Tests are also comparable with each other; however, the qualitative test serves only for

the detection of bacteria, whereas the quantitative test also determines the amount of

bacterium present.

VI

SEZNAM OKRAJŠAV

CagA citotoksični protein oz. s citotoksinom povezan antigen

COX ciklooksigenaza

EIA encimsko-imunski test (angl. enzyme immunoassay)

ELISA encimsko-imunski test (angl. enzyme linked immunosorbent assay)

H. pylori Helicobacter pylori

HP Ag Helicobacter pylori antigen

HpSA testi testi za določanje H. pylori antigena v blatu (angl. H. pylori stool antigen tests) HUT hitri ureazni test

ICA imunokromatografski test (angl. immunochromatography assay)

IRMS spektrometrija določanja razmerja mase izotopov (angl. isotope ratio mass spectrometry)

IZ interval zaupanja

KC Klinični center

KIKKB Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo

MALT limforetikularno tkivo v sluznici (angl. mucosa-associated lymphoid tissue)

NSAR nesteroidni antirevmatiki

OD optična gostota (angl. optical density)

PCR polimerazna verižna reakcija (angl. polymerase chain reaction)

PNA-FISH fluorescenčna in situ hibridizacija s peptidno nukleinsko kislino kot sondo (angl. peptide nucleic acid- fluorescence in situ hybridization)

UKC Univerzitetni klinični center

VacA vakuolizirajoči citotoksin

ZPČ zaviralec/zaviralci protonske črpalke

VII

1. UVOD Bakterija Helicobacter pylori (H. pylori) spremlja človeštvo verjetno že od njegovega

nastanka, saj so njene antigene našli v 1700 let starih mumijah. Odkrita pa je bila šele leta

1983, ko sta Avstralska zdravnika Barry J. Marshall in John Robin Warren pri pregledu

patohistoloških preparatov želodčne sluznice odkrila povezavo med bakterijsko okužbo

želodčne sluznice in aktivnim kroničnim gastritisom. Zaradi podobnosti z rodom

Campylobacter sta jo poimenovala Pyloric Campylobacter. Sledili sta imeniCampylobacter

pyloridis in Campylobacter pylori, leta 1989 pa jo je mikrobiolog Steward Goodwin

preimenoval v Helicobacter pylori, kot jo poznamo danes. S tem je tudi bil ustanovljen nov

bakterijski rod Helicobacter, katerega prva predstavnica je bila H. pylori (1, 2, 3, 4).

Danes vemo, da je H. pylori najpogostejši patogeni mikrob pri človeku in da pomembno

vpliva na razvoj želodčne patogeneze. Svetovna zdravstvena organizacija jo je celo uvrstila v

skupino karcinogenih mikrobov prvega razreda. Njeno odkritje predstavlja torej eno

najpomembnejših spoznanj medicine v zadnjih letih dvajsetega stoletja, za kar sta

raziskovalca Barry Marshall in Robin Warren leta 2005 prejela Nobelovo nagrado za

medicino (1, 2, 3).

1.1 ŽELODEC

1.1.1 ZGRADBA ŽELODCA

Želodec je votel mišičast organ in predstavlja najširši del prebavne cevi. Leži levo pod

trebušno prepono. Njegovi velikost, oblika in položaj so odvisni od napolnjenosti, telesnega

položaja, telesne strukture, starosti in napetosti mišic, njegova osnovna oblika pa spominja na

polmesec ali na lovski rog (5, 6).

Robove želodca oblikujeta dve krivini:

• mala krivina, ki gleda proti desni strani in navzgor proti jetrom in

• velika krivina,ki je obrnjena proti levi strani in navzdol (5, 6).

Želodec sestavljajo naslednji predeli:

• kardija (cardia) - spodnja ožina požiralnika ob vhodu v želodec,

• želodčni svod (fundus) – zgornji predel želodca levo in navzgor od kardije,

• telo želodca ali korpus (corpus) – najobsežnejši, srednji predel želodca,

1

• vratarjev ali pilorični del želodca (pars pylorica) – začetek oženja želodca takoj za

korpusom proti vratarju,

• antrum (antrum pyloricum) – razširjen del želodca pred vratarjem in

• vratar ali pilorus (pylorus) – ozek prehod med želodcem in dvanajstnikom z

zadebeljenim krožnim mišičjem, imenovanim vratarjeva zapiralka (sfinkter) (5, 6).

Želodčna stena je zgrajena iz treh plasti:

• trebušne mrene, ki odeva želodec od zunaj in je del potrebušnice,

• mišične plasti, ki sestoji iz treh plasti gladkega mišičja in

• želodčne sluznice na notranji strani želodca, ki je nagubana ter razbrazdana v manjša in

večja polja, med katerimi priteka želodčni sok iz številnih cevasto oblikovanih sluzničnih

žlez. Ob mali krivini so sluznične gube vzdolžne, da zaužita tekočina lahko odteka v

črevo, ne da bi se zadrževala v želodcu (5).

Zgradbo želodca prikazuje spodnja slika (Slika 1).

Slika 1: Shematski prikaz zgradbe želodca (povzeto po 7)

Na vzdrževanje normalnih razmer v želodcu vpliva ravnovesje med dejavniki okvare in

dejavniki zaščite želodčne sluznice (8).

2

1.1.2 DEJAVNIKI ZAŠČITE SLUZNICE

Sluz - pokriva površino sluzničnega epitelija in zaradi svoje goste konsistence mehansko

prepreči neposreden stik kisle želodčne vsebine in pepsinov z epitelijskimi celicami; z vlogo

substrata za encime tudi kemijsko ovira difuzijo proteolitičnih encimov do epitelijskih celic

sluznice (8).

Bikarbonat (HCO3⁻) - ščiti želodčne epitelijske celice z nevtralizacijo tiste majhne količine

kisline, ki se ji uspe prebiti do epitelija skozi gost sluzni gel; pred kislinsko okvaro zavaruje

tudi sluznico proksimalnega dela dvanajstnika (8).

Zgradba epitelija - tesni stiki med epitelijskimi celicami želodčne sluznice preprečujejo

difuzijo H⁺ iz želodčne kisline v notranjost epitelija; pomembna je tudi sposobnost epitelijskih

celic, da se lahko iz zarodnih celic hitro obnovijo (8).

Ustrezna prekrvitev sluznice - zadovolji velike zahteve sluznice po hranilih in kisiku (8).

Prostaglandini - so pomembni za delovanje vseh dejavnikov zaščite sluznice; z obnovo

epitelijskih celic spodbujajo celjenje okvarjene sluznice, zavirajo pa tudi izločanje želodčne

kisline (8).

1.1.3 DEJAVNIKI OKVARE SLUZNICE

Želodčna kislina ali HCl - izločajo jo parietalne ali oksintične celice, ki se nahajajo med

epitelijskimi celicami sluzničnih žlez v korpusu in fundusu želodca (8). Izločanje HCl iz

parietalne celice prikazuje spodnja slika (Slika 2).

Slika 2: Shematski prikaz izločanja HCl iz parietalne celice (povzeto po 9)

3

Izločanje želodčne kisline uravnavajo poleg parietalnih celic še celice G z izločanjem

gastrina, celice D z izločanjem somatostatina in enterokromafinim celicam podobne celice

(EPC) z izločanjem histamina. V uravnavanje je vključen tudi holinergični živčni sistem z

nevrotransmitorjem acetilholinom (8). Uravnavanje izločanja HCl je prikazano na spodnji

sliki (Slika 3).

Slika 3: Shematski prikaz uravnavanja izločanja HCl (povzeto po 10)

V normalnih fizioloških pogojih izkazuje želodčna kislina koristne učinke, v patoloških

pogojih pa lahko zaradi svoje agresivne narave (korozivnost zaradi močnih kislih lastnosti)

poškoduje sluznico in tako vpliva na nastanek razjed (5, 6, 8).

Pepsin - s cepljenjem peptidne vezi pomembno prispeva k prebavi beljakovin, kislina pa

ustvarja optimalni pH (okrog vrednosti 2,0) za njegovo delovanje. Proteolitičen učinek

pepsina pa lahko tudi pomembno prispeva k okvari sluznice (5, 8).

Nesteroidna protivnetna zdravila (NSAR = nesteroidni antirevmatiki) - so inhibitorji

encima ciklooksigenaze (COX), ki je odgovoren za sintezo prostaglandinov. NSAR torej

zavrejo nastajanje prostaglandinov ter tako okvarijo zgradbo in delovanje sluznice (8).

4

Drugi dejavniki okvare sluznice

Ostali dejavniki, ki zavirajo delovanje zaščitnih dejavnikov sluznice, so: alkohol, α-

adrenergični agonisti, soli žolčnih kislin in kajenje (8).

Bakterija Helicobacter pylori

Na želodčni sluznici kolonizirana bakterija H. pylori zavira negativno povratno zvezo pri

uravnavanju izločanja želodčne kisline, saj zmanjšuje izločanje somatostatina, s tem pa okvari

njegov parakrini nadzorni sistem nad izločanjem gastrina in kisline. Tako izpostavlja sluznico

kislinskim poškodbam, škoduje pa ji tudi s snovmi, ki jih izloča v svojo okolico (1, 2, 8).

1.2 BAKTERIJA HELICOBACTER PYLORI

1.2.1 MIKROBIOLOŠKE ZNAČILNOSTI BAKTERIJE

Bakterija Helicobacter pylori (H. pylori) spada v rod Helicobacter, ki danes združuje okrog

20 bakterijskih vrst. H. pylori je po Gramu negativen, 0,5 do 0,9 μm širok in 2 do 5 μm dolg

ukrivljen ali spiralen bacil. Je striktno mikroaerofilna, kar pomeni, da za preživetje potrebuje

le majhne količine kisika in v njih bolje uspeva, za rast pa potrebuje ogljikov dioksid.

Podobna je predstavnicam rodu Campylobacter, le da ima na enem polu 4 do 6 na koncu

zadebeljenih bičkov, medtem ko predstavnice rodu Campylobacter bičkov nimajo

zadebeljenih (1, 2, 6, 8, 11, 12, 13).

