МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ВІННИЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

НОВИЦЬКИЙ АНДРІЙ ОЛЕКСАНДРОВИЧ

УДК: 576.807:579.84: 616.98

ОПТИМІЗАЦІЯ МІКРОБІОЛОГІЧНОГО ВИЯВЛЕННЯ

HELICOBACTER PYLORI

03.00.07 – мікробіологія

Дисертація

на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Науковий керівник

Власенко Володимир Васильович

доктор біологічних наук,

професор

Вінниця – 2015

2

ЗМІСТ

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА ТЕРМІНІВ ………..………..

ВСТУП …………………………………………………………..……….

РОЗДІЛ 1. СУЧАСНІ УЯВЛЕННЯ ПРО ХЕЛІКОБАКТЕРНУ

ІНФЕКЦІЮ ТА МЕТОДИ ЇЇ ДІАГНОСТИКИ

(ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ) …………………………………………………

1.1. Характеристика морфології та метаболізму Helicobacter pylori..

1.2. Особливості інфекційного процесу, спричиненого Helicobacter

pylori …………………………..……………………………………….

1.3. Діагностика хелікобактеріозу ………………………………….

1.4. Стан резистентності Helicobacter pylori до кларитроміцину …

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ …………...…..

2.1. Загальна характеристика обстежених хворих …………………

2.2. Матеріали дослідження …………………………………………..

2.3. Методи дослідження …………………..…………………………

2.4. Методи статистичної обробки інформації ……..………………

РОЗДІЛ 3. МІКРОБІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАМІВ

HELICOBACTER PYLORI У СЛИЗОВИХ ОБОЛОНКАХ

ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЇ ДІЛЯНКИ ХВОРИХ НА ЗАПАЛЬНО-

ВИРАЗКОВУ ПАТОЛОГІЮ ШЛУНКА І ДВАНАДЦЯТИПАЛОЇ

КИШКИ ……………………………………...………………..……………

3.1. Вивчення розповсюдження Helicobacter pylori у патологічно

змінених слизових оболонках гастродуоденальної ділянки ……..

3.2. Мікробіологічні властивості штамів Helicobacter pylori,

виділених від хворих на гастродуоденіти і виразкову хворобу ……

3.3. Оцінка активності уреази в біоптатах слизових оболонок

4

6

12

12

17

21

38

40

40

42

42

52

53

53

55

3

гастродуоденальної ділянки у хворих на гастродуоденіт та

пептичну виразку в залежності від наявності та концентрації

Helicobacter pylori ……………………………………………………...

3.4. Результати порівняння культивування H. pylori з іншими

методами виявлення хелікобактеріозу ……………………………….

РОЗДІЛ 4. РОЗРОБКА ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА БЕЗ КРОВІ

ДЛЯ БАКТЕРІОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ХЕЛІКОБАКТЕРІОЗУ І

ПОРІВНЯННЯ ЙОГО З ІСНУЮЧИМИ ……………………..….……….

4.1. Вибір інгредієнтів для поживного середовища ………………..

4.2. Культуральні, морфологічні, токсигенні властивості штамів H.

pylori, вирощених на запропонованому поживному середовищі …..

4.3. Порівняння запропонованого поживного середовища для

виявлення Helicobacter pylori з існуючими …………………………..

РОЗДІЛ 5 РОЗРОБКА СПОСОБУ, ДІАГНОСТИЧНОГО РЕАГЕНТУ

ТА АНТИБАКТЕРІАЛЬНОГО ЗАСОБУ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ І

ЕЛІМІНАЦІЇ HELICOBACTER PYLORI ПРИ ШЛУНКОВО-

КИШКОВИХ ЗАХВОРЮВАННЯХ ……………..…………………...…..

5.1. Розробка комбінації інгредієнтів для запропонованого

реагенту…………………………………………………………………

5.2. Результати обстеження хворих за допомогою реагенту ВНВ ….

5.3. Розробка сучасного антихелікобактерного засобу ..………….

АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ .…....

ВИСНОВКИ …………………………………………………………….....

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ ………………..…..……………………

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ………….…………………...….

ДОДАТОК ……..………………………………………………………………………

60

64

70

70

81

85

93

93

97

101

110

121

123

124

155

4

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ ТА ТЕРМІНІВ

H. pylori – Helicobacter pylori

CagA – цитолітичний токсин

VacA – вакуолізующий токсин

r – коефіцієнт кореляції

АМХ – агар Мюллера-Хінтона.

БА – Brucella-агар

ББ – Brucella-бульйон

БМХ – бульйон Мюллера-Хінтона

ВНВ – реагент для визначення наявності H. pylori

ВХ – виразкова хвороба

ГДД – гастро-дуоденальна ділянка

ГЛ – глютамін

ДІ – довірчий інтервал

ДНК – дезоксирибонуклеїнова кислота

ДПК – дванадцятипала кишка

ДУТ – дихальний уреазний тест

ЕД – екстракт дріжджів

ЕТС – ембріональна теляча сироватка

ЗС – запропоноване середовище

ІПП – інгібітори протонної помпи

КА – Колумбійський агар

КБ – Колумбійський бульйон

КК – кінська кров

КМ – кишкова метаплазія

КС – кінська сироватка

КУО – колонієутворюючі одиниці

MIК – мінімальна інгібуюча концентрація

5

OMED – світова організація гастроінтестинальних ендоскопістів

ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція

РНК – рибонуклеїнова кислота

СОШ – слизова оболонка шлунка

ТП – температура плавлення

ШКТ – шлунково-кишковий тракт

ШУТ – швидкий уреазний тест

ФЕГДС – фіброезофагогастродуоденоскопія

ФІ – функціональний інтервал

ХГД – хронічний гастродуоденіт

ХГДП – хронічна гастродуоденальна патологія

6

ВСТУП

Хвороби органів травлення займають одне з провідних місць, як за

частотою інвалідизації, так і за показником смертності. Превалююче

місце в структурі захворюваності органів шлунково-кишкового тракту

займають хронічні гастрити та пептична виразка. За численними даними

авторів в економічно розвинутих країнах лише на пептичну виразку

впродовж життя хворіють від 10 до 20 відсотків всього дорослого

населення. В Україні число виявлених хворих на пептичну виразку

перевищує 4 мільйони, а інфікованість дорослого населення Helicobacter

pylori (H. pylori) сягає 80% [1, 2, 3, 4].

Пептичні виразки шлунка і/чи дванадцятипалої кишки залишаються

однією з найактуальніших проблем гастроентерології, що пов'язано з їх

поширеністю, високою частотою виникнення ускладнень і рецидивів при

невірному лікуванні. Провідне значення у виникненні і рецидивуванні

понад 80% усіх виразок дванадцятипалої кишки і 60% усіх виразок

шлунка має інфекція, викликана H. pylori, яка є також кофактором у

розвитку раку і лімфоми шлунка [5, 6, 7].

За сучасними рекомендаціями діагностика H. pylori повинна бути

комплексною і включати як мінімум 2 тести по визначенню інфікування.

Одне з ключових місць серед цих тестів займає бактеріологічний метод.

Культивування H. pylori необхідне для класифікації і створення колекції

штамів, для діагностичних тестів, визначення резистентності до

антибіотиків, виробництва антигенів, визначення факторів вірулентності

та ін. [8]. Однак через вибагливий характер росту H. pylori для

досягнення задовільних результатів культивування необхідно додавати

до основ твердих чи рідких поживних середовищ кров чи сироватку. У

той же час додавання ростових добавок, таких як сироватка чи кров

7

може викликати розбіжності між експериментами через різницю в стані

здоров`я тварин-донорів. Крім того, при доповненні поживних

середовищ сироваткою можна ввести в них забруднюючі білки, які

можуть перешкодити подальшій експериментальній процедурі,

наприклад, при отриманні антигенів H. pylori. Серед інших недоліків:

робота з небезпечними біологічними рідинами, зміни в здатності

сприяти росту колоній, відсутність забезпечення росту всіх штамів,

нестандартність при виготовленні та вимоги зберігання в заморожених

умовах тощо [9].

Разом з тим, з появою нових методів дослідження, таких як

полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), з’явилась можливість

оптимізувати процес виявлення H. pylori, зменшити кількість хибних

результатів досліджень, а також глибше вивчити властивості

мікроорганізму на молекулярному рівні із перспективою впливу на

генетичні механізми патогенності H. pylori [10, 11, 12].

Незважаючи на всі успіхи при розробці нових схем і препаратів для

ерадикації H. pylori, на жаль, залишається не розв`язаними багато

проблем. Доведено, що при використанні будь-яких

антихелікобактерних схем терапії частота розвитку побічних явищ

наближається до 40% [13, 14]. Збільшується кількість штамів H. pylori,

резистентних до ряду препаратів, які використовують згідно

Маастрихтським консенсусом-4. У 40% пацієнтів після ліквідації

інфекції має місце поновлення симптомів захворювання при відсутності

рецидиву морфологічного дефекту слизової оболонки шлунка. Значно

частіше спостерігаються випадки рецидивів виразки шлунка без

наявності реінфікування хелікобактером [15, 16].

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація є фрагментом комплексної наукової роботи кафедри харчових

технологій та мікробіології Вінницького національного аграрного

8

університету «Оптимізація мікробіологічного виявлення бактерій роду

Helicobacter у тварин та людини» (державна реєстрація № 0113U004975).

Дисертант є співвиконавцем даної теми.

Мета дослідження: оптимізувати мікробіологічні методи виявлення H.

pylori на основі застосування нових рецептур поживних середовищ;

визначити основні морфологічні, культуральні, біологічні особливості

виділеного збудника.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані наступні

завдання:

– дослідити мікробіологічну характеристику H. pylori, частоту їх

персистенції на слизовій оболонці гастродуоденальної ділянки хворих

на гастродуоденіти та виразкову хворобу;

– розробити поживне середовище для оптимізації бактеріологічної

діагностики хелікобактеріозу;

– розробити спосіб і діагностичний реагент для виявлення H. pylori в осіб

з шлунково-кишковими захворюваннями;

– визначити ефективність запропонованих методів діагностики;

– розробити антихелікобактерний засіб для ерадикаційної терапії.

Об'єкт дослідження: процес мікробіологічної діагностики інфекції,

викликаної H. pylori у хворих на виразкову хворобу шлунка, дванадцятипалої

кишки, гастродуоденіт.

Предмет дослідження: частота вилучення, концентрація H. pylori у

слизових оболонках гастродуоденальної ділянки; уреазна активність;

морфологічні, культуральні, біохімічні, біологічні властивості H. pylori,

чутливість до антибіотиків.

Методи досліджень: мікробіологічні – ідентифікація культур, оцінка

морфологічних, культуральних, тинкторіальних ознак виділених

хелікобактерів, визначення ступеня їх токсигенності, резистентності до

антибіотиків; загально-клінічні; ендоскопічний із взяттям матеріалу для

9

бактеріологічного та гістологічного досліджень, біохімічні, морфологічні,

математико-статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблено нове поживне

середовище для виділення H. pylori з покращеними ростовими якостями;

вперше доведено, що на запропонованому поживному середовищі не

виникають зміни токсигенних властивостей H. pylori стосовно токсинів CagA

та VacA. Вперше розроблено метод одночасної реєстрації рН слизової

оболонки шлунка і наявності в ній H. pylori, що дозволяє оптимізувати

мікробіологічну діагностику H. pylori - інфекції. Удосконалено існуючі

поживні середовища для мікробіологічного дослідження H. pylori; вперше

доведено недоцільність використання більше двох ростових добавок для

покращення росту хелікобактерій.

Вперше розроблено антимікробний лікарський засіб для лікування

виразкової хвороби шлунку та дванадцятипалої кишки, асоційованих з H.

pylori на основі синергічної дії комбінації антимікробних препаратів та

комплексу речовин.

Наукову новизну одержаних результатів підтверджена патентами

України на корисну модель: «Спосіб виявлення Helicobacter pylori при

шлунково-кишкових захворюваннях» (Патент № 85459 від 25.11.2013. Бюл.

№ 22, заявка № u201304453 від 09.04.2013); «Поживне середовище для

виявлення Нelicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях»

(Патент № 88360 від 11.03.2014. Бюл № 5, заявка № u201312318 від

21.10.2013); «Засіб для лікування виразкової хвороби шлунка та

дванадцятипалої кишки, асоційованих з Helicobacter pylori» (Патент № 92250

від 11.08.2014. Бюл. № 15, заявка № u201401763 від 24.02.2014).

Практичне значення одержаних результатів. Обговорена доцільність

застосування оригінального поживного середовища для виділення H. pylori,

що не містить крові, її компонентів. Одержані результати дозволяють

обґрунтовано використовувати новий тест для детекції H. pylori, в якому

10

поєднується одночасне визначення рН слизової шлунка, оптимізується

виявлення H. pylori і діагностика гастро-дуоденальної патології.

Розроблено антимікробний засіб для для ефективної терапії хелікобактер

асоційованих захворювань та обґрунтовано його застосування.

Результати досліджень дисертаційної роботи використовуються в

навчальному процесі на кафедрі харчових технологій та мікробіології

Вінницького національного аграрного університету; кафедрі мікробіології,

вірусології та імунології Вінницького національного медичного університету

імені М.І. Пирогова; структурних підрозділах Вінницької центральної

районної клінічної лікарні, про що свідчать акти впроваджень. Дослідження

обґрунтовують перспективність використання патентів України для

оптимізації діагностики, лікування шлунково-кишкових інфекційних

захворювань.

Особистий внесок здобувача. Представлені в роботі матеріали та

фактичні дані є самостійним внеском автора, який самостійно визначив мету

і завдання, вивчив та проаналізував літературу за темою дослідження, провів

патентно-інформаційний пошук, особисто провів відбір і формування груп

хворих. Особисто виконав експериментальну та практичну частини роботи:

зокрема мікробіологічні дослідження, визначення біологічних властивостей

штамів H. pylori, чутливості до антибактеріальних препаратів, визначення

уреазної активності біоптатів слизової шлунка і дванадцятипалої кишки. Брав

участь у розробці композиції запропонованих поживного середовища та

реагенту, їх апробації; брав участь в розробці композиції

антихелікобактерного засобу, дослідженні його ефективності. Самостійно

виконав ендоскопічні дослідження з верифікацією діагнозу на всіх етапах

спостереження (забір матеріалу для бактеріологічного, біохімічного

досліджень, полімеразної ланцюгової реакції); підготував бази даних та

провів статистичну обробку; інтерпретував отримані результати; написав і

оформив усі розділи дисертації, висновки, практичні рекомендації.

11

Автор висловлює подяку персоналу бактеріологічної лабораторії

Вінницької районної СЕС за допомогу в проведенні етапів дослідження та

лабораторії «Меділабс» (м. Вінниця) за проведення полімеразної ланцюгової

реакції.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації

викладено на: XV з`їзді Українського науково-медичного товариства

мікробіологів, епідеміологів та паразитологів імені Д.К. Заболотного (Харків,

2011), конференції «Молоді вчені у вирішенні проблем виробництва і

переробки продуктів тваринництва» (Вінниця, 2011), науково-практичній

конференції «Актуальні питання стратегії, тактики застосування та

дослідження антибіотиків, антисептиків та дезінфектантів» (Вінниця, 2012,

2014), ІІІ-му конгресі Європейських мікробіологів FEMS (Лейпциг, 21-25

липня 2013), щорічній 10-й науково-практичній конференції з міжнародною

участю приуроченої до Дня науки «Сучасні проблеми епідеміології,

мікробіології, гігієни та туберкульозу» (Львів, 2013), ХІІІ з`їзді товариства

мікробіологів України імені С.М. Виноградського (Ялта, 1-6 жовтня, 2013).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць,

із них 6 статей – у фахових наукових журналах і збірниках, рекомендованих

ДАК України, 5 тез у збірниках науково-практичних конференцій, з`їздів,

одержано 3 патенти України на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською

мовою на 156 сторінках комп’ютерного друку і містить вступ, огляд

літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, 3 розділи власних

досліджень, аналіз та узагальнення одержаних результатів, висновки,

практичні рекомендаціі щодо практичного впровадження та додаток.

Дисертація ілюстрована 20 таблицями і 15 рисунками. Список використаних

джерел містить 255 посилань (101 кирилицею і 154 латиницею).

12

РОЗДІЛ 1

СУЧАСНІ УЯВЛЕННЯ ПРО ХЕЛІКОБАКТЕРНУ ІНФЕКЦІЮ ТА

МЕТОДИ ЇЇ ДІАГНОСТИКИ

(ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ)

1.1. Характеристика морфології та метаболізму Helicobacter pylori

Морфологія Helicobacter pylori. H. pylori - грамнегативні

неспороутворюючі рухливі бактерії S- або U-подібної форми (з характерним

зовнішнім виглядом, як «крило чайки»), завдовжки 2 – 6,5 мкм і шириною 0,5

– 1,5 мкм, покриті гладкою оболонкою, мають на одному або двох кінцях 2 –

6 тонких джгутиків довжиною 5 – 10 мкм, що дозволяють їм пересуватися

спіральними рухами в шарі слизу, що покриває слизову оболонку шлунка

(СОШ). Джгутики покриті чохлами, закінчуються колбоподібними

потовщеннями. Рухливість залежить від рН і порушується при рН нижче 4,0.

Мутанти H. pylori без джгутиків або уреази не в змозі колонізувати слизову

оболонку шлунка у лабораторних тварин [17, 18, 19].

Клітинна стінка складається з тришарової зовнішньої мембрани,

прилеглого до неї періплазматичного простору і тришарової

цитоплазматичної мембрани [20]. Бактеріальна клітина оточена

глікокаліксом, який є глікопротеїдним поліаніонним гелем, що на 99 %

складається із води і підтримується матрицею. Він служить своєрідним

бар’єром для дифузії речовин і депо для уреази. Руйнування глікокаліксу

призводить до загибелі бактеріальної клітини. Завдяки його ниткоподібним

виростами H. pylori може прикріплятися до мікроворсинок епітелію шлунка.

Оточені глікокаліксом, H. pylori розмножуються відносно повільно, але гірше

піддаються дії антимікробних препаратів. Після втрати глікокаліксом іонів

Са2+

і Mg2+

полегшуються проникнення і вплив на бактеріальну клітину

гідрофільних антимікробних препаратів [21, 22].

13

Електронно-мікроскопічні дослідження показали, що H. pylori

виявляється у трьох формах: паличкоподібна вигнута форма (у англомовній

літературі вживається термін «спіральна форма»), кокова форма (КФ) і

дегенеративні форми [23]. Перші є життєздатними, можуть культивуватися,

бути вірулентними, колонізувати слизову оболонку і викликати запалення.

При несприятливих умовах середовища існування (зміна температури і рН

середовища, його осмолярності), призначенні антибактеріальних засобів та у

старіючій культурі H. pylori втрачають типову вигнуту форму і

трансформуються у КФ. Вони можуть бути життєздатними, але не

культивуються, менш вірулентні і менш імовірно здатні до колонізації і

індукції запалення [24, 25]. КФ втрачають свою ферментативну активність, у

тому числі і уреазну, що може призвести до хибно негативних результатів

уреазного тесту; репродуктивну здатність, а також у них редукується обмін

речовин, що створює сприятливі умови для їх збереження в кишечнику і у

зовнішньому середовищі, і таким чином формуванню фекально-орального

механізму передачі [26]. Необхідно зазначити, що кокові форми нечутливі до

дії антибіотиків [21]. Потрапивши у сприятливі умови, КФ H. pylori

трансформуються в вегетативну паличкоподібну форму і знову колонізують

СОШ. Це підтверджує така патологія людини, як гетеротопія СОШ в тонкій

(дивертикул Меккеля) і товстій кишці: у цих ділянках вдається знайти

картину «гастриту» і інвазію H. pylori [20, 27]. Дегенеративні форми

пікнотичні, і є КФ мертвих H. pylori [23]. Вони не можуть бути культивовані,

їхні клітинні мембрани розпалися, але генетичний матеріал може бути

виявлений за допомогою ПЛР, наприклад, у матеріалі із систем

водопостачання [28, 29].

Епідеміологія хелікобактерної інфекції. H. pylori – один з найбільш

розповсюджених збудників хронічних інфекцій людини: приблизно 60%

населення нашої планети інфіковані ним, особливо в країнах, що

розвиваються [30, 31].

14

Інфікування людини, як правило, відбувається в дитинстві і зазвичай

маніфестує симптомами гострого гастроентериту [32]. За даними

епідеміологічних досліджень, рівень інфікованості дитячого населення

коливається від 4,2% у Бельгії до 28,9% в Італії, 84% в Індії, у країнах

Східної Європи − від 63% у Чехії до 96% в Албанії. Рівень інфікованості на

H. pylori серед російських школярів становить 60-70% [33], а жителів Москви

– 88% [34].

Рівень інфікованості населення Закарпатської області хелікобактерною

інфекцією становить близько 85% [4]. Ці дані співпадають з описаною рядом

авторів загальною картиною щодо епідемічного розповсюдження H. pylori -

інфекції в Україні [35].

Зараження відбувається як правило орально-оральним або фекально-

оральним шляхом [36]. Немає істотних доказів щодо збереження

життєздатних хелікобактерів в системах водопостачання. Епідеміологічні

дослідження показують, що вода відкритих водоймищ є фактором ризику для

хелікобактерної інфекції в більшій мірі, ніж водопровідна вода, і не може

бути виключеним формування біоплівок H. pylori [37]. Доведено, що H. pylori

не беруть участь у формуванні біоплівок в ротовій порожнині, хоча бактерії

можуть там виявлятись [38].

Епідеміологічні дослідження підтримують докази того, що H. pylori є

найбільш поширеним в бідних регіонах з великою скупченістю населення і

поганими санітарними умовами [39, 40]. Зростання хелікобактерної інфекції

асоціюється з великою кількістю дітей в сім`ї, перебуванням дітей у дитячих

садочках, житлом на вулицях без доріг з твердим покриттям і туалетами без

каналізації [36]. Ряд досліджень підтримують припущення, що інфіковані

члени сім`ї, особливо матір та бабуся, виступають в якості фактора ризику

для інфікування H. pylori [41, 42, 43, 44]. Дослідження останніх років

показали, що поява хелікобактера на протязі першого року після ерадикації

свідчить про повернення попередньої інфекції, коли ж з`являється збудник

15

після року від ерадикації, це свідчить про інфікування новим штамом [45,

46].

Метаболізм Helicobacter pylori. Встановлено, що уреаза, яку бактерія

виділяє у специфічно великій кількості, є одним з ключових ферментів H.

pylori у патогенезі. Вона має молекулярну масу 550 кДа і складається з трьох

субодиниць 26,5 кДа (Ure A), 61 кДа (Ure B) і 13 кДа (Ure C), та складає 6%

від загального вмісту білка H. pylori. Уреаза розщеплює сечовину, яка

входить до складу майже всіх продуктів харчування, на аміак і вуглекислоту

[47, 48]. Завдяки цим процесам навколо бактерій утворюється захисне

мікросередовище у вигляді хмарки іонів амонію, які зв'язують іони водню

шлункового соку, забезпечуючи тим самим захист від згубної дії соляної

кислоти [49, 50, 51]. Виявлено транспортний білок Urel, що кодується

однойменним геном і здійснює транспорт сечовини в периплазматичний

простір, де й відбувається її гідроліз. Інтенсивність цього транспорту

залежить від рН середовища, і діє за принципом негативного зворотнього

зв’язку [52]. Крім того, уреаза є сильно імуногенною сполукою,

безпосередньо пошкоджує клітини епітелію слизової оболонки, гальмує

синтез ДНК, впливає на хемотаксис лейкоцитів. Уреаза викликає

самознищення H. pylori в пробірці в некислому середовищі. Аміак, що

виділяється під час ферментації, пригнічує мітохондріальне окислення,

сповільнює клітинну репродукцію і чинить пряму цитотоксичну дію [53, 54].

Доведено, що велика кількість каталази і супероксид дисмутази H.

pylori є ще одним захисним механізмом персистенції збудника [20, 55].

Перший фермент захищає H. pylori від шкідливого впливу перекису водню,

що звільняється фагоцитами [56]. Останній фермент нейтралізує супероксид,

що виділяється поліморфноядерними лейкоцитами та фагоцитами [57, 58].

Уреаза і каталаза можуть захистити H. pylori від гуморальної імунної

відповіді організму.

16

Інші бактеріальні ферменти — протеаза, ліпаза, глюкофосфатаза —

знижують в'язкість і захисні властивості слизу, що вкриває клітини епітелію.

Фосфоліпаза А2 руйнує фосфоліпіди клітинних мембран, що призводить до

утворення в них дефектів і проникненню в цитоплазму різних речовин і

самих мікроорганізмів. Крім того H. pylori виробляють цитохромоксидазу,

муциназу, лужну фосфатазу, амінопептидази, гамма-глутамінтрасферазу,

естерази, декарбоксилази, редуктазу, гемолізини, а також ліпід А і

цитотоксини, тобто H. pylori має практично всі ферментні системи, необхідні

для повноцінного метаболізму в експериментальних умовах та природних

екологічних нішах [55, 59]. Захищає H. pylori від деструкції соляною

кислотою і розташування бактерій під шаром слизу, де рН наближається до

нейтрального [60, 61, 62].

H. pylori є мікроаерофільною бактерією. Не відновлює нітрати, не

гідролізує гіпурати, стійка до дії налідиксової кислоти [55, 63]. Єдиним

цукром, який використовує H. pylori, є глюкоза. Її метаболізм здійснюється

не тільки шляхом гліколізу, але також за рахунок окислення, що не є

характерним для мікроаерофілів [2]. У H. pylori були виявлені ферменти,

необхідні для утворення нуклеїнових кислот (ДНК і РНК) і таких

коферментів, як НАД і НАДФ. Але для росту і розмноження H. pylori

потребує ряд готових амінокислот, зокрема, гістидин, аргінін, лейцин,

ізолейцин, метіонін, фенілаланін, валін і серин. Враховуючи обмежені

можливості даного мікроорганізму у використанні вуглеводів, готові

амінокислоти потрібні H. pylori не тільки для синтезу білків, але і як джерело

енергії. Доведено, що за допомогою білка зовнішньої мембрани FrpB1, H.

pylori може утилізувати залізо з гема і / або гемоглобіну в умовах нестачі

заліза [9, 64].

Найбільш сприятливі умови для росту і розмноження H. pylori є

температура 37 – 42о

С і рН 4,0 – 8,0, але вони виживають і при рН 2,0 [65,

10]. Важливою умовою існування H. pylori є різниця рН не менше 1,4

17

одиниці всередині і зовні бактерій, що формує електрохімічний градієнт,

необхідний для синтезу молекул АТФ і життєдіяльності клітини. Усередині

бактеріальної клітини рН дорівнює 8,0 – 8,4, а зовні, завдяки уреазний

активності, підтримується в межах від 4 до 7. Якщо рН в шлунку вище 7,

електрохімічний градієнт не досягає потрібної величини, і H. pylori гине, що

пояснює міграцію H. pylori при атрофії СОШ в тіло шлунка, де розташована

основна маса парієтальних клітин (ПК), що виробляють HCl. Якщо ж

кислотність дуже низька, H. pylori поселяється в самих ПК, оскільки

відсутність HCl для них є згубною [26, 66, 67].

1.2. Особливості інфекційного процесу, спричиненого Helicobacter

pylori

Вірулентні властивості H. pylori можуть бути розділені на кілька груп:

1) сприяють колонізації: джутики, вигнута «гельдинамічна» форма, адгезини,

ліпополісахарид, уреаза, морфологічна трансформація у КФ, гамма-глутаміл

транспептидаза; 2) пошкодженню тканин сприяють позаклітинні бактеріальні

фактори: гемолізини, уреаза, глюкосульфатаза, протеаза, фосфоліпаза,

алкогольдегідрогенази, вакуолізуючий цитотоксин (VacA), лужна фосфатаза;

індукція, активація або стимуляція клітинних метаболітів (фактору активації

тромбоцитів, лейкотрієнів, активності прокоагулянтів, стимуляція

інтерлейкінів і фактору некрозу пухлин-альфа, вироблення активного

окисного метаболіту); 3) фактори виживання: внутрішньоклітинне

перебування, каталаза, оксидаза, супероксиддисмутаза, інгібуючий HCl-

секрецію протеїн; 4) індукція аутоімунних реакцій: наявність спільних

епітопів зі слизовою шлунка, гомологія з системою групи крові Льюїс X / Y)

[6, 68, 69, 70].

Коли H. pylori потрапляє у шлунок людини, він може проникати в шар

слизу і прикріплятись до епітеліоцитів шлунка, або проходити через шлунок

18

без колонізації слизової оболонки. Виробництво уреази необхідно H. pylori

для встановлення мікросередовища з нейтральним рН навколо бактерії.

Джгутики хелікобактерів дозволяють їм переміщуватись, а звивиста форма –

проникнути через шар слизу і вступити в контакт зі шлунковим епітелієм. H.

pylori локалізуються на поверхні епітеліальної висилки шлунка, в товщі

слизу або під нею, в глибині шлункових ямок, інтраепітеліально, а також в

ділянці міжклітинних ходів, що обумовлено хемотаксисом на сечовину та

гемін (утворюється внаслідок руйнування гемоглобіну еритроцитів в

мікроциркуляторному руслі). Вважають, що це різні стадії розвитку

патологічного процесу, характерні для хелікобактерної інфекції [71, 72].

H. pylori містить кілька адгезинів, які дозволяють йому приєднатися до

епітеліальних клітин. Адгезин BabA зв'язується з вуглеводною частиною

антигену Lewis b (Leb) групи крові системи ABO, що знаходиться на

поверхні клітин епітелію шлунка і виступає рецептором для адгезії [73, 74].

Адгезія H. pylori до клітин господаря через BabA-Leb зв'язки має важливе

значення для індукції двуниткових розривів ДНК і її пошкодження в

епітеліоцитах, аналогічно, як і від впливу VacA, гамма-глутаміл

транспептидази і CagА [75]. При дослідженні клітинних ефектів іншого

адгезину OipA виявлено, що OipA-опосередковане фосфорилювання білка

паксиліну (адаптера локальної адгезії) відіграє важливу роль в реорганізації

цитоскелету слизової оболонки на ранніх стадіях інфекції H. pylori. Таким

чином, OipA- і, як наслідок CagА-опосередкована активація паксиліну,

призводить до пошкодження клітин [76]. Також показано, що адгезини

зовнішні мембрани AlpA і AlpB є посередниками зв'язування H. pylori з

білком ламініном позаклітинної матриці слизової шлунка [77].

У місцях адгезії H. pylori відбувається деполімеризація одного з

компонентів цитоскелету епітеліоцитів - мікрофіламентів (актинових ниток),

в результаті чого поверхня ураженого епітеліоцита втрачає свою

мікроворсинчасту структуру. Внаслідок цього плазмолемма піднімається над

19

поверхнею клітини, утворюючи подобу невеликих майданчиків –

«контактних площадок». Найбільш міцно H. pylori зв'язуються з екстрактом

гліцероліпідів на поверхні епітеліоцитів в антрумі шлунка, що виконує роль

специфічного рецептора для H. pylori. Це пояснює їх тропізм до антрального

відділу шлунка [18, 78].

Внаслідок адгезії активується інтерлейкін–8 (IL-8), який разом з

бактеріальними антигенами (в першу чергу ліпополісахаридом), стимулюють

міграцію поліморфноядерних лейкоцитів і моноцитів і викликають гострий

гастрит. Антигенвмісні клітини активують лімфоцити та інші мононуклеари,

які залучаються до запалення слизової оболонки, викликаючи хронічний

поверхневий гастрит. Інфекція встановлюється протягом декількох тижнів

після первинного впливу H. pylori. Після цієї початкової колонізації, протікає

багато хімічних, біохімічних та імунологічних реакцій, які мають важливе

значення в розвитку хвороби [18, 79].

H. pylori розвинув численні стратегії, щоб забезпечити своє виживання

в слизовій оболонці шлунка, що включає різноманітні механізми для

уникнення імунного нагляду [80]. Одним із таких механізмів є

глікозилювання білків. Останні дослідження визначили додатково до

флагеліну інші глікопротеїни, що включають ферменти для біосинтезу

каталази і ліпополісахариду [81]. Іншими механізмами є молекулярна

мімікрія і фазові зміни – два механізми, що мають відношення до

виробництва антигенів Lewis на поверхні бактеріальної клітини. Нещодавно

був охарактеризований додатковий ген Le Jhp0562, і його визнано таким, що

сприяє синтезу Leb [82].

Однією з унікальних особливостей H. pylori є його здатність

асимілювати вільний холестерин у свої мембрани. Завдяки цьому

зміцнюється мембранний ліпідний бар`єр, що також захищає бактерії від

імунної відповіді організму [83]. Ця здатність може грати патогенетичну роль

у виживанні і колонізації H. pylori у шлунку [84].

20

Ще одним із патогенних механізмів дії H. pylori на слизову оболонку

шлунка є зміна фосфоліпідного складу клітинних мембран епітелію. До

того ж H. pylori сприяє утворенню потужного медіатора запалення - фактора

агрегації тромбоцитів, що викликає порушення кровопостачання, ішемію і

ерозування слизової шлунка [85].

Продукція токсинів є важливим механізмом патогенної дії H. pylori.

Біля 50-65% штамів виробляють основний фактор вірулентності –

вакуолізуючий цитотоксин (VacA), який сприяє утворенню вакуолей в

епітеліальних клітинах, що призводить до їх апоптозу і некрозу [86]. Виразну

цитотоксичність VacA пояснюють його високою спорідненістю з ліпідним

складом клітинних мембран, а також здатністю індукувати проникність

мембран мітохондрій [87].