H. pylori, vidna z elektronskim mikroskopom, je prikazana na spodnji sliki (Slika 4).

Slika 4: H. pylori (elektronski mikroskop; levo povzeto po 14, desno povzeto po 15)

5

Naravni gostitelj za H. pylori je človek, najdemo pa jo tudi pri primatih, prašičih, mačkah in

skakačih1. Njeno najpomembnejše življenjsko okolje je želodec, kjer je H. pylori prisotna kot

edina bakterijska vrsta, kar je edini takšen primer. Povsod drugod v telesu si življenjski

prostor namreč deli več različnih vrst bakterij, večinoma celo iz različnih rodov. H. pylori se

lahko razširi v proksimalen predel dvanajstnika ali v distalen predel požiralnika, kadar je v teh

predelih prisotna gastrična metaplazija. Ektopično nahajališče bakterije bi naj bil tudi želodčni

epitelij v Meckelovem divertiklu v ileumu. Genska zaporedja H. pylori so našli tudi v ustni

vsebini, v zobnih oblogah in v vsebini debelega črevesa, vendar ni znano, ali je bakterija tam

prisotna le prehodno ali stalno (1, 2, 4, 16).

Natančneje je H. pylori pri gostitelju naseljena v globokih plasteh mukusa, tik ob površini

epitelijskih celic v antrumu in korpusu želodca ter tik ob površini metaplastičnih gastričnih

celic epitelija v dvanajstniku. Po površini epitelijskih celic se razporeja neenakomerno, v

otokih. Ni invazivna in nikoli ne prodira v celice (1, 8, 11, 12).

Naselitev H. pylori je prikazana na spodnji sliki (Slika 5).

Slika 5: Naselitev H. pylori na želodčni sluznici (barvanje z Warthin Starry srebrovo metodo; kontrast eozin-hematoksilin; 100-kratna povečava; povzeto po 17)

1 Skakači (angl. gerbils) so majhni glodavci, ki spadajo v poddružino Gerbillinae. Mongolski skakači so bili uporabljeni kot živalski model pri proučevanju s H. pylori povzročenega razvoja kroničnega gastritisa (4, 18).

6

1.2.2 VIRULENTNE ZNAČILNOSTI IN PRILAGODITVENI MEHANIZMI BAKTERIJE

Za življenje v človeškem želodcu je bakterija H. pylori morala razviti specifične lastnosti, s

katerimi se je uspešno zoperstavila zanjo neugodnim želodčnim razmeram. Te prilagoditvene

lastnosti, ki hkrati predstavljajo tudi bakterijske virulentne značilnosti, so (11, 16):

• gibljivost: bički (flageli) omogočajo H. pylori hitro svedrasto gibanje v viskoznem

mukoznem sloju želodčne sluznice, naseljevanje na sluznici, širjenje v sosednja tkiva,

potovanje v predele z veliko hranili in izogibanje fagocitom (1, 2, 11);

• adhezivnost oz. neposreden oprijem H. pylori na želodčno tkivo prepreči mehansko

spiranje bakterije iz prebavnega sistema in jo tudi nekoliko zaščiti pred kislim pH (1, 19,

20, 21);

• izločanje toksinov: po vezavi na epitelijske celice začne bakterija izločati toksina VacA

(vakuolizirajoči citotoksin) in CagA (citotoksični protein oz. s citotoksinom povezan

antigen). Za VacA je značilno, da tvori pore oz. vakuole v membrani epitelijskih celic,

zaradi česar se poveča prepustnost plazemske membrane in spremeni endo-lizosomalni

promet, kar pripelje do celične smrti (22, 23). CagA pa spodbuja vnetne celice k izločanju

citokinov in aktivira signalne poti, povezane z rakotvornostjo (1, 11, 22);

• antigenska spremenljivost površinskih proteinov omogoča bakteriji uspešno izmikanje

gostiteljevemu obrambnemu sistemu (1);

• izločanje encimov: H. pylori izloča encim ureazo, ki razgradi sečnino v amonijak in

ogljikovo kislino. Bazičen amonijak nevtralizira kislino okrog bakterije in tako v njeni

neposredni okolici ustvari pH med 4 in 7 (2, 11, 12). Amonijak nastane tudi kot stranski

produkt razgradnje glutamina z bakterijskim encimom γ-glutamiltranspeptidazo (GGT).

Bakterija proizvaja tudi lipaze,fosfolipaze in proteaze, ki razgrajujejo sestavine želodčne

sluzi in epitelijskih celic (2, 8). S katalazo pa se H. pylori zaščiti pred škodljivimi učinki

vodikovega peroksida, ki med vnetnimi procesi v telesu proizvaja strupene kisikove zvrsti

(24);

• v ekstremno neugodnih razmerah se je H. pylori sposobna pretvoriti iz spiralne v

kokoidno obliko. Ta oblika bakterije je sposobna preživetja, saj je metabolično aktivna,

ne da pa se kultivirati, saj ni sposobna delitve (13).

7

1.2.3 NAČINI PRENOSA OKUŽBE

Glavni gostitelj za H. pylori je človek, pri živalih jo najdemo redko. Zato se okužba s H.

pylori prenaša v glavnem s človeka na človeka s slino, z dajanjem okuženih predmetov v usta,

s pitjem okužene vode, z nesteriliziranim medicinskim priborom pri diagnosticiranju zgornjih

prebavil in tudi preko insektov (1, 2, 4, 11).

1.2.4 EPIDEMIOLOGIJA OKUŽBE

Okužba s H. pylori ima svetovno razsežnost in je zelo pogosta, saj je z njo okužen že vsak

drugi prebivalec tega planeta. Večje število okužb s H. pylori se pogosteje pojavlja v

nerazvitem delu sveta z nizkim socialno-ekonomskim in bivalnim standardom ter v revnejših

slojih razvitega sveta. Večina prebivalstva v teh državah se okuži že v otroštvu.

Epidemiološke raziskave namreč kažejo, da je v nerazvitem svetu okuženih že skoraj 80%

otrok in mladostnikov do 20. leta starosti. Po tem letu pa porast prekuženosti pade (1, 2, 4).

V razvitem svetu postaja okužba s H. pylori vse manj pogosta, kar se najbolj jasno izraža v

zahodnih državah od 20. stoletja dalje predvsem zaradi izboljšanja sanitarnih razmer, manj

številčnih družin in pogoste uporabe antibiotikov v otroštvu (16). V razvitih državah je največ

okuženih šele pri starosti 40 – 49 let, zelo malo je okuženih otrok in prevalenca narašča veliko

počasneje. Okuženi odrasli so verjetno nosilci bakterije že od svoje mladosti zaradi življenja v

slabih bivanjskih in higienskih razmerah tistih časov. Po 70. letu starosti se prevalenca okužbe

spet zniža. Trend upadanja prekuženosti prebivalstva je značilen tudi za Slovenijo (1, 2, 25).

1.2.5 DEJAVNIKI, KI VPLIVAJO NA OKUŽBO

H. pylori razvije pri okuženih ljudeh različne klinične slike, več kot 80% okuženih pa

kliničnih težav sploh nima. Okužba s H. pylori je zelo trdovratna in vztraja celo življenje,

možno, vendar redko, pa lahko pride tudi do spontane ozdravitve. Na potek in končen izid

okužbe namreč vplivajo (1, 2, 11):

• bakterijski dejavniki – virulentne lastnosti bakterije so različno izražene med genetsko

različnimi bakterijskimi sevi; največji vpliv na razvoj bolezni imajo genetski zapisi vacA

(gen za vakuolizirajoči citotoksin A), cagA (s citotoksinom povezan gen A) in iceA1 (gen,

spodbujen ob stiku z epitelom) (1, 2, 4),

• dejavniki gostitelja – starost ob okužbi in različno gensko pogojena regulacija imunskega

sistema pri posameznikih (2),

8

• dejavniki iz okolja - zdravila (NSAR in salicilati), alkohol, kajenje, sol, nitriti, oksidanti

v hrani in/ali pomanjkanje antioksidantov ter bakterijska kontaminacija hrane (2, 26).

1.2.6 PATOGENEZA BOLEZNI ŽELODCA IN DVANAJSTNIKA

Preko različnih stopenj strukturno in funkcionalno spremenjene sluznice želodca in

dvanajstnika vodi okužba s H. pylori do nastanka naslednjih bolezni zgornjega dela prebavil:

gastritisa, želodčne razjede, razjede na dvanajstniku, limfoma MALT in raka na želodcu

(1, 2, 4, 27). Nastanek in razvoj teh bolezni je shematsko prikazan na spodnji sliki (Slika 6).

Slika 6: Možni izidi okužbe z bakterijo H. pylori (povzeto po 2)

9

1.2.7 DIAGNOSTIKA OKUŽBE

Ustrezne preiskave za okužbo s H. pylori se opravijo le pri tistih bolnikih, ki so razvili

klinično pomembno bolezen in tako pri njih obstaja indikacija za zdravljenje. Poleg

odkrivanja okužbe se diagnostične metode uporabljajo tudi za ugotavljanje uspešnosti

protimikrobnega zdravljenja in občutljivosti bakterije za posamezne antibiotike (2, 12).

Neinvazivne diagnostične metode

To so metode, ki niso povezane z endoskopijo zgornjih prebavil, zato so bolnikom

prijaznejše. Mednje uvrščamo:

• serološke preiskave: zajemajo določevanje specifičnih protiteles IgG, IgM in IgA v

serumu. V glavnem določamo protitelesa IgG, ki so odraz kronične okužbe. Protitelesa

IgA lahko določamo tudi v želodčnem soku ali v slini, ampak ima to manjšo diagnostično

vrednost kot določevanje protiteles v serumu. Na voljo so tudi testi za določanje protiteles

iz polne krvi, vendar zaradi relativno slabe občutljivosti niso primerni za vsakodnevno

uporabo (1, 2). Prednost seroloških preiskav je v njihovi preprosti in hitri izvedbi ter nizki

ceni. Največ se uporabljajo pri epidemioloških raziskavah, rutinsko pa pri presejanju

bolnikov z dispeptičnimi težavami. Zaradi počasnega zmanjševanja koncentracije

protiteles v krvi niso uporabne za ugotavljanje uspešnosti zdravljenja in z njimi tako tudi

ne moremo razlikovati, ali gre za trenutno ali za preteklo okužbo (2, 11, 28, 29);

• dihalni test s sečnino: Z njim določamo aktivnost H. pylori ureaze z merjenjem

izdihanega CO2, ki nastane poleg amonijaka pri encimski razgradnji sečnine.

Preiskovanec zaužije z izotopom ogljika (13C ali 14C) označeno sečnino in pri njeni

razgradnji nastane z izotopom ogljika označen CO2, ki se preko krvi izloči v pljuča in ga

tako lahko zaznamo v izdihanem zraku. Uporaba izotopa 14C je poceni in lahko dostopna

(dobra preskrba bolnišnic s scintilacijskimi števci za merjenje energije ionizirajočega

sevanja), zaradi radioaktivnosti pa je omejena na mikrokapsulirano obliko, pri kateri

radioaktivnost ne preseže dnevnega odmerka sevanja iz naravnega okolja (to je 1μCi).

Izotop 13C je stabilen in povsem neškodljiv in se tako lahko za razliko od 14C uporablja

tudi pri nosečnicah, doječih materah in otrocih. 13C lahko določimo s plinsko

kromatografijo in masno spektrometrijo, zaradi visoke cene njunih aparatur pa so za

določanje 13C razvili še cenejšo lasersko in infrardečo spektrometrijo (1, 2, 13). Dihalni

test s sečnino se uporablja tako za odkrivanje okužbe s H. pylori kot tudi za ocenjevanje

uspešnosti zdravljenja okužbe (2, 12);

10

• dokazovanje H. pylori v blatu: je ena izmed novejših diagnostičnih preiskav določanja

specifičnega antigena, ki se pojavi v blatu po okužbi s H. pylori. Za njegovo določitev

obstajata dve metodi: EIA oz. encimsko-imunska metoda, ki temelji na merjenju optične

gostote in metoda, ki temelji na imunokromatografiji (angl. assay based on

immunochromatography). Obe metodi sta zelo obetavni, saj zagotavljata 100%

specifičnost, občutljivost in natančnost (28, 30);

• dokazovanje H. pylori v slini: V slini lahko določimo protitelesa proti H. pylori, njeno

DNA in ureazo s pomočjo molekularnih tehnik, ki vključujejo PCR in PCR-

denaturacijsko gradientno gelsko elektroforezo ter s pomočjo HUT, imunohistokemije in

PNA-FISH. Te preiskave večinoma ne dajejo dobrih rezultatov, so pa privlačne zaradi

lažjega zbiranja vzorca (2, 12, 28, 30).

Invazivne diagnostične metode

Te metode so vezane na endoskopski pregled zgornjega dela prebavil, zato imajo to prednost,

da lahko poleg ugotavljanja okužbe bolezen tudi makroskopsko opredelijo. Mednje uvrščamo:

• hitri bioptični ureazni test (HUT): enako kot dihalni test s sečnino temelji na ureazni

aktivnosti bakterije H. pylori. Košček tkiva želodčne sluznice, odvzetega ob gastroskopiji,

potopimo v sečnino s pH indikatorjem. V primeru prisotnosti H. pylori v tkivu, ureaza, ki

jo izloča, razgradi sečnino v amonijev ion in bikarbonat. Pri tem se poveča pH, ki

spremeni barvo indikatorja iz slamnato rumene v rdečo. Poleg hitrega rezultata odlikuje

HUT tudi nizka cena ter visoka občutljivost in specifičnost (med 90% in 95%), zato je ta

diagnostični test osnova za dokazovanje okužbe s H. pylori pri endoskopskih preiskavah

zgornjih prebavil (1, 2, 30);

• faznokontrastna mikroskopija: S pomočjo faznokontrastnega mikroskopa se lahko že

brez barvanja takoj po odvzemu bioptičnega vzorca prepričamo o prisotnosti bakterije na

želodčni sluznici (2);

• histološka preiskava biopta: nam poleg ugotavljanja prisotnosti bakterije omogoča tudi

ugotavljanje vrste, stopnje in intenzivnosti bolezenskih sprememb. Za boljši pregled z

mikroskopom vzorec namreč obarvamo po Giemsi ali s hematoksilin-eozinom, uporabimo

pa lahko tudi različne tehnike srebrenja (npr. Warthin-Starry) in imunohistokemične

metode. Že tako visoko občutljivost te metode izboljša pregled vzorcev, odvzetih na

različnih mestih želodčne sluznice. Specifičnost te metode je skoraj 100% (1, 2);

11

• bakterijska kultura: nam omogoča spremljanje rasti bakterije na gojišču, tudi ob

prisotnosti antibiotikov, kar se izkorišča za določanje občutljivosti bakterije za posamezne

antibiotike pred zdravljenjem in po neuspešni antibiotični terapiji. Na splošno velja

bakterijska kultura v diagnostiki za eno izmed treh metod zlatega standarda, uporablja pa

se tudi pri epidemioloških raziskavah (1, 2, 12).

1.2.8 ZDRAVLJENJE OKUŽBE

Za zdravljenje okužbe s H. pylori obstajajo mednarodna in nacionalna priporočila, ki tudi

določajo indikacije, na podlagi katerih so bolniki sploh upravičeni do zdravljenja. Pri izbiri

zdravil je potrebno upoštevati vpliv želodčnih in bakterijskih dejavnikov ter razvoj lokalne

bakterijske odpornosti nanje, zato ustrezni kombinaciji antibiotikov dodajamo še zaviralce

protonske črpalke ali bizmutove spojine. Poleg tega je treba upoštevati tudi, da imajo zdravila

čim manj stranskih učinkov, da so varna, da režim jemanja zdravil ni prezapleten in da stroški

zdravljenja niso previsoki (1, 2, 26).

H. pylori je in vitro občutljiva na veliko antibiotikov, ki pa in vivo ne izkazujejo zadostnega

učinka. Bakterija se namreč pred antibiotiki zavaruje z gostim mukusnim slojem, poleg tega

večina antibiotikov v kislem okolju želodca ni učinkovita, njihovo koncentracijo na mestu

okužbe pa zmanjšuje še peristaltika. Za najbolj učinkovite in vivo so se izkazali imidazoli

(predvsem metronidazol) in makrolid klaritromicin. Posebna odlika metronidazola in

klaritromicina je njuno aktivno izločanje skozi želodčno sluznico v želodčni sok,

metronidazol pa je pri nizkih vrednostih pH enako učinkovit kot pri višjih vrednostih. Vendar

je njuna uporaba kljub temu omejena zaradi razvoja rezistentnih sevov, kar je posledica

razširjene uporabe metronidazola pri ginekoloških okužbah in okužbah z drisko ter

klaritromicina pri okužbah dihal in sečil. Zaradi tega se v terapevtsko shemo uvajajo

antibiotiki z nizko odpornostjo. Eden takšnih je amoksicilin (1, 31).

Zaradi dviga pH želodčnega soka, pri katerem je večina antibiotikov bolj učinkovita, in zaradi

zmanjšanja viskoznosti mukoznega sloja za lažje prehajanje antibiotikov do mesta okužbe, so

sestavni del zdravljenja H. pylori okužb tudi zaviralci protonske črpalke (ZPČ) (lansoprazol,

omeprazol, pantoprazol). ZPČ so se izkazali za uspešnejše kot na začetku uporabljeni

antagonisti H2receptorjev s podobnim delovanjem (1).

Za podporo pri zdravljenju lahko uporabljamo tudi bizmutove spojine (bizmut

subsalicilat/subcitrat in ranitidin bizmut citrat) s svojim bakteriostatičnim in

12

citoprotektivnim delovanjem. Ranitidin bizmut citrat pa ima še dodatno baktericidno in

antisekretorno delovanje (1).

Svetovna priporočila

Leta 1996 so bila v Maastrichtu sprejeta enotna evropska priporočila za obravnavo bolnikov,

okuženih s H. pylori. Med ta priporočila sodijo tudi indikacije za eradikacijo H. pylori in

različne ravni ukrepanja glede na pomembnost eradikacije. Okužbo s H. pylori se vedno

zdravi le pri tistih bolnikih, ki izpolnjujejo merila za zdravljenje (1, 32).

Široko uporabna po vsem svetu je postala standardna empirična trotirna terapija, ki je bila

sprejeta že na 1. konferenci Evropskega združenja za raziskave H. pylori v Maastrichtu.

Predstavlja prvi izbor zdravil, sestavljen iz ZPČ ter dveh antibiotikov (klaritromicina in

amoksicilina), ki se jemljejo 2-krat na dan 7 dni. Pri bolnikih z alergijo na peniciline se

amoksicilin zamenja z metronidazolom, v državah, kjer so na voljo bizmutove soli, pa se

lahko namesto ZPČ uporabi tudi ranitidin bizmut citrat. Zaradi padca stopnje uspešnosti

zdravljenja pod priporočeno (80%) v zadnjih letih se empirično zdravljenje priporoča le v

regijah, kjer je odpornost na klaritromicin manjša od 15-20%. V regijah z odpornostjo na

klaritromicin, večjo od 15-20%, se priporoča štiritirna terapija, sestavljena iz ZPČ,

bizmutove soli, tetraciklina in metronidazola (32, 33).

Po neuspešnem začetnem zdravljenju sta se v novejšem času kot alternativni terapiji uvedli

sekvenčno zdravljenje (5 dni ZPČ in amoksicilin, nato 5 dni ZPČ, klaritromicin in

metronidazol/tinidazol) in sočasno zdravljenje (ZPČ, amoksicilin, metronidazol,

klaritromicin) (32, 33).

Pri tretjem izboru zdravljenja številne raziskave podpirajo uporabo kinolonov ali rifabutina,

na katere bakterija še ni razvila klinično pomembne rezistence. V primeru odpornosti na

nitroimidazole (metronidazol) pa se priporoča uporaba furazolidona. Ena od možnih oblik je

tudi dvotirno zdravljenje z visokimi odmerki ZPČ in amoksicilina, predvsem v primeru

nedostopnosti bizmutovih spojin in furazolidona (32, 33).