H. pylori також виробляють цитотоксин-асоційований білок (CagA).

Аналіз досліджень свідчить про відсутність доказової бази відносно

взаємозв’язку між VacA+ штамами і раком шлунка, тоді як на зв’язок між

СagA+ штамами і раком шлунка вказується в більшості досліджень [88].

СagA+ та VacA+ штами найбільш часто викликають виразкову хворобу

(91%), штами СagA- та VacA- – хронічний гастрит (48%). Ці штами

спричиняють розвиток автодеструкції СОШ шляхом індукції викиду протеаз

і реактивних кисневих метаболітів запальними клітинами [89]. Острівець

патогенності Cag (Cag PAI) хелікобактерів кодує приблизно 27 генів, 17 з

яких суворо необхідні для кодування секреторної системи IV типу. За

допомогою останньої CagA - ефекторні білки проникають в епітеліальні

клітини господаря з подальшою індукцією секреції прозапального медіатору

інтерлейкіну-8 [90, 91]. Однак доведено, що CagA-позитивні штами легше

піддаються ерадикації [92, 93].

21

1.3. Діагностика хелікобактеріозу

Інвазивні тести. Ендоскопія. Інвазивні тести були першими, які

використовувались в діагностиці H. pylori. Шлунок, як правило, доступний

огляду за допомогою волоконно-оптичної ендоскопії з виконанням біопсії.

Однак за допомогою стандартних ендоскопічних технологій ознаки інвазії H.

pylori не є специфічними [94, 95]. У деяких випадках можна спостерігати

фолікулярний гастрит, особливо у дітей і підлітків [96] (чутливість та

специфічність відповідно 84% і 100% [97]), а також великі ураження, такі як

виразки, поліпи, пухлини. Тим не менш, останнім часом ендоскопія дає

можливість збільшити аномалії слизової оболонки шлунка за допомогою

вузькосмугової візуалізації (NBI-технологія) [98], ендоцитоскопії [99], і

конфокальної лазерної ендомікроскопії [100]. Вузькосмугова візуалізація –

методика, що дає змогу посилювати видимість текстури слизової оболонки і

капілярної сітки поверхні шлунка. На теперішній час визначені 5 моделей

текстури слизової відповідно різних гістологічних стадій гастриту [101, 102].

Автори підкреслюють, що цей метод прогнозує гістологічні умови і рівні

пепсиногену, і може бути економічно ефективним в спостереженні за раком

шлунку [103, 104]. Конфокальна лазерна ендомікроскопія дозволила в

перший раз виявити H. pylori на поверхні живих тканин під час проведення

ендоскопій за допомогою мікроскопування. Ji et al. виявили хелікобактерний

гастрит з точністю 92% [105]. У іншому дослідженні група зосередила увагу

на тяжкості H. pylori - асоційованого гастриту, особливо атрофії і кишкової

метаплазії, з досить прийнятною діагностичною точністю [106].

Використання двох контрастних барвників (акрифлавіну і флуоресцеїну,

введеного внутрішньовенно) дало змогу ендоскопістам, використовуючи

ендомікроскоп Pentax (Токіо, Японія), побачити скупчення бактерій, а також

одну бактеріальну клітину, що фарбуються акрифлавіном як на поверхні, так

і в більш глибокому шарі шлункового епітелію. Дане повідомлення

22

представляє собою справжній прорив в сучасних діагностичних можливостях

[100].

Для уникнення ендоскопії були запропоновані інші, менш інвазивні

доступи до шлунка. За допомогою назогастрального зонду можливо

отримати шлунковий сік. Це дає змогу виявляти H. pylori культивуванням,

фарбуванням, уреазним тестом і полімеразною ланцюговою реакцією, але це

менш надійно, ніж виконувати шлункові біопсії. Тест за допомогою «струни»

також може бути використаний для отримання шлункового слизу, однак

найбільш привабливим методом є розширювана орально-шлункова кисть, що

міститься в пластиковій трубці (Baylor Brush, US Endoscopy, TX). Цей метод

є швидким і надійним для діагностики хелікобактерної інфекції [107].

Культивування Helicobacter pylori необхідно для класифікації

штамів, діагностики, моніторування резистентності до антибіотиків,

виробництва антигенів, визначення факторів вірулентності тощо [8].

Згідно IV Маахстрихтського консенсусу (2012р.) необхідно виконувати

культивування і визначення антибіотикочутливості H. pylori, якщо рівень

первинної резистентності до кларитроміцину у певній місцевості перевищує

20% [108].

Біопсійний матеріал і забір проб. Найкращими для культивування H.

pylori є зразки, отримані під час ендоскопії. Але висока активність гастриту,

низька бактеріальна щільність, вживання алкоголю, антибіотиків та

використання антисекреторних препаратів, особливо інгібіторів протонної

помпи (ІПП) знижують ефективність культивування у інфікованих осіб [109,

110]. Хоча ІПП не мають прямого протимікробного ефекту при концентрації,

присутній в шлунку, вони побічно втручаються в розподіл H. pylori по

слизовій оболонці шлунку шляхом зміни рН, що призводить до міграції H.

pylori з антрума у тіло шлунка. Отже, рекомендації – не вживати ці препарати

за 2 тижні до ендоскопії. Очевидно, що вплив також залежить від дози і

23

тривалості лікування; разова доза не буде настільки ж шкідливою, як

субтотальне пригнічення кислотності [111, 112].

Потенційне забруднення біопсійних зразків за допомогою ендоскопа

було ключовим питанням у минулому, але тепер є вирішеним, принаймні в

розвинених країнах. Дійсно, після відкриття пріонів і вірусів значну увагу

було приділено очищенню і дезінфекції ендоскопів. Медичні асоціації навіть

випустили рекомендації використовувати в деяких випадках одноразові

щипці. Наслідком для мікробіологів є виключення забруднень шлункових

біопсій. Забруднення шлунка орофарингеальною флорою і бактеріями

кишківника в разі надмірного бактеріального росту, очевидно, залишається.

Попередня обробка зразка біопсії промиванням у стерильному

фізіологічному розчині може поліпшити культивування H. pylori [6, 113].

Кількість необхідних для діагностики хелікобактерної інфекції (ХІ)

біопсій є предметом суперечок. Одна біопсія, взята з антрального (2 см від

воротаря) відділу шлунка дає хорошу чутливість, але не завжди є достатньою

для встановлення діагнозу. H. pylori може мати неоднорідний розподіл по

шлунку, тому чим більше взято біопсійних зразків, тим вище ймовірність

виявлення мікроорганізму. Рекомендовано брати дві біопсії з антрума, а

також два зразки з передньої і задньої стінок тіла шлунка. Є деякі рідкісні

випадки, коли інфекція знаходиться тільки в тілі шлунка, але, як правило, H.

pylori присутня у всіх відділах [3, 114].

Транспортування зразків біопсії. Ключовим моментом є

транспортування біопсійних зразків з ендоскопічного відділення в

лабораторію. Проблеми на цьому етапі є причинами багатьох невдач

культивування і призвели до негативного ставлення деяких

гастроентерологів до цього методу. H. pylori є вибагливим мікроорганізмом.

Він повинен бути захищеним від висихання і контакту з киснем, а також

кімнатної температури. Обов'язковим є не піддавати біопсійні зразки

впливові повітря і розміщувати їх або в фізіологічний розчин для

24

короткострокового транспортування (максимум 4 год.) або в транспортні

середовища, що як правило, складаються з напіврідкого агару, і знаходяться

при температурі 4° C: 20% розчин глюкози (біоптат може зберігатися на

протязі 5 годин), поживні бульйони, тіогліколеве середовище, середовища

Кері-Блер та Стюарта. В цих середовищах життєдіяльність H. pylori

зберігається на протязі доби. Також комерційно доступне середовище Porta-

germ pylori (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France) є задовільним для цієї мети

[115]. Посів може бути затриманий на 24 годин, якщо використовуються такі

транспортні середовища, що дозволяють надіслати біопсії поштою в

ізотермічному контейнері (Sarstedt, Numbrecht, Німеччина). Якщо ці умови

перевезення не можуть бути виконані, краще заморозити біопсії при -70° C в

рідкому азоті або в сухій трубці і транспортувати їх замороженими в

лабораторію або при 4 ° С в середовищі, що містить 20% гліцерину. Посів

біопсій безпосередньо у ендоскопічному кабінеті є проблемою, так як

матеріал повинен бути подрібненим, і необхідно створити особливу

атмосферу для транспортування. З огляду на це дана процедура не

використовується [116].

Мікроскопічне дослідження мазків. Стандартний бактеріологічний

метод включає в себе мікроскопічне дослідження мазків, отриманих зі

зразків біопсії або цитології. Браш-біопсія з наступним оглядом за

допомогою фазово-контрастної мікроскопії в ендоскопічному кабінеті є

швидкою діагностичною методикою і альтернативою уреазному тесту. Із

методів фарбування використовують наступні: за Грамом, за Романовським –

Гімзою, акридиновим оранжевим, азуром [117]. Бактеріоскопія має

чутливість близько 80%. Крім здатності забезпечувати швидкий результат,

цей метод дозволяє візуалізувати запальні клітини і виявляти Helicobacter

heilmanii, який може бути ідентифікований за його типовою морфологією з 6

- 8 спіралями [118].

25

Подрібнення зразків біопсії. У більшості випадків бактерії не

рівномірно розподілені в біопсійних зразках. Тому, якщо вони засіваються

тільки штрихом на чашки, кілька суміжних організмів дадуть одну колонію, а

якщо ж бактерії були розсіяні, то з'явиться кілька колоній. Порівняння

культивувань, що здійснювались з подрібненням або без нього показали, що

більша кількість колоній з’явилась після подрібнення, хоча кількість

позитивних зразків не змінилась. З цієї причини подрібнення зразка біопсії є

обов'язковим [119].

Культури на твердих основах. Середовища включають в себе агар,

ростові і селективні добавки. В якості основ поживних середовищ для

вирощування H. pylori використовують основи агару Колумбія, серцево-

мозкового агару, агару Мюллер – Хінтона, агару Уілкінса – Чалгрена, агару

для культивування бруцел, триптазо-соєвого агару, «Pylori»-агару. Окрім

основ середовищ обов'язковими для додавання є ростові добавки: кров або

сироватка овець або коней, що містять безліч поживних речовин (вітамінів,

мікроелементів тощо), які підвищують ріст H. pylori. Частка крові або

сироватки може бути 5%, 7%, або, переважно, 10%. Еритроцити можуть бути

лізовані для кращої доступності. Використовуються інші ростові добавки,

такі як яєчний жовток, активоване деревне вугілля, крохмаль, бичачий

сироватковий альбумін і каталаза, циклодекстрини (циклічні олігосахариди,

що отримують із крохмалю шляхом ферментативної обробки), заліза

сульфат, натрію піруват і свинний муцин, 2,3,5-тріфенілтетразолію хлорид

(40 мг/л) [120, 121, 122]. Челліні та ін. запропонували середовище без крові з

додаванням isovitalex (2%) і геміну (10 мг / л). Вони також додали сечовину

(20 г / л) і рН індикатор (феноловий червоний) для визначення уреазо-

позитивних колоній [123].

H. pylori найкраще росте в слабко-кислому середовищі (рН 5,0-6,0),

відповідно до його екологічної ніші - під шаром слизу, де існує градієнт рН

[124].

26

Селективні добавки також дуже важливі через наявність забруднюючої

флори [125]. Прописи Skirrow і Dent, що містять антимікробні сполуки:

ванкоміцин або тейкопланін для пригнічення грампозитивних коків,

поліміксин, налідиксову кислоту, колістин, триметоприм або цефсулодин

проти грамнегативних паличок, і ністатин або амфотерицин В для

пригнічення росту грибів, залишаються найкращими комерційно доступними

селективними добавками [126, 127].

H. pylori є мікроаерофільною і капнофільною бактерією. Оптимальні

умови для росту створюються при інкубації в атмосфері, що містить 5%

кисню, 7% окису вуглецю, 8% водню і 80% азоту з підтриманням вологості

98% і температури 37оС [128]. Для даного мікроорганізму згубні як анаеробні

умови, так і більш високий відсоток кисню. Це пов’язане з інактивацією та

агрегацією уреази, зниженням активності супероксиддисмутази і каталази, а

також окисленням і фрагментацією ДНК. На відміну від цих висновків Xia et

al. стверджують, що більшість їх штамів H. pylori виросли в аеробних умовах,

але зі зменшеною кількістю клітин і колоній. Цей феномен можна пояснити

тим, що при низьких бактеріальних концентраціях H. pylori є

мікроаерофілом, а при високих бактеріальних концентраціях вона може

рости аеробно [129].

Для створення мікроаерофільної атмосфери використовують

газогенераторні пакети «Gas Pack», «Genbox Microaer», які починають

продукувати газові суміші після додавання в них води або при їх контакті з

атмосферою.

У первинній культурі при оптимальних умовах колонії можуть

з'явитися після 3 – 5 днів інкубації. Тим не менш, у випадку негативної

культури рекомендується продовжити інкубацію до 7 - 10 днів, щоб

переконатися, що результат буде негативним. На відміну від цього

субкультури виростають за 2 - 3 дні [130].

27

Щільність розташування бактерій може бути надзвичайно мінливою –

в діапазоні від 5 до 105 КУО / мг. Репродуктивність біопсій з антрального

відділу шлунка вище в порівнянні з тілом шлунка. Висока щільність H. pylori

була пов'язана з бактеріальними детермінантами вірулентності (CagA, VacA,

s1m1), припускаючи їх центральну роль в патогенезі запалення і

виразкоутворення у гастродуоденальній зоні [16, 131].

Бульйонні культури. Схожі основи, добавки і умови, що

використовуються для агаризованих середовищ, застосовуються для

бульонних культур, в той час як серцево-мозкова витяжка є кращою для

дослідження фізіології і метаболізму H. pylori. Атмосфера культивування є

важливою, тому в цьому відношенні були запропоновані дві рекомендації: 1)

постійно перевіряти мікроаеробні умови або 2) підготовка двофазного

середовища з тонким шаром бульйону в колбі і інкубація в мікроаеробних

умовах. У результаті бактерії мають типову морфологію і залишаються

рухливими. Вони також можуть утворювати агрегати. Використання

газопроникних колб для культивування може поліпшити ріст H. pylori [132,

133].

Фенотипова ідентифікація. На поживному середовищі H. pylori

утворюють округлі гладкі вологі напівпрозорі «росинчасті» з рівним чітким

краєм мілкі колонії діаметром 1-3 мм. При додаванні до середовища 2,3,5-

триметилтетразолію хлориду, колонії забарвлюються у червоний колір з

характерним золотистим відтінком при огляді у відбитому світлі.

Гемолітична активність не спостерігається, але може з'явитися через кілька

днів при 4° C. Мікроскопічне дослідження бактерій з культури може

показати морфологію H. pylori, що відрізняється від бактерій, присутніх у

зразку біопсії, тобто бактерії які не є ні вигнутими, ні рухливими, але

прямими, оскільки вигнута форма і рухливість безпосередньо пов'язані із

в'язкістю середовища [19, 134].

28

Ідентифікація бактерій складається з тестування на наявність

ферментів: цитохромоксидази, каталази і уреази, 7-глутамілтранспептидази,

лейцин амінопептидази, і лужної фосфатази, амінопептидаз і естераз (С4-

С12) [135].

Цитохромоксидаза виявляється за допомогою спеціальних реагентів на

диску або смузі. Каталаза виявляється шляхом внесення бактерій петлею у

краплю перекису водню і спостереження утворення рясних бульбашок. Тим

не менш, були описані каталазо-негативні мутанти H. pylori [136].

Уреаза, безумовно, є найважливішим ферментом для ідентифікації.

Методи її виявлення in vitro будуть описані при розгляді швидких уреазних

тестів.

H. pylori може рости в середовищі з 2,3,5-триметилтетразолію

хлоридом (0,4 і 1 мг / л), селенітом натрію (0,1%) і гліцином (1%), але не з

глюкозою (8%) і натрію хлоридом (3,5%). Культивування є важливим етапом

для виконання подальших тестів чутливості до протимікробних препаратів і

типування штамів при необхідності [137, 138].

Робота зі штамами є не простою. Колонії можуть вижити на чашках

протягом тижня, якщо вони зберігаються в мікроаеробних умовах при

температурі 4° C. Для довгострокового збереження бактерії повинні бути

заморожені при температурі -70° C у морозильній камері або рідкому азоті.

Використовуються різні бульйонні середовища завжди з кріопротектором,

таким як гліцерин. Процес заморожування-відтаювання завжди смертельний

для бактерій, і лише невелика частина виживає. З цієї причини є

обов'язковим використання бактерій в експоненційній фазі росту, так як вони

мають більше шансів вижити. Заморожені зразки H. pylori можуть

зберігатися протягом десятиліть при -70° C. Заморожування при -20° C є

недостатнім. Втрата життєздатності H. pylori відбувається під час

зневоднення [139, 140].

29

Останнім часом виконувалась робота, присвячена вивченню

можливості збереження росту в агарі життєздатних хелікобактерів протягом

тривалого періоду часу (56 днів) при температурі 37° С. Для цього була

використана атмосфера з 10% CO2, в той час як бактерії не виживають при

кімнатній температурі. Ліофілізація H. pylori і зберігання їх при 4° С можуть

допомогти виживанню бактерій [141].

Дослідження останніх років показують, що культивування H. pylori з

фекалій залишається надзвичайно важким. Kim do і співавт. [142]

культивували хелікобактери в дев'яти зразках від 20 H. pylori позитивних

пацієнтів, що підтвердило результати Parsonnet et al. [143].

Таким чином, бактеріологічний метод залишається стандартним

методом, але обмежена чутливість цього методу залишає місце для

вдосконалення. Він вважається еталонним методом при порівнянні точності

неінвазивних тестів. Його специфічність є максимальною (100%).

Мікроорганізми, що виросли, доступні обстеженню усіма відомими

методами. Його чутливість може знижуватись у зв'язку з жорсткими умовами

транспортування. Теоретично його чутливість має бути найкращою, тому що

присутності однієї клітини в зразку для посіву достатньо, щоб дати

позитивний результат. Однак в дослідженнях з оцінки неінвазивних тестів

існує правило, що зразок, H. pylori-негативний при культивуванні,

вважається H. pylori-позитивним, якщо і гістологічний, і уреазний тести є

позитивними. Крім того культивування як і раніше є ідеальним методом для

визначення антимікробної чутливості і типування, хоча молекулярні методи

також можуть бути використані в даний час для цієї мети.

Слід зауважити, що застосування крові і сироватки як ростових

добавок може викликати розбіжності в результатах експериментів завдяки

різниці між станом тварин – донорів цих добавок. Крім того сироватка як

добавка може ввести забруднюючі антигени, які можуть перешкодити

подальшим експериментам. Серед інших недоліків, пов'язаних з

30

використанням крові і сироватки, є робота з небезпечними біологічними

рідинами, різна здатність цих добавок сприяти росту колоній, відсутність

забезпечення росту всіх штамів, нестандартність при виготовленні

середовищ і необхідність суворо дотримуватись температурних режимів

зберігання і транспортування [8]. Тому існує потреба у пошуку нових

середовищ, що були б позбавлені цих недоліків.

Гістологія вважається «золотим стандартом» у прямому

діагностуванні H. pylori асоційованого гастриту [108]. Цей метод дає

можливість виявити бактерії в гістологічних препаратах, визначити їх

розташування, спостерігати взаємовідносини з тканинами господаря, оцінити

характер патологічного процесу в слизовій оболонці, наявність та

вираженість запалення, атрофії, метаплазії [144]. Гістологічна ідентифікація

H. pylori в біоптаті проводиться за допомогою світлового, фазово-

контрастного і люмінесцентного мікроскопів. У світловому мікроскопі

досліджуються зрізи, пофарбовані за методами Гімзе, гематоксиліном і

еозином. Також слід відмітити специфічне сріблення за Вартин-Старрі, яке

відрізняється високою специфічністю та чутливістю. При такому фарбуванні

H. pylori забарвлюється в чорний колір і чітко виділяється на ясно-жовтому

фоні у вигляді зігнутих S- або V-подібних паличок, що дозволяє значно

простіше його виявити [145, 146].

Чутливість гістологічного методу виявлення H. pylori при дотриманні

технології виготовлення препарату складає 85-90%, специфічність – 93-

100%. Він має низку переваг: широка доступність, зручність зберігання і

транспортування препаратів; можливість оцінки в будь-який час будь-яким

фахівцем, який проводить ретроспективний аналіз; можливість визначення

ступеня обсіменіння. Можливість оцінити стан СОШ, а не тільки визначити

наявність H. pylori – величезна перевага гістологічного методу. Поставити

діагноз гастриту і класифікувати виявлені зміни за Сіднейською системою,

можна тільки морфологічно [128, 147]. Л. И. Аруин запропонував оцінювати

31

щільність колонізації H. pylori (ступінь обсіменіння СОШ) у балах: 1 – до 20

мікробних тіл у полі зору; 2 – 20-50; 3 – понад 50 у полі зору [148].

До недоліків цього методу належать тривале (від 5 до 7 діб) очікування

результатів, неможливість достовірно судити про наявність кокових форм H.

pylori у гістологічних зрізах, так як поперечно зрізані паличкоподібні

мікроорганізми, як і сферичні, мають округлу форму. Хибнопозитивні

результати можуть бути отримані, коли під впливом рН середовища

відбувається морфологічне диференціювання грамнегативних бактерій [149,

150]. Також цей метод дає хибнонегативні результати (4-7%) при попередній

антибактеріальній або антисекреторній терапії, яка сприяє переходу бактерій

в кокову форму, або зміні розселення H. pylori, а також внаслідок

технологічних особливостей процесу виготовлення препаратів, які пов’язані

з відмивкою слизового шару в процесі фіксації та зневоднення біопсійного

шматочка. Тому прийом антисекреторних препаратів необхідно призупинити

за 2 тижні до обстеження [108, 151]. Суттєво покращує збереження шару

слизу додавання в фіксатор 1% танінової кислоти [152].

Для оцінки наявності H. pylori-інфекції з великою впевненістю може

бути використана імуногістохімія. Тим не менш, систематичне використання

її у звичайній клінічній лабораторії не представляється необхідним, оскільки

вона не має ніякої цінності у випадках з відсутністю патологічних аномалій

[106]. Разом з тим, цей метод дозволяє діагностувати кластери хелікобактерів

переважно коковидної форми, які важко визначити стандартними

фарбуваннями [153].

Метод флуоресцентної гібридизації in situ (FISH) запропонований в

2000 р. Trebesius K. еt al. [154]. Цей метод не потребує культивування H.

pylori і дозволяє удосконалювати морфологічне виявлення мікроорганізму

шляхом обробки зрізів міченими флуоресцентними нуклеотидами. Після

гібридизації бактерії виявляють при флюоресцентній мікроскопії, результати

можуть бути отримані на протязі 3 годин. Метод має високу чутливість

32

(91%) і специфічність (100%) і дозволяє виявити інвазію змішаних штамів,

яка виявляється у 15% хворих [155], а також визначати резистентність до

кларитроміцину. Водночас метод дорогий і потребує спеціального

обладнання [156].

Особливо цінною є система OLGA (Operative Link on Gastritis

Assessment) - оперативний зв'язок для оцінки гастриту в аспекті гістологічної

картини, яка дозволяє передбачити ризик розвитку раку шлунка [157, 158,

159].

Швидкий уреазний тест (ШУТ) заснований на визначенні активності

уреази H. pylori в біоптаті слизової оболонки шлунка шляхом занурення його

в рідке або гелеподібне середовище, що містить сечовину, індикатор рН та

бактеріостатичний агент. При наявності в досліджуваному матеріалі уреази,

сечовина гідролізується до аміаку, який залужнює середовище, що змінює

колір індикатору [160].

Чутливість і специфічність сучасних ШУТ складають більше 90% [108,

161]. Однак, слід враховувати, що при шлунковій кровотечі чутливість їх

знижується [162]. Тим більше, забруднені формаліном та дезінфектантами

біопсійні щипці можуть бути причиною хибнонегативних результатів ШУТ і

культивування [163]. Слід зауважити, що тестування подвійного зразка

(антрум + тіло шлунку) є способом підвищення чутливості ШУТ [164].

До переваг усіх уреазних тестів необхідно віднести простоту

виконання та швидкість, до недоліків – непряму сутність методу, тобто

виявлення не самого H. pylori, а лише його уреазної активності. Тест дає

хибнонегативні результати при невисокому ступеню обсіменіння тканин (<

1000 клітин у біопсійному шматочку), коли сумарна уреазна активність буде

невисокою, а також при уреазонегативних штамах H. pylori [144, 165]. З

іншого боку, хибнопозитивні результати пов’язані з присутністю

уреазопродуцентних мікроорганізмів (протей, псевдомонади, стрептококи та

інші), особливо при тривалій 24-годинній експозиції в термостаті. В зв’язку з

33

цим, більшу специфічність мають лише т.з. «холодні тести», тобто які

проводяться при кімнатній температурі, що дозволяє отримати позитивну

відповідь лише на уреазу, накопичену в тканині, специфічну для H. pylori, а

не яку виробляють бактерії в процесі культивування [1].

Молекулярні методи. В основі методу полімеразної ланцюгової

реакції (ПЛР) лежить виявлення специфічного фрагменту ДНК

мікроорганізму шляхом накопичення (ампліфікації) копій даного фрагмента

(ДНК-мішені) у процесі синтезу нових ланцюгів ДНК. ПЛР являє собою

багаторазово повторювані цикли синтезу ДНК-мішені у присутності

термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинуклеозидів-трифосфатів (дНТФ),

відповідного сольового буфера і олігонуклеотидних затравок – праймерів, що

визначають межі ділянки ДНК-мішені, що ампліфікується [166].

ПЛР дозволяє в лічені години розмножити in vitro специфічну ділянку

ДНК (тобто будь-який ген, що цікавить дослідника): за допомогою ПЛР

можна збільшити число копій специфічної нуклеотидної послідовності

більш, ніж у 106 разів. Щоб провести реакцію, досить мати ДНК-матеріал 1

клітини; кількість ампліфікованої за допомогою ПЛР ДНК настільки велика,

що цю ДНК можна легко фарбувати, або визначати за допомогою

електрофорезу в агарозному гелі [11, 167].

Метод дозволяє оцінити властивості H. pylori по виявленню генів

CagA, VacA, IceA, BabA, виявити мікроорганізм у будь-якій формі, в тому

числі коковій, а також виявляти різні по токсигенності та антигенній

структурі штами. Ця методика дає змогу дізнатися про життєздатність H.

pylori також в зразках із навколишнього середовища [168, 169].

На сучасному етапі найбільш широко використовуються ПЛР у

реальному часі (ПЛР РЧ). Вона дає найкращі результати з точки зору

чутливості і специфічності на рівні 93% і 91% відповідно, в порівнянні з

культивуванням. Чутливість і специфічність для визначення резистентності

до кларитроміцину були 91% і 96% відповідно, порівняно з ETest [12, 170].

34

Також цей метод дає змогу покращити виявлення H. pylori у хворих під час

епізоду кровотечі [171, 172].

Однією з причин, чому H. pylori довго персистує і важко елімінується,

є колонізація одного господаря H. pylori з різними генотипами [173]. У

своєму дослідженні Ren et al., використавши модифікований ними метод

ПЛР, показали, що 99% обстежених ними хворих мали декілька (до п’яти)

штамів H. pylori. Також вони довели, що дослідження первинних ізолятів H.

pylori з культури краще відображає різноманіття штамів в окремої особи

[169, 174].

Переваги методу у швидкості, високій чутливості, специфічності,

можливості дослідження великої кількості клінічного матеріалу (біопсії

слизової шлунка, шлунковий сік, змиви з порожнини рота, зубний наліт з

субгінгівальних кишень, копрофільтрат). Цей метод дає можливість типувати

і диференціювати штами бактерій, що дозволяє здійснювати їх

епідеміологічне вивчення, відрізняти випадки реінфекції від рецидиву,

визначати стійкість до антибіотиків [173, 175].

Неінвазивні тести. Неінвазивні методи базуються на виявленні ознак,

які свідчать про присутність H. pylori в організмі і не потребують взяття

біоптатів під час ендоскопічного втручання.

Серологічні методи. Базуються на визначенні в крові хворого антитіл

до H. pylori, що відносяться до IgA, IgM, найчастіше - до IgG. В даний час

розроблено велику кількість методів серологічної діагностики H. pylori:

реакція зв'язування комплементу, реакція гемаглютинації,

імунофлюоресценція, але найбільш широке розповсюдження отримав

імуноферментний аналіз (ІФА). У якості антигену застосовують препарати

ультразвукової дезінтеграції або термічної інактивації H. pylori. Чутливість

методу коливається від 87 до 98%, специфічність - від 75 до 100%. В останні

роки були отримані діагностичні тест-системи на базі ІФА, які мають високу

чутливість і дозволяють кількісно визначати антитіла різних класів до H.

35

pylori, а також до CagA- білку H. pylori, гастрину і пепсиногену крові [176].

Завдяки цьому можна з великою ймовірністю діагностувати рак шлунка на

ранніх стадіях [177].

Італійські дослідники Perna та Vaira розробили оригінальний підхід для

прискорення результату культивування і визначення чутливості. Принцип: 1)

Культивувати H.pylori в бульйоні для його росту протягом 20 годин. 2)

Включити серійні розведення антибіотиків у різних пробірках. 3) Визначити

ріст за допомогою ІФА. Новий метод перевірявся на 111 H. pylori-позитивних

пацієнтах і показав 105 позитивних результатів, як і стандартний метод –

культивування [178].

Серологічний метод є найбільш простим, найдешевшим і найбільш

доступним для визначення інфікованості H. pylori [108, 118]. Він є єдиним

тестом, на який не впливають місцеві зміни слизової шлунку, що може

призвести до хибно негативних результатів. Також у пацієнтів, яким не

можна призупинити прийом ІПП на 2 тижні, можна використати тест ELISA,

оснований на визначенні IgG. Його можна використовувати у хворих з

кровотечами [108, 179]. Недоліки тесту: не можна використовувати для

оцінки ефективності лікування або діагностики реінфекції, так як достовірне

зниження титрів специфічних антитіл у крові після успішної ерадикації

бактерій настає не раніше 6-9 міс, неможливість визначення інфікування H.

pylori в ранніх строках через інертність імунної системи (тест негативний

приблизно до 18-60-го дня після зараження, поки гуморальна відповідь ще не

виникла) [180], ймовірність гіпердіагностики внаслідок перехресних реакцій

з антигенами кампілобактерій інших видів, можливість хибнонегативних

результатів через неадекватну відповідь імунної системи внаслідок її різкого

пригнічення [181, 182].

Дослідження останніх років показують, що діагностичні комплекти зі

штамами H. pylori, розроблені в одних регіонах, не можуть бути застосовані в

інших, де штами відрізняються [183, 184].

36

Одним з методів серологічної діагностики H. pylori-інфекції, що

володіє високою специфічністю, є Westernblot - зустрічна преципітація в гелі

антитіл сироватки крові хворого з різними білками H. pylori, міченими

зондами, підданими розділенню по молекулярній масі за допомогою

електрофорезу і нанесеними на нітроцелюлозу. За допомогою даного методу

штами H. pylori в даний час поділяють на 4 серотипи залежно від продукції

мікроорганізмами цитотоксину VacA і цитотоксинасоційованого білка CagA:

тип I (CagA +, VacA +), тип Ia (CagA +, VacA-), тип Ib (CagA-, VacA +) , тип

II (CagA-, VacA-) [128]. Було показано, що H. pylori генотипів CagA+ і VacA+

були предикторами прогресування передракових уражень [185].

Дихальні уреазні тести (ДУТ). Вони є по суті біохімічними тестами in

vivo, так як засновані на реєстрації у повітрі, що видихається, продуктів

гідролізу сечовини уреазою H. pylori – вуглецю, що входить в склад

вуглекислого газу, або аміаку. В залежності від цього їх можна поділити на

дві підгрупи: вуглецеві та аміачні [160].

Перші визначають ізотопи вуглецю 14

С або 13

С, що вивільняються після

приймання порції сечовини, міченої цими ізотопами, яка розщеплюється в

шлунку хворого під дією уреази H. pylori. Вуглекислий газ з кровотоком

потрапляє в легені і виводиться з повітрям, що видихається. Пацієнт видихає

в спеціальну пробірку-контейнер і пробу повітря направляють на аналіз. 14

С

- радіоактивний ізотоп, який є джерелом низькоенергетичних бета-частин,

його застосування має ряд обмежень і потребує ретельного контролю. Для

визначення ізотопу 13

С, який не має радіоактивності, потрібен

високочутливий газовий мас-спектрометр або лазерне обладнання. Аміачні

дихальні тести засновані на оцінці приросту концентрації аміаку в повітрі

ротової порожнини після приймання пацієнтом сечовини [186].

У порівнянні з гістологією та біопсійними тестами, ДУТ відзначається

високою чутливістю (94,9%), і 100% специфічністю і, отже, високою

позитивною (100%) і негативною (96,3%), прогностичною цінністю [187]. В

37

іншому дослідженні з використанням

13С значення ДУТ не корелювали з

стійкістю H. pylori до антибіотиків [188]. ДУТ вже протягом деякого часу

вважається золотим стандартом неінвазивних тестів. У 2009 році

систематичний огляд тридцяти досліджень, проведений Nocon зі співавт., які

безпосередньо порівнювали 13

С ДУТ з біопсійними тестами, підтвердив цю

точку зору. У більшості досліджень 13

C ДУТ показали вищу чутливість і

специфічність, ніж IgG серологічні тести і визначення антигену в стільці. У

порівнянні з біопсійними уреазними тестами, результати по чутливості є

суперечливими, але специфічність є дещо вищою у 13

С ДУТ. Немає

достатньо результатів досліджень для порівняння між 13

C і 14

C ДУТ,

гістології і ПЛР для визначення значущих відмінностей [189].

ДУТ зручні для епідемічних досліджень (один мас-спектрометр за 10

год роботи аналізує 100 проб дихання), дозволяють контролювати наслідки

лікування, але обмежені в розповсюдженні через необхідність використання

дорогого обладнання і ізотопних препаратів. Серед інших недоліків:

виявлення тільки активних форм H. pylori; ДУТ з радіоактивним 14

C не

можна застосовувати у дітей, а ДУТ з 13

C, як показав метааналіз Leal et al., не

має достатньої точності у цій віковій категорії [190]. При колонізації ротової

порожнини і глотки такими уреазопродуцентами, як стрептокок і стафілокок,

можна отримати хибнопозитивні результати [128]. Хибнонегативні відповіді

тесту можуть бути отримані, якщо пацієнт приймає антибіотики, солі

вісмуту, блокатори протонної помпи, а також у хворих після резекції шлунку

[191].

Виявлення H. pylori інфекції в інших діагностичних зразках. Для

виявлення антитіл до H. pylori слина використовується з обмеженим успіхом,

так як точність таких методів не така висока, як серологічних [192]. Тим не

менш, слина або зубний наліт може виявитися корисним, коли молекулярні

методи стануть більш дешевими і ширше розповсюдженими, так як їх легше

збирати, ніж кров або кал [193].

38

Сучасні моноклональні тести для визначення ДНК H. pylori у калі

(Stool antigen tests - SAT) можуть широко використовуватись як для

первинної діагностики, так і для контролю ерадикації H. pylori інфекції [108].

Їх точність у порівнянні з ДУТ знаходиться на рівні 93,6 - 98,0% [194, 195,

196]. SAT є корисним і надійним діагностичним методом навіть під час

прийому ІПП [197, 198]. Також встановлено, що SAT методом ELISA з

використанням моноклональних антитіл є ефективним неінвазивним тестом

для діагностики H. pylori інфекції у дітей [190, 199].

Виявлення H. pylori в зубному нальоті є складною задачею, оскільки

інші члени Epsilonproteobacteriaceae можуть бути присутніми і привести до

хибнопозитивних результатів [200]. Використовуючи два гени замість одного

в якості мішені, Chaudhry і співавт. знизили рівень хибнопозитивних

результатів з 73% до 52% [201]. В іншому дослідженні за допомогою ПЛР та

Southern-блотингу виявили позитивну кореляцію між наявністю H. pylori в

шлункових біопсіях і ротовій порожнині, що свідчить про існування

орального резервуару інфекції H. pylori [202].

1.4. Стан резистентності Helicobacter pylori до кларитроміцину

Серед схем, що використовуються для лікування інфекції H. рylori,

найбільші темпи ерадикації були досягнуті з використанням інгібіторів

протонної помпи (ІПП) у поєднанні з двома антибіотиками, в основному,

амоксициліном з кларитроміцином або метронідазолом. Однак досі ця

комбінована терапія не ефективна у 21–25% випадків [203, 204].

Первинна резистентність до кларитроміцину зростає в усьому світі, в

Європі вона коливається від 1,7 до 23%, і це було розцінено як основний

фактор, що знижує ефективність антихелікобактерної терапії [205, 206, 207].

Існує градієнт «північ-південь»: у північних країнах, де макроліди

використовували рідко, частота резистентності H.pylori до кларитроміцину є

незначною (1,7-3%), наприклад, у Швеції – 3%, а у південних країнах Європи

39

вона значно вища – 15-23 % (в Італії – понад 40%) [208]. За даними

Бодревича Б. Б. резистентність до кларитроміцину в Україні становить 9,1%

[209].

Актуальним залишається питання розвитку вторинної резистентності,

яка розвивається внаслідок застосування антихелікобактерної терапії [210,

211]. За даними багатьох досліджень, вторинна резистентність H.pylori до

кларитроміцину розвивається у 70% хворих після невдалого курсу

антихелікобактерної терапії [212, 213, 214].

Основною причиною відсутності чутливості H.pylori до макролідів є

відсутність зв'язування препаратів з 23S рРНК компонентом бактеріальної

рибосоми, в основному через точкові мутації – трансверсії аденін-гуанін в

положенні 2142 і 2143 і аденін-цитозин у позиції 2142, всі з яких включені в

петлю пептидилтрансферази 23S рРНК [14, 170, 215].

Все вище викладене дозволило нам дійти наступних висновків: у даний

час не існує єдиного тесту, який можна розглядати як «золотий стандарт» для

діагностики інфікування H. pylori. Вибір найбільш відповідних

діагностичних тестів залежить від їх доступності та вартості, а також від

клінічних обставин. Необхідні додаткові дослідження для оцінки сучасних

інвазивних і неінвазивних тестів для поліпшення їх діагностичної точності.

Наведені в цьому розділі результати досліджень висвітлені в

наступних наукових виданнях:

1. Палій Г. К. Сучасні погляди на розвиток хелікобактерної інфекції і

методи її діагностики / Г. К. Палій, В. В. Власенко, І. Г. Власенко А. О.

Новицький, І. К. Палій // Вісник Вінницького національного медичного

університету. – 2011. - № 1, Т. 15. – С. 148–153. (Здобувач взяв участь у

вивченні літератури, формулюванні положень та написанні тексту та

висновків статті).

40

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Загальна характеристика обстежених хворих

За період 2010 - 2013 років було обстежено 126 хворих з

захворюваннями гастродуоденальної зони, які перебували на амбулаторному

та стаціонарному лікуванні у поліклінічному, терапевтичному та

хірургічному відділеннях Вінницької центральної районної клінічної лікарні.

Висловлюю щиру та глибоку подяку усім колегам за надану допомогу

та сприяння при виконанні дисертаційної роботи.

Серед пацієнтів, включених в дослідження, чоловіків було 56 і жінок

70, вік хворих від 18 до 82 років, середній вік становив (44,5 ± 18,9) років.

Враховуючи клініко-анамнестичні та лабораторно-інструментальні дані

у 34 пацієнтів виявлено ерозивний гастродуоденіт (ЕГД) (геморагічні та

поверхневі ерозії гастро-дуоденальної ділянки при

фіброезофагогастродуоденоскопії (ФЕГДС), у 42 пацієнтів діагностовано

катаральний, атрофічний, поверхневий та інші види гастродуоденітів, ці

хворі були об`єднані у групу «неерозивний гастродуоденіт (НЕГД)», у 27

хворих на виразкову хворобу було виявлено одиничні або множинні дефекти

слизової шлунка чи дванадцятипалої кишки (ДПК) у вигляді активних

виразок.

Згідно з директивами консенсусу Маастрихт-4 (2012) [108] у

дослідження також включалися пацієнти із ендоскопічно виявленою

виразкою ДПК в анамнезі та характерним для виразкової хвороби больовим

синдромом, але без активної виразки ДПК на момент обстеження. Тоді

необхідною для включення в дослідження була наявність вторинних ознак

виразкової хвороби ДПК: видимих рубців цибулини ДПК або рубцевої

41

деформації, ерозивних змін слизової гастродуоденальної зони. Таким чином

у 23 пацієнтів загострення виразкової хвороби протікало без утворення

дефекту слизової (при ФЕГДС виявлено рубці, рубцеві деформації шлунка

або ДПК та гастродуоденопатію з порушенням трофіки).

Хворі включались у дослідження за наступними критеріями:

місце проживання (Вінницький район),

вік (18 років і старші),

однотипність клінічного діагнозу,

однотипний характер порушень функції шлунка,

єдина діагностична програма.

Хворі виключались з дослідження за наступними критеріями:

наявність декомпенсованої супутньої патології,

вік до 18 років,

обстеження в інших лікувально-профілактичних закладах,

проживання за межами Вінницького району,

вживання антисекреторних препаратів за 4 доби до дослідження,

використання імуносупресорів або хіміотерапевтичних,

протизапальних препаратів, антагоністів Н2-рецепторів,

антимікробних препаратів і / або похідних нітроімідазолу та / або

сполук вісмуту менше 4 тижнів до початку досліджень,

вагітні та жінки, що годували груддю,

наявність кровотеч,

алергічні реакції на препарати, плановані до застосування.

Дослідження проведене з урахуванням основних положень GCР ІCH

та Хельсинської декларації з біомедичних досліджень, де людина виступає їх

об’єктом, та наступних її переглядів (Сеул, 2008), Конвенції Ради Європи

про права людини та біомедицину (2007 р.) і рекомендації Комітету з

біоетики при Президії АМН України (2002 р.).

Проведення дослідження передбачало дотримання принципів

42

конфіденційності та поваги особистості хворого, концепцію інформованої

згоди, врахування переваг користі над ризиком і шкодою та інших етичних

принципів стосовно людей, які виступають суб’єктами дослідження.

2.2. Матеріали дослідження

Біоптати слизової шлунка та ДПК, що були об’єктом дослідження,

відбирались з тіла шлунка в 8-ми сантиметрах від кардії по великій та малій

кривизнах (2-3 біоптати), з антрального відділу в 2-3 сантиметрах від

пілорусу по великій і малій кривизні (2-4 біоптати), періульцерозної зони та

бульбарного відділу ДПК. Усього відібрано 342 біопсійних зразків. З них

матеріал 166 біоптатів засівався на поживні середовища для отримання росту

колоній, решта відбиралась для проведення швидкого уреазного тесту і

гістологічного дослідження. Загалом виділено 78 штамів H.pylori.

2.3. Методи дослідження

Усім хворим проводили ФЕГДС. Вона була основою на етапі відбору

хворих для дослідження. Усім пацієнтам після нічного голодування ФЕГДС

виконувалась особисто в ендоскопічному кабінеті Вінницької центральної

районної клінічної лікарні за допомогою панендоскопа «Fujinon 1Z», Японія)

до і, за потреби, через 4 тижні після отриманого лікування.

При огляді фіксували зміни з боку слизової оболонки стравоходу,

шлунка і дванадцятипалої кишки, візуальні особливості функціонування

кардії і пілоруса, вміст шлунка і ДПК. Зміни при гастроскопії

характеризувались відповідно до номенклатури, рекомендованої OMED

[216]. Фіксувались вогнищеві дефекти слизової оболонки шлунка і ДПК, а

також дифузні зміни – поверхневу гастро- або дуоденопатію, гіпертрофічні

чи атрофічні зміни слизової шлунка (рис. 2.1).

43

Рис. 2.1. Виразка задньо-нижньої стінки цибулини

дванадцятипалої кишки

При ендоскопічному обстеженні використовували місцеву анестезію

глоткового кільця 10% розчином лідокаїну. Диметикон не використовувався.

Під час ФЕГДС оцінювали також розміри, форму і локалізацію виразок

при виразковій хворобі, вираженість запальних змін слизової, наявність

ерозій і дуодено-гастрального рефлюксу. Неінвазивні методи проводились

перед фіброезофагогастродуоденоскопією.

Дослідження біохімічної активності біоптатів. Виділені біоптати

слизової шлунка та ДПК обстежували на наявність уреази за допомогою

швидкого уреазного тесту (ШУТ). Ми використовували комерційний набір

Ure Hp-test (Erba Lachema, Чехія). Тест виконувався особисто при кімнатній

температурі в ендоскопічному кабінеті. Для цього біоптати занурювали в

планшети 0,2 мл середовища уреазного тесту. Результат вважався

позитивним, коли колір змінювався з жовтого на малиновий. Спостереження

проводили протягом 24 годин, фіксуючи зміну кольору через 1,2, 4,6,12 та 24

години.

Для бактеріоскопії H. pylori досліджували біоптати слизової оболонки

44

шлунка і ДПК, які готували наступним способом: на чистому обезжиреному

склі розчавлювали біоптат слизової, розмащуючи матеріал на площі біля 2-х

см2 і видаляли нерозчавлені фрагменти (сполучну тканину). Препарат

фіксували 96 % етиловим спиртом, висушували над полум’ям спиртової

горілки і фарбували за методом Романовського-Гімзе, Грама або

гематоксиліном-еозином. В світловому мікроскопі при збільшенні у 900 -

1000 разів під імерсією виявляли H. pylori, зафарбовані у синьо-фіолетовий

колір (при фарбування за Романовським-Гімзе) або червоний (при

фарбуванні за методом Грама) [217].

Визначення ступеня обсіювання слизової оболонки H. pylori проводили

згідно критеріїв Аруина Л. И. і співавторів [148]. Наявність менше 20

мікроорганізмів в полі зору вважали слабким ступенем обсіювання, 20 – 50 –

середнього ступеню, більше 50-ти – високим.

Культивування. Біопсійні шматочки занурювали у транспортне

середовище і не пізніше 3 годин доставляли у лабораторію для посіву. У

якості транспортних використовувались напіврідке тіогліколеве середовище і

середовище «Portagerm pylori» (bioMerieux, Франція). Ємкості з баоптатами

зважували до та після забору матеріалу на аналітичних терезах. Різницю ваги

вважали масою біоптату (середня вага становила (9,382,56) мг). Біоптати

асептично вносили в біологічний гомогенізатор і розтирали при додаванні 1

мл фізіологічного розчину. Далі готували ряд послідовних десятикратних

розведень. По 0,1 мл гомогенізату висівали на елективні та диференційно-

діагностичні агаризовані та рідкі накопичувальні середовища для виділення

чистих культур, як викладено у нормативних та методичних посібниках

загальноприйнятими методами [218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226,

227]. Культивування посівів проводили відповідно в аеробних та

мікроаерофільних умовах із використанням мікроанаеростатів упродовж 24-

120 годин при 37 0С.

Для дослідження H.pylori використовували селективне середовище

45

«Рylori agar» (bioMerieux, Франція) або середовища з селективною добавкою:

ванкоміцин (2,5 мг / мл) для пригнічення грампозитивних коків, налідиксова

кислота (2,5 мг / мл) проти грамнегативних паличок і амфотерицин B (0,25 мг

/ мл) для пригнічення росту грибів [126]. Для дослідження супутньої

мікрофлори використовували селективні та диференціально-діагностичні

середовища, більшість із яких була виробництва «Дослідне виробництво

бактеріальних заквасок Технологічного інституту молока та м’яса ААН

України» (м. Київ), Himedia, Індія та bioMerieux, Франція. Для ідентифікації

виділених культур мікроорганізмів використовували окремі тести та набори

виробництва PLIVA-Lachema а.s., Чехія та bioMerieux, Франція.

Чашки інкубували при 37° С протягом 7 днів у мікроаеробному

інкубаторі (5-10% О2 та 5-10% CO2 ) із застосуваням одноразових

газогенераторних пакетів Genbox Microaer (Bio-Merieux, Франція).

Культури мікроорганізмів, що виросли, ідентифікувались за

морфологічними, тинкторіальними, культуральними, біохімічними

властивостями загальноприйнятими методами згідно з „Визначником

бактерій Берджи”, 1997 [17]. Бактеріальна культура вважалася позитивною на

H. pylori, коли мілкі округлі гладкі напівпрозорі «росинчасті» з рівним

чітким краєм колонії діаметром 1-3 мм мали вигнуті грамнегативні палички

при бактеріоскопії, що володіли оксидазною, каталазною і уреазою

активністю. Субкультури засівали на середовища без селективної добавки.

Поживні середовища готувались за наказом МОЗ України № 167 від

2007 року Про затвердження методичних вказівок «Визначення чутливості

мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» та за ГОСТом 10.444. 1 –

84 (СТСЭВ 3833 – 82) «Приготовление растворов, реактивов, красок,

индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом

анализе» [228, 229].

Контроль якості поживних середовищ проводили за рекомендаціями

фірм-виробників, як зазначено у сертифікатах до продукції, та за

46

Інформаційним листом МОЗ України № 05.4.1/1670 „Бактеріологічний

контроль поживних середовищ”, Київ, 2000.

Визначення чутливості 78 штамів H.pylori до кларитроміцину,

амоксициліну, тетрацикліну, левоміцетину, офлоксацину, фуразолідону та

цефтріаксону з використанням готових комерційних дисків (НИЦФ, Санкт-

Петербург, Росія та OXOID Ld, Великобританія) проводили на середовищі

Мюллера-Хінтона (bioMerieux, Франція) із додаванням 5% дефібрінованої

овечої крові.

Кількість бактерій у 1 г біоптату визначали шляхом підрахунку

колонієутворюючих одиниць (КУО/г) з урахуванням маси біоптату, кількості

посівного матеріалу та розведення за формулою:

m

NMХ

10

(2.1)

де Х – число КУО/г біоптату,

10 – константа при посіві 0,1 мл гомогенізату,

N – кількість колоній,

М – розведення (в 10, 100, 1000 разів тощо),

m – маса біоптату.

Одержані результати визначення кількості мікроорганізмів для

зручності виражали в десяткових логарифмах числа мікроорганізмів на 1

грам біоптату – lg КУО/г.

Суспензії мікроорганізмів із визначеною концентрацією мікробних

клітин готували за допомогою спектрофотометра «GRANUM 722» за

шкалою McFarland згідно з інструкцією до приладу. Тест-культури змивали з

поверхні агарових середовищ стерильним фізіологічним розчином та

доводили до необхідної для проведення дослідів кількості одиниць

оптичного стандарту щільності за McFarland.

Кількість життєздатних мікроорганізмів (КУО) визначали методом

47

серійних розведень із наступним висівом на відповідні поживні середовища.

Серійні розведення бульйонних культур були виконані в асептичних умовах.

Зразки (0,1 мл) кожного розведення висівали у двох повтореннях на

кров'яний агар і колонії підраховувалися після 72 год. інкубації при

температурі 37 ° C у мікроаеробних умовах.

Ферментативну активність бактерій визначали наступним чином. У

межах дослідження визначали здатність мікроорганізмів виробляти уреазу,

каталазу, оксидазу та гемолітичну активність.

Уреазну активність визначали на середовищі Крістенсена без

додавання протимікробних речовин шляхом внесення у 0,5 мл субстрату

суспензії мікробних клітин у концентрації 2х109 КУО/мл. Визначення

результатів проводили візуально, спостерігаючи за зміною кольору тесту

впродовж 48 годин при 37 0С [222].

Каталазну активність виявляли шляхом внесення суспензії бактерій

петлею у краплю перекису водню і спостереження утворення рясних

бульбашок [136].

Активність гемолізинів визначали на агарових середовищах із

додаванням 5% дефібрінованої овечої крові.

Перед проведенням дослідів проводилась синхронізація культур

шляхом одноразового впливу низької температури (4 0С) упродовж 30

хвилин [230].

Дослідження чутливості до антибактеріальних препаратів. Визначення

чутливості виділених культур мікроорганізмів до протимікробних препаратів

проводили диско-дифузійним методом за Bauer-Kirbi з використанням

готових комерційних дисків. Суспензії з бульйонних або агарових культур

доводили до оптичного стандарту щільності 0,5 одиниць за McFarland,

розводили у 10 разів фізіологічним розчином і наносили на поверхню агару.

Інокулят рівномірно розподіляли по поверхні агару, надлишок видаляли

пастерівською піпеткою. Пінцетом розкладали диски з антибіотиками (не

48

більше 6 дисків на чашку) на поверхню засіяного агару. У залежності від

виду бактерій, що досліджувались, чашки інкубували в аеробних або

мікроаерофільних умовах упродовж 18-72 годин. Визначення результатів

проводили шляхом вимірювання зон затримки росту бактерій навколо дисків

включно з діаметром самого диска [229, 231, 232].

Щодо антибіотикочутливості тест-культур H. pylori результати

інтерпретували у відповідності з даними літератури [233, 203, 234], інших

бактерій – у відповідності з методичними рекомендаціями [229, 231]. За

таблицею, що містить граничні значення діаметрів зон затримки росту для

стійких, помірно-стійких і чутливих штамів проводили оцінку результатів.

Значення діаметрів зон затримки росту порівнювали з граничними

значеннями у таблиці і відносили досліджувані штами до однієї з трьох

категорій чутливості.

Для дослідження чутливості штамів до метронідазолу використовували

метод послідовних двократних розведень в агарі. Виготовляли ряд

послідовних розведень препарату у твердому середовищі до кінцевих

концентрацій метронідазолу 1, 2, 4, 8, 16 мкг/мл. На поверхню підсушеного

агару, що вміщував різні концентрації протимікробного препарату, штампом-

реплікатором наносили добову бульйонну культуру, що дозволило на одній

чашці дослідити до 19 тест-штамів. Концентрація протимікробного

препарату в чашки, де спостерігалась повна затримка росту, вважалась

мінімальною інгібуючою концентрацією для штаму, що досліджувався [229].

Для гістологічного дослідження слизової оболонки шлунка і ДПК під

час ФЕГДС за раніше вказаною методикою забору біопсійного матеріалу

брали шматочки слизової та фіксували їх в 10 % нейтральному розчині

формаліну. Депарафінізовані зрізи забарвлювали гематоксиліном і еозином,

за методом ван Гізона, для ідентифікації епітеліальних клітин застосовували

ШИК-реакцію в модифікації Самсонова В.А. (1973) [235]. Присутність H.

pylori характеризувалась наявністю звивистих бактерій в слизовій оболонці

49

або поверхні епітеліальних клітин (рис. 2.2).

Рис. 2.2. H. pylori у просвіті залоз слизової шлунка. Фарбування

гематоксиліном-еозином. Збільшення 1000х

Полімеразну ланцюгову реакцію проводили з використанням набору

ХЕЛІКОПОЛ СА та ХЕЛІКОПОЛ VА («Литех», Росія) за наступною

методикою (згідно інструкції виробника).

1. Підготовка проб і виділення ДНК.

2. Підготовка готової до вживання суміші ферментів.

3. Ампліфікація і комбіноване виявлення ДНК-матриць з подальшим

визначенням кривих плавлення.

4. Інтерпретація генотипів.

1. Підготовка проб і виділення ДНК.

1.1. Перенесли біопсійний зразок у стерильну мікропробірку і додали

40 мкл протеїнази К розчином (А8), 40 мкл буфера для лізису (A7) і 320μL

води, вільної від ДНКази. Інкубували протягом 6 год при 37 ° С в термостаті.

Екстрагували геномну ДНК з використанням комерційного набору для

виділення ДНК.

1.2 Якщо ПЛР не виконувалась негайно, зберігали екстраговані ДНК

50

при -20° C.

2. Підготовка готової до використання суміші ферментів.

2.1. Центрифугували один флакон ферментної суміші (A1a) і один

флакон ферментного буфера (A1b) коротким режимом при 13000 обертів на

хвилину.

2.2 Перенесли 60 мкл ферментного буфера (A1b) в суміш ферментів

(A1a).

2.3 Ретельно перемішали за допомогою піпетки вгору і вниз. Це готові

до вживання суміші ферментів.

3. Ампліфікацію проводили на апараті Терцик («ДНК-Технологии»,

Росія).

Головну суміш для відповідної кількості зразків і контролів готували

наступним чином.

3.1. Об`єм суміші ферментів для реакції і зразки повинні бути

помножені на кількість зразків, що повинні бути виконані, в тому числі

контролі А4, А5 і А6 (N). Продовжували в тому ж порядку з усіма

додатковими реагентами. Усі реагенти протягом усієї роботи охолоджували.

Обережно перемішували (не центрифугували) наступні реагенти в

стерильному флаконі: ферментна суміш (готова до вживання) (+ A1a A1b),

суміш праймерів і зондів (A2) і MgCl2 (A3). Ця суміш є головною сумішшю.

3.2 Внесли 18 мкл головної суміші з використанням мікропіпеток зі

стерильним фільтром у кожен з капілярів аналізатора. Потім додавали 2 мкл

ДНК-зразків, позитивний і негативний контроль (А4, А5 і А6) до кожного з

цих капілярів. Рекомендується негативні піпетки використовувати першими,

щоб уникнути забруднення. Негайно закривали капіляри, щоб уникнути

забруднення.

3.4. Денатурацію проводили при t = 95 º С, відпал праймерів – при 54º

С і елонгацію – при 72º С.

Режим ПЛР був наступним:

51

95° С протягом 10 хв,

45 циклів: 95° С протягом 0 сек.

55° C протягом 10 сек., темп наростання температури: 20° C / сек.

72° С протягом 15 сек.

95° С протягом 0 сек.

50° С протягом 5 сек.

80° С протягом 0 сек., темп наростання температури: 0,1° С / сек.

40° С протягом 30 сек.

4. Аналіз генотипів та інтерпретація результатів.

Детекцію продуктів ампліфікації проводили методом горизонтального

електрофорезу в агарозному гелі.

Дихальний уреазний тест (ДУТ). Ми використовували аміачний

дихальний тест «Хелик-Тест» (АМА-мед, Росія) з використанням

індикаторних трубок, заповнених селективним хемосорбентом згідно

інструкції виробника. А саме: через індикаторну трубку прокачувалось за

допомогою електровідсмоктувача 2 л повітря з ротової порожнини.

Вимірювання концентрації аміаку проводили по довжині зафарбованого

стовпчика в трубці. Визначали базальний рівень аміаку і після прийому 500

мг. сечовини. При прирості довжини зафарбованого стовпчика 3 мм. і більше

судили про інфікування пацієнтів H. pylori [236].

Схема ферментативного гідролізу сечовини представлена на рис. 2.3.

Рис. 2.3. Схема гідролізу сечовини уреазою H. pylori

Стул-тест виконували імунохроматографічним методом з визначенням

Ag H. pylori в калі за допомогою тест-системи Cer Test Biotec SL. Іспанія

52

згідно інструкції виробника.

2.4. Методи статистичної обробки інформації

При характеристиці методів діагностики були розраховані чутливість,

специфічність, позитивні і негативні прогностичні значення, точність для

кожного методу, враховуючи будь-яку комбінацію з 3 і більше позитивних

результатів з 5 методів в якості «золотого стандарту». Для об’єктивного

судження про ступінь достовірності результатів дослідження застосовували

варіаційно-статистичний метод аналізу отриманих результатів. Статистична

обробка проводилась з використанням програми Microsoft Exell. Визначали

середню арифметичну величину (М), помилку середньоквадратичного

відхилення (+m) та показник суттєвої різниці (t). Коефіцієнт вірогідності (р)

визначали за таблицею Ст’юдента. Значення р в межах 0,1 - 0,05 розглядали

як наявність тенденції до різниці порівнювальних величин, коли коефіцієнт

достовірності дорівнював або був меншим 0,05, то результати вважалися

достовірними.

Для оцінки кореляції між щільністю геномів H. рylori і розподілом H.

рylori в біопсійних зразках розраховувався коефіцієнт рангової кореляції

Спірмена (r). Повна кореляційна залежність між ознаками характеризувалася

значенням r = 1, при r = 0 кореляційний зв’язок відсутній. Значення r від 1 до

0,7 свідчили про тісну взаємодію, для значень r = 0,7 - 0,4 характерна

помірна, а для r = 0,4 і менше – слабка кореляційна залежність. Знаки “+” або

“-” відтворювали характер зв’язку – прямий чи зворотній. Q-тест Кокрана був

використаний для вивчення узгодження позитивних і негативних результатів.

Порівняння між парами тестів здійснено за допомогою тесту χ2 Мак Немара.

Для графічного зображення використовували розрахунок відсоткового

відхилення від норми, прийнятої за 100 %. Рівень припущення для нульової

гіпотези був встановлений на рівні 0,05.

53

РОЗДІЛ 3

МІКРОБІОЛОГІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАМІВ HELICOBACTER

PYLORI У СЛИЗОВИХ ОБОЛОНКАХ ГАСТРОДУОДЕНАЛЬНОЇ

ДІЛЯНКИ ХВОРИХ НА ЗАПАЛЬНО-ВИРАЗКОВУ ПАТОЛОГІЮ

ШЛУНКА І ДВАНАДЦЯТИПАЛОЇ КИШКИ

3.1. Вивчення розповсюдження Helicobacter pylori у патологічно

змінених слизових оболонках гастродуоденальної ділянки

Робота присвячена вивченню особливостей персистування

хелікобактерів у патологічно змінених слизових оболонках шлунка та

дванадцятипалої кишки.

Дослідження показали, що бактерії знаходились у слизовій оболонці

шлунка та ДПК всіх обстежених осіб. Частка виділення H. pylori та іншої

мікрофлори залежала наявності чи відсутності дефектів слизової та від

діагнозу. Хелікобактери частіше виділялись від хворих з дефектами слизової

шлунка чи ДПК (табл. 3.1). Так, при ерозивному гастродуоденіті штами H.

pylori були виявлені у 85,3% обстежених, тоді як при неерозивних

гастродуоденітах лише в 52,4% (р<0,05).

Аналогічні результати виявлені у хворих з виразковими ураженнями

ГДД. При активній виразці H. pylori виділено у 88,9% хворих, що більше, ніж

у шість разів частіше, ніж при загостреннях хвороби без дефекту слизових

оболонок, коли хелікобактери виділено у 13,0% пацієнтів (р<0,001).

Таблиця 3.1

Частка виявлення Helicobacter pylori в слизових оболонках шлунка та дванадцятипалої кишки у хворих з

запально-виразковими ураженнями гастродуоденальної ділянки

Ендоскопічний висновок Всього

хворих

виділені мікроорганізми Виділено

штамів

H. pylori при

захворюваннях тільки H. pylori

H. pylori і

асоціації з іншою

мікрофлорою

тільки інша

мукозна

мікрофлора

абс.

число

питома

вага

(%)

абс.

число

питома

вага (%)

абс.

число

питома

вага (%)

Процес із

дефектами

слизової

оболонки

(ерозії,

виразки)

гастродуоденіт

ерозивний 34 19 55,9 10 29,4 5 14,7 29

активна виразка

шлунка або ДПК 27 17 63 7 25,9 3 11,1 24

Процес без

дефектів

слизової

оболонки

гастродуоденіт

неерозивний 42 3 7,2 19 45,2 20 47,6 22

загострення

виразкової хвороби

шлунка або ДПК

(рубці, деформація

шлунка або ДПК)

23 1 4,3 2 8,7 20 87 3

Всього 126 40 31,7 38 30,2 48 30,1 78

54

55

Найбільш густозаселеними H. pylori відділами, за літературними

даними, є антрум шлунка, періульцерозна зона шлунка та ДПК, далі тіло

шлунка та цибулина [18]. Однак такий розподіл у наших дослідженнях

підтвердився тільки до певної міри.

За отриманими результатами не було достовірної різниці між кількістю

H. pylori в тілі та антральному відділі шлунка, через це при узагальненні

матеріалу ці дані були об`єднані. Дослідження показали (табл. 3.2), що у всіх

групах хворих штами хелікобактерів найчастіше виділялися з біоптатів

слизових оболонок шлунка у порівнянні з ДПК.

У пацієнтів із дефектами слизових оболонок виявлено найбільш високі

показники позитивних знахідок хелікобактерів – при активній виразці

шлунка – у 85,2% із періульцерозної зони, при ерозивному гастродуоденіті –

у 85,3% біоптатів. Однак у пацієнтів усіх указаних груп мікробіологічне

дослідження біоптатів з цибулини ДПК виявило, що у слизовій цього відділу

ГДД H. pylori персистують рідко: лише в 2-х випадках удалось виділити

хелікобактери при наявності виразки цибулини ДПК.

Дослідження показали, що середня концентрація H. pylori у слизових

оболонках ГДД хворих із різною нозологією достовірно не відрізнялась й

становила в середньому (5,79±1,34) lg КУО/г біоптату.

3.2. Мікробіологічні властивості штамів Helicobacter pylori,

виділених від хворих на гастродуоденіти і виразкову хворобу

Виділені штами хелікобактерів (n=78) через 3-5 діб інкубації у

мікроаерофільних умовах при температурі (37±0,1) 0С на твердому

поживному середовищі утворювали мілкі діаметром (1-3) мм напівпрозорі

вологі з чітким контуром колонії, що не зливались між собою.

Таблиця 3.2

Характеристика штамів Helicobacter pylori, виділених з біопсійних зразків з різних відділів гастродуоденальної

ділянки у хворих на запально-виразкову патологію

Ендоскопічний висновок Відділи гастродуоденальної

ділянки

Кіль-

кість

біоптатів

з них виділено штамів H. pylori

абс. число питома

вага (%)

кількість

lg КУО/г

(М±m)

Процес із

дефектами

слизової

оболонки

(ерозії,

виразка)

гастродуоденіт

ерозивний

Антрум та тіло шлунка 34 29 85,3 5,94±1,18

Цибулина ДПК 8 0 - -

активна виразка шлунка

або ДПК

Антрум та тіло шлунка 21 16 76,2 6,11±1,21

Періульцерозна зона шлунка 7 6 85,2 5,77±1,29

Періульцерозна зона ДПК 11 2 18,2 6,08±1,72

Процес без

дефектів

слизової

оболонки

гастродуоденіт

неерозивний

Антрум та тіло шлунка 38 22 58,0 5,37±1,32

Цибулина ДПК 16 0 - -

загострення виразкової

хвороби шлунка або

ДПК (рубці, деформація

шлунка або ДПК)

Антрум та тіло шлунка 16 3 18,8 5,45±1,33

Цибулина ДПК 15 0 - -

Всього 166 78 44,3 5,79±1,34 *

Примітка. * - подано середнє значення

56

57

При бактеріоскопії виділені мікроорганізми мали вигляд

грамнегативних зігнутих паличок, які розташовувались у полі зору

поодиноко або, частіше, скупченнями. Коли строк інкубації тривав до 7 днів,

94,9% штамів H. pylori утворювали кокоподібну форму, яка спостерігалась у

100% випадків при культивуванні 10 днів і більше. При повторних пересівах

ці штами не культивувались. Їх уреазна активність залишалась помірною.