Raziskave kažejo, da daljše zdravljenje od 7 dni, kot ga imajo npr. v ZDA (14 dni), ne prinese

večjega uspeha. 14-dnevno zdravljenje bi bilo smiselno le pri bolnikih z veliko količino H.

pylori (32, 33).

13

Priporočila v Sloveniji

Priporočila za zdravljenje okužbe s H. pylori v Sloveniji je sprejelo Slovensko združenje za

gastroenterologijo in hepatologijo leta 1997. Absolutne in relativne indikacije za zdravljenje

se skladajo z indikacijami iz maastrichtskih priporočil, z zdravili pa smo zelo omejeni, saj v

Sloveniji ni na voljo bizmutovih preparatov in furazolidona. Možnosti zdravljenja z zdravili v

Sloveniji sta prikazani v spodnjih dveh tabelah (Tabela I in Tabela II) (2, 26, 32).

Tabela I: Priporočena 7-dnevna shema prvega izbora (št. 1)

ZDRAVILO DNEVNI ODMEREK

ZPČ (npr. omeprazol) 2x standardni odmerek (npr. 2x 20 mg omeprazola)

klaritromicin 2x 500 mg

amoksicilin 2x 1000 mg

Tabela II: Priporočena 7-dnevna shema drugega izbora (št. 2) – v primeru neuspeha sheme št. 1

ZDRAVILO DNEVNI ODMEREK

ZPČ (npr. omeprazol) 2x standardni odmerek (npr. 2x 20 mg omeprazola)

amoksicilin 2x 1000 mg

metronidazol (tinidazol) 2x 500 mg

V primeru, da ti dve shemi nista uspešni, se o bolnikovem nadaljnjem zdravljenju odloča

gastroenterolog, ki ima glede na občutljivost bakterije za makrolide dve možnosti:

• H. pylori za makrolide ni odporna: lahko uporabi kombinacijo ZPČ, klaritromicina in

ciprofloksacina.

• H. pylori za makrolide je odporna:lahko uporabi visoke odmerke ZPČ in amoksicilina

(32).

Uspešnost zdravljenja

Ker uspešnost trotirnega standardnega zdravljenja, ki predstavlja prvi izbor zdravil, z leti

upada, je toliko pomembneje preverjati njegovo uspešnost pri vsakem bolniku. Metoda izbora

za ocenjevanje uspešnosti zdravljenja je dihalni test s sečnino, v poštev pa pride tudi

dokazovanje bakterijskega antigena v blatu. Pri bolnikih, pri katerih je iz medicinskega

razloga potrebna kontrolna gastroskopija (bolniki z razjedo na želodcu, peptično razjedo z

14

zapleti ali limfomom MALT), pa se uspeh zdravljenja preveri s histološkim pregledom

odvzetega vzorca, hitrim ureaznim testom ali kulturo. To preverjanje se izvede najmanj 4

tedne po končanem antimikrobnem zdravljenju in vsaj 2 tedna po prenehanju jemanja ZPČ ali

H2 antagonistov (1, 2, 31, 32).

1.2.9 RAZVOJ CEPIVA PROTI H. PYLORI Ker različni sevi H. pylori predstavljajo naraščajočo odpornost na antibiotike po vsem svetu,

je za obvladovanje okužbe nujno razviti učinkovito cepivo. Za razvoj cepiva je bilo narejenih

že veliko raziskav na živalskih modelih, vendar ob tem uporabljeni adjuvansi in vektorji niso

dali dovolj učinkovitega imunskega odgovora proti antigenu v cepivu. Nasploh je potrebno

ugotoviti, ali bi bilo mogoče dosedanje rezultate ponoviti tudi pri ljudeh. Tako je verjetno, da

bo z večjim številom raziskav v tej smeri nekoč končno mogoče nadzorovati okužbo in tako

preprečiti obolevnost in umrljivost zaradi te nalezljive bolezni (34).

2. NAMEN DELA Namen diplomskega dela je določiti diagnostično uporabnost kvalitativne in kvantitativne

metode določanja H. pylori antigena v blatu v primerjavi z dihalnim testom s sečnino ter

ugotoviti povezavo med kvalitativnimi vrednostmi določanja H. pylori antigena v blatu in

koncentracijo H. pylori antigena v blatu. Za ta namen bomo izračunali diagnostične vrednosti

teh metod (občutljivost, specifičnost, točnost ter pozitivno in negativno napovedno vrednost),

jih primerjali med seboj in določili mejno vrednost kvalitativne metode določanja H. pylori

antigena v blatu s pomočjo rezultatov kvantitativne metode.

Za kontrolo uspešnosti terapije okužb s H. pylori se rutinsko uporablja dihalni test s sečnino,

ki je visoko specifičen in občutljiv. Za rutinsko izvajanje dihalnega testa pride v poštev le z

izotopom ogljika 13C označena sečnina, saj je izotop 13C, v primerjavi z radioaktivnim

izotopom 14C, stabilen in neškodljiv. Vendar je izvedba dihalnega testa s 13C označeno

sečnino draga. Poleg tega lahko bolniki odvzem vzorcev izdihanega zraka opravijo le v

zdravstvenih ustanovah. V naši raziskavi bomo zato preverili uporabnost cenejših

neinvazivnih diagnostičnih metod za ugotavljanje uspešnosti zdravljenja okužb s H. pylori,

katerih vzorci bi se lahko pošiljali tudi od doma.

15

Naš cilj je ugotoviti, ali lahko metoda določanja H. pylori antigena v blatu nadomesti do sedaj

uporabljano metodo – dihalni test s sečnino. Predpostavljamo, da bosta testa določanja

antigena v blatu dala primerljive rezultate z dihalnim testom.

3. MATERIALI IN METODE DELA

3.1 PRIDOBIVANJE PODATKOV

V preiskavo smo vključili 100 zaporedno izbranih ljudi, ki so bili v polletnem obdobju

preiskovani na Kliničnem oddelku za gastroenterologijo Univerzitetnega kliničnega centra

(UKC) v Ljubljani. Po gastroskopiji jim je bila narejena histološka preiskava želodčnega tkiva

in/ali HUT in s tem ugotovljena prisotnost H. pylori. Okužba s H. pylori je bila pri nekaterih

preiskovancih ugotovljena bodisi prvič, pri drugih pa bodisi zaradi neuspešne eradikacije

bakterije po 1. izboru zdravljenja. Vsem preiskovancem je bila predpisana terapija z

antibiotiki in ZPČ. Še pred terapijo z zdravili so jim bile zaradi kontrole uspešnosti

zdravljenja na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo (KIKKB) Kliničnega

centra (KC) v Ljubljani narejene dihalni test s sečnino in serološke preiskave seruma, dodatno

pa smo jim v okviru naše preiskave naredili še kvalitativno in kvantitativno analizo

bakterijskega antigena v blatu. Po približno 8 tednih od prvega dne zdravljenja z zdravili so

bili preiskovanci napoteni na ponovno opravljanje teh preiskav na KIKKB.

Od 100 preiskovancev, ki so prišli na prvi pregled, je bilo 55 žensk in 45 moških, starih med

10 in 85 let. Njihova povprečna starost je bila 46,74 let.

3.2 PROUČEVANE DIAGNOSTIČNE METODE

3.2.1 DIHALNI TEST S SEČNINO

Helicobacter Test INFAI - 13C urea dihalni test

13C urea dihalni test je neinvaziven in neradioaktiven test za odkrivanje okužb z bakterijo H.

pylori in za ocenjevanje uspešnosti zdravljenja okužbe. Izotop 13C je stabilen in povsem

neškodljiv, zato se lahko uporablja tudi pri nosečnicah, doječih materah in otrocih (1, 2, 35).

Helicobacter Test INFAI je dihalni test za enkratno uporabo, namenjen in vivo

diagnosticiranju gastroduodenalne okužbe s H. pylori. Za preiskovanje odraslih in otrok od

12. leta dalje, pri katerih obstaja sum na peptični ulkus, uporabljamo Helicobacter Test

16

INFAI, 75 mg prašek za peroralno raztopino. Otroke od 3. do 11. leta starosti, s sumom na

peptični ulkus, testiramo s Helicobacter Testom INFAI, 45 mg praškom za peroralno

raztopino (36).

PRINCIP METODE

Ko pacient popije sečnino, označeno z izotopom ogljika 13C, bakterija H. pylori s svojim

encimom ureazo cepi sečnino na amonijak in ogljikov dioksid. Ogljikov dioksid se absorbira

v krvni obtok in se izloči z izdihanim zrakom preko pljuč. Izmerimo delež izotopa 13C v

izdihanem zraku (35).

FARMAKODINAMIČNE LASTNOSTI

Farmakoterapevtska skupina: drugi diagnostiki; oznaka ATC: VO4CX.

Za količino 13C sečnine, ki se uporabi pri dihalnem testu, farmakodinamični učinki niso

opisani.

Po zaužitju s 13C označena sečnina doseže želodčno sluznico. V primeru prisotnosti H. pylori

na želodčni sluznici, označeno sečnino presnovi bakterijski encim ureaza, kot kaže spodnja

enačba (enačba 1):

NH2 – (13C = O) – NH2 + H2O ureaza�⎯⎯⎯� P13CO2 + 2NH3 (1)

Ogljikov dioksid difundira v krvne žile. Od tam se v obliki bikarbonata prenese v pljuča in se

izloči z izdihanim zrakom kot 13CO2.

V prisotnosti bakterijske ureaze se razmerje med 13C in 12C-ogljikovimi izotopi znatno

spremeni. Delež 13CO2 v vzorcih izdihanega zraka je določen s pomočjo spektrometrije

določanja razmerja mase izotopov (angl. IRMS = isotope ratio mass spectrometry) in se

navede kot absolutna razlika (∆δ-vrednost) med 00-minutnimi in 30-minutnimi vrednostmi.

Ureazo proizvaja v želodcu samo H. pylori. Ostale bakterije, ki proizvajajo ureazo, najdemo v

želodčni flori redko.