Уреазна активність свіжовиділених штамів хелікобактерів фіксувалась

при внесенні у реагент суспензії бактерій у концентрації 109 КУО на 1 мл

субстрату і становила 1,5±0,5 хвилин.

Гемолітична активність штамів у вигляді зон альфа-гемолізу на

кровʾяних середовищах зафіксована у 36 штамів (46,2%), серед них - 17 –

штамів хелікобактерів у хворих з пептичною виразкою, 1 штам у пацієнтів із

загостренням виразкової хвороби без дефектів слизової, 14 штамів у хворих

з ерозивним гастродуоденітом, та 4 штамів у хворих з неерозивним

гастродуоденітом (рис. 3.1).

Рис. 3.1. Показники гемолітичної активності штамів H. pylori, що

виділені при різних видах гастродуоденальної патології

58

Було також встановлено, що гемолітична властивість штамів

хелікобактерів достовірно частіше (р<0,001) проявлялась при патології з

дефектами слизової оболонки, ніж при захворюваннях без її дефекту. При

чому, різниця по цій ознаці становила - у хворих з ерозивним

гастродуоденітом у 2,7 рази частіше ніж при неерозивному гастродуоденіті,

та у 2,1 рази частіше у штамів, що були виділені у хворих з активною

виразкою, ніж при загостренні без дефектів слизової (р<0,001).

Хелікобактери всіх 78 штамів проявляли каталазну, оксидазну та

фосфатазну активність та не ферментували вуглеводи.

Проведено визначення чутливості до антибактеріальних препаратів, що

використовуються для ерадикації, у 78 штамів H. pylori (табл. 3.3).

Таблиця 3.3

Чутливість штамів H. pylori до антибактеріальних препаратів, що

використовували для ерадикації

Назва препарату

Кількість чутливих та помірно-

чутливих штамів H. pylori

Середні

значення

діаметрів зон

затримки росту,

мм (М±m)

абс.

число

питома вага

(%)

Амоксицилін 70 89,7 24,1±2,7

Кларитроміцин 65 83,3 22,8±1,8

Метронідазол 33 42,3 *

Тетрациклін 74 94,9 27,6±4,2

Фуразолідон 64 82,1 26,7±3,0

Левоміцетин 77 98,7 28,4±4,1

Офлоксацин 73 93,6 24,8±4,1

Примітка. * - мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) < 8 мкг/мл

59

Результати свідчать, що найбільша чутливість хелікобактерів

спостерігалась до левоміцетину, тетрацикліну та офлоксацину. Однак, до

засобів, які входять до найбільш поширених схем антихелікобактерної

терапії (кларитроміцин, амоксицилін, фурезолідон та метронідазол),

виявлено найбільшу кількість резистентних штамів (10,3-57,7%).

Виявлено, що із всіх досліджених штамів H. pylori, 50 штамів (64,1%)

виявили чутливість до всіх препаратів; 14 штамів (17,9%) були

резистентними до одного з препаратів, 8 штамів (10,3%) – до двох

препаратів, 4 штами (7,6%) – до трьох препаратів (рис. 3.2).

Рис. 3.2. Резистентність штамів H. pylori до ерадикаційних засобів

Найчастіше резистентність H. pylori до амоксициліну поєднувалась з

резистентністю до метронідазолу (5 штамів), а 6 штамів проявляли поєднану

стійкість до метронідазолу з кларитроміцином.

60

3.3. Оцінка активності уреази в біоптатах слизових оболонок

гастродуоденальної ділянки у хворих на гастродуоденіт та пептичну

виразку в залежності від наявності та концентрації Helicobacter pylori

Під час виконання роботи нами проведено біохімічне дослідження 166

біоптатів слизової шлунка та 12-ти палої кишки, отриманих при проведенні

ФЕГДС, на предмет ферментації сечовини. Результати свідчать, що уреазна

активність в біоптатах, взятих у хворих з дефектами слизової оболонки,

зареєстрована у 72,8% випадків, а без дефекта слизової уреазний тест був

позитивним у 36,5% (р<0,01) досліджених біоптатів (рис. 3.3, табл. 3.4).

Також була відмічена відмінність у швидкості ферментації сечовини у

описаних об’єктах дослідження. Рис. 3.3 свідчить, що у пацієнтів з

дефектами слизової оболонки переважна більшість біоптатів (72,9%) при

внесенні у реактив гідролізують сечовину напротязі першої години

спостереження за уреазним тестом, тоді як у хворих без дефектів слизової

біоптатів з високою уреазою активністю було 29,4% (р<0,001).

Рис. 3.3. Швидкість ферментації сечовини при дослідженні

біоптатів слизових оболонок гастродуоденальної ділянки при запально-

виразковій патології шлунка та дванадцятипалої кишки

Таблиця 3.4

Частота та швидкість ферментації сечовини при дослідженні біоптатів слизових оболонок шлунка та

дванадцятипалої кишки у хворих на запально-виразкову патологію гастродуоденальної зони

Ендоскопічний висновок Кількість

біоптатів

з них

уреазопозитивні

Розподіл біоптатів за швидкістю

ферментації сечовини (в годинах)

абс.

число

питома

вага (%) <0,5 0,5 - 1 1 - 3 3 - 12 12 - 24

Процес із

дефектами

слизової

оболонки

(ерозії,

виразки)

гастродуоденіт

ерозивний 42 29 69,0 10 9 6 2 2

виразкова хвороба

шлунка або ДПК

(активна виразка шлунка

або ДПК)

39 30 76,9 13 11 2 3 1

Процес без

дефектів

слизової

оболонки

гастродуоденіт

неерозивний 54 23 42,6 2 5 8 2 6

загострення виразкової

хвороби шлунка або

ДПК (рубці, деформація

шлунка або ДПК)

31 8 25,8 - 2 - 1 5

Всього 166 90 54,2 25 27 16 8 14

61

62

Разом з тим, пізня ферментація сечовини (12 - 24 годин від початку

реакції) у біоптатах, взятих зі слизових без дефектів, складала 35,5%, у

біоптатах, взятих зі слизових з ерозіями чи виразками, спостерігалась у 5,1%

(р<0,001).

Дані результати є наслідком наявності в біоптатах хелікобактерів з

різною ферментативною активністю. Так, у хворих з ерозивним

гастродуоденітом та активною виразкою H. pylori було виділено з 88,1%

біоптатів, які розкладали сечовину (табл. 3.5), а частота виділення H. pylori з

уреазопозитивних біоптатів у хворих без дефектів слизової склала 80,6%

(р>0,05).

Однак, необхідно зазначити, що частина біоптатів проявляла уреазну

активність без наявності в них хелікобактерів (10,2%), а також частина

біоптатів (2,4%), де виявляли H. pylori, не мали або мали дуже слабку уреазну

активність в межах чутливості уреазного тесту.

Можна припустити, що на це впливає супутня мікрофлора, що з одного

боку проявляє власну невиражену уреазну активність, а з іншого боку

пригнічує уреазну активність хелікобактерів.

Таблиця 3.5

Частка гідролізу сечовини та виділення Helicobacter pylori при дослідженні біоптатів слизових оболонок

гастродуоденальної ділянки у хворих на запально-виразкову патологію шлунка та дванадцятипалої кишки

Ендоскопічний висновок

Кіль-

кість

біоптатів

з них з позитивни-

ми результатами

уреазного тесту і

посівів

Розподіл біоптатів за результатами

уреазного тесту і посівів

абс.

число

питома

вага (%)

позитивний

уреазний

тест,

виділення

H. pylori

негативний

уреазний

тест,

виділення

H. pylori

позитив-

ний

уреазний

тест,

відсутність

H. pylori

Процес із

дефектами

слизової

оболонки

(ерозії,

виразки)

гастродуоденіт ерозивний 42 29 69,0 28 1 1

виразкова хвороба шлунка або

ДПК (активна виразка шлунка

або ДПК)

39 30 76,9 24 0 6

Процес без

дефектів

слизової

оболонки

гастродуоденіт неерозивний 54 23 42,6 20 2 3

загострення виразкової хвороби

шлунка або ДПК (рубці,

деформація шлунка або ДПК)

31 8 25,8 2 1 6

Всього 166 90 54,2 74 4 16

63

64

3.4. Результати порівняння культивування H. pylori з іншими

методами виявлення хелікобактеріозу

У країнах, що розвиваються, поширеність H. pylori вище, ніж у

розвинених країнах, і рівні варіюють від 41,3% до 91,3% [237]. За останні 30

років кількість хворих на виразкову хворобу в Україні збільшилася більш ніж

у двічі. З огляду на високу захворюваність, тимчасову та стійку втрату

працездатності в Україні виразкова хвороба шлунка та дванадцятипалої

кишки є важливою медико-соціальною проблемою [238]. Тому надійний тест

для виявлення Н. рylori має вирішальне значення [183].

Метою даного дослідження було порівняти точність бактеріологічного

методу діагностики хелікобактерної інфекції з інвазивними методами:

швидким уреазним тестом (ШУТ) і гістологічним, та неінвазивними

методами: стул-тестом і дихальним уреазним тестом (ДУТ).

У дане дослідження ввійшло 74 амбулаторних хворих з диспепсичними

явищами, які проходили діагностичну ендоскопію верхніх відділів

шлунково-кишкового тракту (ШКТ) з біопсією слизової шлунка. Пацієнти,

які використовували імуносупресори або хіміотерапевтичні препарати,

протизапальні препарати, антагоністи Н2-рецепторів, антимікробні

препарати і / або похідні нітроімідазолу та / або сполуки вісмуту менше 4

тижнів до початку досліджень, вагітні, жінки, що годували груддю, хворі з

кровотечами, були виключені. Інвазивні методи ендоскопії проводили під

місцевою анестезією глоткового кільця розчином лідокаїну 10% за

допомогою фіброгастроскопу Fujinon 1Z (Японія) після нічного голодування.

Диметикон не використовувався. Неінвазивні методи проводились перед

фіброгастродуоденоскопією (ФГДС). Біопсії були взяті з антрального відділу

з ділянки приблизно 2 см від пілоричного каналу для гістології (2

фрагменти), швидкого уреазного тесту (2 фрагменти) і посіву (2 фрагменти).

Чутливість, специфічність, позитивні і негативні прогностичні

значення були розраховані для кожного методу, враховуючи будь-яку

65

комбінацію з 3 і більше позитивних результатів з 5 методів в якості

стандарту. Q-тест Кокрана був використаний для вивчення узгодження

позитивних і негативних результатів. Порівняння між парами тестів

здійснено за допомогою тесту хі-квадрат Мак Немара. Рівень припущення

для нульової гіпотези був встановлений на рівні 0,05.

Результати дослідження показали, що вік 74 хворих коливався від від

19 до 69 років (середнє значення 48,5 ± 18,9 років), з яких 55,4% (41/74) були

жінки і 44,6% (33/74) були чоловіки. Біль у животі був присутній у 94,6%

(70/74), локалізувався в епігастральній ділянці у 86,5% і мав пекучий

характер у 77,0%, блювота була присутня у 48,6% і нічні болі у 43,2%

пацієнтів. Сімейний анамнез виразкової хвороби був присутній у 40,5%

хворих.

Ендоскопічна картина була нормальною у 14,9% (11/74) і патологічною

у 85,1% (63/74). Хелікобактеріоз був присутній загалом у 67,6% (50/74) (табл

3.6 і 3.7).

Таблиця 3.6

Частка виявлення H. pylori при різній патології верхніх відділів

шлунково-кишкового тракту

Патологія Наявність H. pylori, %

Езофагіти 54,5%

Гастродуоденіти 81,1%

Ерозивно-виразкові

ураження 93,3%

У даному дослідженні ми вважали хворих інфікованими H. pylori, коли

3 і більше методів дали позитивний результат, і не інфікованими, коли 3 і

більше методів дали негативний результат.

У групі пацієнтів (11 чоловік) без ендоскопічної патології у восьми

(72,7%) H. рylori не виявлявся, і 27,3% (3/11) були H. рylori-позитивними. У

групі хворих з патологічним ендоскопічним заключенням 74,6% (47/63) були

H. рylori-позитивні і 25,4% (16/63) були H. рylori-негативними (р <0,05, табл.

66

3.6.). Хворі з патологічною ендоскопічною картиною страждали на езофагіт

різних ступеней важкості в 17,5% (11/63), гастродуоденіт у 58,7% (37/63), і

ерозивно-виразкові ураження гастродуоденальної зони мали 23,8% (15/63)

осіб.

Таблиця 3.7

Розподіл хворих в залежності від результатів тестів

Номер

групи

Кількість

хворих

Культура Швидкий

уреазний

тест

Гістологія Дихальний

уреазний

тест

Стул-

тест

1 17 - - - - -

2 2 - - - + -

3 1 - - - - +

4 2 - - - + +

5 2 - + - - +

6 1 + + - - +

7 1 + + + - -

8 1 + - + + -

9 1 - + + + -

10 2 - + + - +

11 1 + - - + +

12 3 - + + + +

13 3 + + - + +

14 37 + + + + +

Примітка. «+» - позитивний результат тесту, «-» - негативний результат

тесту

Серед хворих з гастродуоденітом 81,1% (30/37) були H. рylori

позитивними, також хелікобактеріоз виявлявся у 54,5% (6/11) хворих з

езофагітом, і у 93,3% хворих з ерозивно-виразковими ураженнями шлунка і

дванадцятипалої кишки (14/15). Антральні вузлики спостерігались у 75,7%

хворих на гастрит. Нормальна гістологічна картина виявлена у 12,2% (9/74),

всі з яких були H. рylori-негативні пацієнти.

67

Всі методи, узгоджені в 73% (54/74) пацієнтів, негативні результати

узгоджені в 70,8% (17/24), позитивні – 74% (37/50), р<0,05. Неузгодженість

спостерігали в 27% випадків: у 6 (8,1%) пацієнтів були 4 позитивних і 1

негативний тест, у трьох (4%) були 4 негативні тести і один позитивний, у

семи пацієнтів (9,5%) три тести були позитивні і 2 тести виявились

негативними, і у чотирьох пацієнтів (4%) 2 тести були позитивними та 3

негативними (табл. 3.7). Виявили найбільшу відповідність серед інвазивних

методів: 89,2% - між гістологією та ШУТ уреазним тестом, по 85,1% - між

культивуванням і ШУТ і культивуванням та гістологією.

Найвищу специфічність отримали при використанні мікробіологічного

(100%) і гістологічного (100%) методів, далі: ШУТ (91,7%), ДУТ (87,5%) і

стул-тест (79,2%). Найвищу чутливість мав ШУТ (96%), далі: стул-тест

(93,75%), ДУТ (92%), гістологія (90%) і культивування (86,0%) (табл. 3.8).

Таблиця 3.8

Чутливість, специфічність, позитивна і негативна прогностична

цінність, точність діагностичних тестів

Тест Чутливість,

%

Специфічність,

%

Позитивне

прогностичне

значення, %

Негативне

прогностичне

значення, %

Точність,

%

Культивуван-

ня

86 100 100 80 91,9

ШУТ 96 91,7 94,1 91,3 93,2

Гістологія 90 100 100 82,8 93,2

ДУТ 92 87,5 93,9 84 90,5

Стул-тест 93,75 79,2 90 86,3 88,9

Все вище викладене дозволило нам дійти наступних висновків.

Встановлено вірогідну різницю (р<0,001) за частотою виділення

хелікобактерів у хворих з ерозіями чи виразками слизової оболонки (86,9%)

та без дефектів слизової (38,5%).

68

Виділення H. pylori також залежить від відділу гастродуоденальної

ділянки, звідки береться біопсія. Так, частіше хелікобактери культивувались

з тіла та антрального відділу шлунка (при захворюваннях з дефектами

слизових – на рівні 85,3%, при інших станах – в межах від 18,8% до 58,0%).

Встановлено, що H .pylori виділяється з усіх відділів шлунка і ДПК в

середній концентрації (5,79±1,34) lg10 КУО/г біоптату без достовірної різниці

між відділами ГДД.

Усі штами H. pylori, отримані під час досліджень, мали типові

морфологічні, культуральні та біохімічні властивості. 36 штамів (46,2%) мали

гемолітичні властивості. При цьому наявність гемолізинів в біоптатах, взятих

у хворих з дефектами слизової ГДД, становила 58,5% випадків, а в біоптатах

взятих із слизових без дефектів – 20,0% (р<0,01).

При дослідженні хелікобактерів на чутливість до антибіотиків, що

застосовуються при ерадикації, виявлена чутливість на рівні 42,3-98,7%, у

35,9% випадків відмічалась резистентність H. pylori до одного-трьох

препаратів.

Уреазна активність біоптатів, що були взяті із слизових з дефектами

(ерозії, виразки), спостерігалась у 72,8% випадків. Вона була високою (в

межах першої години після постановки тесту) у 70,5% хворих з дефектами

слизових, і лише у 10,6% хворих без дефектів слизової. Уреазний тест у

біоптатів, що були взяті зі слизових без дефектів, був позитивним лише у

36,5% біоптатів (р<0,05).

Жоден з доступних тестів не підходить для всіх ситуацій, кожний з

яких має свої недоліки і переваги. У літературі підкреслюється необхідність

валідації комерційних діагностичних тестів для кожного регіону, популяції і

віку.

Наведені в цьому розділі результати досліджень висвітлені в наступних

наукових виданнях:

69

1. Палій Г. К. Вивчення властивостей клінічних ізолятів Helicobacter

pylori та їх чутливість до антибактеріальних препаратів / Г. К. Палій, І. Г.

Власенко, А. О. Новицький, В. В. Власенко // Biomedical and biosocial

anthropology. – 2012. - № 19. – С. 68–70. (Здобувач виконував усім пацієнтам

ендоскопічне обстеження з біопсією, визначення чутливості хелікобактерів

до антибактеріальних препаратів, брав участь в узагальненні результатів).

2. Власенко І. Г. Характеристика інвазивних та неінвазивних методів

діагностики хелікобактерної інфекції / І. Г. Власенко, Г. К. Палій, А. О.

Новицький, В. В. Власенко // Вісник Вінницького національного медичного

університету. – 2013. - № 2., Т. 17. – С. 438–441. (Здобувач виконав забір

матеріалу для дослідження, виконав неінвазивні та деякі інвазивні методи

виявлення хелікобактерів, підготував матеріали до друку).

3. Власенко В. В. Аналіз захворюваності жителів Вінницького регіону

на виразкову хворобу шлунка і дванадцятипалої кишки та гастродуоденіт / В.

В. Власенко, А. О. Новицький // Анали Мечніковського інституту. – 2011. -

№ 4. – С. 28-29. (Здобувач зібрав дані офіційної статистики щодо показників

захворюваності у Вінницькій області, брав участь у обробці отриманих

даних).

4. Власенко В. В. Порівняння діагностичних тестів для виявлення

Helicobacter pylori / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, А. О. Новицький // Тези

доповідей ХІІІ з`їзду товариства мікробіологів України ім. С. М.

Виноградського - Ялта, 2013. – С. 234. (Здобувач виконав підбір хворих і

постановку дослідів, підготував матеріали до друку).

70

РОЗДІЛ 4

РОЗРОБКА ПОЖИВНОГО СЕРЕДОВИЩА БЕЗ КРОВІ ДЛЯ

БАКТЕРІОЛОГІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ХЕЛІКОБАКТЕРІОЗУ І

ПОРІВНЯННЯ ЙОГО З ІСНУЮЧИМИ

4.1. Вибір інгредієнтів для поживного середовища

До нового середовища, яке планувалося розробити, були поставлені

наступні вимоги: воно повинно відноситися до прискореної

бактеріологічної діагностики, тобто давати швидкий ріст колоній H.

pylori в межах 3-6 діб після посіву матеріалу. Крім того, середовище

повинно забезпечувати висівання чистої культури та пригнічувати ріст

супутньої мікрофлори.

Обов’язковою умовою для нового середовища повинна бути

загальнодоступність, тобто усі його інгредієнти повинні продаватися в

аптечній мережі. Середовище повинно легко готуватись та тривало

зберігатись в доступних природно-кліматичних і температурних умовах.

Було вирішено для середовища підбирати сухі інгредієнти, що

забезпечувало б тривале його зберігання. Досліджувалось багато різних

порошкоподібних речовин, стимуляторів росту мікроорганізмів як

природного так і не природного походження, які не задовільнили нашим

вимогам, тому наслідки їх тестування не наводяться в даній роботі .

Внаслідок кропіткої і тривалої роботи позитивні результати дав препарат

Nutrilon, який як інгредієнт при численних дослідженнях дав бажаний

результат. Nutrilon являє собою суху адаптовану молочну суміш із

залізом, дуже добре розчинну у воді і як виявилось має властивість

повністю стимулювати ріст хелікобактерів.

71

В числених додаткових дослідах на щільних субстратах з

інгредієнтом Nutrilon був виявлений закономірний факт високої

чутливості росту хелікобактерів.

Встановивши, що Nutrilon в певних концентраціях може давати

гарний ріст мікрофлори, було припущено, що завдяки двом фізико-

хімічним властивостям цього препарату він може бути цінним

специфічним інгредієнтом для нашого середовища.

По-перше, як розчинник для Nutrilon використовується вода, а не

інші розчинники, які містять сторонні домішки, що може послужити

додатковою перешкодою при створенні середовища.

По-друге, Nutrilon являє собою багатокомпонентну суху суміш, що

містить білки, залізо, ліпіди тощо. Ці компоненти використовуються

мікроорганізмами, як необхідні для обмінних процесів мікробної клітини.

Задовільнившись підібраним інгредієнтом для нашого середовища,

ми зосередили свою увагу на його вдосконаленні з точки зору зручного

приготування та зберігання.

Вибір поживної основи. Найбільш розповсюдженою основою, що

гарно себе зарекомендувала в більшості середовищ, є сухий агар-агар,

який добре розчиний у воді при кип’ятінні. Ця та інші його властивості

дозволили обрати його, як один з інградієнтів для нашого середовища.

Однак, він не містить необхідних компонентів для росту H. pylori.

У свою чергу добавка Nutrilon має покращені і збалансовані білкові

складові, а також тривало зберігалася в лабораторних умовах без

погіршення властивостей.

Таким чином, Nutrilon, як сухий інгредієнт створеного поживного

середовища, повністю задовільнив наші вимоги. Отже, нами створене

поживне середовище повністю забезпечує мікроорганізми для

розмноження необхідними білками (пептон та білки в складі Nutrilon) та

72

залізом (входить до складу Nutrilon), як підсилювач окисно-

відновлювальних процесів.

Отже, поживне середовище для виділення H. pylori містить сухий

ферментативний пептон, агар-агар, воду та суху адаптовану молочну

суміш із залізом – Nutrilon при такому співвідношенні, мас.%: агар-агар

1-2, сухий ферментативний пептон 8-12, Nutrilon 1-3, вода – решта.

Концентрація поживних речовин у 100 мл готового середовища:

лінолева кислота – 26,7 – 80,1 мг, альфа-ліноленова кислота – 4,71 – 14,13

мг, залізо – 0,08 - 0,24 мг.

Спосіб виділення H. pylori на запропонованому поживному

середовищі здійснювали у наступній послідовності.

Для виділення хелікобактера готували поживне середовище, при

цьому у нього додавали селективну добавку: ванкоміцин 2,5 мг / мл для

пригнічення росту грам позитивних коків, налідиксова кислота 2,5 мг / мл

для пригнічення росту грам-негативних паличок і амфотерицин B 0,25 мг

/ мл для пригнічення росту грибів з подальшим посівом на поживне

середовище.

За контрольне брали поживне середовище агар Мюллера-Хінтона з

5% овечої крові. Основу цього середовища вибрано через те, що за

наказом Міністерства охорони здоров`я України від 05.04.2007р за № 167

«Про затвердження методичних вказівок "Визначення чутливості

мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів"» його рекомендовано в

якості середовища для визначення чутливості мікроорганізмів до

антибактеріальних препаратів [239].

Висівали посівний матеріал в чашки Петрі на поживне середовище у

дозі 0,1 мл. Засіяні чашки Петрі розташовували в термостаті кришками

догори, термостатували при температурі 37 ± 1°С протягом до 10 діб.

Поява росту колоній на 2-5 добу вказує на позитивний результат, а

73

відсутність росту хелікобактерів після 10 діб вважається негативним

результатом.

Серією дослідів встановлювалась дія різних концентрацій

інгредієнтів запропонованого середовища на термін максимального росту

H. pylori на цьому середовищі (табл. 4.1).

Перша серія дослідів. Брались мінімальні концентрації компонентів,

що входять в середовище, а саме (мас.%): агар-агар – 1,0; сухий

ферментативний пептон – 8,0; Nutrilon – 1,0; вода – решта.

Хід виконання був наступним. Усі компоненти перемелювались в

лабораторному млину протягом 10-50 хвилин. До них додавали 100 мл

очищеної води, перемішували і кип’ятили до повного розплавлення агар-

агару біля 3-5 хвилин. Суміш фільтрували через ватно-марлевий фільтр,

розливали у мірні скляні колби та стерилізували в автоклаві при

температурі 120° ± 1°С протягом 15 хвилин. Охолоджували до

температури 45°С, додавали суміш антибактеріальних препаратів.

Поживне середовище в асептичних умовах розливали в стерильні чашки

Петрі по 20 мл. Через 10 хвилин середовище, як правило, застигало, і

мало жовтуватий колір. рН середовища було 7,2 ± 0,2. Після повного

застигання середовища на нього виконували посів клінічних ізолятів.

Засіяний матеріал в чашках Петрі поміщали в термостат на 10 діб

при температурі 37°±1°С. Одночасно проводився посів матеріалу на

контрольне середовище.

Облік результатів проводили щоденно до закінчення строку

інкубації. Було встановлено, що ріст колоній H. pylori на чашках Петрі із

запропонованим середовищем почав спостерігатися через 48 годин,

максимальний ріст – зявився після третьої доби. На контрольному

середовищі максимальний ріст колоній H. pylori спостерігався на 3-7

добу.

Таким чином, результати дослідження підтверджують якість

74

обраних компонентів запропонованого середовища.

Друга серія дослідів. Брались середня концентрація компонентів,

що входять в середовище, в межах зазначених інтервалів, а саме (мас.%):

агар-агар – 1,5; сухий ферментативний пептон – 10,0; Nutrilon – 2,0; вода

– решта. Схема проведення досліджень аналогічна першій серії.

Результати досліджень другої серії суттєво не відрізнялись від

результатів першої серії.

Таблиця 4.1

Результати культивування штамів H. pylori на контрольному та

дослідному середовищах

Штами H.

pylori

Кількість

посівів

(n)

Термін виявлення H. pylori (M±m,

год)

p

контроль дослідне середовище

H. pylori № 2 30 72±12 72±7 >0,05

H. pylori № 3 35 72±8 72±5 >0,05

H. pylori № 4 35 72±3 48±6 <0,05

H. pylori № 8 35 96±10 72±5 <0,05

Третя серія дослідів. Бралась максимальна концентрація

компонентів, що входять в середовище, в межах зазначених інтервалів, а

саме (мас.%): агар-агар – 2,0; сухий ферментативний пептон – 12,0;

Nutrilon – 3,0; вода – решта. Схема проведення досліджень третьої серії

аналогічна першій та другій серії.

Результати досліджень третьої серії показали, що ріст колоній H.

pylori через 48 годин відбувався більш інтенсивно, ніж в першій та другій

серії, але максимальний ріст колоній H. pylori спостерігався після третьої

доби. На контрольному середовищі максимальний ріст колоній H. pylori

спостерігався на 3-7 добу.

Як видно з результатів табл. 4.1, запропоноване середовище не

поступається контрольному щодо швидкості росту збудника

75

хелікобактеріозу, а інколи і переважає його, а концентрація інгредієнтів

заявлених до складу середовища в мінімальних і максимальних

концентраціях на швидкість ростових якостей суттєво не впливає.

Ефективність запропонованого поживного середовища полягає у тому, що до

його складу не входить кров чи сироватка, що дозволяє уникнути недоліків

при їх застосуванні. Одночасно з цим не зменшується вихід – "урожайність"

хелікобактерів на поживному середовищі, що забезпечує більш високу

точність діагностики.

Отже, з проведених досліджень можна зробити висновок, що

запропоноване поживне середовище не подовжує термін дослідження, просте

за способом приготування, не потребує спеціальних умов зберігання, не

поступається іншим подібним середовищам, всі компоненти заявлених його

складових загально доступні та продаються в Україні, що є досить вагомим

фактором для виробничих, науково-дослідних лабораторій медичного

профілю, а головне – позбавлене вищеперерахованих недоліків, які мають

середовища з кров`ю або сироваткою.

Наступним етапом нашого дослідження було проведення

технологічного контролю якості запропонованого поживного середовища.

Для цього в лабораторних умовах відпрацьовувалась технологічна схема

виробництва середовища, яка була нами запропонована, а саме: відібрати

сухі інгредієнти у відповідних співвідношеннях, старанно їх змішати та

розфасувати в певних дозах (200г).

Після розробки макета-схеми технологічного процесу виготовлення

нашого поживного середовища в лабораторних умовах, ми приступили до

експериментального її впровадження в цеху медпрепаратів (№105)

Вінницького м’ясокомбінату, де було відповідне обладнання. Виготовлене

поживне середовище повинно зберігатися в асептичних умовах та підлягати

мікробіологічному контролю якості. Якщо середовище відповідає всім

76

вимогам, воно розфасовується у флакони темного кольору по 100 або 200 г.

Готові флакони парафінують, наклеюють етикетку та запаковують.

Заключний мікробіологічний контроль якості запропонованого

середовища. Запропонована нами схема контролю якості нашого

середовища передбачає: органолептичну оцінку, приготування середовища

до практичного застосування, визначення стандарту чутливості і швидкості

росту мікроорганізмів.

Органолептична оцінка. В нормі середовище представляє собою суху

порошкоподібну суміш біло-жовтого кольору, що розфасована по 100 або

200 г у флакони темного кольору. Флакони герметично закорковані, корки

залиті парафіном. Зберігається в сухому прохолодному місці. Зниження

якості препарату супроводжується утворенням щільних грудочок та зміною

кольору порошку.

Приготування середовища до практичного використання в лабораторії.

Для контролю якості середовища від кожної серії сухого поживного

середовища відбирали не менше трьох проб по 10 грам, з яких виготовляли

робоче середовище наступним чином.

Десять грам сухого середовища насипили у колбу, додавали

дистильовану воду з рН 7,2 до 100 мл, кип’ятили до повного розплавлення

агар-агару, приблизно 3-5 хвилин, фільтрували через ватно-марлевий фільтр,

розливали у флакони, які стерилізували автоклавуванням при температурі

120 ± 1°С протягом 15 хвилин, охолоджували до температури 45° при

кімнатній температурі, розливали, зберігаючи асептичні умови в

стерильні чашки Петрі по 20 мл. Середовище, як правило, затвердіває на

протязі 7-10 хвилин, після чого на ньому проводиться посів. Готове

середовище повинно мати жовтуватий колір та рН 7,2 ± 0,2.

Як правило, перші три чашки використовують для посіву культур, а

інші являються контролем стерильності.

77

Визначення стандарту чутливості висіваємості культур. Для того, щоб

перевірити якість росту мікроорганізмів на запропонованому середовищі

нами використовувались штами культур H. pylori. Бралась оптимальна

посівна концентрація культур мікроорганізмів, тобто 1 млн. мікробних тіл /

мл, проводився посів шляхом нанесення на поверхню дослідного середовища

0,1 мл суспензії, яку рівномірно і ретельно розподіляли по поверхні

бактеріологічним шпателем.

Після посіву на чашки Петрі, для інкубації їх поміщали в термостат при

температурі 37°С на 10 діб, через 2 дні і до закінчення терміну дослідження,

кожен день підраховували кількість отриманих колоній на дослідному

середовищі. Від даної кількості нанесених мікробних тіл повинно бути

отримано 70-90% колоній.

Якщо процентне співвідношення менше за норму після 10 діб інкубації,

то проводять повторне дослідження, але кількість проб збільшують в три

рази. В разі отримання меншу кількість колоній ніж 70% , середовище в

реалізацію не допускають.

Визначення швидкості зростання H. рylori. На приготовлене робоче

поживне середовище висівають 0,1 мл суспензії бактерій. Після посіву на

чашки Петрі, для інкубації їх поміщають в термостат при температурі 37°С

на 10 діб. Ріст бактерій повинен зявитися на 3-10 день на всіх чашках із

засіяним матеріалом. Після 10 днів інкубації ріст бактерій H. pylori

зявляється дуже рідко. Якщо ж таке трапляється, то в такому випадку

необхідно повторити дослідження, але при цьому кількість досліджень

збільшують втричі. Якщо після другого посіву ріст H. pylori з'явився на 10-15

добу, то таке середовище вводити в реалізацію забороняється.