V odsotnosti bakterijske ureaze se celotna količina zaužite sečnine po absorpciji iz

gastrointestinalnega trakta presnovi enako kot endogena sečnina. Amonijak, ki nastane pri

bakterijski hidrolizi, se vključi v presnovo v obliki NH4+.

17

FARMAKOKINETIČNE LASTNOSTI

Zaužita 13C-sečnina se presnovi v ogljikov dioksid in amonijak ali se vključi v cikel sečnine v

telesu. Povečanje količine 13CO2 izmerimo z izotopsko analizo.

Absorpcija in porazdelitev 13CO2 je hitrejša od reakcije sečnine. Zato je cepitev 13C-sečnine s

H. pylori ureazo tista stopnja, ki omejuje hitrost celotnega postopka.

Samo pri H. pylori pozitivnih bolnikih 75 mg označene sečnine (ali 45 mg pri otrocih od 3-11

let) znatno poveča količino 13CO2 v vzorcu izdihanega zraka v prvih 30 minutah po zaužitju

(36).

TOKSIČNI UČINKI 13C

Izotop 13C ni telesu tuja snov, saj je v približni količini 2g/kg telesne mase že normalno

prisoten pri ljudeh. Vsakodnevno ga vnesemo v telo povprečno 2-3 g in je tako v izdihanem

zraku prisoten 1% 13C od vsega izdihanega CO2. Zato vnos 100 mg s 13C označene sečnine, ki

je ekvivalentna 21 mg 13C izotopa, predstavlja le 1% dnevnega vnosa 13C izotopa. Dnevno se

v telesu sintetizira 20-30 g sečnine. V primerjavi s tem je 100 mg s 13C označene sečnine, ki

jo vnesemo v organizem z dihalnim testom, malo, in tako sečnina v tej količini ni toksična.

Tudi količina amonijaka, ki nastane pri razgradnji zaužite sečnine, je premajhna, da bi

povzročala toksične učinke (37).

KOMPONENTE TESTA

Testni komplet Helicobacter INFAI (Slika 7) vsebuje naslednje komponente:

• Plastenka (prostornina 10 ml, iz polistirena s polietilenskim pokrovčkom), ki vsebuje 75

mg praška 13C-sečnine za peroralno raztopino (ali 45 mg pri otrocih od 3-11 let),

• označene steklene ali plastične epruvete za zbiranje, shranjevanje in prenašanje vzorcev

izdihanega zraka za analizo: 2 epruveti za čas vzorčenja pri 00-minutni vrednosti in 2

epruveti za čas vzorčenja pri 30-minutni vrednosti,

• upogljiva slamica za zbiranje vzorcev izdihanega zraka v ustrezne vsebnike za vzorec,

• podatkovni list za dokumentacijo bolnika,

• navodilo za uporabo,

• list z etiketami s črtno kodo in nalepka (36).

18

Slika 7: Testni komplet Helicobacter INFAI (povzeto po 38)

ODVZEM VZORCEV ZRAKA

1. V epruveto z oznako »čas vzorčenja: 00-minutna vrednost« zberemo osnovni vzorec zraka

tako, da pacient rahlo vpihuje preko slamice v epruveto, dokler se notranja površina

epruvete ne zarosi. Izvlečemo slamico in epruveto takoj zapremo s priloženim zamaškom

(če ostane odprta več kot 30 sekund, je lahko izid testa napačen). Na epruveto prilepimo

črtno kodo z ustrezno oznako.

2. Po enakem postopku napolnimo še drugo epruveto z oznako »čas vzorčenja: 00-minutna

vrednost«.

3. Pacient popije 200 ml 100% pomarančnega soka ali 1g citronske kisline v 200 ml vode, da

upočasni praznjenje želodca in za tem v 30 ml vode raztopljene 13C sečnine (odrasli v

starosti ≥ 12 let: 75 mg sečnine/30 ml vode, otroci v starosti 3-11 let: 45 mg sečnine/30 ml

vode). Raztopino sečnine pripravimo tako, da plastenko s praškom 13C-sečnine odpremo

in jo do ¾ napolnimo z navadno vodo. Zaprto plastenko stresamo, da se prašek raztopi in

vsebino prelijemo v kozarec. Plastenko splahnemo z vodo in vlijemo v kozarec, tako da je

celotna količina vode v kozarcu približno 30 ml. Raztopino sečnine mora pacient popiti

takoj. Zapišemo si čas zaužitja raztopine.

4. Čez 30 minut zberemo izdihan zrak v epruveti z oznako »čas vzorčenja: 30-minutna

vrednost« na enak način kot na začetku in epruveti označimo s črtno kodo.

5. Na bolnikov podatkovni list nalepimo ustrezno etiketo s črtno kodo. Na koncu zapečatimo

paket z nalepko.

6. Vzorce izdihanega zraka analiziramo s spektrometrično metodo določanja razmerja mase

izotopov ali IRMS (35, 36).

Postopek odvzema vzorcev zraka je prikazan na spodnji sliki (Slika 8).

19

Slika 8: Postopek testiranja s testom Helicobacter INFAI (povzeto po 35)

ANALIZA VZORCEV ZRAKA

Vzorce izdihanega zraka, zbrane v 10 ml steklenih ali plastičnih epruvetah, analiziramo s

spektrometrično metodo določanja razmerja mase izotopov (IRMS). Analiza razmerja

med 13C in 12C v izdihanem ogljikovem dioksidu je sestavni del diagnostičnega postopka

Testa Helicobacter INFAI. Natančnost testa je močno odvisna od kakovosti analize

izdihanega zraka. Podroben opis parametrov analize zraka – linearnost, stabilnost (natančnost

referenčnega plina) - ter natančnost meritev sta bistvena pogoja za točnost testnih rezultatov.

Priprava vzorcev za IRMS

Za določitev razmerja med 13C in 12C v izdihanem ogljikovem dioksidu z masno

spektrometrično analizo moramo ogljikov dioksid ločiti od zraka in ga vnesti v masni

spektrometer. Avtomatski sistem priprave vzorcev za masne spektrometre, namenjen analizi

izdihanega zraka, je osnovan na plinsko-kromatografski tehniki ločevanja z neprekinjenim

pretokom.

20

Vodo odstranimo iz vzorca s pomočjo Nafion vodne zapore ali s plinsko-kromatografskim

sistemom, ki loči posamezne pline v plinsko-kromatografski koloni s helijem kot eluentom. Z

ionizacijskim detektorjem določimo vrste posameznih plinov, ko ti prehajajo skozi kolono. V

masni spektrometer vnesemo frakcijo ogljikovega dioksida, ki jo določimo z zanj značilnim

retencijskim časom.

Masno-spektrometrična analiza

Za analizo ločenega ogljikovega dioksida se morajo njegove molekule ionizirati in oblikovati

v žarek. Molekule se nato pospešijo v električnem polju, odklonijo v magnetnem polju in na

koncu detektirajo. Teh pet procesov poteka v analizatorju masnega spektrometra, ki je

sestavljen iz treh ločenih delov: vira, cevi in kolektorja. Ionizacija, tvorba žarka in pospešek

potekajo v viru, magnetni odklon poteka v cevi in detekcija v kolektorju.

INTERPRETACIJA REZULTATOV

Določamo razmerje izotopov 13C/12C v ogljikovem dioksidu v izdihanem zraku. Delež 13CO2

(ali izotopa 13C) v izdihanem zraku se navede kot absolutna razlika (∆δ-vrednost) med 00-

minutnimi in 30-minutnimi vrednostmi. Mejna ∆δ-vrednost je 4‰, kar pomeni:

- ∆δ-vrednost > 4‰: okužba s H.pylori je prisotna (pozitiven rezultat),

- ∆δ-vrednost ≤ 4‰: okužba s H. pylori ni prisotna (negativen rezultat) (36).

POSEBNA OPOZORILA

Prašek v testu se lahko uporablja le za diagnostične namene. Preiskovanci morajo biti tešči

vsaj 6 ur, pred testom ne smejo kaditi, pijejo lahko le negazirano vodo, med testom pa morajo

mirovati. Za ocenjevanje uspešnosti zdravljenja okužbe morajo preiskovanci najmanj 4 tedne

pred testom prenehati z jemanjem antibiotikov in najmanj 2 tedna pred testom z jemanjem

antacidov ali inhibitorjev protonske črpalke (povzročijo lažno negativen rezultat) ali

antagonistov H2-receptorjev (povzročijo lažno pozitiven rezultat). Pozitiven dihalni test še ne

pomeni indikacije za eradikacijsko terapijo, ampak se mora za preučitev razmer v želodcu

izvesti diferencialna diagnostika z invazivnimi endoskopskimi metodami. Pri nekaterih

posameznikih lahko atrofični gastritis daje lažno pozitivne rezultate dihalnega testa. V teh

primerih se za potrditev okužbe s H. pylori zahtevajo druge diagnostične metode. Zaradi

vpliva na pojav lažno pozitivnih rezultatov se test tudi ne priporoča izvajati na bolnikih z

ostalimi okužbami želodca. Če je potrebno ponoviti postopek testa, se lahko ta izvede šele

21

naslednji dan. Prevelikega odmerjanja pri zaužitju enega odmerka, ki vsebuje 75 mg 13C

sečnine (ali 45 mg pri otrocih od 3-11 let), ne pričakujemo (35, 36).

LASTNOSTI TESTA

V primerjavi s hitrim bioptičnim ureaznim testom (HUT) je Helicobacter INFAI dihalni test

dosegel občutljivost v območju 96,5% do 97,9% [95% interval zaupanja: 94,05%-99,72%] in

specifičnost v območju 96,7% do 100% [95% interval zaupanja: 94,17%-103,63%] (36).

3.2.2 DOLOČANJE H. PYLORI ANTIGENA V BLATU

ImmunoCard STAT! HpSA – test za kvalitativno določanje H. pylori antigena v blatu

ImmunoCard STAT! HpSA je hiter in vitro kvalitativen postopek za odkrivanje H. pylori

antigena v človeškem blatu. Namenjen je za pomoč pri diagnosticiranju okužbe s H. pylori

kot tudi za preverjanje prisotnosti H. pylori antigena v blatu po zdravljenju. Kot vse metode

za ugotavljanje uspešnosti zdravljenja je tudi to metodo potrebno opraviti vsaj štiri tedne po

zaključku zdravljenja.