Диференційні властивості селективного середовища. Приготоване по

приведеному вище рецепту, селективне середовище дозволяє абсолютно

чітко і легко проводити макроскопічну диференціацію колоній H. pylori, що

виростають на ньому при посіві. Проведені нами дослідження показали, що

78

вже через 48 годин після посіву можна проводити візуальну діагностику

патогенних хелікобактерів, що має велике практичне значення.

Підводячи підсумок вище викладеному, можна зробити висновок, що

запропоноване нами елективне середовище для мікробіологічної діагностики

H. pylori має перевагу над існуючими до цього середовищами для виявлення

даних мікроорганізмів, які в якості ростових добавок містили кров або

сироватку. Перевага запропонованого елективного середовища полягає в

доступності інгредієнтів, простій методиці його приготування, економії

реактивів та середовища, економії робочого часу, відсутності недоліків

середовищ з кров`ю чи сироваткою та простішому виявленні хелікобактерів.

Вивчення активності росту штамів H. pylori на запропонованому

середовищі. Щоб вивчити активність росту і розвитку мікроорганізмів на

запропонованому середовищі ми використовували клінічні штами H. pylori.

Дослідження проводилося наступним чином. У стерильну чашку Петрі,

дотримуючись асептичних умов, наливали 20 мл робочого запропонованого

середовища, яке було приготовано вище зазначеним способом. Для контролю

брали іншу чашку Петрі, в яку наливали таку ж кількість контрольного

середовища. В обидва середовища висівали тижневу культуру H. рylori, що

виросла на середовищі Мюллера-Хінтона. Доза посівного матеріалу завжди

складала 0,1 мл. Дослідження проводились при температурі 37°С. Через 48

годин робили окремі підрахунки кількості колоній на дослідному і

контрольному середовищах. За такою методикою ставили досліди з всіма

штамами збудника хелікобактеріозу.

Проведений підрахунок колоній був використаний для обчислення

індексу чутливості запропонованого середовища по відношенню до H. рylori.

Для його підрахунку брались результати кількості колоній, що зросли на

запропонованому та контрольному середовищах. Індекс чутливості

обчислювався процентним співвідношенням кількості колоній, що виросли

79

на дослідному середовищі по відношенню до кількості колоній, що зросли на

контрольному середовищі (рис.4.1).

Індекс чутливості являв собою середню величину від трикратних

обчислень виражену у процентному співвідношенні в залежності від

чутливості кожного штаму H. pylori. Щоб запобігти помилці при його

обчисленні, досліди з кожним штамом хелікобактерів необхідно було

проводити тричі.

Рис. 4.1. Індикація чутливості запропонованого середовища в

залежності від штаму H. pylori

Результати обчислень середнього індексу чутливості запропонованого

середовища у відношенні хелікобактерів представлені в табл. 4.2. Індекс

чутливості запропонованого середовища по відношенню до різних штамів

збудника хелікобактеріозу коливався в межах від 93,4% до 96,3%. Середній

індекс для всіх трьох штамів склав 94,95%.

Вірогідної різниці між контрольним і дослідним середовищами

стосовно індексу чутливості не було виявлено. Таким чином, на

запропонованому середовищі виявляли в середньому 94,95%

80

бактеріальних клітин, що можна вважати цілком гарним результатом

культивування хелікобактерів.

Таблиця 4.2

Індекс чутливості запропонованого середовища у відношенні

хелікобактерів

Штами H. pylori

Середня кількість колоній H. pylori (M m)

р контрольне

середовище

дослідне

середовище

штам H. pylori №5,

(n=3) 801,2 760,93

>0,05

штам H. pylori №11,

(n=3) 812,1 761,1

штам H. pylori №12,

(n=3) 811,03 780,89

штам H. pylori №13,

(n=3) 821,6 781,0

Отже, дане поживне середовище пропонується для використовування в

практичній медицині лікарями та працівниками лабораторій, воно не

сповільнює отримання результатів бактеріологічних досліджень. Крім того,

на відміну від інших середовищ, воно безпечне, так як не містить кров або її

компоненти, тобто відсутня можливість заразитися захворюваннями, що

передаються через кров, що актуально в наш час, та не викликає екологічного

забруднення зовнішнього середовища.

81

4.2. Культуральні, морфологічні, токсигенні властивості штамів

H. pylori, вирощених на запропонованому поживному середовищі

В наших дослідженнях ми використовували штами H. pylori, вирощені

на запропонованому середовищі. На стерильні чашки Петрі з дослідним

середовищем висівали бак масу культур хелікобактерів. Чашки для

попередження висихання герметично заклеювали клейкою стрічкою.

Проводили інкубацію в термостаті на протязі 10 діб, контролювали результат

щодня. Коли візуально відмічався початок росту культури фіксували

результат та робили два мазки, один з яких забарвлювали за Романовським-

Гімзою, другий за Грамом. Дослідженнями було встановлено, що на

поживному середовищі візуальний ріст штамів хелікобактерів починався з 2-

3-ї доби, максимальний ріст культур фіксували на 4 5 добу.

Бактерії H. рylori на запропонованому поживному середовищі виявили

наступні характерні культуральні властивості, а саме: колонії бактерій

виростали мілкі, блискучі, напівпрозорі, округлі, з чітким контуром, мали

вигляд «крапель роси».

Під час проведення мікроскопічного дослідження мазків отриманих

штамів, що фарбувались за Грамом, було встановлено, що всі штами

хелікобактерів, що виросли на даному середовищі, в полі зору мали вигляд

грамнегативних вигнутих паличок (рис.4.2 – 4.4).

82

Рис. 4.2. Морфологія H. pylori, вирощених на дослідному

середовищі через 48 год. Фарбування за методом Грама. Збільшення 900х

Рис. 4.3. Морфологія H. pylori, отриманих на дослідному середовищі

через 48 год. Фарбування за методом Грама. Збільшення 900х

83

Рис. 4.4. Морфологія H. pylori, отриманих на дослідному

середовищі через 72 год. Фарбування за методом Грама. Збільшення

1000х

В подальшому ми приступили до вивчення токсигенних властивостей

H. pylori, вирощених на запропонованому поживному середовищі. Для цього

ми провели методом ПЛР визначення генів, відповідальних за продукцію

токсинів CagA та VacA штамів H. pylori до посіву на запропоноване поживне

середовище, тобто з біоптатів, та після отримання росту, тобто з культури.

Генотипування H. pylori у досліджуваних осіб методом ПЛР

проводилося з праймерами, специфічними до ділянок генів, відповідальних

за синтез токсинів CagA та VacA. У дослідженні використовували набори

ХЕЛІКОПОЛ СА та ХЕЛІКОПОЛ VА («Литех», Росія).

У дослідження увійшли штами H. pylori, отримані від хворих на

хронічний гастрит та виразкову хворобу шлунка або дванадцятипалої кишки,

обстежені попередньо на наявність збудника за допомогою швидкого

уреазного тесту.

84

Питома вага всіх штамів із наявністю генів токсичності (tox+)

становить 67,4% від усіх досліджених штамів H. pylori. Спектр генів

токсичності H. pylori розподілився наступним чином: CagA+ визначено у 25

осіб (80,6 %), VacA+ визначено у 23 осіб (74,2 %). Отже, серед штамів H.

pylori виявляється генетична гетерогенність.

Результати дослідження представлені в табл. 4.3.

Таблиця 4.3

Кількісна характеристика токсигенних штамів H. pylori, виділених

від пацієнтів

Спосіб

ідентифікації

Токсигенні штами H. pylori Нетоксигенні

штами H.

pylori

CagA+

VacA+

CagA+

VacA-

CagA-

VacA+

Усього CagA- VacA-

З біортатів 17 8 6 31 15

З колоній на

поживному

середовищі

16 8 5 29 14

р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Дослідження показали, що при рості на запропонованому середовищі

токсигенність штамів H. pylori (токсини VacA та CagA) достовірно не

змінилась стосовно як кожного окремого штаму, так і загальної кількості

токсигенних і нетоксигенних хелікобактерів (р > 0,05).

Новизна запропонованого поживного середовища закріплена патентом

України на корисну модель UA88360U «Поживне середовище для

виявлення Нelicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях».

85

4.3. Порівняння запропонованого поживного середовища для

виявлення Helicobacter pylori з існуючими

У зв'язку з вибагливим характером хелікобактера, культивування

його in vitro є складним. Раніше були проведені дослідження для оцінки

росту H. pylori на різних твердих середовищах з додаванням крові [173,

240]. Також повідомлялося про вирощування мікроорганізму в малих і

великих обсягах рідких середовищ, що містять сироватку [241, 242].

Метою даного дослідження було оцінити здатність різних поживних

середовищ, в тому числі розробленого запропонованого середовища,

підтримувати ріст H. pylori.

Штами H. pylori були ізольовані з шлункових біоптатів, взятих у

пацієнтів з хронічним гастритом і виразковою хворобою дванадцятипалої

кишки відповідно, які проходили гастроскопію у Вінницькій центральній

районній клінічній лікарні. Біопсійні зразки отримували від пацієнтів до

призначення антихелікобактерної терапії. Всі середовища розчинялися в

дистильованій воді відповідно до інструкцій виробників і стерилізувалися

при 121 ° C при тиску 1,1 кгс/см2 протягом 15 хв. Кінська кров, сироватки

та інші стерильні компоненти були додані в стерильні середовища, коли їх

температура досягала 45° C. Біопсійні зразки були доставлені в

лабораторію в 5 мл тіогліколевого середовища і оброблялися негайно. Їх

засівали на чашки Петрі зі збагаченим середовищем: основа серцево-

мозкового агару (СМА) (bioMerieux, Франція), 5% дефібринованої кінської

крові (КК) (HiMedia, Індія) і селективна добавка для H. pylori (HiMedia,

Індія). Засіяні збагачені середовища інкубували при 37 ° С в

мікроаеробних умовах зі співвідношенням 6% O2, 10% CO2 і 84% N2,

атмосфера була створена з використанням одноразових газогенераторних

пакетів GENbox microaer (bioMerieux, Франція) в анаеростаті GENbox Jar

(bioMerieux, Франція). При отриманні колоній проводилася бактеріоскопія

86

препарату (фарбування за Грамом). Для ідентифікації H. pylori

використовували біохімічні тести: оксидазний - каталазний - уреазний

(bioMerieux, Франція).

Рідкі середовища, що використовувались в дослідженнях, мали

наступні основи: Колумбійський бульйон (КБ) (bioMerieux, Франція),

Brucella-бульйон (ББ) (bioMerieux, Франція), бульйон Мюллер-Хінтона

(БМХ) (bioMerieux, Франція) та запропоноване середовище (ЗС).

До цих основ додавали 5% кінську сироватку (КС), 5% ембріональну

телячу сироватку (ЕТС), 5% дефібриновану кінську кров (КК), 1%

дріжджовий екстракт (ДЕ), 2% глутамін (ГЛ).

Мікробна суспензія була підготовлена шляхом збору 3-денних

культур, що виросли на кров'яному агарі, в стерильний фізіологічний

розчин і регулювання оптичної щільності при 620 нм до 0,033 з

використанням спектрофотометра «GRANUM 722», ця суспензія

відповідала концентрації інокулята близько 102 колонієутворюючих

одиниць (КУО) / мл. Таким чином, бактерії збирали в стерильний

фосфатно-сольовий буфер з рН = 7,3, готувались розведення цієї

бактеріальної суспензії і виконані посіви (100 мкл) на кров'яний агар.

Засіяні чашки з кров'яним агаром інкубували при 37 ° С протягом 72 год., а

потім підраховували колонії. Передбачалося, що кожна колонія виникла з

однієї клітини. Бульйони (9 мл) інокулювали 1 мл цієї суспензії і

переносили в колби об'ємом 50 мл. Колби інкубували з вільно прикритим

корком при 37 ° С протягом 72 год. в мікроаеробних умовах. Після

інкубації чистота культури визначалася з використанням мікроскопії за

Грамом та визначення активності каталази, оксидази і уреази, як зазначено

вище. Крім того, зразки (10 мкл) були видалені з культур, посіяні на

кров'яний агар і інкубувались при 37 ° C протягом 24 год. в аеробних

умовах, щоб виключити забруднення аеробними мікроорганізмами.

87

Серійні розведення бульйону культури були зроблені в асептичних

умовах. Зразки (0,1 мл) кожного розведення висівали у двох примірниках

на кров'яний агар і колонії підраховувалися після 72 год. інкубації при

температурі 37 ° C у мікроаеробних умовах.

Твердими основами поживних середовищ, до яких були додані

добавки, були: Колумбійський агар (КА) (bioMerieux, Франція), Brucella-

агар (БА) (bioMerieux, Франція), агар Мюллера-Хінтона (АМХ)

(bioMerieux, Франція) та агаризоване запропоноване середовище (ЗС).

Суспензію мікроорганізмів отримували, як описано для рідких

середовищ, і подвійні набори середовищ були засіяні бактеріальною

суспензією (0,1 мл). Засіяні середовища інкубували при 37° C протягом 72

год. в мікроаеробних умовах. Після інкубації додавали 1 мл стерильного

фізіологічного розчину на кожну чашку і збирали колонії, які виросли.

Серійні розведення цієї бактеріальної суспензії були підготовлені і

визначали КУО, як зазначено вище.

Результати росту на твердих середовищах. При додаванні крові до

основ поживних середовищ, всі штами дали 106-10

7 КУО / мл після 72 год.

інкубації (рис. 4.5). Найкращий ріст штамів був досягнутий на

запропонованому середовищі та агарі Мюллера-Хінтона, що містили кров.

Тверді середовища без крові з додаванням КС, ЕТС, КК та ГЛ

підтримували ріст в малому ступені, і це було недостатньо, щоб бути

врахованним (менше 20 КУО на чашку, дані не представлені).

88

Рис. 4.5. Показники (lg КУО/мл) H. pylori на середовищах з 5%

кінської крові; БА - Brucella-агар, КА - Колумбійський агар, АМХ - агар

Мюллера-Хінтона, ЗС - запропоноване середовище

Результати росту в рідких середовищах. Всі досліджені основи

рідких середовищ, в тому числі бруцела-бульйон, підтримували ріст

штамів H. pylori (рис. 4.6). Кращими основами для росту обох штамів в

рідкому середовищі були БМХ та ЗС, а ББ дав самі незначні результати.

Оптимальний ріст штамів був досягнутий, коли в якості окремої добавки

до основі бульйонів була додана тільки кров (рис. 4.7) або кров у

комбінації з іншими добавками (табл. 4.4). Середовища БMХ та

запропоноване з кров'ю були кращими рідкими середовищами для росту

штамів. Ріст кожного штаму був оптимальним у всіх основах з

додаванням крові і не залежав від інших добавок. Таким чином,

оптимальний ріст штамів H. pylori не був досягнутий в середовищах без

крові (табл. 4.4).

89

Рис. 4.6. Показники (lg КУО/мл) H. pylori в середовищах без

добавок; ББ - Brucella-бульйон, КБ - Колумбійський бульйон, БМХ -

бульйон Мюллера-Хінтона, ЗС - запропоноване середовище

Дослідження росту Helicobacter pylori у середовищах з добавками.

Загалом, додавання однієї добавки, крім крові, до основ бульйонів

покращувало ріст штамів H. pylori в порівнянні з основами без добавок

(рис. 4.6 і 4.7), але була різниця в рості штамів при різних добавках. Як

показано в табл. 4.4, при додаванні другої добавки до бульйону, в якому

міститься КС, збільшився ріст штамів. Крім того, при додаванні добавок

до основи бульйону, що містить ЕТС, збільшувався зріст. Тим не менш,

ріст штамів змінювався, коли інша добавка була додана до основи

бульйону, що вже містив дві добавки, однією з яких була КС або ЕТС. У

деяких випадках відбулося поліпшення росту, в той час як ріст інших був

знижений. Крім того, протягом усього експерименту було виявлено, що в

90

загальному добавка КС мала перевагу в підтримці росту штамів H. pylori,

ніж добавка ЕТС (рис. 4.7 і табл. 4.4).

БМХ і ЗС, що містять КС і, крім того ЕД або КС, дали оптимальний

ріст штамів H. pylori в середовищах без крові.

Чашки, які інкубували в аеробних умовах росту не дали .

Рис. 4.7. Показники (lg КУО / мл) H. pylori в рідких середовищах з

ростовими добавками

Примітка. ББ - Brucella-бульйон, КБ - Колумбійський бульйон, БМХ –

бульйон Мюллера-Хінтона, ЗС - запропоноване середовище, КК - 5% кінська

кров, КС - 5% кінська сироватка, ЕТС - 5% ембріональна теляча сироватка,

ГЛ - 2% глутамін, ЕД - 2% екстракт дріжджів

91

Таблиця 4.4

Залежність концентрації H. pylori від складу рідкого живильного

середовища ( lg КУО / мл)

Компоненти Контроль Дослід

ББ КБ БМХ ЗС

кінська кров + кінська сироватка 7,3 7,4 7,7 7,7

кінська кров + ембріональна теляча сироватка 7,1 7,5 7,9 8,0

кінська кров + глутамін 6,9 7,6 7,8 7,7

кінська кров + екстракт дріжджів 7,2 7,5 7,7 7,8

кінська сироватка + глутамін 5,8 6,5 6,8 6,8

ембріональна теляча сироватка + глутамін 5,9 6,4 6,5 6,5

ембріональна теляча сироватка + екстракт дріжджів 5,7 6,7 6,6 6,6

кінська сироватка + глутамін +

+ ембріональна теляча сироватка

5,4 6,1 6,2 6,2

кінська сироватка + глутамін +

+ екстракт дріжджів

5,5 6,1 6,5 6,4

ембріональна теляча сироватка + глутамін +

+ екстракт дріжджів

5,5 6,2 6,5 6,4

Без добавок 5,4 5,9 6,2 6,2

Примітка. Поживні бульони: ББ - Brucella-бульйон, КБ - Колумбійський

бульйон, БМХ - бульйон Мюллера-Хінтона, ЗС - запропоноване середовище

Все вище викладене дозволило нам дійти наступних висновків.

Запропоноване поживне середовище просте за способом його приготування,

не подовжує термін дослідження, зручне при виготовленні та зберіганні, не

змінює антигенну будову вирощених хелікобактерів. Всі компоненти

заявлених складових продаються в Україні, що є досить зручним для

виробничих, науково-дослідних лабораторій медичного профілю. В основах

всіх чотирьох рідких поживних середовищ без ростових добавок

92

відзначався ріст H. pylori. Однак бруцела-бульйон (ББ) дав найбідніший

ріст H. pylori в цьому дослідженні. Протягом усього дослідження ББ з

добавками давав гірший ріст, ніж інші середовища. Бульйони, які містять

тільки кров або кров з іншою добавкою давали оптимальний ріст штамів

H. pylori. Тим не менш, в той час, коли рідкі основи без добавок

підтримували ріст, тверді основи середовищ, крім запропонованого

середовища, аналогічного складу, росту не дали. Таким чином, рідкі

середовища більш сприяли зростанню штамів. Різницю виявили в рості

штамів при використанні різних стимуляторів. Так, найкращий ріст

бактерій отримали при додаванні кінської крові. Дещо гірші ростові

характеристики мали кінська сироватка та екстракт дріжджів. Найнижчий

рівень ростових властивостей демонстрували екстракт телячої сироватки

та глутамін. Доведена недоцільність використання більше двох ростових

добавок, що досліджувались, для покращення росту хелікобактерів.

Наведені в цьому розділі результати досліджень висвітлені в наступних

наукових виданнях:

1. Пат. UA 88360 U Україна, МПК С 12 N 1/02, C 12 N 1/20. Поживне

середовище для виявлення Нelicobacter pylori при шлунково-кишкових

захворюваннях / Власенко В. В.; винахідники В. В. Власенко, І. Г. Власенко,

А. О. Новицький; заявл. 21.10.13 ; опубл. 11.03.14, Бюл. № 5. (Здобувач

виконав підбір пацієнтів, збір матеріалу, брав участь у розробці композиції

середовища, апробацію запропонованого середовища, підготував матеріали

для подачі заявки на корисну модель).

2. Vlasenko V. Evaluation of blood-free media for Нelicobacter pylori

growth / Vlasenko V., Vlasenko I., Novytskyi A. // 5th Congress of European

microbiologists FEMS 2013, Leipzig, Germany, July 21-25, 2013. – abstract №

382. (Здобувач провів ендоскопічне обстеження пацієнтів з біопсією,

культивування H. pylori на середовищах, що не містять крові, підготував

матеріали до подачі в редакцію).

93

РОЗДІЛ 5

РОЗРОБКА СПОСОБУ, ДІАГНОСТИЧНОГО РЕАГЕНТУ ТА

АНТИБАКТЕРІАЛЬНОГО ЗАСОБУ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ І ЕЛІМІНАЦІЇ

HELICOBACTER PYLORI ПРИ ШЛУНКОВО-КИШКОВИХ

ЗАХВОРЮВАННЯХ

За даними літератури частка виявлення H. pylori при хронічному

гастриті, виразковій хворобі шлунка та дванадцятипалої кишки сягає 70-95 %

[243]. Відомо декілька методів виявлення H. pylori. Ці методи поділяються на

прямі, засновані на безпосередньому виявленні збудника захворювань, та

непрямі – визначення продуктів його метаболізму.

5.1. Розробка комбінації інгредієнтів для запропонованого реагенту

Як найближчий аналог запропонованого реагенту можна навести

біохімічний швидкий уреазний тест, що заснований на визначенні активності

уреази H. pylori в біоптаті слизової оболонки шлунка шляхом занурення його

в рідке або гелеподібне середовище, що містить сечовину, індикатор та

буфер. При наявності в біопсійному матеріалі уреази, сечовина реагенту

гідролізується до аміаку, який залужнює середовище, що змінює колір

індикатору [161]. До переваг цього уреазного тесту необхідно віднести

простоту виконання та швидкість. Разом з тим цей тест через різну

ферментативну активність бактерій та різний ступінь обсіменіння тканин

призводить до отримання хибно негативних результатів, що знижує

достовірність діагнозу. Найближчим аналогом запропонованого способу є

ендоскопічна рН-метрія, що проводиться з метою оцінки секреторної функції

шлунка. Однак при її поєднанні з виконанням швидкого уреазного тесту

значно збільшується тривалість ендоскопічного обстеження, а коштовне

94

обладнання і постійна потреба у заміні рН-зондів, часто не дозволяє

використовувати даний метод у сучасних умовах.

Задачею даного дослідження було підвищити чутливість даного швидкого

уреазного тесту для виявлення H. pylori, скоротити час на ендоскопічне

обстеження. Суть даного способу полягає в тому, що при приготуванні

середовища для постановки швидкого уреазного тесту замість індикатору

фенолового червоного, який має рН переходу забарвлення 6,6 – 8,0,

використовують суміш індикаторів: диметиловий оранжевий, метиловий

червоний та бромтимоловий синій. Цей запропонований реагент дістав назву

«ВНВ». рН переходу забарвлення препарату ВНВ наведено в табл. 5.1.

Таблиця 5.1

Інтервали зміни кольору індикаторів, що застосовувались у

дослідженні

Індикатор Інтервал рН Колір

Кислої форми Лужної форми

Диметиловий оранжевий 3,1 – 4,4 Червоний Жовтий

Метиловий червоний 4,4 – 6,2 Червоний Жовтий

Бромтимоловий синій 6,2 – 7,6 Жовтий Синій

Це дає змогу реєструвати рН біопсійного шматочка у широких межах –

від рН менше 1,5 до 7,0 і більше (табл. 5.2).

Таблиця 5.2

Зміна кольору препарату ВНВ в залежності від його рН

Інтервал рН Колір реагенту

<1,5 рожевий

1,5 – 2,0 червоний

2,0 – 4,0 оранжевий

4,0 – 6,0 жовтий

6,0 – 7,0 жовто-зелений

7,0 > зелений

95

Метод дозволяє поєднувати рН–метрію та визначати наявність H. pylori

у шлунку, а також оцінювати здатність слизової антрального відділу шлунка

залужнювати шлунковий вміст, що потрапляє у дванадцятипалу кишку

(ДПК), недостатність цієї функції, що є предиктором утворення виразки

цибулини ДПК [244], фіксується зміною кольору реагенту (табл. 5.2) у перші

2 – 5 секунд спостереження.

Спільною ознакою з аналогом швидким уреазним тестом є наявність в

складі сечовини і індикатора, який змінює колір при гідролізі сечовини.

Спільною ознакою з іншим аналогом внутрішньо шлунковою pH-

метрією можливість реєструвати рівень pH слизової оболонки шлунка.

Відмінною ознакою від аналога швидкого уреазного тесту є наявність в

складі ще двох індикаторів, що дозволяє реєструвати не тільки підвищення

pH, а й зниження pH в перші секунди спостереження, внаслідок нищого від

вихідного рівня значення pH біопсійного шматочка.

Відмінною ознакою від іншого аналогу внутрішлункової pH метрії є

спосіб виконання дослідження, а саме взяття біопсії, а не використання pH

зонду.

Застосування препарату ВНВ дозволяє одночасно визначати

секреторну функцію шлунка, на що вказує рівень рН у цих відділах за

визначеною шкалою переходу забарвлення, і з більшою чутливістю

визначати активність уреази хелікобактерів, через наявність у діагностикумі

сечовини.

Продовживши пошук найкращої комбінації індикаторів для

запропонованої тест-системи, ми зупинились на такому співвідношенні

реагентів: 4 г сечовини, 0,04 г бромтимолового синього, 0,03 г диметилового

оранжевого і 0,01 г метилового червоного, доки не утвориться однорідна за

кольором суміш. Одержану суміш перетирають у ступці і розважують по 0,02

г у мікротитрувальні лунки або скляні флакони місткістю 10-15 мл,

наприклад, у флакони з-під антибіотиків, закривають гумовими корками і

96

завальцьовують алюмінієвими ковпачками. Наші дослідження

ефективності реагенту ВНВ, що зберігався у такому вигляді напротязі

трьох років, показали, що достовірного зниження його активності за цей

період часу не відбулось. Таким чином, у такому вигляді препарат ВНВ

може зберігатися три роки. Для приготування середовища флакон

відкривають, додають 0,5-1,0 мл фізіологічного розчину і розчиняють

суміш. Таким чином отримано наступні робочі концентрації індикаторів:

диметиловий оранжевий – 0,015 – 0,03%, метиловий червоний – 0,005 –

0,01%, бромтимоловий синій – 0,02 – 0,04%.

Спосіб виконують таким чином. Під час ендоскопії беруть біоптати

слизової оболонки шлунку (тіло та антральний відділ). Вміщують їх у

флакони із препаратом ВНВ, які містять сечовину (2-4 мас %), суміш

індикаторів і фізіологічний розчин (решта). Починають відлік часу,

спостерігаючи за зміною кольору середовища. Зміна кольору реагенту

ВНВ відображає рН слизової даних відділів, а зміна забарвлення на

зелене свідчить про уреазну активність біоптату через наявність в ньому

H. pylori (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Зміна кольору препарату ВНВ в залежності від рН

біопсійного шматочка. А (оранжевий) – рН 2,0-4,0; Б (рожевий) – рН

<1,5; В (жовтий) – рН 4,0-6,0; Г (зелений) – рН >7,0 (H. pylori -

позитивний)

97

5.2. Результати обстеження хворих за допомогою реагенту ВНВ

Порівняння результатів визначення рН шлункової слизової з

даними внутрішлункової рН-метрії. Щоб довести можливість досягнення

позитивного ефекту було досліджено біопсійні зразки зі шлунків 107 хворих

на хронічний гастрит та виразкову хворобу шлунка та дванадцятипалої

кишки.

Результати інтерпретували наступним чином. На рівень рН ділянки,

звідки взято біопсійний шматочок, вказував колір реагенту, який виник

одразу після внесення в нього цього біопсійного зразка. На присутність H.

pylori в тому самому біопійному шматочку вказувала зміна кольору

середовища, що характеризувало зсув рН в лужний бік. Ця зміна кольору

відбувалась на протязі перших 5-40 хвилин. Спостереження за реагентом

протягом 24 годин не виявило подальшої зміни кольору.

Таким чином 117 хворих з диспепсичними скаргами до проведення

гастроскопії пройшли дихальний уреазний тест і швидкий уреазний тест в

якості контролю. Ми вважали хворих інфікованими хелікобактерами, коли

результати і дихального уреазного тесту, і швидкого уреазного тесту були

позитивними. Коли результати цих двох контрольних тестів були

негативними, хворі вважались такими, що не інфіковані H. pylori. Якщо

результати цих тестів відрізнялись, хворі вважались сумнівними щодо

інфікування і були виключені з дослідження. Таким чином у дослідження

увійшли 107 чоловік, 72 з яких були хелікобактер-позитивні і 35 не були

інфікованими. Результати порівняння контролю і запропонованого тесту

наведені у табл. 5.3.

98

Таблиця 5.3

Результати дослідження препарату ВНВ та контролю

Наявність H. pylori Контроль Запропонований тест

Позитивний результат (H. pylori+) 72 71

(ІП – 68, ХП – 3)

Негативний результат (H. pylori-) 35 36

(ІН – 32, ХН - 4)

Примітка. ІП – істинно позитивні результати, ХП – хибно позитивні

результати, ІН – істинно негативні результати, ХН – хибно негативні

результати

Таким чином, по відношенню до контролю запропонований уреазний

тест дав 68 істинно позитивних результатів при 3 хибно позитивних, а також

32 істинно негативних результатів при 4 хибно негативних. Показники

чутливості специфічності, позитивного і негативного прогностичного

значення, точності та довірчі інтервали запропонованого уреазного тесту

наведені у табл. 5.4.

Таблиця 5.4

Характеристика реагенту ВНВ

Показник Специфічність Чутливість Позитивне

прогностичне

значення

Негативне

прогностичне

значення

Точність

Реагент

ВНВ

91,4

(±3,1)

94,4

(±4,1)

95,8

(±2,9)

88,9

(±6,2)

93,5

(±4,4)

Примітка. У дужках наведені 95% довірчі інтервали. Дані наведені у %

Наступним кроком дослідження було порівняння результатів

запропонованого тесту з результатами інтрагастральної рН-метрії. Для більш

зручної інтерпретації результатів, ми співставили рівні рН, отримані при

запропонованому тесті, з функціональними інтервалами (ФІ) рН-метрії (табл.

5.5).

99

Таблиця 5.5

Відповідність показників препарату ВНВ функціональним

інтервалам рН-метрії

Показники запропонованого тесту Показники рН-грами

Інтервал рН Колір реагенту ФІ (рН)

7,0 > зелений 0 (7,0-7,5)

6,0 – 7,0 жовто-зелений 1 (3,6-6,9)

4,0 – 6,0 жовтий

2,0 – 4,0 оранжевий 2 (2,3-3,5)

1,5 – 2,0 червоний 3 (1,6-2,2)

<1,5 рожевий 4 (1,3-1,5)

5 (0,9-1,2)

Співвідношення результатів запропонованого тесту і внутрішлункової

рН-метрії викладені у табл. 5.6.

Таблиця 5.6

Порівняння результатів визначення рН слизової шлунка за

допомогою препарату ВНВ і рН-метрії

Показники

запропонованого

тесту, інтервал

рН

ФІ рН-

грами (рН)

Результати

запропонованого

тесту

n=107 (%)

Результати

рН-метрії

n=107 (%)

Вірогідність

відмінностей

(р)

7,0 > 0 (7,0-7,5) 2 (1,9) 2 (1,9) > 0,05

6,0 – 7,0

4,0 – 6,0 1 (3,6-6,9)

3 (2,8) 4 (3,7) > 0,05

2,0 – 4,0 2 (2,3-3,5) 7 (6,5) 4 (3,7) > 0,05

1,5 – 2,0 3 (1,6-2,2) 25 (23,4) 23 (21,5) > 0,05

<1,5 4 (1,3-1,5)

5 (0,9-1,2)

70 (65,4) 74 (69,2) > 0,05

100

Аналіз отриманих даних показав, що для обстежуваних хворих в

переважній більшості (74 осіб, 69,2 %) характерна гіперацидність (зниження

рН до 1,3+0,23). Разом з тим у 23 (21,5 %) значення рН шлункового вмісту

відповідали нормоцидному стану (дані рН-метрії) (рис. 5.2).

Аналізуючи стан кислотоутворювальної функції, виявили, що

найчастіше підвищена кислотність спостерігалася у хворих на виразкову

хворобу ДПК (49,3±3,3) %, дещо рідше при ерозивному гастродуоденіті

(31,3±3,0) %, φ*=1,29, p>0,05 та вірогідно рідше при гастродуоденітах

(19,4±2,0) %, φ*=1,89, p<0,05.

При порівнянні результатів інрагастральної рН-метрії і

запропонованого методу виявлено позитивний кореляційний зв'язок помірної

сили (r = 0,65).

Рис. 5.2. Розподіл хворих на хронічну гастродуоденальну

патологію, залежно від стану кислотоутворювальної функції шлунка

101

5.3. Розробка сучасного антихелікобактерного засобу

Розроблений засіб належить до фармацевтичних композицій,

зокрема є препаратом з антимікробною активністю відносно Н. руlоrі,

придатним для застосування в лікуванні виразкової хвороби шлунку та

дванадцятипалої кишки.

Мікроорганізми H. pylori є найбільш поширеною та потенційно

курабельною причиною диспепсії та виразкової хвороби шлунку і ДПК, а

також асоційована з розвитком аденокарциноми та MALT-лімфоми шлунка.

Загальним стандартом в лікуванні пацієнтів з гастродуоденальною

патологією, асоційованою з цим патогеном, є потрійна терапія, що включає

ІПП в комплексі з комбінацією антимікробних засобів, - кларитроміцин та

амоксицилін, або кларитроміцин та метронідазол протягом 7-14 діб [245].

Широке застосування вказаних протимікробних комбінацій призвело до

суттєвого падіння їх клінічної ефективності (до рівня 70 % та нижче),

що пов'язується зі зростанням рівня резистентності до кларитроміцину

та метронідазолу.

При цьому загальною проблемою при застосуванні стандартних

засобів ерадикаційної терапії є побічні негативні ефекти, зумовлені

тривалістю терапевтичного курсу та широтою спектра антибактерійної

активності, зокрема руйнування кишкового мікробіоценозу з відповідними

наслідками для стану шлунково-кишкового тракту та імунної системи [245].

На сучасному етапі відомі препарати РЕРТІСА СОМВІРАСК®, що

містить 250 мг кларитроміцину та 500 мг тинідазолу та PYLOBACT

NEO®, що містить амоксициліну тригідрат (еквівалентно амоксициліну 1000

мг) та кларитроміцину 500 мг. Загальною причиною, що заважає

досягненню бажаного технічного результату при використанні вказаних

засобів є розповсюдження штамів H. pylori, резистентних до

кларитроміцину, а також розповсюджена практика вирішення цієї

102

проблеми шляхом підвищення тривалості терапевтичного курсу для

досягнення клінічного результату, що, відповідно, підвищує ступінь

дисбіотичних порушень.

Відомий протимікробний засіб для лікування гострих кишкових

інфекцій та дисбіотичних порушень "Гранули ПОЛІДЕКАНІТ" [246], що

містить наступні компоненти, мас. %:

нітазол 0,400-0,600

гліцирам 0,080-0,120

декаметоксин 0,008-0,012

пектин 8,000-12,000

кислота сорбінова 0,300-0,500

натрію хлорид 0,700-1,100

целюлоза мікрокристалічна 16,000-24,000

крохмаль 16,000-24,000

цукор решта.

Основною активною речовиною засобу є нітазол (2-ацетиламіно-5-

нітротіазол), який застосовується, головним чином, при лікуванні

протозойних інфекцій, а також проявляє активність відносно до

бактероїдів, клостридій, пептококів, пептострептококів, стрептококів,

стафілококів. Декаметоксин та кислота сорбінова використано як

консерванти. Гліцирам, що є поверхнево-активною речовиною, підвищує

невисоку розчинність нітазолу та, відповідно, його біодоступність, а також

покращує органолептичні властивості засобу. Крім того, в склад

препарату входять речовини рослинного походження з протективними

відносно до слизової оболонки кишкового тракту властивостями (пектин,

целюлоза мікрокристалічна, крохмаль).

Ознаками, спільними з ознаками рішення, яке заявляється, є лікарська

форма (водорозчинні гранули) та використання наступних компонентів:

103

нітазол, гліцирам, декаметоксин, пектин, кислота сорбінова, целюлоза

мікрокристалічна, крохмаль і цукор.

До причин, що заважають отриманню бажаного технічного результату

належить відсутність специфічної активності вказаної комбінації у

відношенні Н. pylori. Цей факт робить препарат досить віддаленим

аналогом, незважаючи на значну кількість спільних ознак.

Найближчим аналогом рішення, що заявляється, можна вважати

засіб для ерадикації H. pylori HELICOCIN®, що містить 750 мг

амоксициліну у вигляді амоксициліну тригідрату та 500 мг метронідазолу.

Ознаками, спільними з ознаками рішення, що заявляється є:

- використання комбінації антибіотиків, активних у відношенні H.

pylori;

- наявність в складі амоксициліну та препарату із групи нітроімідазолів.

До причин, що заважають отриманню бажаного технічного

результату належать згадані вище побічні ефекти, зумовлені широтою

спектра протимікробної дії даної комбінації, а також розповсюдження

штамів H. pylori, резистентних до метронідазолу.

В основу корисної моделі поставлено задачу розробити засіб для

лікування виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої кишки,

асоційованих з H. pylori, в якому за рахунок добору сінергічної комбінації

антимікробних препаратів та включення комплексу речовин, що виконують

проективні функції, мінімізувати негативні побічні ефекти засобу

ерадикаційної терапії.

Поставлена задача вирішується наступним складом водорозчинних

гранул, мас. %:

амоксицилін 25,0-30,0

нітазол 2,5-3,0

гліцирам 0,08-0,12

декаметоксин 0,008-0,012

104

пектин 8,000-12,000

кислота сорбінова 0,300-0,500

целюлоза мікрокристалічна 16,000-24,000

крохмаль 16,000-24,000

цукор решта.

Основними компонентами композиції, що забезпечують ерадикацію

H. pylori є комбінація амоксициліну та нітазолу, що виявляє сінергідну

дію та дозволяє суттєво знизити ефективну концентрацію кожного з цих

антимікробних засобів. Нижня межа діапазонів значень їх кількості

визначається мінімальною ефективною концентрацією, що може бути

досягнута в складі цієї композиції. Верхня межа визначається

максимальними рекомендованими добовими дозами кожного з препаратів,

що визначає діапазон значень, в межах якого можливо отримання

бажаного технічного результату. Переважний варіант здійснення

корисної моделі наведено в прикладі 1.

Включення в склад пектину, целюлози мікрокристалічної та крохмалю

забезпечують певний захист слизової оболонки та сприятиме зменшенню

негативних побічних ефектів з боку ШКТ.

Заявлені діапазони концентрацій цих речовин не мають

принципового впливу на специфічну активність засобу та визначено з

огляду на технологічні умови отримання гранульованої водорозчинної

лікарської форми.

Використання гранульованої водорозчинної форми має підвищувати

біодоступність та, відповідно ефективність препарату. В терапії

асоційованої з Н. pylori гастродуоденальної патології засіб застосовують

в комплексі з ІПП та іншими препаратами, які призначаються

гастроентерологом індивідуально, з урахуванням стану пацієнта.

Відомості, що підтверджують можливість здійснення корисної моделі

наведено в прикладах.

105

Приклад 1. Для отримання композиції, що заявляється, просіяні

порошки амоксициліну, нітазолу, гліцераму, пектину, целюлози

мікрокристалічної, крохмалю та цукру перемішують. Одержану суміш

зволожують водно-спиртовим розчином кислоти сорбінової та

декаметоксину і продовжують перемішування до одержання однорідної

маси. Вологу масу гранулюють, висушують та просіюють. Гранули

фракціями фасують по 3 г в одноразові пакети. Перед вживанням

препарату до вмісту пакета додають ¼ або ½ склянки кип'яченої теплої

води і перемішують до повного розчинення гранул.

У вказаному складі використано наступні стандартизовані речовини

при наведеному співвідношенні компонентів мас. %:

Амоксицилін (ФС - 42-24-5585) - 25,0

Нітазол (ФС - 42-24-5585) - 2,5

Гліцерам (ВФС 42-419-95) - 0,1

Декаметоксин (ВФС - 42-1874-88) - 0,01

Пектин (ОСТ 111-3-82) - 8,0

Кислота сорбінова (ТУ 6-14-358-76) - 0,4

Целюлоза мікрокристалічна (ВФС 42-2185-93) - 16,0

Крохмаль (ГОСТ 7697-82) - 16,0

Цукор (ДСТУ 22-94) - решта.

Приклад 2. Порівняльна оцінка ефективності протимікробної

комбінації, що входить до складу препарату, що заявляється, та

препарату HELICOCIN® проведено на дванадцяти клінічних штамах H.

pylori, виділених із аутопсійного матеріалу 38 пацієнтів з діагнозами

аденокарцинома і недиференційований рак шлунка II-III стадії. Індикацію

та ідентифікацію H. pylori в пухлинах та позапухлинних тканинах

проводили паралельно кількома методами (бактеріологічним,

цитологічним, біохімічним), які дозволяють безпосередньо виявити

мікроорганізми і продукти їх життєдіяльності (наявність уреазної

106

активності). Отримані штами за своїми морфологічними, культуральними

і біохімічним показникам відповідали всім параметрам, що

характеризують представників цього роду.

Визначення чутливості виділених культур досліджували в

мікроаерофільних умовах (концентрація кисню 7-10 %, СО 2 біля 14 %)

протягом 48 годин, при t=37 °C. Дослідження проводили за методом серійних

розведень в бульйоні Мюллера-Хінтона з 10 % кінської сироватки за

загальновідомою методикою [247]. Мінімальну інгібуючу концентрацію

(МІК) антихелікобактерних засобів визначено у перерахунку на амоксицилін.

Результати наведено в табл. 5.7 і 5.8.

Таблиця 5.7

Значення МІК запропонованого засобу і контролю відносно штамів

H. рylori у перерахунку на амоксицилін (мкг/мл)

Назва штаму H. pylori Антимікробний засіб 1 HELICOCIN®

H. pylori № 15 1 2

H. pylori № 18 1 2

H. pylori № 25 2 2

H. pylori № 26 1 1

H. pylori № 27 1 2

H. pylori № 28 1 2

H. pylori № 30 2 2

H. pylori № 33 1 2

H. pylori № 34 1 2

H. pylori № 35 2 4

H. pylori № 37 1 2

H. pylori № 40 1 2

107

Таблиця 5.8

Чутливість H. pylori до антимікробних засобів у перерахунку на

амоксицилін (мкг/мл)

Антимікробний

лікарський засіб

Кількість

штамів у

дослідах

Чутливість бактерій

(М±m, мкг/мл)

р

Антимікробний

засіб 1

12 1,25 ± 0,89

<0,05

HELICOCIN® 12 2,08 ± 0,93

Таким чином, через те, що до складу запатентованого нами препарату

входять антибактеріальні компоненти (амоксицилін та нітазол), що

володіють синергічною дією, знижено їхні концентрації в препараті. Це дасть

змогу знизити рівень побічних реакцій при проведенні ерадикаційної терапії

цим засобом.

Водночас незважаючи на знижену концентрацію основних інгредієнтів,

засіб володіє хорошою антихелікобактерною активністю, що переконливо

показали досліди: рівень МІК запропонованого засобу достовірно менший,

ніж у препарату-аналогу HELICOCIN®

Все вище викладене дозволило нам дійти наступних висновків.

Використання реагенту ВНВ дозволяє підвищити чутливість швидкого

уреазного тесту для виявлення H. pylori, скоротити час на ендоскопічне

обстеження та знизити вартість ресурсів для рН-метрії.

Запропонований засіб для ерадикаційної терапії хелікобактерної

інфекції виявив свою ефективність в дослідженнях in vitro.

Наведені в цьому розділі результати досліджень висвітлені в наступних

наукових виданнях:

1. Власенко І. Г. Антихелікобактерна активність озону при лікуванні

хворих на пептичну виразку дванадцятипалої кишки / І. Г. Власенко, А. О.

Новицький, Г. К. Палій, В. В. Власенко // Biomedical and biosocial

anthropology – 2012. - № 18. – С. 55–58. (Здобувач виконував усім пацієнтам

108

ендоскопічне обстеження з біопсією, виявив активність озону щодо

хелікобактерів, взяв участь у формулюванні положень та написанні тексту

статті).

2. Власенко І. Г. Діагностичне середовище для виявлення Нelicobacter

pylori при шлунково-кишкових захворюваннях / І. Г. Власенко, А. О.

Новицький, В. В. Власенко // Biomedical and biosocial anthropology– 2014. - №

22. – С. 60–64. (Здобувач виконав підбір пацієнтів, збір матеріалу, брав

участь у розробці композиції реагенту, апробації запропонованого реагенту,

підготував матеріали до друку).

3. Пат. UA 85459 U Україна, МПК С 12 N 1/02, C 12 N 1/20. Спосіб

виявлення Helicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях /

Власенко В. В.; винахідники В. В. Власенко, І. Г. Власенко, А. О. Новицький;

заявл. 09.04.13 ; опубл. 25.11.13, Бюл. № 22. (Здобувач виконав підбір

пацієнтів, збір матеріалу, брав участь у розробці композиції реагенту,

апробацію запропонованого реагенту, підготував матеріали для подачі

заявки на корисну модель).

4. Новицький А. О. Використання уреазного тесту для виявлення

хелікобактера у тварин та людини / А. О. Новицький, В. В. Власенко, І. Г.

Власенко // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції

«Молоді вчені у вирішенні проблем виробництва та переробки продукції

тваринництва». – м. Вінниця. – 2011. – С. 145-147. (Здобувач виконав

постановку дослідів, формулювання положень тез).

5. Власенко В. В. Місцеве виявлення Нelicobacter pylori на слизовій

оболонці шлунка / В. В. Власенко, А. О. Новицький // Наукові праці щорічної

10-ї науково-практичної конференції з міжнародною участю приуроченої до

Дня науки «Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології, гігієни та

туберкульозу». – м. Львів. – 2013. – Вип. 10. – С. 80–82. (Здобувач розробив

композицію для швидкого уреазного тесту, виконав підбір хворих і

постановку дослідів).

109

6. Власенко В. В. Визначення чутливості Helicobacter pylori до

кларитроміцину методом полімеразної ланцюгової реакції / В. В. Власенко, І.

Г. Власенко, А. О. Новицький // Сучасна гастроентерологія. – 2014. - № 2

(76).– С. 29–34. (Здобувач підготував вибірку хворих, збір матеріалу, обробку

отриманих даних, підготував матеріали до друку).

7. Пат. UA 92250 U Україна, МПК А 61 К 31/00. Засіб для лікування

виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої кишки, асоційованих з

Helicobacter pylori. / Казмірчук В. В.; винахідники В. В. Казмірчук, Б. І.

Гушилик, А. О. Новицький, А. В. Фаталієва, І. П. Юдін, В. В. Власенко, І. О.

Ведерникова, І. Ф. Білоконь, С. Л. Крестецька, В. І. Чернявський, О. Р.

Гіршфельд, О. І. Грішина, Н. М. Шульга, І. В. Поволокіна , В. Д. Макаренко,

І. Ф. Невмержицький; заявл. 24.02.2014 ; опубл. 11.08.2014, Бюл. № 15.

(Здобувач брав участь у розробці композиції антихелікобактерного засобу,

визначенні його протимікробної активності).

110

АНАЛІЗ ТА УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ

До найбільш актуальних питань сучасної мікробіології належать

захворювання, пов’язані із інфікуванням H. pylori [5]. Важливість цієї

проблеми обумовлена збільшенням частоти рецидивів хелікобактер-

залежних захворювань при неефективній ерадикації збудника та

розвитком важких ускладнень при тривалій персистенції H. pylori на

слизовій оболонці шлунка, таких як виразкова хвороба і рак шлунка [13].

Поряд із цими проблемами на одне із перших місць висувається і

проблема ефективної діагностики цього збудника. Велика кількість

запропонованих методів діагностики та їх різна точність, особливо при

визначенні кокових форм H. pylori, призводять до значних розбіжностей

як при оцінці характеру інфікування, так і при визначенні ефективності

різних схем антихелікобактерної терапії [139, 241]. Сьогодні всі

рекомендації для визначення H. pylori вимагають проведення комплексної

діагностики, але не визначено, які саме методи треба використовувати у

цьому комплексі.

З іншого боку, в сучасних економічних умовах, коли хворому

доводиться вибирати між адекватною діагностикою і відповідним

лікуванням, не менш актуальним є питання вартості обстеження. І в

клінічній практиці частіше перевага надається саме лікувальним заходам,

тоді як невірна попередня діагностика часто призводить до

невиправданих витрат на дорогі медичні препарати.

Отже, питання успішної діагностики H. pylori має не менш важливе

значення, ніж пошук ефективних схем лікування хвороб, пов’язаних із

цим патогеном.

Метою нашої роботи було розробити нові та удосконалити існуючі

методи діагностики H. pylori, в тому числі бактеріологічний, на основі

111

застосування нових рецептур поживних та діагностичних середовищ,

простежити основні морфологічні, культуральні, біохімічні і токсигенні

особливості виділеного збудника.

Задля досягнення мети та вирішення встановлених завдань нами

було проведено комплексне клінічне та інструментально-лабораторне

обстеження 126 хворих на гастродуоденальну патологію:

гастродуоденіти, та виразкову хворобу (ВХ) шлунка і ДПК, які

проживали у Вінницькому районі. Вік пацієнтів становив 18 – 82 років.

При цьому 61,3 % хворих були особами середнього віку, - найбільш

працездатної категорії населення, що вказує на серйозність проблеми, що

вивчалася. У цілому, середній вік обстежених становив 44,6+18,9 років.

Всі хворі проходили ФЕГДС з біопсією слизової шлунка і ДПК. Усього

відібрано 342 біопсійних зразків. З них матеріал 166 біоптатів засівався

на поживні середовища для отримання росту колоній, решта відбиралась

для проведення швидкого уреазного тесту і гістологічного дослідження.

Загалом виділено 78 штамів H.pylori.

З метою вивчення ролі бактеріального фактора при розвитку

запально-виразкової патології шлунка і ДПК, на першому етапі було

вивчено частоту виділення H. pylori в залежності від діагнозу і характеру

перебігу захворювання. Так, при ерозивних гастродуоденітах та активній

виразці хелікобакери виявлені у 85,3 - 88,9% хворих, тоді як при станах

без порушень цілості слизової оболонки позитивні знахідки H. pylori

спостерігалися у 52,4% та 13,0% обстежених осіб при НЕГД та хронічній

ВХ відповідно (р<0,05 та р<0,001), що співпадає з даними літератури [15,

118].

При аналізі наведених результатів, необхідно прийняти до уваги

інтенсивну персистенцію H. pylori [30, 31]. Тому частота виявлення

хелікобактерів у хворих ще не є достатнім доказовим аргументом

етіологічної значущості H. pylori в розвитку запально-виразкових

112

процесів ГДД. Окрім зазначеного, потрібно знати про інші провокуючі

фактори розвитку патології у кожному випадку.

Слід відмітити, що виділення H. pylori також залежить від відділу

гастродуоденальної ділянки, звідки береться біопсія. Так, частіше

хелікобактери культивувались з тіла та антрального відділу шлунка (при

захворюваннях з дефектами слизових – на рівні 85,3%, при інших станах

– в межах від 18,8% до 58,0%). Встановлено, що H. pylori виділяється з

усіх відділів шлунка і ДПК в середній концентрації (5,79±1,34) lg10 КУО/г

біоптату без достовірної різниці між відділами ГДД.

У дослідах встановлено, що у обстежених хворих H. pylori в

монокультурах виділено в 31,7% випадків, а в асоціаціях з іншою

мікрофлорою – у 30,2%. У 30,1% пацієнтів виділялась тільки супутні

мікрофлора без хелікобактерів. На нашу думку, неможливо достовірно

встановити, чи дійсно виділена супутня мікрофлора персистує у слизовій

поряд з H. pylori, чи вона є транзиторною мікрофлорою з ротової

порожнини. Тому вплив мікробних асоціацій на персистенцію

хелікобактерів у нашому дослідженні до уваги не брався, і це не входило

до завдань даної роботи.

Низький процент позитивних знахідок хелікобактерів у слизових

оболонках хворих на загострення виразкової хвороби без дефектів у

літературі не проаналізований. Ми допускаємо, що загострення

патологічного процесу у таких хворих могло бути обумовлено іншими не

бактеріальними чиниками, як то: порушеннями дієти, наявністю стресів,

прийомом медикаментів тощо.

Щоб дослідити, в якій мірі H. pylori, що заселяють слизові шлунка і

ДПК, беруть участь в розвитку запально-виразкової патології цих

ділянок, у наступних дослідженнях ми вивчали їх мікробіологічні

властивості.

113

Встановлено, що штами H. pylori достовірно відрізнялись за

гемолітичними властивостями, і це залежало від характеру перебігу

патології. Так, різниця по цій ознаці становила - у хворих з ерозивним

гастродуоденітом у 2,7 рази частіше ніж при неерозивному

гастродуоденіті, та у 2,1 рази частіше у штамів, що були виділені у

хворих з активною виразкою, ніж при загостренні без дефектів слизової

(р<0,001).

Чутливість хелікобактерів до антибактеріальних препаратів, які

застосовуються при ерадикації, була наступною. Виявлено, що із всіх

досліджених штамів H. pylori, 50 штамів (64,1%) виявили чутливість до

всіх препаратів, 14 штамів (17,9%) були резистентними до одного з

препаратів, 8 штамів (10,3%) – до двох препаратів, 4 штами (7,6%) – до

трьох препаратів. Найчастіше резистентність H. pylori до амоксициліну

поєднувалась з резистентністю до метронідазолу (5 штамів), а 6 штамів

проявляли поєднану стійкість до метронідазолу з кларитроміцином. Ці

дані збігаються з іншими літературними спостереженнями [203, 205].

Дослідженнями встановлено різну частоту виявлення уреази та

швидкості ферментації сечовини в залежності від характеру перебігу

захворювань. Встановлено, що уреазна активність в біоптатах, взятих у

хворих з дефектами слизової оболонки, зареєстрована у 72,8% випадків, а

без дефекта слизової уреазний тест був позитивним у 36,5% (р<0,01)

досліджених біоптатів. Відмінності в частоті виявлення даного ферменту

в біоптатах у цих груп пацієнтів також доповнюються швидкістю

гідролізу сечовини у описаних об’єктах дослідження. Встановлено, що у

пацієнтів з дефектами слизової оболонки переважна більшість біоптатів

(72,9%) при внесенні у реактив гідролізують сечовину напротязі першої

години спостереження за уреазним тестом, тоді як у хворих без дефектів

слизової біоптатів з високою уреазою активністю було 29,4% (р<0,001).

114

Разом з тим, пізня ферментація сечовини (12 - 24 годин від початку

реакції) у біоптатах, взятих зі слизових без дефектів, складала 35,5%, у

біоптатах, взятих зі слизових з ерозіями чи виразками, спостерігалась у

5,1% (р<0,001).

Дані результати є наслідком наявності в біоптатах хелікобактерів з

різною ферментативною активністю. Так, у хворих з ерозивним

гастродуоденітом та активною виразкою H. pylori було виділено з 88,1%

біоптатів, які розкладали сечовину, а частота виділення H. pylori з

уреазопозитивних біоптатів у хворих без дефектів слизової склала 80,6%

(р>0,05).

Однак, необхідно зазначити, що частина біоптатів проявляла

уреазну активність без наявності в них хелікобактерів (10,2%), а також

частина біоптатів (2,4%), де виявляли H. pylori, не мали або мали дуже

слабку уреазну активність в межах чутливості уреазного тесту. Можна

припустити, що на це впливає супутня мікрофлора, що з одного боку

проявляє власну невиражену уреазну активність, а з іншого боку

пригнічує уреазну активність хелікобактерів.

При порівнянні мікробіологічного методу з іншими інвазивними і

неінвазивними тестами виявлення H. pylori визначено узгодження

позитивних і негативних результатів на рівні 73% випадків, яке було

нижчим, ніж спостерігалося в дослідженні Vandenplas Y. et al. (87%), і

вищим, ніж у дослідженні Ogata S. et al. (61%) [248]. Це сталось через

появу хибних результатів: 10 пацієнтів (13,5%) мали хибний результат

одного тесту, і 10 (13,5%) хворих отримали хибні результати двох тестів.

Ми вважаємо, що коли результат одного тесту відрізнявся від інших, його

можна вважати помилковим, але коли більш ніж один метод дає

невідповідність, необхідно ретельно проаналізувати методи і критерії, які

використовуються для характеристики пацієнта як зараженого чи не

115

зараженого H. pylori. Тому дуже важливо вибрати, які методи і скільки їх

буде використовуватися в якості стандарту.

Інвазивні методи через їх високу специфічність вважаються золотим

стандартом, але вони мають дещо нижчу чутливість, тому що основані на

біопсії, тому можуть постраждати від помилки вибірки, через

неоднорідний розподіл H. pylori по слизовій шлунка, низьку

концентрацію бактерій у біоптатах і низьку біохімічну активність

мікроорганізмів.

Культуральний метод дав найвищий рівень хибнонегативних

результатів, що знизило чутливість до 86% в порівнянні з іншими

дослідженнями (від 86 до 100%) [248]. Тим не менш, його специфічність

була високою (100%), що є без сумніву доказом присутності бактерій.

Труднощі у виділенні і культивуванні, технічні вимоги та відносно низька

доступність не дозволяють цей метод використовувати в якості єдиного

стандарту.

До переваг усіх уреазних тестів належать простота виконання та

швидкість, до недоліків – непряма сутність методу, тобто виявлення не

самого H. pylori, а лише його уреазної активності. Тест дає

хибнонегативні результати при невисокому ступеню обсіменіння тканин,

коли сумарна уреазна активність буде невисокою, а також при

уреазонегативних штамах H. pylori. З іншого боку, хибнопозитивні

результати пов’язані з присутністю уреазопродуцентних мікроорганізмів

(протей, псевдомонади, стрептококи та інші), особливо при тривалій 24-

годинній експозиції в термостаті. В зв’язку з цим, більшу специфічність

мають лише т.з. «холодні тести», тобто які проводяться при кімнатній

температурі, що дозволяє отримати позитивну відповідь лише на уреазу,

накопичену в тканині, специфічну для H. pylori, а не яку виробляють

бактерії в процесі культивування.

116

У нашому дослідженні швидкий уреазний тест і гістологія дали

найкращу точність. Ці методи, крім кращої точності і практичності,

мають відносно низьку вартість в порівнянні з іншими методами.

Поєднання цих двох методів дозволяє оцінити стан інфікованості

пацієнта (ШУТ) і мікроскопічний аналіз слизової оболонки шлунка

(гістологія). Але хоча комбінація цих інвазивних методів розглянута як

стандарт більшістю авторів [242], в рутинній практиці для діагностики

хелікобактеріозу гістологія не використовується і до того ж займає часу

близько 1 тижня, що не дозволяє для цього її використовувати.

У нашому дослідженні аміачний ДУТ дав велику кількість випадків

хибних результатів: 3 хибнопозитивних і 4 хибнонегативних результатів.

Незважаючи на високу чутливість і специфічність даного способу, наші

результати (чутливість = 92%, а специфічність = 87,5%) були нижче, ніж

спостерігалося і в інших дослідженнях [249]. Це можна пояснити

колонізацією ротової порожнини і глотки пацієнтів такими

уреазопродуцентами, як стрептокок і стафілокок (хибнопозитивні

результати). Хибнонегативні відповіді тесту можуть бути отримані, якщо

у пацієнта гіпо- чи ахлоргідрія, пацієнт приймає антибіотики, солі

вісмуту, блокатори протонної помпи, а також у хворих після резекції

шлунку.

Як зазначено у консенсусі Maastricht IV/Florence, сучасні

моноклональні тести для визначення ДНК H. pylori у калі (стул-тести)

можуть широко використовуватись як для первинної діагностики, так і

для контролю ерадикації H. pylori інфекції [108]. Стул-тести є корисними

і надійними навіть під час прийому інгібіторів протонової помпи. Їх

точність у порівнянні з ДУТ знаходиться на рівні 93,6 - 98,0% [194], що

підтвердило наше дослідження (88,9%). Велику кількість

хибнопозитивних результатів, що знизило специфічність, можна

пояснити інфікованістю пацієнтів іншими видами бактерій роду

117

Helicobacter, що містяться у кишківнику, а також відмінністю антигенів

H. pylori в досліджуваній нами популяції і тих бактерій, що

використовувались при розробці даного комерційного стул-тесту.

Створюючи поживне середовище для виділення H. pylori, ми

враховували, що однією з унікальних особливостей H. pylori є його здатність

асимілювати вільний холестерин, а також жирні кислоти у свої мембрани. Це

необхідно для зміцнення мембранного ліпідного бар`єру, що також захищає

бактерії від імунної відповіді організму [83]. Ця здатність може грати

патогенетичну роль у виживанні і колонізації H. pylori у шлунку [84]. Тому

до складу інгредієнтів середовища ми включили препарат Nutrilon, який має

в своєму складі вищезгадані складові. Таким чином, конструюючи поживне

середовище, в якості забезпечення макро- і мікроелементів ми використали

препарат Nutrilon, а в якості білкового забезпечення – пептон

ферментативний, розчинником служила дистильована вода. Завдяки

застосуванню препарату Nutrilon в середовищі покращуються окисно-

відновні та білково-обмінні процеси в клітинах хеліюактерів, при цьому

синтезуються всі необхідні речовини для росту і розмноження збудника.

Результатом цьому є швидкий ріст H. pylori в порівнянні з контролем.

Разом з тим, запропоноване середовище позбавлене недоліків, які

мають поживні середовища, що містять кров чи її похідні: розбіжності

між експериментами через різницю в стані здоров`я тварин-

донорів. Крім того, при доповненні поживних середовищ сироваткою

можна ввести в них забруднюючі білки, які можуть перешкодити

подальшій експериментальній процедурі, наприклад, при

отриманні антигенів H. pylori, робота з небезпечними біологічними

рідинами, зміни в здатності сприяти росту колоній, відсутність

забезпечення росту всіх штамів, нестандартність при виготовленні та

вимоги зберігання в заморожених умовах.

118

Попередні дослідження поживних потреб H. pylori були зосереджені

в основному на рості цієї бактерії у великих і малих обсягах рідких

середовищ, на впливі на ріст у різних твердих композиціях поживних

середовищ, або на виживання H. pylori в різних транспортних системах

[250, 251].

В основах всіх чотирьох рідких поживних середовищ без ростових

добавок відзначався ріст H. pylori, включаючи бруцела-бульйон (ББ). Тим

не менш, останній дав найбідніший ріст H. pylori в цьому дослідженні.

Протягом усього дослідження ББ з добавками давав гірший ріст, ніж інші

середовища.

Бульйони, які містять тільки кров або кров з іншою добавкою

давали оптимальний ріст штамів H. pylori. Тим не менш, в той час, коли

рідкі основи без добавок підтримували ріст, тверді основи середовищ,

крім запропонованого середовища (ЗС), аналогічного складу, росту не

дали. Нездатність H. pylori рости на основах твердих середовищ

повідомили Coudron і Stratton (1995) [252]. Таким чином, рідкі

середовища більш сприяли зростанню штамів.

При додаванні до твердих основ середовищ, добавки з кров'ю, як і в

бульйонах, дали оптимальний ріст H. pylori. У цьому дослідженні 5%

кінська кров була додана до основ середовищ. Hutton et al. (2011) [8]

повідомили, що джерело крові має вирішальне значення для росту H.

pylori, а також було відзначено, що овеча кров, лакова або цільна кров

пригнічують ріст H. pylori в рідких середовищах [252]. Результати цього

дослідження показують, що цільна кінська кров підтримує ріст H. pylori в

твердих і рідких середовищах. Тим не менш, спостерігалися відмінності в

здатності штамів рости на твердих середовищах з додаванням крові в

порівнянні з рідкими середовищами з кров'ю.

У цьому дослідженні була обрана низька концентрація суспензії

(102 КУО/мл), яка відповідає справжньому числу H. pylori в шлункових

119

біоптатах і неоднорідному розподілу цих мікроорганізмів у шлунку [253,

254]. Був обраний інкубаційний період в 72 год, для досягнення

максимального росту штамів H. pylori. Це також допомогло уникнути

появи кокоподібних форм, які починають з'являтися через 6-7 днів

інкубації [38]. У цьому дослідженні були використані колби об'ємом 50

мл з рідкими середовищами, в яких було 10 мл бульйону, з вільно

прикритими корками, тим самим дозволяючи дифузії мікроаеробної

газової атмосфери в культуральне середовище і виключаючи необхідність

обертання.

У нашому дослідженні дані про рН біопсійних зразків корелювали з

результатами інтрагастральної рН-метрії.

Запропонований біохімічний уреазний тест має достатні чутливість,

специфічність, позитивне і негативне прогностичне значення і точність, у

порівнянні з дихальним уреазним тестом.

Запропонований спосіб біохімічного виявлення H. pylori та

визначення рН біопсійних шматочків може використовуватись при

рутинному ендоскопічному обстеженні гастроентерологічних хворих,

зменшити тривалість ендоскопічного обстеження.

На сьогодні вже ні у кого не виникає сумнів, що досягнення

ерадикації H. pylorі стає надалі все складнішим. У всьому світі

знижується ефективність запропонованих схем. Передусім це

пояснюється появою нових стійких до антихелікобактерних препаратів

штамів H. pylorі [255].

Резистентні штами гірше піддаються ерадикації і знижують

ефективність лікування. Розроблений нами засіб покликаний допомогти

пацієнтам, що інфіковані резистентними до кларитроміцину штамами H.

pylori. Через те, що до складу запатентованого нами препарату входять

антибактеріальні компоненти (амоксицилін та нітазол), що володіють

синергічною дією, знижено їхні концентрації в препараті. Це дасть змогу

120

знизити рівень побічних реакцій при прведенні ерадикаційної терапії цим

засобом.

Водночас незважаючи на знижену концентрацію основних

інгредієнтів, засіб володіє хорошою антихелікобактерною активністю, що

переконливо показали досліди: максимальний рівень МІК

запропонованого засобу у перерахунку на амоксицилін менше, ніж у

препарату-аналогу HELICOCIN®

на 46,9%.

У перспективі є клінічна апробація запропонованого засобу з

визначенням рівня ерадикації H. pylori у пацієнтів, що страждають на

хелікобактер-асоційовану гастро-дуоденальну патологію.