ImmunoCard STAT! HpSA je hiter imunski test, ki uporablja monoklonska anti-H. pylori

protitelesa za zajetje in detekcijo primarnih protiteles. Razredčen vzorec človeškega blata

obdela testna naprava. Pojav rožnato-rdeče črte poleg črke T v bralnem okvirju po petih

minutah inkubacije pri sobni temperaturi nakazuje na pozitiven rezultat.

KOMPONENTE TESTA

Osnovne komponente:

• ImmunoCard STAT! testna naprava: kromatografski trak, nameščen v plastičnem okvirju

in zaprt v vrečki iz folije s sušilnim sredstvom; trak nosi monoklonska anti-H. pylori

lovilna protitelesa za testiranje vzorca in živalske beljakovine za kontrolo; trakovi

vsebujejo tudi rdeči lateks, konjugiran z anti-H. pylori protitelesi in moder lateks,

konjugiran z anti-proteinskimi protitelesi, kot protitelesa za detekcijo vzorca in kontrole;

ko testna naprava ni v uporabi, se shrani pri 2-8 ºC in se ne sme zamrzovati,

• vzorec za redčenje: raztopina puferske soli, ki vsebuje natrijev azid (0,095%) kot

konzervans; nahaja se v rdeče limitirani viali z aplikatorsko konico; ko se vzorec za

redčenje ne uporablja, se shrani pri 2-8 ºC,

22

• pozitivna kontrola: suspenzija inaktivirane H. pylori v uravnoteženi solni raztopini z

natrijevim azidom (0,095%) kot konzervansom; nahaja se v viali s plastično kapalko in je

že pripravljena za uporabo; ko se pozitivna kontrola ne uporablja, se shrani pri 2-8 ºC,

• 100 μl prenašalne pipete.

Zahtevan dodaten material:

• rokavice iz lateksa za enkratno uporabo,

• po želji mešalna naprava za suspendiranje vzorca blata v vzorec za redčenje,

• samodejni mehanizem za aktiviranje naprave po časovnih intervalih.

PRIPRAVA VZORCA

Vzorci se morajo transportirati v zračno tesni posodi in jih je potrebno testirati čim prej.

Lahko pa se pred testiranjem shranijo pri temperaturi 2-8 °C do 72 ur. Če testiranja ni mogoče

opraviti v tem času, je potrebno vzorce po prejemu takoj zamrzniti pri ≤ -20 °C. Zamrznejo in

odmrznejo se lahko dvakrat. Pred testiranjem je potrebno vzorce blata temeljito premešati.

Vzorci tekočega ali poltrdnega blata

Na rdeče limitirani viali z vzorcem za redčenje odvijemo rdeč pokrov. Uporabimo čisto

kalibrirano transportno pipeto (priloženo v kompletu) za prenos 100 μl vzorca blata (do druge

oznake na pipeti). V vzorec za redčenje damo vzorec blata in razredčen vzorec zmešamo z

isto transportno pipeto tako, da na njej trikrat previdno stisnemo gumijasto žogico. Vialo

trdno zapremo, nato pa vzorec temeljito, a nežno premešamo z vrtinčenjem vsebine v viali za

15 sekund. Paziti je potrebno pri pipetiranju poltrdnega blata, saj dodatek manj kot 100 μl

blata lahko povzroči lažno negativen rezultat, več kot 100 μl blata pa neveljaven rezultat

zaradi omejenega pretoka vzorca.

Vzorci trdnega blata

S plastično aplikatorsko paličico, ki se nahaja na rdečem zamašku viale od vzorca za redčenje,

zberemo majhen del blata (5-6 mm) in ga dodamo vzorcu za redčenje v viali. Mešan vzorec v

viali temeljito, a nežno premešamo z vrtinčenjem vsebine v viali za 15 sekund. Vzorcu za

redčenje je potrebno dodati točno 100 μl blata in to temeljito premešati, da se izognemo lažno

negativnim in neveljavnim rezultatom.

23

ANALIZNI POSTOPEK

Testiranje vzorca

Naprava, reagenti in vzorci morajo biti pred testiranjem izpostavljeni sobni temperaturi (20-

26 °C). Za testiranje vzorcev uporabljamo ImmunoCard STAT! testno napravo. Na testni

napravi sta označeni testna in kontrolna linija. Okroglo okno s puščico je testno okno, na

katerega se da vzorec. V testno napravo vnesemo ime oz. oznako bolnika. Vialo z

razredčenim vzorcem držimo pokončno in se pred nadaljevanjem nežno dotaknemo dna

laboratorijskega pulta. Vrh viale pokrijemo z vpojnim papirjem, da preprečimo razlivanje

vsebine. Odlomimo rdečo konico na zunanji strani rdečega pokrovčka. Vialo obrnemo

navzdol in kanemo 4 kapljice razredčenega vzorca v okroglo okno (na puščico) testne

naprave. Pri tem pazimo, da se s konico viale ne dotikamo testne naprave. Nastavimo čas in

inkubiramo 5 minut pri 20-26 °C. V času 1 minute po inkubaciji odčitamo rezultat (39).

Postopek testiranja je prikazan na spodnji sliki (Slika 9).

Slika 9: Postopek testiranja s testom ImmunoCard STAT! HpSA (povzeto po 40)

24

Kontrola

Pozitivne in negativne kontrole so namenjene za prikaz aktivnosti reagentov, njihove

specifičnosti in sposobnosti dajanja pričakovanih rezultatov. Pred preizkusom izpostavimo

kontrolne reagente temperaturi 20-26 °C. V ImmunoCard STAT! testno napravo vnesemo

oznako kontrole, ki se preizkuša. Vialo z reagenti obrnemo navzdol in kanemo 4 kapljice

pozitivne kontrole na testno okno (na puščico). Pazimo, da se vrh viale ne dotika področja

vzorca. Na zunanji strani rdečega pokrovčka viale z vzorcem za redčenje odlomimo rdečo

konico in nanesemo 4 kapljice vzorca za redčenje na testno okno (na puščico) druge testne

naprave. Nastavimo čas in inkubiramo 5 minut pri 20-26 °C. V času 1 minute po inkubaciji

odčitamo rezultate.

INTERPRETACIJA REZULTATOV

Negativen rezultat:

Prikaz modre črte v osrednjem oknu testne naprave, blizu črke C (kontrolna linija). Črta na

testni liniji ni vidna. Pomeni, da so H. pylori antigeni odsotni ali pod ravnjo detekcije.

Pozitiven rezultat:

Poleg modre črte blizu črke C (kontrolna linija) še prikaz rožnato-rdeče črte v osrednjem oknu

testne naprave, blizu črke T (testna linija). Tudi zelo šibka rožnato-rdeča črta pomeni

pozitiven rezultat, saj je intenzivnost obarvanja odvisna od koncentracije antigena v vzorcu.

Obarvanje črte na testni liniji pomeni, da so v vzorcu prisotni H. pylori antigeni (39).

Pozitiven rezultat prikazuje spodnja slika (Slika 10).

Slika 10: Prikaz pozitivnega rezultata ImmunoCard STAT! HpSA testa (povzeto po 41)

25

Neveljaven rezultat:

Odsotnost modre črte na kontrolni liniji ob prisotnosti ali odsotnosti rožnato-rdeče črte na

testni liniji; pojav rožnato-rdeče črte na testni liniji šele po 6 minutah; pojav črte katere druge

barve kot rožnato-rdeče na testni liniji.

OMEJITVE TESTA

Test je izključno kvalitativen; rezultati se glede intenzitete obarvanja črte na testni liniji ne

morejo kvantitativno razložiti. Rezultati se naj uporabljajo v povezavi z ostalimi

informacijami o bolniku in z ostalimi diagnostičnimi postopki. Uživanje antibiotikov,

zaviralcev protonske črpalke in bizmutovih pripravkov 2 tedna pred izvedbo tega testa lahko

da lažno negativne rezultate. V tem primeru je potrebno preiskavo ponoviti 2 tedna po

prekinitvi zdravljenja s temi zdravili. Lažno negativen rezultat lahko povzroči tudi nezadostna

količina blata, ki ga dodamo vzorcu za redčenje. Dodatek prevelike količine blata pa lahko

zaradi zaviranja pravilnega pretoka vzorca povzroči neveljaven rezultat. Presežna inkubacija

lahko privede do lažno pozitivnih rezultatov, inkubacija pri nižjih temperaturah ali krajši čas

pa do lažno negativnih rezultatov. Test ni primeren za vzorec vodenega blata (kot je npr. pri

diareji), saj lahko takšno blato, sestavljeno predvsem iz tekočine z malo ali brez trdne snovi,

povzroči lažno negativne rezultate.

LASTNOSTI TESTA

Narejena je bila klinična študija, v kateri so primerjali ImmunoCard STAT! HpSA metodo

določanja bakterijskega antigena v vzorcih blata bolnikov z invazivnimi metodami

(histologijo/HUT/bakterijsko kulturo), narejenimi na biopsijskih vzorcih tkiva bolnikov,

odvzetih pri endoskopiji. Bolniki niso uživali nobenih zdravil za zaviranje želodčne kisline in

ne antibiotikov. S primerjavo rezultatov so izračunali naslednje lastnosti ImmunoCard STAT!

HpSA testa:

Diagnostična občutljivost: 90,6%,

Diagnostična specifičnost: 91,5%,

Pozitivna napovedna vrednost: 86,5%,

Negativna napovedna vrednost: 94,2%,

Diagnostična točnost: 91,2% (39).

26

DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA – test za kvantitativno določanje H. pylori

antigena v blatu

DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA je encimsko-imunski test (ELISA) tako za

kvalitativno kot kvantitativno določanje H. pylori antigena v človeškem blatu.

PRINCIP METODE

Metoda uporablja mikroplošče, prevlečene z monoklonskimi mišjimi protitelesi, usmerjenim

k najbolj specifičnemu H. pylori antigenu (HP Ag). V prvi inkubaciji trdno fazo obdelamo z

vzorcem, ki smo ga predhodno ekstrahirali iz blata, in hkrati z mešanico monoklonskih

protiteles proti H. pylori, konjugiranih s peroksidazo. Speremo ostale sestavine vzorca in

ponovno inkubiramo. Na trdni fazi vezan encim generira optični signal, ki je sorazmeren s

količino H. pylori antigena v vzorcu (42).

Princip metode je shematsko prikazan na spodnji sliki (Slika 11).

Slika 11: Princip testa določanja HP Ag v blatu (povzeto po 43)

27

KOMPONENTE TESTA

Osnovne komponente (Slika 12):

• mikroplošča: 6 trakov x 8 mikro vdolbinic, prevlečenih s prečiščenimi mišjimi

monoklonskimi anti HP Ag protitelesi, zapečatenimi v vrečki s sušilnim sredstvom; pred

odprtjem naj mikroplošča doseže sobno temperaturo; neuporabljene trakove shranimo v

vrečko s sušilnim sredstvom pri 4 °C in vrečko zapremo;

• standardi: 4 viale liofiliziranih standardov; pred uporabo se standardi raztopijo v vodi EIA

razreda do naslednjih koncentracij: 0-0,1-0,5-1,0 g/ml HP Ag; vsebujejo fetalni goveji

serum, inaktiviran HP Ag, 10 mM fosfatni pufer (pH 7,4 +/- 0,1), 0,02% gentamicin sulfat

in 0,1% Kathon GC kot konzervansa;

• pufer za izpiranje: 1 x 60 ml/steklenička - 20x koncentrirana raztopina; vsebuje 10 mM

fosfatni pufer (pH 7,0 +/- 0,2), 0,05% Tween 20 in 0,05% Kathon GC;

• encimski konjugat: 1 x 8 ml/viala - pripravljen za uporabo; vsebuje s hrenovo peroksidazo

(HRP) označena mišja monoklonska protitelesa proti HP Ag, 10 mM Tris pufer (pH 6,8

+/- 0.1), 2% BSA ter 0,1% Kathon GC in 0,02% gentamicin sulfat kot konzervansa;

encimski konjugat je označen rdeče;

• kromogen/substratna raztopina: 1 x 16 ml/viala - vsebuje 50 mM citrat-fosfatno pufersko

raztopino (pH 3,5-3,8), 0,03% tetra-metil-benzidin (TMB) in 0,02% vodikov peroksid

(H2O2);

• vzorec za redčenje: 1 x 60 ml/viala - puferska raztopina za ekstrakcijo HP Ag iz vzorca in

za pripravo vzorca; vsebuje 10 mM Tris-HCl pufer (pH 7,4 +/- 0,1), 2% BSA ter 0,1%

Kathon GC in 0,02% gentamicin sulfat kot konzervansa; vzorec za redčenje je označen

modro;

• žveplova kislina: 1 x 10 ml/viala - vsebuje 0,3 M raztopino H2SO4;

• tesnilna folija: 2 zavoja;

• navodilo (42).

28

Slika 12: Testni komplet DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA (povzeto po 44)

Zahtevan dodaten material:

• komplet za ekstrakcijo HP Ag iz blata: vsebuje ekstrakcijsko krtačo, epruveto, filtrirni bat

in Pasteurjevo pipeto,

• kalibrirane plastične mikropipete za enkratno uporabo, volumnov 1000 μl in 200 μl,

• voda EIA oz. ELISA razreda (dvakrat destilirana ali deionizirana in obdelana z aktivnim

ogljem za odstranitev oksidativnih kemikalij, ki se uporabljajo kot dezinfekcijska

sredstva),

• štoparica,

• vpojni papir,

• kalibriran ELISA termostatski inkubator (za suho ali mokro inkubacijo mikroplošče),

nastavljen na 37 °C,

• kalibriran ELISA optični čitalnik mikro vdolbinic s 450 nm filtri (za branje) in po

možnosti s 620-630 nm filtri (za odštetje ozadja),

• kalibrirana ELISA pralna naprava mikroplošče,

• vorteks ali podobna mešalna naprava,

• plastična žlička za enkratno uporabo za pridobivanje vzorca blata,

• posoda za zbiranje blata.

29

PRIPRAVA VZORCA

1. Odpremo napravo za zbiranje blata in porinemo ekstrakcijsko krtačo globoko v vzorec.

Krtačo zavrtimo 2-4 krat, da zberemo zadostno količino biološkega materiala (približno

0,2 g).

2. Krtačo z vzorcem blata pazljivo prenesemo v epruveto, dobavljeno v kompletu, in dodamo

1 ml vzorca za redčenje. Krtačo pustimo v epruveti in močno premešamo z mešalno

napravo za 2 min (+/- 10%), da preide H. pylori iz blata v raztopino.

3. Krtačo zavržemo in v epruveto vstavimo filtrirni bat, ki je v kompletu. Nežno potisnemo

bat navzdol, da zberemo dovolj velik volumen tekoče faze suspenzije za izvedbo testa (ne

več kot 150-200 μl).

PRIPRAVA KOMPONENT

Mikroplošče

Vsebnik z mikroploščami postavimo na sobno temperaturo (za približno 1 uro), preden ga

odpremo. Preverimo barvo sušilnega sredstva (temno zelena barva kaže na nepravilno

shranjevanje). Neuporabljene trakove trdno zapremo nazaj v aluminijasto vrečko s sušilnim

sredstvom in jih shranimo pri 2-8 °C.

Standardi

Liofiliziranemu prašku vsakega standarda dodamo količino vode razreda ELISA, kot je

navedeno na etiketi standarda. Pustimo, da se vsebina popolnoma raztopi in jo nato rahlo

zmešamo z mešalno napravo.

Koncentrat pufra za izpiranje

Celotno vsebino koncentrirane raztopine 20-krat razredčimo z vodo razreda ELISA in pred

uporabo rahlo premešamo. Med pripravo preprečimo penjenje, ker lahko prisotnost

mehurčkov vpliva na učinkovitost ciklov pranja.

Encimski konjugat

Pripravljen za uporabo. Pred uporabo ga dobro premešamo z mešalno napravo.

Kromogen/ substratna raztopina

Pripravljen/-a za uporabo. Pred uporabo dobro premešamo z mešalno napravo. Preprečimo

kontaminacijo tekočine z oksidativnimi kemikalijami, zračnim prahom ali mikrobi. Ne

30

izpostavljamo močni svetlobi, oksidantom in kovinskim površinam. Za prenos te komponente

uporabimo le plastičen in, če je mogoče, sterilen vsebnik za enkratno uporabo.

Vzorec za redčenje


Stop reagent (žveplova kislina)


ANALIZNI POSTOPEK

Postopek za kvantitativno določanje HP Ag

1. Potrebno število trakov položimo v plastični nosilec in natančno opredelimo vdolbinice za

standarde in vzorce. A1 + B1 vdolbinici pustimo prazni – služita za slepa vzorca.

2. V vdolbinice za kalibracijo prenesemo s pipeto 100 μl standardov v dveh izvodih.

3. S Pasteurjevo pipeto izsesamo suspenzijo vzorca blata, jo v epruveti za vzorec filtriramo

navzgor v notranjo komoro bata in v vsako vdolbinico za vzorce dobro porazdelimo 3

kapljice tega vzorca (približno 100 μl). Preverimo prisotnost vzorcev v vdolbinicah s

prostim očesom (med prazno in polno vdolbinico obstaja barvna razlika) ali z branjem s

pomočjo ELISA optičnega čitalnika pri 450/620 nm. Vzorci kažejo vrednosti OD (optična

gostota ali angl. optical density), višje od 0,100.

4. Dispergiramo 100 μl encimskega konjugata v vse vdolbinice, razen v A1 + B1, ki se

uporabljata za slepe izvedbe.

5. Po dodatku konjugata preverimo spremembo barve vzorcev iz rjave do svetlo rdečkaste in

mikroplošče inkubiramo 120 min pri 37 °C.

6. Po končani inkubaciji speremo mikro vdolbinice z ELISA pralno napravo. Izvedemo 4-5

ciklov pranja (porazdelitev in izsesavanje 300 μl pralne raztopine v vsako mikro

vdolbinico predstavlja 1 cikel). Predlagan namakalni čas med cikli je 20-30 sekund.

7. Pipetiramo 200 μl kromogena/substrata v vse vdolbinice, vključno z A1 + B1. Mikroploščo

inkubiramo zaščiteno pred svetlobo pri sobni temperaturi (18-24 °C) 20 min. Močna

neposredna svetloba lahko namreč ustvari visoko ozadje.

8. Pipetiramo 100 μl stop reagenta v vse vdolbinice, da ustavimo encimsko reakcijo.

Izvedemo enako zaporedje pipetiranja kot pri koraku 7.

31

9. Izmerimo intenzivnost barve raztopine v vsaki vdolbinici, pri čemer uporabimo 450 nm

filter (za branje) in 620-630 nm filter (za odštetje ozadja). Slepa vrednost instrumenta je pri

vdolbinici A1 ali B1 ali pri obeh.

IZRAČUN REZULTATOV

Operacijski sistem ELISA izračuna srednjo vrednost OD standardov pri 450 nm. Nariše

umeritveno krivuljo in iz nje izračuna koncentracijo HP antigena v vzorcu.

NOTRANJA KONTROLA KAKOVOSTI

Kontrola kakovosti se izvede s pomočjo kontrol/standardov z namenom preverjanja, ali je

pričakovana vrednost OD pri 450 nm usklajena z analizo. Vrednosti OD standardov morajo

ustrezati vrednostim, podanim v spodnji tabeli (Tabela III) (42).

Tabela III: Zahtevane vrednosti OD slepega vzorca in standardov (Std.)