121

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення, науково

обґрунтовано практичне вирішення актуального завдання щодо

оптимізації і розробки нових та удосконалення існуючих методів

діагностики H. pylori – інфекції на основі застосування нових поживних

середовищ, дослідження, розроблених антимікробних лікарських засобів.

1. Встановлено вірогідну різницю (р<0,01) за частотою виявлення H.

pylori у хворих з ерозіями, виразками слизової оболонки (86,9 %) та із

захворюваннями без дефектів слизової (38,5 %). Виділення H. pylori

залежить від відділу гастродуоденальної ділянки. Частіше H. pylori

виділяють з тіла та антрального відділу шлунка (при захворюваннях з

дефектами слизових – на рівні 85,3 %, при інших станах – в межах від

18,8 % до 58,0 %). H. pylori ізолюються з усіх відділів шлунка і

дванадцятипалої кишки в концентрації 5,79±1,34 lg КУО/г біоптату без

достовірної різниці між відділами гастродуоденальної ділянки (р>0,05).

2. Рівень поширеності H. pylori серед пацієнтів з патологічною

ендоскопічною картиною в нашому дослідженні складає 67,6 %. Серед

досліджуваних тестів найвищу специфічність мають мікробіологічний

(100 %), гістологічний (100 %) методи; швидкий уреазний тест (91,7 %);

дихальний уреазний тест (87,5 %); стул-тест (79,2 %). Найвищу

чутливість мають швидкий уреазний тест (96,0 %); стул-тест (93,8 %);

дихальний уреазний тест (92,0 %). Для пацієнтів, які проходять

гастроскопію, доцільне поєднання швидкого уреазного тесту та

гістологічного дослідження. У випадках відсутності ендоскопії у хворих

показано застосування комбінації неінвазивних тестів (дихальний

уреазний тест; стул-тест).

122

3. Розроблено нове ефективне поживне середовище для виділення

H. pylori, яке за рахунок нового складу компонентів, їх кількісного

співвідношення дозволяє оптимізувати діагностику хелікобактеріозу.

Запропоноване поживне середовище просте за способом його

приготування, забезпечує виділення в 94,95% H. pylori в досліджуваному

матеріалі. Це поживне середовище не змінює токсигенні властивості H.

pylori (токсини CagA; VacA). За результатами досліджень отримано

патент України на корисну модель UA88360U «Поживне середовище для

виявлення Нelicobacter pylori при шлунково-кишкових захворюваннях».

4. Додавання крові до поживних середовищ забезпечує оптимальний

ріст H. pylori, однак при роботі з бульйонами, що містять кров,

виникають труднощі, і культивування в середовищах без крові є

доцільнішим. За ростовими характеристиками кінська сироватка

перевершує ембріональну телячу сироватку. Додавання більше двох

добавок до бульйонів знижує концентрацію H. pylori.

5. Антимікробний засіб для лікування виразкової хвороби шлунка та

дванадцятипалої кишки, асоційованих з H. pylori, проявляє

антибактеріальну дію в дозі 1 мкг/мл, яка переважає в два рази відомий

антихелікобактерний лікарський препарат Helicocin® (2 мкг/мл).

123

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для уникнення небажаних ефектів поживних середовищ для

виділення H. pylori, що містять кров або її похідні, доцільно

використовувати розроблене і впроваджене поживне середовище, яке

покращує мікробіологічну діагностику хелікобактеріозу і не змінює

властивості досліджуваного збудника.

2. Для оптимізації діагностики захворювань гастродуоденальної зони

для виявлення H. pylori рекомендовано використання нового біохімічного

тесту ВНВ, що дозволяє поєднати інтрагастральну рН-метрію.

3. Для лікування виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої

кишки, асоційованих з Helicobacter pylori, доцільно використання

комплексного антимікробного засобу після проведення клінічних

досліджень цього препарату відповідно до законодавства України .

124

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Шептулин А. А. Хронический гастрит и функциональная диспепсия:

есть ли выход из тупика? / А. А. Шептулин // Российский журнал

гастроентерологии, гепатологии, колонопроктологии. – 2010. - № 2. -

С. 84-88.

2. Дегтярева И. И. Клиническая гастроэнтерология. / И.И. Дегтярева. -

Москва : Медицинское информационное издательство, 2004. – 850 с.

3. Рапопорт С. И. Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной

кишки: морфофункциональные, нейроэндокринные и клинические

параллели / С. И. Рапопорт, Н. И. Жернакова, К. И. Прощаев [и др.] //

Клиническая медицина. – 2008. - № 5. – С. 28–30.

4. Колесник П. О. Дослідження інфікованності Helicobacter pylori

пацієнтів різних вікових груп у Закарпатській області / П. О.

Колесник, С. В. Козич, М. В. Шепетько [та ін.] // Сімейна медицина. –

2008. - № 3. – С. 108–110.

5. Харченко Н. В. Гастроентерологія. / Н. В. Харченко, О. Я. Бабак. –

Київ : Друкар, 2007. – 720 с.

6. Tytgat G. N. Etiopathogenetic principles and peptic ulcer disease

classification / G.N. Tytgat // Dig. Dis. - 2011. - № 29 (5). - Р. 454-458.

7. Лапина Т. Л. Две цели лечения язвенной болезни – заживление язвы и

эрадикация Нelicobacter pylori / Т. Л. Лапина // Сучасна

гастроентерологія. – 2010. - № 3 (53). – С. 48–53.

8. Hutton M. L. The Use of AlbuMAX II as a Blood or Serum Alternative for

the Culture of Helicobacter pylori / M. L. Hutton, M. Kaparakis-Liaskos,

R. L. Ferrero // Helicobacter. – 2011. - № 17. – P. 68–76.

9. Исаков В. А. Хеликобактериоз / В. А. Исаков, И. В. Домарадский –

Москва : Медпрактика-М, 2003. – 411 с.

125

10. Satoh K. Efficacy of claritromicin in eradicating Helicobacter pylori / K.

Satoh, K. Kimura, T. Takimoto // J. Gastroenterol. – 2009. – Vol. 31,

Suppl. 9. – P. 75-76.

11. Мишкина Т. В. Полимеразная цепная реакция в диагностике

хеликобактерной инфекции у детей / Т. В. Мишкина, В. А.

Александрова, А. Н. Суворов // Врач. - 2007. - №7. – С. 74-76.

12. Осипов К. В. Генетический анализ устойчивости к кларитромицину

штаммов Н.pylori, изолированных у детей, проживающих в Санкт-

Петербурге / К. В. Осипов, Т. Г. Зачепило, [и др.] //

Гастроэнтерология Санкт-Петербурга: материалы 9-го Славяно-

Балтийского форума. - 2009. - № 1-2. - С. 114-115.

13. Megraud F. Helicobacter pylori resistance to antibiotics in Europe and its

relationship to antibiotic consumption / F. Megraud, S. Coenen, A.

Versporten [et al.] // Gut. – 2013. - № 1 (62). – Р. 34-42.

14. Мироджов Г. К. Побочные действия эрадикационной терапии

Helicobacter pylori / Г. К. Мироджов, Д. М. Ишанкулова, М. Б.

Бойматова [и др.] // Клиническая медицина. – 2007. - № 6. – С. 47-50.

15. Arents N. X. Does the declining prevalence of Helicobacter pylori unmask

patients with idiopathic peptic ulcer disease? Trends over an 8 year period

/ N.L. Arents, A.A. Thijs van Zwet [et al.] // European J. of Gastroenterol.

Hepatol. — 2004. – № 16 (8). - P. 779-783.

16. Циммерман Я. С. Клиническая гастроэнтерология / Я. С. Циммерман.

– Москва : Гэотар-Медиа, 2009. – 416 с.

17. Определитель бактерий Берджи: в 2-х томах. Т. 1 / Под ред. Хоулта

Дж., Крига Н., Снита П., Стейли Дж., Уилльямса С. / Пер. с англ. под

ред. Заварзина Г. А. – 9-е изд. - Москва : Мир, 1997. – 432 с.

18. Andersen L. P. Colonization and Infection by Helicobacter pylori in

Humans / L. P. Andresen // Helicobacter. – 2007. – Vol. 12 (Suppl.2). – P.

12–15.

126

19. Marshall B. J. Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with

gastritis and peptic ulceration / B. J. Marshall, J. R. Warren // Lancet. –

1984. – Р. 1311 – 1315.

20. Гончар М. Г. Сучасні аспекти етіопатогенезу виразкової хвороби

шлунка і дванадцятипалої кишки / М. Г. Гончар, В. Є. Нейко, Я. М.

Кучірка // Галицький лікарський вісник. – 2003. – Т. 10, № 3. – С. 116-

119.

21. Шкитин В. А. Роль Helicobacter pylori в патологии человека / В. А.

Шкитин, А. И. Шпирна, Г. Н. Старовойтов // Клиническая

микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2002. – Т. 4, № 2. –

С. 128–145.

22. Сарапук О. Р. Інфекція Helicobacter pylori та порушення

кислотоутворювальной функції шлунка / О. Р. Сарапук // Галицький

лікарський вісник. – 2004. – Т. 11, № 1. – С. 99 - 101.

23. Saito N. Plural transformation-processes from spiral to coccoid

Helicobacter pylori and its viability / N. Saito, K. Konishi, F. Sato et al. //

J. Infect. – 2003. - № 46. – Р. 49–55.

24. Cellini L. Searching the point of no return in Helicobacter pylori life:

necrosis and/or programmed death? / L. Cellini, I. Robuffo, N. M. Maraldi,

G. Donelli // J. Appl. Microbiol. – 2001. - № 90. Р. 727–732.

25. Will´en R. Morphologic conversion of Helicobacter pylori from spiral to

coccoid form. Scanning (SEM) and transmission electron microscopy

(TEM) suggest viability / R. Will´en, B. Carl´en, X. Wang [et al.] // Upsala

J. Med. Sci. – 2000. - № 105. – Р. 31–40.

26. Rothenbacher D. Helicobacter pylori among preschool children and their

parents: evidence of parent-child transmission / D. Rothenbacher, G. Bode,

G.Berg // J. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 24, № 179. - P. 398-402.

127

27. Li N. Proliferative and apoptotic effects of gastric epithelial cells induced

by coccoid Helicobacter pylori / N. Li, L. Han, J. Chen [et al.] // J. Basic

Microbiol. – 2012. - № 36. – Р. 345–353.

28. Azevedo N. F. Adhesion of water stressed Helicobacter pylori to abiotic

surfaces / N. F. Azevedo, A. P. Pacheco, C. W. Keevil, M. J. Vieira // J.

Appl. Microbiol. – 2006. - № 101. – Р. 718–724.

29. Giao M. S. Persistence of Helicobacter pylori in heterotrophic drinking-

water biofilms / M. S. Giao, N. F. Azevedo, S. A. Wilks et al. // Appl.

Environ. Microb. – 2008. - № 74. – Р. 5898–5904.

30. Терещенко С. Ю. Внегастральные проявления инфекции Helicobacter

pylori у детей: гипотезы или реальность? / С. Ю. Терещенко, Э. В.

Каспаров, Т. В. Афанасьева // Педиатрия. − 2004. − № 6. − С. 63–67.

31. Тивончук О. С. Роль і місце інфекції Helicobacter pylori у хворих на

ожиріння / О. С. Тивончук, А. С. Лаврик, І. В. Гомоляко [та ін.] //

Клінічна хірургія. – 2007. - № 4. – С. 34–35.

32. Зайцева Н. В. Особенности эрадикационной терапии хронического

гастродуоденита, ассоциированного с Helicobacter pylori у детей,

проживающих в экологически неблагоприятных условиях / Н. В.

Зайцева, А. И. Аминова, А. А. Акатова, Е. Ю. Минченко //

Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2009. - № 4. - С.

49-53.

33. Сорокман Т. В. Імунологічна характеристика дітей із

гастродуоденальним гелікобактеріозом / Т. В. Сорокман, Н. Є.

Куцобіна, С. В. Сокольник, О. В. Макарова // Здоровье ребенка. –

2010. – №1 (22). – С. 12–15.

34. Герман С. В. Распространённость инфекции H. pylori среди населения

Москвы / С. В. Герман, И. Е. Зыкова, А.В. Модестова [и др.] //

Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии,

колонопроктологии. – 2010. - № 2. – С. 25-30.

128

35. Боброва В. І. Епідеміологічні аспекти перебігу хронічної гастро

дуоденальної патології у дітей / В. І. Боброва, О. В. П’янкова, Н. І.

Надточій [та інш.] // Сучасна гастроентерологія. – 2010. - № 2 (52). –

С. 33-36.

36. Dattoli V. C. Seroprevalence and potential risk factors for Helicobacter

pylori infection in Brazilian children / V. C. Dattoli, R. V. Veiga, S. S. da

Cunha [et al.] // Helicobacter. – 2010. - № 15. – P. 273–278.

37. Konishi K. Helicobacter pylori: longer survival in deep ground water and

sea water than in a nutrient-rich environment / K. Konishi, N. Saito, E.

Shoji [et al.] // Apmis. – 2007. - № 115. – Р. 1285–1291.

38. Andersen L. P. Helicobacter pylori-coccoid forms and biofilm formation /

L. P. Andersen, L. Rasmussen // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2009.

- № 2 (56). - P. 112-115.

39. Cervantes D. T. Exposure to Helicobacter pylori-positive siblings and

persistence of Helicobacter pylori infection in early childhood / D. T.

Cervantes, L. A. Fischbach, K. J. Goodman [et al.] // J. Pediatr.

Gastroenterol. Nutr. – 2010. - № 50. – P. 481-485.

40. Циммерман Я. С. Проблема этиологии и патогенеза язвенной

болезни: перечитывая В. Х. Василенко / Я. С. Циммерман //

Клиническая медицина. – 2011. - № 1.– С. 14–19.

41. Fialho A. M. Younger siblings play a major role in Helicobacter pylori

transmission among children from a low-income community in the

Northeast of Brazil / A. M. Fialho, A. B. Braga, M. B. Braga Neto [et al.]

// Helicobacter. – 2010. - № 15. – Р. 491–496.

42. Muhsen K. Presence of Helicobacter pylori in a sibling is associated with a

long-term increased risk of H. pylori infection in Israeli Arab children / K.

Muhsen, A. Athamna, A. Bialik [et al.] // Helicobacter. – 2010. - № 15. –

P. 108–113.

129

43. Nam J. H. Helicobacter pylori infection and histological changes in

siblings of young gastric cancer patients / J. H. Nam, I. J. Choi, S. J. Cho

[et al.] // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2011. - № 26. – P. 1157–1163.

44. Urita Y. Role of infected grandmothers in transmission of Helicobacter

pylori to children in a Japanese rural town / Y. Urita, Т. Watanabe, N.

Kawagoe [et al.] // J. Paediatr. Child. Health. – 2013. - № 49. – Р. 394–

398.

45. Calvet X. Diagnosis and Epidemiology of Helicobacter pylori Infection /

X. Calvet, M.-J. R. Lazaro, P. Lehours, F. Megraud // Helicobacter. –

2013. - № 18 (Suppl. 1). P. 5–11.

46. Gisbert J. P. The Recurrence of Helicobacter pylori Infection: Incidence

and Va¬riables Influencing It. A Critical Review. // Am. J. Gastroenterol. -

2005. - Vol. 100.- P. 2083–2099.

47. Peek R. M. Helicobacter pylori gastritis in children / R. M. Peek // Ann.

Med. – 2009. – Vol. 31, № 1. – P. 767 - 770.

48. Paster B. J. Phylogeny of Helicobacter felis sp. nov., Helicobacter

mustelae, and related bacteria / B. J. Paster // International Journal of

Systematic Bacteriology. - 2010. - № 41. - Р. 3138.

49. Передерій В. Г. Пептичні виразки гастродуоденальної зони: сучасні

уявлення про причини виникнення, діагностику і лікування / В. Г.

Передерій, С. М. Ткач // Нова медицина. – 2003. - № 6. – С. 16-21.

50. Васильев Ю. В. Патогенетические аспекты Helicobacter pylori / Ю. В.

Васильев // Международный мед. журнал. – 2007. – № 1. – С. 53-64.

51. Mobley H. L. T. Characterization of urease from Campylobacter pylori /

H. L. T. Mobley, M. J. Cortesia, L. E. Rosenthal, B. D. Jones // J. Clin.

Microbiol. – 1988. - № 26. – Р. 831–836.

52. Konturek P. C. Helicobacter pylori infection in gastric cancerogenesis /

P.C. Konturek, S.J. Konturek, T. Brzozowski // J. Physiol. Pharmacol. –

2009. – Vol. 60 (3). – P. 21–30.

130

53. Pancaldi M. E. Helicobacter pylori-bacterial characteristics / M. E.

Pancaldi, A. R. Di Biase // Pediatr. Med. Chir. – 2010. – Vol. 20, № 5. – P.

323-328.

54. Geyer G. Occurrence of spiral-shaped bacteria in gastric biopsies of dogs

and cats / G. Geyer, C. Colbatzky, F. Lechner // Veterinary Record. - 2009.

- № 133. - Р. 1819-.

55. Бабій І. Л. Роль і значення інфекції Helicobacter pylori в розвитку

хронічних захворювань органів гастродуоденальної зони у дітей / І. Л.

Бабій // Педіатрія, акушерство та гінекол. – 2000. – № 2. – С. 5–9.

56. Hazell S. L. Helicobacter pylori catalase / S. L. Hazell, D. J. Evans, D. Y.

Graham // J. Gen. Microbiol. – 1991. - № 137. – Р. 57–61.

57. Spigelhalder C. Purification of Helicobacter pylori superoxide dismutase

and cloning and sequencing of the gene / C. Spigelhalder, B. Gerstenecker,

A. Kersten et al. // Infect. Immun. – 1993. - № 61. – Р. 5315–5325.

58. Губергріц Н. Б. Практична панкреатологія / Н. Б. Губергріц, С. В.

Скопиченко – Донецьк. : ЛЕБІДЬ, 2007. – 244 с.

59. Сірчак Є. С. Гелікобактерна інфікованість хворих на цироз печінки /

Є. С. Сірчак, Л. Л. Варга, О. М. Москаль та ін. // Галицький

лікарський вісник. – 2004. – Т. 11, № 2. – С. 87-89.

60. Жукова В. Б. Морфофункціональні особливості слизової оболонки

шлунка у хворих на хронічний атрофічний гастрит, асоційований з

Helicobacter pylori на тлі атеросклерозу / В. Б. Жукова // Сучасна

гастроентерологія. – 2006. - № 4 (30). – С. 35–38.

61. Бабич Є. М. Міжмікробні взаємовідносини антагоністів та симбіонтів

по відношенню до Helicobacter pylori / Є. М. Бабич, Н. І. Скляр, Ю. Л.

Волянський, Л. А. Ждамарова, В. І. Білозерський // Annals of

Mechnicov’s Institute. – 2005. - № 2. – С. 4–11.

62. Puera A. D. Helicobacter pylori and ulcerogenesis / A. D. Puera //

American Journal of Medicine. - 2006. - № 100. - Р. 3456–3459.

131

63. Сучасні підходи до діагностики та принципів лікування Helicobacter

pylori асоційованих захворювань гастродуоденальної зони у дітей:

метод. рекомендації / укл.: С. Л. Няньковський, Л. П. Дедишин, О. С.

Івахненко [та ін.]. – Львів, 2000. – 17 с.

64. Carrizo-Chávez M. A. The frpB1 gene of Helicobacter pylori is regulated

by iron and encodes a membrane protein capable of binding haem and

haemoglobin / M. A. Carrizo-Chávez, А. Cruz-Castañeda, J. J. Olivares-

Trejo // FEBS Lett. – 2012. - № 586. – Р. 875-879.

65. Rothenbacher D. Diagnosis of Helicobacter pylori infection with a novel

stool antigen-based assay in children / D. Rothenbacher, G. Bode, H.

Brenner // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2007. – Vol. 35, № 19. - P. 364-366.

66. Сосюра В. Х. Кислотность первичного париетального секрета

желудка у детей с хроническим гастродуоденитом / В. Х. Сосюра, Е.

М. Таберовская, А. В. Новикова [и др.] // Педиатрия. – 2007. – Т. 86. -

№ 5. – С. 18–21.

67. Леонтьева В. А. Болевой синдром у больных язвенной болезнью в

сопоставлении с интрагастральным рН / В. А. Леонтьева, И. Ю.

Колесникова // Клиническая медицина.– 2008. - № 8. – С.50–53.

68. Backert S. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection. / S. Backert, M.

Clyne // Helicobacter. – 2011. - № 16 (Suppl. 1). – Р. 19–25.

69. Huang C.H. Alkylhydroperoxide reductase of Helicobacter pylori as a

biomarker for gastric patients with different pathological manifestations /

C.H. Huang, M.H. Chuang, W.L. Lo et al. // Biochimie. – 2011. - № 93. –

P. 1115–1123.

70. Мироджов Г. К. Частота и резистентность

цитотоксинассоциированных (CAG A) штаммов Helicobacter pylori к

антибактериальным препаратам при хроническом гастрите и

язвенной болезни двенадцатиперстной кишки / Г. К. Мироджов, Д. М.

132

Ишанкулова, А. Д. Дустов // Клиническая медицина. – 2006. - № 5. –

С. 51–54.

71. Маев И. В. Современные представления о заболеваниях желудочно-

кишечного тракта, ассоциированных с Helicobacter pylori / И. В. Маев

// Терапевтический архив. – 2006. - № 2. – С. 10-15.

72. Калинин А. В. Язвенная болезнь от патогенеза к лечению / А. В.

Калинин // Фарматека. – 2002. – № 9. - С. 64–73.

73. Ishijima N. BabA-mediated adherence is a potentiator of the Helicobacter

pylori type IV secretion system activity / N. Ishijima, M. Suzuki, H.

Ashida et al. // J. Biol. Chem. – 2011. - № 286. – Р. 25256–25264.

74. Lindén S. Role of Mucin Lewis Status in Resistance to Helicobacter pylori

Infection in Pediatric Patients / S. Lindén, C. Semino-Mora, H. Liu et al. //

Helicobacter. – 2010. – Vol. 15, Is. 4. – P. 251–258.

75. Toller I. A. Carcinogenic bacterial pathogen Helicobacter pylori triggers

DNA double-strand breaks and a DNA damage response in its host cells /

I. A. Toller, K. J. Neelsen, M. Steger et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –

2011. № 108. – Р. 14944–14949.

76. Tabassam F. H. Paxillin is a novel cellular target for converging

Helicobacter pylori-induced cellular signalling / F. H. Tabassam, D. Y.

Graham, Y. Yamaoka // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. –

2011. - № 301. – Р. 601–611.

77. Senkovich O. A. Helicobacter pylori AlpA and AlpB bind host laminin

and influence gastric inflammation in gerbils / O. A. Senkovich, J. Yin, V.

Ekshyyan et al. // Infect. Immun. – 2011. - № 79. – Р. 3106–3116. .

78. Калиш Ю. И. О природе вторичных язв желудка / Ю. И. Калиш, А. А.

Турсуметов // Вестник хирургии. – 2007. – Т. 116. - № 6. – С. 15–17.

79. Andersen L. P. Basic bacteriology and culture. Helicobacter pylori:

Physiology and Genetics / L.P. Andersen, T. Wadstrom // ASM Press,

Washington, DC. - 2001. – P. 27–38.

133

80. Kusters J. G. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection / J.G. Kusters,

A.H.M van Vliet., E.J. Kuipers // Clinical Mi¬crobiology Reviews. –

2006. – Vol. 19, № 3. – P. 449–490.

81. Hopf P. S. Protein Glycosylation in Helicobacter pylori: Beyond the

Flagellins? / P. S. Hopf, R. S. Ford, N. Zebian [et al.] // PLoS ONE. –

2011. - № 6(9). - P. 257-262.

82. Pohl M. A. Novel functions for glycosyltransferases Jhp0562 and GalT in

Lewis antigen synthesis and variation in Helicobacter pylori / M. A. Pohl,

S. Kienesberger, M. J. Blaser // Infect. Immun. – 2012. – Vol. 80. – P.

1593–1605.

83. Shimomura H. Phosphatidylethanolamine of Helicobacter pylori functions

as a steroid-binding lipid in the assimilation of free cholesterol and 3β-

hydroxyl steroids into the bacterial cell membrane / H. Shimomura, K.

Hosoda, S. Hayashi et al. // J. Bacteriol. – 2012. - № 194 (10). – Р. 2658–

2667.

84. Trampenau C. Affinity of Helicobacter pylori to cholesterol and other

steroids / C. Trampenau, K. D. Muller // Microbes. Infect. – 2003. – Vol.

5. – P. 13–17.

85. Маев И. В. Кровоток и морфофункциональное состояние

гастродуоденальной слизистой в разные фазы язвенной болезни / И.

В. Маев, В. В. Горбань, Л. М. Салова // Терапевтический архив.–

2007. - № 8. – С.57–61.

86. Egi Y. Role of Helicobacter pylori infection and chronic inflammation in

gastric cancer in the cardia / Y. Egi, M. Ito, S. Tanaka [et al.] // Jpn. J.

Clin. Oncol. – 2007. – Vol. 37 (5). – P. 365–369.

87. Willhite D. C. Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin enters cells,

localizes to the mitochondria, and induces mitochondrial membrane

permeability changes correlated to toxin channel activity / D. C. Willhite,

S. R. Blanke // Cell. Microbiol. – 2004. – Vol. 6 (Iss. 2). – Р. 143–154.

134

88. Malfertheiner P. Current concepts in the management of Helicobacter

pylori infection: the Maastricht III Consensus Report / P. Malfertheiner, F.

Megraud, C. O’Morain [et al.] // Gut. – 2007. – Vol. 56 (6). – P. 772–781.

89. Kang H. Y. Progression of atrophic gastritis and intestinal metaplasia

drives Helicobacter pylori out of the gastric mucosa / H.Y. Kang, N. Kim ,

Y.S. Park [et al.] // J. Clin. Gastroenterol. – 2008. – Vol. 42 (1). – P. 29–

35.

90. Tegtmeyer N. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV

secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis / N. Tegtmeyer, S.

Wessler, S. Backert // FEBS J. – 2011. - № 278. – Р. 1190–1202.

91. Backert S. The versatility of Helicobacter pylori CagA effector protein

functions: the master key hypothesis / S. Backert, N. Tegtmeyer, M.

Selbach // Helicobacter. – 2010. - № 15. – Р. 163–176.

92. Broutet N. СagA status and eradication treatment outcome of anti-

Helicobacter pylori triple therapies in patients with nonulcer dyspepsia / N.

Broutet, A. Marais, H. Lamouliatte [et al. // J. Clin. Microbiol. - 2001. - №

39. – Р. 1319–1322.

93. Решетников О. В. Связь штаммов Helicobacter pylori, продуцирующих

Cag A, с желудочно-кишечной патологией / О. В. Решетников, С. А.

Курилович, С. А. Кротов [и др.] // Терапевтический архив. – 2005. - №

2. – С. 25-28.

94. Дубинская Т. К. Возможности эзофагогастродуоденоскопии в

диагностике хронического гастрита / Т. К. Дубинская, В. Н.

Сотников, А. В. Волова [и др.] // Рос. журнал гастроэнтерол., гепатол.,

колопроктол. – 2006. – Приложение № 28. – С. 126.

95. Ендоскопія травного каналу. Норма, патологія, сучасні класифікації /

В. Й. Кімакович, В. І. Нікішаєв, І. М. Тумак [та ін.] / ред. В. Й.

Кімаковича, В. І. Нікішаєва. - Львів : Медицина світу, 2008. – С. 208.

135

96. Rudnicka W. A potential double role of anti-Lewis X antibodies in

Helicobacter pylori-associated gastroduodenal ulcer / W. Rudnicka, E.

Czkwianianc // FEMS Immunol Med Microbiol. – 2009. - Vol. 30, № 2. –

P. 121-125.

97. Hidaka N. Endoscopic identification of Helicobacter pylori gastritis in

children / N. Hidaka, Y. Nakayama, A. Horiuchi, S. Kato, K. Sano // Dig

Endosc. – 2010. - №. 22. – P. 90–94.

98. Kim S. Magnifying gastroendoscopy for diagnosis of histologic gastritis in

the gastric antrum / S. Kim, K. Haruma, M. Ito [et al.] // Dig. Liver Dis. –

2004. - № 36. – P. 286-291.

99. Inoue H. In vivo observation of living cancer cells in the esophagus,

stomach, and colon using catheter-type contact endoscope, Endo-

Cytoscopy system / H. Inoue, T. Kazawa, Y. Sato, et al. // Gastrointest.

Endosc. Clin. N. Am. – 2004. - № 14. – Р. 589–594.

100. Kiesslich R. Diagnosing Helicobacter pylori in vivo by confocal laser

endoscopy / Kiesslich, R., M. Goetz, J. Burg [et al.] // Gastroenterology. –

2005. - № 128. – Р. 2119–2123.

101. Alaboudy A.A. Conventional narrow-band imaging has good correlation

with histopathological severity of Helicobacter pylori gastritis / A.A.

Alaboudy, A. Elbahrawy, S. Matsumoto, A. Yoshizawa // Dig Dis Sci. –

2011. - № 56. – P. 1127–1130.

102. Okubo M. Changes in gastric mucosal patterns seen by magnifying NBI

during H. pylori eradication / M. Okubo, T. Tahara, T. Shibata, M.

Nakamura, D. Yoshioka, Y. Maeda et al. // J Gastroenterol. – 2011. - №

46. – P. 175–182.

103. Okubo M. Usefulness of magnifying narrow-band imaging endoscopy in

the Helicobacter pylori-related chronic gastritis / M. Okubo, T. Tahara, T.

Shibata, M. Nakamura, Y. Kamiya, D. Yoshioka // Digestion. – 2011. - №

83. – P. 161–166.

136

104. Креймер В. Д. Возможности цифровой видеоэндоскопической

диагностики хеликобактерной инфекции при хронических

воспалительных заболеваниях желудка и двенадцатиперстной кишки

/ В. Д. Креймер, В. П. Тюрин, Е. А. Коган [и др.] // Клиническая

медицина. – 2009. - № 9. – С. 43-46.

105. Ji R. Confocal laser endomicroscopy for diagnosis of Helicobacter pylori

infection: a prospective study / R. Ji, Y.Q. Li, X.M. Gu [et al.] // J.

Gastroenterol. Hepatol. – 2010. - № 25. – P. 700–705.

106. Wang X. I. The role of routine immunohistochemistry for Helicobacter

pylori in gastric biopsy / X. I. Wang, S. Zhang, F. Abreo, J. Thomas // Ann

Diagn Pathol. – 2010. - № 14. – P. 256–259.

107. Graham D. Y. Practical rapid, minimally invasive, reliable nonendoscopic

method to obtain Helicobacter pylori for culture / D. Y. Graham, M. Kudo,

R. Reddy, A. R. Opekun // Helicobacter. – 2005. - № 10. – P. 1–3.

108. Malfertheiner P. Management of Helicobacter pylori infection – the

Maastricht IV/Florence Consensus Report / P. Malfertheiner, F. Megraud,

C. A. O’Morain et al. // Gut. – 2012. - № 61. – Р. 646–664.

109. Leszczynska K. Patient factors affecting culture of Helicobacter pylori

isolated from gastric mucosal specimens / K. Leszczynska, A. Namiot, Z.

Namiot, J.K. Leszczynska, P. Jakoniuk, M. Chilewicz, et al. // Adv Med

Sci. – 2010. - № 55. – P. 161–166.

110. Булыч П. В. Язвенное поражение желудка и двенадцатиперстной

кишки в практике эндопротезирования / П. В. Булыч, А. Н. Косяков,

Н. В. Бабич // Клінічна хірургія. – 2008. - № 1. – С.49–52.

111. Винокуров М. М. Тактика лечения больных с язвенным

гастродуоденальным кровотечением / М. М. Винокуров, М. А.

Капитонова // Хирургия. – 2008. - № 2. – С. 33–36.

137

112. Губергриц Н. Б. Хронический гастрит: насколько это просто? / Н. Б.

Губергриц // Сучасна гастроентерологія. – 2010. - № 3 (53). – С. 58–

69.

113. Шапошников А. В. Предраковые заболевания желудка / А. В.

Шапошников // Клиническая медицина.– 2007. - № 2. – С.4–9.

114. Lee H. K. Differences of urease activity and expression of associated

genes according to gastric topography / H.K. Lee, H. Kim, H.S. Chae [et

al.] // Helicobacter. – 2011. - № 16. – P. 20–26.

115. Grove D. I. Isolation of Helicobacter pylori after transport from a regional

laboratory of gastric biopsy specimens in saline, Portagerm pylori or

cultured on chocolate agar / D. I. Grove, R. A. B. McLeay, K. E. Byron, G.

Koutsouridis // Pathology. – 2001. - № 33. - Р. 362-364.

116. Bartnik W. Clinical aspects of H. pylori infection / W. Bartnik // Pol. Arch.

Med. Wewn. - 2008. – Vol. 118 (7-8). - P. 426-430.

117. Медвецький Є. Б. Спосіб забарвлення Helicobacter pylori в

цитологічних препаратах / Є. Б. Медвецький, І. О. Вільцанюк //

Вісник морфології. - 2001. - Т.7, №1. - С. 154-155.

118. Braden B. Diagnosis of Helicobacter pylori infection / B. Draden // BMJ. –

2012. - № 344. – Р. 828.