PARAMETER ZAHTEVANE VREDNOSTI OD (450 nm)

Slepi vzorec < 0,100

Std. 0 μg/ml < 0,200

Std. 0,1 μg/ml OD 450 nm > OD 450 nm Std. 0 μg/ml + 0,100

Std. 1 μg/ml > 1,000

3.3 STATISTIČNA OBDELAVA PODATKOV

Za statistično obdelavo smo uporabili podatke le tistih pacientov, ki so imeli opravljene

preiskave z vsemi tremi testi (dihalni test s sečnino ter kvalitativno in kvantitativno določanje

H. pylori antigena v blatu). Takšnih pacientov je bilo 74.

3.3.1 DOLOČITEV MEJNE VREDNOSTI KVANTITATIVNEGA TESTA

DOLOČANJA H. PYLORI ANTIGENA V BLATU S POMOČJO STATISTIČNEGA

PROGRAMA MedCalc

Mejno vrednost kvantitativnega DRG® Helicobacter Pylori Ag (stool) ELISA testa smo

določili s pomočjo statističnega programa MedCalc, v katerega smo vnesli vrednosti,

pridobljene pri testiranju pacientov s kvantitativnim testom določanja H. pylori antigena v

32

blatu in z dihalnim testom s sečnino. Vrednosti dihalnega testa s sečnino so nam služile kot

referenčne vrednosti, s pomočjo katerih smo vrednosti kvantitativnega testa označili s

karakteristiko 0 pri negativnih vrednostih dihalnega testa in s karakteristiko 1 pri pozitivnih

vrednostih dihalnega testa. Na podlagi teh podatkov je statistični program MedCalc pri vsaki

vrednosti kvantitativnega testa HP Ag v blatu izračunal občutljivost in specifičnost pri 95%

intervalu zaupanja ter določil mejno vrednost kvantitativnega testa. Mejna vrednost je tista,

pri kateri je Youdenov indeks maksimalen.

Youdenov indeks (J) se izračuna za vsako vrednost kvantitativnega testa (c) po naslednji

enačbi (enačba 2) (45):

J (c) = občutljivost (c) + specifičnost (c) – 1 (2)

3.3.2 VREDNOTENJE DIAGNOSTIČNIH TESTOV

Testa določanja bakterijskega antigena v blatu smo ovrednotili z izračunom naslednjih

diagnostičnih vrednosti: občutljivosti, specifičnosti, točnosti ter pozitivne in negativne

napovedne vrednosti.

Občutljivost določa delež pozitivnih preiskovancev na testu med resnično bolnimi (enačba

3). Kaže na sposobnost pozitivnega rezultata testa za napoved dejansko bolnih. Visoka

občutljivost testa pomeni, da prevladujejo pravilno oz. resnično pozitivni rezultati in da je

napačno oz. lažno negativnih rezultatov malo. Simetrično glede na občutljivost določa

specifičnost delež negativnih preiskovancev na testu med resnično zdravimi (enačba 4) in

tako kaže na sposobnost negativnega rezultata testa za napoved dejansko zdravih. Simetrično

pomeni zato njena visoka vrednost prevlado pravilno negativnih rezultatov in malo napačno

pozitivnih rezultatov. Med občutljivostjo in specifičnostjo nekega testa obstaja antagonizem,

kar pomeni, da se pri izboljševanju občutljivosti zmanjšuje specifičnost in obratno. Če želimo

zajeti čim več bolnih, povečamo občutljivost, vendar s tem tvegamo več lažno pozitivnih

rezultatov, zaradi česar se zmanjša specifičnost. Obratno izboljšamo specifičnost, če želimo

zajeti čim večje število zdravih preiskovancev, s čimer pa tvegamo več lažno negativnih

rezultatov in zato manjšo občutljivost.

33

OBČUTLJIVOST = RP/(RP + LN) (3)

SPECIFIČNOST = RN/(RN + LP) (4)

O zanesljivosti pozitivnega rezultata testa govori pozitivna napovedna vrednost, ki je

določena kot delež resnično bolnih preiskovancev med vsemi preiskovanci s pozitivnimi

rezultati na testu (enačba 5). Analogno nam negativna napovedna vrednost pove, koliko se

lahko zanesemo na negativen rezultat testa in je podana z razmerjem med resnično zdravimi

preiskovanci in vsemi preiskovanci z negativnimi izvidi na testu (enačba 6). Napovedna

vrednost testa je odvisna od prevalence bolezni in od opazovanega znaka. Tako je pozitivna

napovedna vrednost pri enaki občutljivosti testa večja ob večji prevalenci bolezni in manjši

prevalenci znaka. Napovedna moč negativne vrednosti (ob odsotnosti znaka) pa je večja ob

redkem pojavu bolezni in pogostem pojavljanju znaka med preiskovanci.

POZITIVNA NAPOVEDNA VREDNOST = RP/(RP + LP) (5)

NEGATIVNA NAPOVEDNA VREDNOST = RN/(RN+ LN) (6)

Dihotomni diagnostični test lahko ovrednotimo tudi s točnostjo, ki je opredeljena z

razmerjem med številom pravilnih določitev oz. z vsoto pravilnih pozitivnih in pravilnih

negativnih rezultatov in številom vseh določitev oz. z vsoto števil vseh rezultatov (enačba 7).

TOČNOST = (RP + RN)/(RP + LP+ RN + LN) (7)

Za izračun diagnostičnih vrednosti moramo poznati dejansko stanje preiskovanih oseb,

skladno s proučevano boleznijo. Pri tem so nam v pomoč referenčne diagnostične metode, ki

so dober približek realnega stanja. V primerjavi z rezultati referenčne metode, izvedene na

enakem vzorcu preiskovancev, lahko določimo pravilne in napačne rezultate metode, ki jo

vrednotimo (46, 47). V našem primeru je referenčna diagnostična metoda dihalni test s

sečnino. V primerjavi z njim označimo rezultate naših testov na ta način:

34

- RESNIČNO POZITIVNI REZULTATI (RP): pozitiven rezultat dihalnega testa s sečnino

in pozitiven rezultat kvalitativnega/kvantitativnega testa določanja HP Ag v blatu,

- RESNIČNO NEGATIVNI REZULTATI (RN): negativen rezultat dihalnega testa s

sečnino in negativen rezultat kvalitativnega/kvantitativnega testa določanja HP Ag v blatu,

- LAŽNO POZITIVNI REZULTATI (LP): negativen rezultat dihalnega testa s sečnino in

pozitiven rezultat kvalitativnega/kvantitativnega testa določanja HP Ag v blatu,

- LAŽNO NEGATIVNI REZULTATI (LN): pozitiven rezultat dihalnega testa s sečnino in

negativen rezultat kvalitativnega/kvantitativnega testa določanja HP Ag v blatu.

3.3.3 DOLOČITEV MEJNE VREDNOSTI KVALITATIVNEGA TESTA DOLOČANJA H. PYLORI ANTIGENA V BLATU GLEDE NA KVANTITATIVNI TEST

Mejno vrednost kvalitativnega ImmunoCard STAT! HpSA testa smo določili s pomočjo

statističnega programa MedCalc. Vnesli smo vrednosti, pridobljene pri testiranju pacientov s

kvantitativnim in kvalitativnim testom določanja H. pylori antigena v blatu. Vrednosti

kvantitativnega testa so nam služile kot referenčne vrednosti.

4. REZULTATI

Rezultati testiranja pacientov z dihalnim testom s sečnino ter s testoma kvalitativnega in

kvantitativnega določanja HP Ag v blatu so prikazani v spodnji tabeli (Tabela IV).

Tabela IV: Rezultati neinvazivnih preiskav pacientov, narejenih na KIKKB, pred eradikacijsko

terapijo Pacient Dihalni test s sečnino

(‰) Kvalitativen test HP Ag v

blatu Kvantitativen test HP Ag v blatu

(µg/l) 1 0,40 0 2 37,10 1 29,000 3 43,90 1 4,160 4 0,80 1 5 60,10 1 78,000 6 0,50 0 0,390 7 32,00 1 3,710 8 5,60 0 2,610 9 8,60 2,310 10 12,50 1 15,100 11 1,30 0 0,510

35

12 0,20 1 0,470 13 20,00 1 78,000 14 0,80 0 0,265 15 1,60 0 16 0 0,445 17 25,10 1 1,365 18 7,10 1 46,200 19 0,10 0 0,470 20 55,40 0 0,850 21 13,50 18,950 22 20,60 1 37,755 23 1,30 0 0,520 24 0,70 0 0,620 25 0,30 0 26 1,70 0 0,535 27 8,20 1 11,240 28 1,50 0,770 29 1,30 0 0,110 30 8,00 0 0,430 31 15,80 1 6,000 32 0,30 0 0,450 33 0,50 0 0,790 34 1 0,590 35 1,60 1 0,920 36 29,40 1 0,525 37 1,00 1 0,590 38 0,70 0 0,510 39 0,80 0 0,615 40 0,50 0 0,235 41 22,05 1 42 0,90 0 0,535 43 71,00 1 5,300 44 0,40 1 0,130 45 32,60 1 78,000 46 0,90 0 0,240 47 20,50 1 21,750 48 0,20 0 0,600 49 0,50 0 0,410 50 0 0,860 51 0,30 0 0,430 52 0,70 0 53 35,20 1 46,900 54 2,10 0 0,420 55 0,10 0 0,910 56 22,30 1 0,295 57 0,50 0 0,250 58 0,30 1 0,530 59 7,98 1 12,500 60 1 0,550 61 0,40 0 0,430 62 12,50 1 63 1 0,420

36

64 1,40 1 0,930 65 0,90 0 0,450 66 0,30 0 0,435 67 25,00 1 68 0,10 0 69 1,10 0 71,700 70 0,30 0 0,280 71 0,90 0 0,290 72 1,00 0 73 1,80 0 0,570 74 1,10 0 0,360 75 20,10 1 12,070 76 19,40 1 2,160 77 1,40 0 0,270 78 22,00 1 27,000 79 0,70 1 80 19,60 1 29,000 81 10,40 1 1,525 82 0,60 0,430 83 0,80 0 0,280 84 1,30 0,180 85 27,02 0,300 86 32,05 1 87 1,20 0 0,490 88 1,51 1 0,

PRIMERJAVA REZULTATOV DIHALNEGA TESTA ZA DOLOČANJE BAKTERIJE HELICOBACTER PYLORI IN ... · 2015....

Documents

Transcript of PRIMERJAVA REZULTATOV DIHALNEGA TESTA ZA DOLOČANJE BAKTERIJE HELICOBACTER PYLORI IN ... · 2015....