119. Нестеренко З. В. Современные аспекты диагностики заболеваний

гастродуоденальной зоны у детей / З. В. Нестеренко, Л. А. Семененко,

Л. В. Медведева [и др.] // Український медичний альманах. – 2009. –

Т. 12, № 3. – С. 133-134.

120. Bar A. Cyclodextrins / A. Bar // Regul Toxicol Pharmacol. - 2004. - №. 39

(Suppl 1). - S. 1–2.

121. Циммерман Я. С. Проблема хронического гастрита / Я. С. Циммерман

// Клиническая медицина.– 2008. - № 5. – С.13 – 21.

122. Jiang X. P. Growth supplements for Helicobacter pylori / X. P. Jiang, M.

P. Doyle // J. Clin. Microbiol. – 2000. - № 38. – Р. 1984–1987.

138

123. Cellini L. New plate medium for growth and detection of urease activity of

Helicobacter pylori / L. Cellini, N. Allocati, R. Piccolomini [et al.] // J.

Clin. Microbiol. – 1992. - № 30. – Р. 1351–1353.

124. Juttner S. Reliable detection of macrolideresistant Helicobacter pylori via

fluorescence in situ hybridization in formalin-fixed tissue / S. Juttner, M.

Vieth, S. Miehlke et al. // Mod. Pathol. – 2004. - № 17. – Р. 684–689.

125. Miendje Deyi V.Y. Comparative evaluation of 3 selective media for

primary isolation of Helicobacter pylori from gastric biopsies under

routine conditions / V.Y. Miendje Deyi, C. Van den Borre, V. Fontaine //

Diagn Microbiol Infect Dis. – 2010. - № 68. – P. 474-476.

126. Dent J. C. Evaluation of a new selective medium for Campylobacter pylori

/ J. C. Dent, C. A. McNulty // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 1988. -

№ 7. – Р. 555–558.

127. Циммерман Я. С. Актуальные проблемы клинической

гастроэнтерологии: Клинические очерки / Я. С. Циммерман. – Пермь:

Б.И., 2008. – 360 с.

128. Кишкун А. А. Современные методы диагностики и оценки

эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori

(обзор литературы) / А. А. Кишкун // Клиническая лабораторная

диагностика. –2002. - № 8. – С. 41–46.

129. Bury-Mone S. Is Helicobacter pylori a true microaerophile? / S. Bury-

Mone, N. O. Kaakoush, C. Asencio et al. // Helicobacter. – 2006. - № 11. –

Р. 296–303.

130. Передерій В. Г. Бактеріологічний метод визначення чутливості

Helicobacter pylori до антибактеріальних препаратів / В. Г. Передерій,

Ю. О. Володічева, Ю. Г. Кузенко [та інш.] // Сучасна

гастроентерологія. – 2011. – № 3 (59). – С. 7-10.

139

131. Schraw W. Association of Helicobacter pylori vacuolating toxin (VacA)

with lipid rafts / W. Schraw, Y. Li, M.S. McClain et al. // J. Biol. Chem. –

2002. – Vol. 277. – P. 34642–34650.

132. Testerman T. L. Helicobacter pylori growth and urease detection in the

chemically defined medium Ham’s F-12 nutrient mixture / T. L.

Testerman, D. J. McGee, H. L. T. Mobley // J. Clin. Microbiol. – 2001. -

№ 39. – Р. 3842 – 3850.

133. Lin Y. L. Determination of optimal liquid medium for enzyme expression

by Helicobacter pylori / Y. L. Lin, E. Lee, C. Chan // J. Clin. Pathol. –

2006. - № 49. – Р. 818–820.

134. Orihara T. Effect of Helicobacter pylori eradication on gastric mucosal

phospholipid content and its fatty acid composition / T. Orihara, H.

Wakabayashi, A. Nakaya et al. // J. Gastroenterol. Hepatol. – 2001. – Vol.

16. – P. 269–275.

135. Короткий В. М. Особливості мікрофлори шлунка при хронічних

захворюваннях гастродуоденальної зони / В. М. Короткий, І. В.

Колосович, Б. Б. Шкурко [та ін.] // Сучасні препарати та технології. -

2009. - № 7. - С. 57-59.

136. Westblom T. U. Catalase negative mutants of Helicobacter pylori / T. U.

Westblom, S. Phadnis, W. Langenberg et al. // Eur. J. Clin. Microbiol.

Infect. Dis. – 1992. - № 11. – Р. 522–526.

137. Glupczynski Y. Culture of Helicobacter pylori from gastric biopsies and

antimicrobial susceptibility treating / Y. Glupczynski // Helicobacter

pylori׃ Techniques for clinical diagnosis and basic research / Ed. by A.

Lee, F. Megraud. – London etc. : Saunders, 2006. - P. 17-29.

138. Чернин В. В. Болезни пищевода, желудка и двенадцатиперстной

кишки: Руководство для врачей / В. В. Чернин. – Москва : Мед.

информ. агентство, 2010. – 528 с.

140

139. Megraud F. Helicobacter pylori Detection and Antimicrobial Susceptibility

Testing / F. Megraud, P. Lehours // Clin. Microbiol. Rev. – 2007. - № 2,

Vol. 20. – P. 280–322.

140. Пелішенко А. Г. Порівняльна характеристика різних методів

діагностики хелікобактеріозу на курорті Моршин / А. Г. Пелішенко,

Н. Ф. Половинко, І. О. Баєв // Світ медицини та біології. – 2010. - № 2.

– С. 210-212.

141. Xu J. Maintenance of Helicobacter pylori cultures in agar stabs / J. Xu, S.J.

Czinn, T.G. Blanchard // Helicobacter. – 2010. - № 15. – P. 477–480.

142. Kim do H. Culture and polymerase chain reaction of Helicobacter pylori

from rectal and terminal ileal fluid after polyethylene glycol (colyte)

ingestion in healthy adults with positive urea breath test / H. Kim do, H.M.

Jung, Y. J. Hwang, Y. S. Ahn, J. S. Mun,. B. H. Myoung [et al.] // Korean

J Gastroenterol. – 2010. - № 56. – P. 27–32.

143. Parsonnet J. Fecal and oral shedding of Helicobacter pylori from healthy

infected adults / J. Parsonnet, H. Shmuely, T. Haggerty // JAMA. – 1999. -

№ 282. – P. 2240–2245.

144. Dixon M. F. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney

System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis,

Houston 1994 / M. F. Dixon, R. M. Genta, J. H. Yardley, P. Correa // Am.

J. Surg. Pathol. – 1996. - № 20. - P. 1161-1181.

145. Marshall B. J. The future of H. pylori eradication a personal perspective /

B. J. Marshall // Alim. Pharm. & Therap. - 2007. – Suppl.1. – P. 109-115.

146. Пасиешвили Л. М. Пептическая язва и хронический гастрит:

достижения и перспективы / Л. М. Пасиешвили // Сучасна

гастроентерологія. – 2009. - № 4 (48). – С. 94-99.

147. Каратеев А. Е. Развитие и рецидивирование язв желудка и

двенадцатиперстной кишки у больных, принимающих нестероидные

противовоспалительные препараты: влияние стандартных факторов

141

риска / А. Е. Каратеев, В. А. Насонова // Терапевтический архив. –

2008. - № 5.– С. 62–64.

148. Аруин Л. И. Морфологическая диагностика болезней желудка и

кишечника / Л. И. Аруин, Л. Л. Капуллер, В. А. Исаков. – Москва :

Триада-X, 1998. – 483 с.

149. Прокопчук З. М. Порівняльне дослідження антимікробних та

біологічних властивостей супозиторіїв: автореф. диссертація к. мед.

н. – Харків: Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова

АМН України, 2001. – 27 с.

150. Осадчук А. М. Роль маркеров клеточного обновления (BCL-2, KI –

67) и апоптоза эпителиоцитов в возникновении опухолевых

заболеваний желудка, ассоциированных с H. pylori / А. М. Осадчук,

М.А. Осадчук, И. М. Кветной // Клиническая медицина.– 2008. - № 5.

– С.33–38.

151. Гюлумян О. Н. Схемы лечения семейной хеликобактерной инфекции

в амбулаторных условиях / О. Н. Гюлумян, С. Г. Сёмин, А. Б.

Сафонов [и др.] // Педиатрия. – 2007. – Т. 86. - № 5. – С. 32–37.

152. Морозов И. А. Морфологические аспекты H. pylori-инфекции в

желудке / И. А. Морозов // Матер. 6-й сессии Российской группы по

изучению Helicobacter pylori. – Омск. – 1997. – С. 19-23.

153. Aggarwal N. Unusual Helicobacter pylori in gastric resection specimens:

an old friend with a new look / N. Aggarwal, P. Snyder, S.R. Owens // Int.

J. Surg. Pathol. – 2011. - № 19. – P. 297–302.

154. Trebesius K. Rapid and specific detection of Helicobacter pylori macrolide

resistance in gastric tissue by fluorescent in situ hybridization / K.

Trebesius, K. Panthel, S. Strobel et al // Gut. – 2000. - Vol. 46. - P. 608-

614.

155. Russmann H. Comparison of fluorescent in situ hybridization and

conventional culturing for detection of Helicobacter pylori in gastric

142

biopsy speciments / H. Russmann, V. A. Kempf, S. Koletzko et al. //

J.Clin.Microbiol. – 2001. - Vol. 39. - P. 304-308.

156. Cerqueira L. PNA-FISH as a new diagnostic method for the determination

of clarithromycin resistance of Helicobacter pylori / L. Cerqueira, R. M.

Fernandes, R. M. Ferreira et al. // BMC Microbiol. – 2011. № 11. – Р. 101-

109.

157. Rugge M. Gastritis OLGA-staging and gastric cancer risk: a twelve-year

clinico-pathological follow-up study / M. Rugge, M. de Boni, G. Pennelli,

M. de Bona, L. Giacomelli, M. Fassan et al. // Aliment Pharmacol Ther. –

2010. - № 31. – P. 1104–1111.

158. Rugge M. Gastritis: the histology report / M. Rugge, G. Pennelli, E.

Pilozzi, M. Fassan, G. Ingravallo, V.M. Russo et al. // Dig Liver Dis. –

2011. - № 43 (Suppl 4). – P. 373–384.

159. Зак М. Ю. Классификация хронического гастрита: от Сиднейской

системы к системе OGLA / М. Ю. Зак // Сучасна гастроентерологія. –

2010. - № 6 (56). – С. 116-126.

160. Подгаецкая О. Ю. О природе уремического запаха при хронической

почечной недостаточности. Перспективы определения аммиака в

выдыхаемом воздухе / О. Ю. Подгаецкая, В. П. Валюхов, Б. Г.

Лукичёв [и др.]// Нефрология.– 2007.– Т. 11, №2. – С. 26–30.

161. Leodolter A. Current Standards in the Diagnosis of Helicobacter pylori

infection / A. Leodolter, K. Wolle, P. Malfertheiner // Dig. Diseases. –

2001. - Vol. 19. - P. 116-122.

162. Choi Y. J. Accuracy of diagnostic tests for Helicobacter pylori in patients

with peptic ulcer bleeding / Y. J. Choi, N. Kim, J. Lim et al. //

Helicobacter. – 2012. - № 17. – P. 77–85.

163. Ozaslan E. A forgotten cause of false negative rapid urease test: formalin

contamination of the sample / E. Ozaslan, T. Koseoglu, T. Purnak, A.

Yildiz // Hepatogastroenterology. – 2010. - № 57. – P. 4-10.

143

164. Hsu W.H. Dual specimens increase the diagnostic accuracy and reduce the

reaction duration of rapid urease test / W.H. Hsu, S.S. Wang, C.H. Kuo [et

al.] // World J Gastroenterol. – 2010. - № 16. – P. 2926–2930.

165. Cox D. M. The isolation and characteristics of urease-negative variants of

Helicobacter pylori / D. M. Cox, A. McLaren, M. A. Snowden // Rev. Esp.

Enf. Digest. – 1990. - Vol. 78. – P. 29.

166. Pohl G. Principle and applications of digital PCR / G. Pohl, I-M. Shih //

Expert Rev. Mol. Diagn. – 2004. – Vol.4 (1). – P. 41–47.

167. Миронова Т. В. Возможности метода полимеразной цепной реакции в

диагностике НР – ассоциированных заболеваний у детей / Т. В.

Миронова // Актуальные проблемы абдоминальной патологии у

детей: материалы конференции детских гастроэнтерологов России –

Москва, 2010. – С. 123-128.

168. Agusti G. Viability determination of Helicobacter pylori using propidium

monoazide quantitative PCR / G. Agusti, F. Codony, M. Fittipaldi, B.

Adrados, J. Morato // Helicobacter. – 2010. - № 15. – P. 473–476.

169. Агеева Е. С. Молекулярно-генетические факторы, влияющие на исход

инфицирования Helicobacter pylori у жителей Республики Хакасия / Е.

С. Агеева, О. В. Штыгашева, Н.В. Рязанцева [и др.] // Российский

журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колонопроктологии. – 2010.

- № 4. – С. 16-21.

170. Agudo S. Detection of Helicobacter pylori and clarithromycin resistance in

gastric biopsies of pediatric patients by using a commercially available

real-time polymerase chain reaction after NucliSenssemiautomated DNA

extraction / S. Agudo, T. Alarcon, P. Urruzuno, M.J. Martinez, M. Lopez-

Brea // Diagn Microbiol Infect Dis. - 2010. - № 67. – P. 213–219.

171. Ramirez-Lazaro M. J. Real-time PCR improves Helicobacter pylori

detection in patients with peptic ulcer bleeding / M. J. Ramirez-Lazaro, S.

Lario, A. Casalots et al. // PLoS ONE. – 2011. - № 6. – Р. 20-29.

144

172. Lu H. New ideas for future study of Helicobacter pylori / H. Lu, Xiao S //

Digestive diseases. - 2013. - DOI: 10.1111/1751-2980.12105.

173. Tonkic A. Epidemiology and Diagnosis of Helicobacter pylori Infection /

A. Tonkic, M. Tonkic, P. Lehours, F. Megraud // Helicobacter. - 2012. -

Vol. 7. - P. 1-8.

174. Ren L. High frequency variations of Helicobacter pylori isolates in

individual hosts in a Chinese population / L. Ren, Y. L. Liao, Y. Song et

al. // Int J Infect Dis. – 2012. - № 16. – Р. 358–363.

175. Щербаков П. Л. Современные проблемы подростковой

гастроэнтерологии / П. Л. Щербаков // Педиатрия. – 2010. - № 2, Т. 89.

– С. 6-11.

176. Toyoda K. Serum pepsinogen and Helicobacter pylori infection-a Japanese

population study / K. Toyoda, N. Furusyo, T. Ihara et al. // Eur J Clin

Microbiol Infect Dis. – 2012. – Vol. 31. – Р. 2117–2124.

177. Bornschein J. Serological assessment of gastric mucosal atrophy in gastric

cancer / J. Bornschein, M. Selgrad, T. Wex et al. // BMC Gastroenterol. –

2012. - № 12. – Р. 10.

178. Perna F. A new 24 h ELISA culture based method for Helicobacter pylori

chemosusceptibility / F. Perna, D. Vaira // J Clin Pathol. – 2010. - № 63. –

P. 648–651.

179. Решетников О. В. Распространённость атрофического гастрита в

разных популяциях Сибири по данным серологического

исследования / О. В. Решетников, С. А. Курилович, С. А. Кротов [и

др.] // Клиническая медицина.– 2008. - № 7. – С.35–38.

180. Delahay R. M. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection / R. M.

Delahay, M. Rugge // Helicobacter. – 2012. - № 17 (Suppl. 1). – Р. 9–15.

181. Авраменко А. А. Язвенная болезнь (очерки клинической

патофизиологии) / А. А. Авраменко, А. И. Гоженко, В. С. Гойдык. –

Одесса : ООО «РА «АРТ-В», 2008. – 304 с.

145

182. Пиманов С. И. Возможности диагностики атрофического гастрита

серологическим методом / С. И. Пиманов, Е. В. Макаренко //

Терапевтический архив. – 2008. - № 2. – С. 15-21.

183. Gong Y. Comparative study of serology and histology based detection of

Helicobacter pylori infections: a large population-based study of 7,241

subjects from China / Y. Gong, L. Sun, S. Jin, Y. Yuan // Eur J Clin

Microbiol Infect Dis. – 2010. - № 29. – P. 907-911.

184. Hung H. Immunoglobulin G antibody against Helicobacter pylori is an

accurate test for atrophic gastritis / H. Hung, T. Chen, H. Lin // J Chin Med

Assoc/ - 2010. - № 73. – P. 355–359.

185. Gonzalez C. A. Helicobacter pylori cagA and vacA genotypes as

predictors of progression of gastric preneoplastic lesions: a long-term

follow-up in a high-risk area in Spain / C. A. Gonzalez, C. Figueiredo, C.

B. Lic, R.M. Ferreira, M. L. Pardo, J. M. Ruiz Liso [et al.] // Am J

Gastroenterol. – 2011. - № 106. – P. 867–874.

186. Корниенко Е. А. Неинвазивные методы диагностики инфекции,

вызванной Helicobacter pylori / Е. А. Корниенко, В. Е. Милейко, В. А.

Самокиш, О.Н. Нажиганов // Педиатрия. – 1999. - № 1. – С. 37-41.

187. Petrovic M. Relationship between Helicobacter pylori infection estimated

by (14)C-urea breath test and gender, blood groups and Rhesus factor / M.

Petrovic, V. Artiko, S. Novosel, T. Ille, D. Sobic-Saranovic, S. Pavlovic, et

al. // Hell J Nucl Med. – 2011. - № 14. - P. 21-24.

188. De Francesco V. Helicobacter pylori antibiotic resistance and 13C urea

breath test values / V. De Francesco, A. Zullo, F. Perna, F. Giorgio, C.

Hassan, L. Vannella [et al.] // J Med Microbiol. – 2010. - № 59 ( Pt 5 ) . –

P. 588–591.

189. Nocon M. Efficacy and cost-effectiveness of the 13C-urea breath test as

the primary diagnostic investigation for the detection of Helicobacter

pylori infection compared to invasive and non-invasive diagnostic tests /

146

A. Nocon, A. Kuhlmann, A. Leodolter, S. Roll, C. Vauth, S. N. Willich, et

al. // GMS Health Technol Assess. – 2009. - № 5. – P. 5–12.

190. Leal Y. A. 13C-urea breath test for the diagnosis of Helicobacter pylori

infection in children: a systematic review and meta-analysis / Y. A. Leal,

L. L. Flores, E. M. Fuentes-Panana [et al.] // Helicobacter. – 2011. - № 16.

– Р. 327–337.

191. Wardi J. A rapid continuous-real-time 13C-urea breath test for the

detection of Helicobacter pylori in patients after partial gastrectomy / J.

Wardi, T. Shalev, O. Shevah et al. // J Clin Gastroenterol. – 2012. - № 46.

– Р. 293–296.

192. Luzza F. Evaluation of a commercial serological kit for detection of

salivary immunoglobulin G to Helicobacter pylori: a multicentre study / F.

Luzza, M. Imeneo, A. Marasco et al. // Eur J Gastroenterol Hepatol. –

2000. - № 12. - P. 1117-1120.

193. Cellini L. Detection of Helicobacter pylori in saliva and esophagus / L.

Cellini, R. Grande, L. Artese, L. Marzio // New Microbiol. – 2010. - № 33.

– P. 351–357.

194. Shimoyama T. Applicability of a rapid stool antigen test, using monoclonal

antibody to catalase, for the management of Helicobacter pylori infection /

T. Shimoyama, M. Sawaya, A. Ishiguro et al. // J Gastroenterol. – 2011. -

№ 46. – P. 487–491.

195. Choi J. Prospective evaluation of a new stool antigen test for the detection

of Helicobacter pylori, in comparison with histology, rapid urease test,

(13)C-urea breath test, and serology / J. Choi, C. H. Kim, D. Kimet al. // J

Gastroenterol Hepatol. – 2011. - № 26. - Р. - 1053-1059.

196. Horemans T. An alternative, sensitive method to detect Helicobacter pylori

DNA in feces / M. Horemans, M. Deschacht, S. Clais et al. // Helicobacter.

– 2011. - № 16. – P. 113–118.

147

197. Kodama M. Influence of proton pump inhibitor treatment on Helicobacter

pylori stool antigen test / M. Kodama, K. Murakami, T. Okimoto et al. //

World J Gastroenterol. – 2012. - № 18. - Р. 44–48.

198. Silva J. M. Validation of a rapid stool antigen test for diagnosis of

Helicobacter pylori infection / J. M. Silva, C. A. Villares, S. Monteiro Mdo

et al. // Rev Inst Med Trop Sao Paulo. – 2010. - № 52. – P. 125–128.

199. Pourakbari B. Evaluation of a new antigen for diagnosis of Helicobacter

pylori infection in stool of adult and children / B. Pourakbari, A.

Mirsalehian, P. Maleknejad et al. // Helicobacter. – 2011. - № 16. – P. 42-

46.

200. Namiot D. B. The occurrence of Helicobacter pylori antigens in dental

plaque; an association with oral health status and oral hygiene practices /

D. B. Namiot, K. Leszczynska, Z. Namiot et al. // Adv Med Sci. – 2010. -

№ 55. – P. 167-171.

201. Chaudhry S. Simultaneous amplification of two bacterial genes: more

reliable method of Helicobacter pylori detection in microbial rich dental

plaque samples / S. Chaudhry, M. Idrees, M. Izhar, A.K. Butt, A.A. Khan

// Curr Microbiol. – 2011. - № 62. P. 78–83.

202. Rasmussen L. T. Helicobacter pylori detection in gastric biopsies, saliva

and dental plaque of Brazilian dyspeptic patients / L. T. Rasmussen, R. W.

Labio, L. L. Gatti, L. C. Silva, V. F. Queiroz, A. Smith, et al. // Mem Inst

Oswaldo Cruz. – 2010. - № 105. - P. 326-330.

203. Wu W. Recent Insights into Antibiotic Resistance in Helicobacter pylori

Eradication / W. Wu, Y. Yang, G. Sun // Gastroenterol. Res. Pract. – 2012.

- № 20. – Р. 72–73.

204. Буторов И. В. Медицинская, социальная и экономическая

эффективность лечения больных язвенной болезнью в условиях

дневного стационара / И. В. Буторов, Ю. П. Осояну, В. В. Максимов

[и др.]// Клиническая медицина. – 2006. - № 1. – С. 53–56.

148

205. Fiorini G. Newer agents for Helicobacter pylori eradication / G. Fiorini, A.

Zullo, L. Gatta [et al.] // Clin. Exp. Gastroenterol. – 2012. - № 5. – Р. 109-

112.

206. Horiki N. Annual change of primary resistance to clarithromycin among

Helicobacter pylori isolates from 1996 through 2008 in Japan / N. Horiki,

F. Omata, M. Uemura [et al.] // Helicobacter. – 2009. - № 14. – Р. 86–90.

207. Gazi S. Real-Time PCR detection and quantitation of Helicobacter pylori

clarithromycin-resistant strains in archival material and correlation with

Sydney classification / S. Gazi, A. Karameris, M. Christoforou [et al.] //

Annals of Gastroenterology. – 2013. - № 26. - Р. 226-232.

208. De Francesco V. Primary clarithromycin resistance in Italy assessed on

Helicobacter pylori DNA sequences by TaqMan real-time polymerase

chain reaction / V. De Francesco, M. Margiotta, A. Zullo // Aliment.

Pharmacol. Ther. – 2006. – Vol. 23, № 3. – P. 429-435.

209. Бодревич Б. Б. Про резистентність до антибіотиків штамів

Helicobacter pylori в Україні / Б. Б. Бодревич // Гастроентерологія:

Міжвід. зб. – Дніпропетровськ, 2001. – Вип. 32. – С. 284–290.

210. Kim N. The Effect of Antibiotic Resistance on the Eradication of

Helicobacter pylori / N. Kim // Korean J. Gastroenterol. – 2006. – Vol. 47.

– P. 82–86.

211. Саблин О. А. Проблема резистентности Helicobacter pylori к

кларитромицину / О. А. Саблин, Т. А. Ильчишина //

Гастроэнтерология. – 2009. - № 2. – Приложение Consilium medicum.

– С. 4-8.

212. Janssen M. J. Low prevalence of metronidazole and clarithomycin-

resistant Helicobacter pylori in the Hertogenbosch region, 1998-2003 / M.

J. Janssen, P. M. Schneeberger, W. A. de Boer // J. Chemother. – 2005. –

Vol.17. – P. 270–276.

149

213. O’Connor A. Treatment of Helicobacter pylori Infection / A. O’Connor, J.

P. Gisbert, D. McNamara, C. O’Morain // Helicobacter. – 2011. - № 16

(Suppl. 1). – Р. 53–58.

214. Cambau E. Evaluation of a new test, genotype HelicoDR, for molecular

detection of antibiotic resistance in Helicobacter pylori / E. Cambau, V.

Allerheiligen, C. Coulon [et al.] // J. Clin. Microbiol. – 2009. - № 47. - Р.

3600–3607.

215. De F. Minimal inhibitory concentration (MIC) values and different point

mutations in the 23S rRNA gene for clarithromycin resistance in

Helicobacter pylori / F. De, A. Zullo, E. Ierardi, D. Vaira // Dig. Liver.

Dis. – 2009. - № 41. – Р. 610-611.

216. Терминология, определения терминов и диагностические критерии в

эндоскопии пищеварительного тракта: номенклатура OMED / Зденек

Маржатка при сотрудничестве и с участием членов комитета по

терминологии OMED. – 3-е изд., перер. и доп. - Bad Homburg :

NORMED-Verlag, 1996. – 208 с.

217. Морозов И. А. Цитологическая диагностика инфекции Helicobacter

pylori в желудке // Рос. журнал гастроэнтерол., гепатол., колопроктол.

– 2000. - № 2. – С. 7-9.

218. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учеб. /

под ред. А. А. Воробьева. – М. : Медицинское информационное

агентство, 2004. – 691 с.

219. Лабораторна діагностика гастритів, виразкової хвороби шлунка та

дванадцятипалої кишки, які викликані Helicobacter pylori (Методичні

рекомендації) / Харків. НДІ мікробіол. та імунол. ім. І. І. Мечникова.

– Харків, 1995. – 20 с.

220. Методы общей бактериологии : пер. с англ., 3-х т. т. 2 / под ред. Ф.

Герхардта. - Москва : Мир, 1984. – 472 с.

150

221. Методические указания по микробиологической диагностике

заболеваний, вызываемых энтеробактериями / МЗ СССР № 04-723/3

от 17.12.84 г. – Москва : 1984. – 136 c.

222. Приказ № 535 ”Об унификации микробиологических

(бактериологических) методов исследования, применяемых в

клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических

учреждений” / МЗ СССР от 22.04.1985 г. – Офиц. изд. - 123 с.

223. Методические рекомендации «Применение бактерийных

биологических препаратов в практике лечения больных кишечными

инфекциями, диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» / МЗ

СССР. – Москва : 1986 г. – 23 с.

224. Основные методы лабораторных исследований в клинической

бактериологии / Руководство ВООЗ. – Женева, 1994. – 132 с.

225. Лабораторные тесты. Микробиологическая и вирусологическая

диагностика. / под ред. М. Х. Турьянова, М. Каппа. – Москва: Каппа,

1995. – Ч. І. – 111 с.

226. Лабораторные тесты. Микробиологическая и вирусологическая

диагностика. / Под ред. М. Х. Турьянова, М. Каппа. – Москва : Каппа,

1995. Ч. ІІ. – 144 с.

227. Методичні рекомендації „Лабораторна діагностика гнійно-запальних

захворювань, обумовлених аспорогенними анаеробними

мікроорганізмами” / МОЗ України. – Харків : 2000. – 35 с.

228. ГОСТ 10. 444. 1 – 84 (СТСЭВ 3833 – 82) “Приготовление растворов,

реактивов, красок, индикаторов и питательных серед, применяемых в

микробиологическом анализе”. - Введен в действие 1985–30-06. -

Москва : Издательство стандартов, 2002. – 19 с.

229. Про затвердження методичних вказівок «Визначення чутливості

мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів» : наказ № 167 від

05.04.07. – Офіц. вид. – К. : Міністерство охорони здоров’я України,

151

2007. – 6 с. - (Нормативний документ Міністерства охорони здоров’я

України. Наказ).

230. Баснакьян И. А. Культивирование микроорганизмов с заданными

свойствами. – М. : Медицина, 1992. – С. 29-59.

231. Критерии для интерпритации результатов испытаний, основанных на

методе Бауэр-Кирби // Серия технических докладов ВОЗ, Женева. –

1984. – № 873. – С. 147–189.

232. Midolo P. D. Antimicrobial resistance testing of Helicobacter pylori : a

comparison of Etest and disk diffusion methods / P. D. Midolo, J. M. Bell,

J. R. Lambert [et al.] // Pathology. – 1997. – Vol. 29, № 4. – Р. 411–414.

233. Grignon В. Validation of Diffusion Methods for Macrolide Susceptibility

Testing of Helicobacter pylori / В. Grignon, J. Tankovic, F. Mеgraud [et

al.] // Microbial. Drug. Resistance. – 2002. – Vol. 8, № 1. – Р. 61–66.

234. Smaill F. Antibiotic susceptibility and resistance testing: an overview //

Can. J. Gastroenterol. – 2000. – Vol. 14, № 10. – Р. 871–875.

235. Корниенко Е. А. Сравнительная оценка эффективности современных

методов диагностики инфекции Helicobacter pylori / Е. А. Корниенко,

Н. И. Паролова, М. А. Дмитриенко // Consilium medicum. Педиатрия.

– 2008. – № 1. – С. 4–8.

236. Паролова Н. И. Сравнение неинвазивных методов диагностики

Helicobacter pylori. Опыт применения дыхательного «Хелик»-

аппарата у детей / Н. И. Паролова, Е. А. Корниенко, М. А.

Дмитриенко, С. Э. Быков // Медлайн Экспресс. – 2007. – № 6. – С. 58–

59.

237. Tsukanov V. V. Helicobacter pylori infection, intestinal metaplasia, and

gastric cancer risk in Eastern Siberia / V. V. Tsukanov, N. N. Butorin, A.

S. Maady [et al.] // Helicobacter. – 2011. - № 16. – Р. 107–112.

238. Непорада К. С. Вплив попередньої адаптації на патогенез пептичної

виразки / К. С. Непорада, О. Ф. Гопко, І. М. Скрипник // ВДНЗУ

152

«Українська медична стоматологічна академія», Полтава. – 2008. – С.

15–17.

239. «Про затвердження методичних вказівок "Визначення чутливості

мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів"» : наказ № 167 від

05.04.2007. – Офіц. вид. – К. : Міністерство охорони здоров`я

України, 2007. – 56 с. - (Нормативний документ Міністерства охорони

здоров`я України. Наказ).

240. Walsh E. J. Influence of medium composition on the growth and antigen

expression of Helicobacter pylori / E. J. Walsh, А. Р. Moran // J Appl

Microbiol. – 1997. - № 83. – Р. 67–75.

241. De Korwin J.D. Advantages and limitations of diagnostic methods for H.

pylori infection / J. D. De Korwin // Gastroenterol. Clin. Biol. - 2003. - №

27. - Р. 380-390.

242. Mégraud F. The most important diagnostic modalities for Helicobacter

pylori, now and in the future / F. Mégraud // Eur. J. Gastroenterol. Hepatol.

- 2012.- Suppl. 1. - Р. 13-15.

243. Циммерман Я. С. Гастродуоденальные заболевания и Helicobacter

pylori-инфекция: общее обозрение проблемы / Я. С. Циммерман //

Клиническая медицина. – 2009. - №5. - С. 9-15.

244. Рапопорт С. И., Лакшин А.А., Ракитин Б.В., Трифонов М.М. рН-

метрия пищевода и желудка при заболеваниях верхних отделов

пищеварительного тракта / под ред. академика РАМН Ф. И.

Комарова. – Москва : ИД МЕДПРАКТИКА-М, 2005, - 208 с.

245. Malfertheiner P. Management of Helicobacter pylori infection – the

Maastricht IV/Florence Consensus Report / P. Malfertheiner, F. Megraud,

C. A. O’Morain [et al.] // Gut. – 2012. - № 61. – Р. 646–664.

246. Пат. № 35137 (UA), МПК (2006): A61К 31/425 A61К 47/18 A61Р

31/00. Антимікробний засіб "Полідеканіт" для лікування гострих

кишкових інфекцій / Білоконь І. Ф., Спиридонов В. М., Любецька Ж.

153

А., Чуїленко В. М., Кобзар Г. І.; заявник Державне підприємство

"Державний науковий центр лікарських засобів" (UA). - З. №

99084735; заявл. 19.08.1999; опубліковано 15.04.2003, Бюл. № 4 /

2003.

247. Сидоренко С. В. Антибиотикограмма: диско-диффузионный метод,

метод серийных разведений. Интерпретация результатов / С. В.

Сидоренко, В. Е. Кокалов // Sanofi Pasteriur. - Москва : "Арина" -

1999. - № 31. - с. 25.

248. Ogata S. K. Evaluation of invasive and non-invasive methods for the

diagnosis of Helicobacter pylori infection in symptomatic children and

adolescents / S. K. Ogata, E. Kawakami, F. R. S. Patrício [et al.] // Sao

Paulo Med. J. – 2001. - № 2 (Vol. 119.) – Р. 67-71.

249. Корниенко Е. А. Сравнительная оценка непрерывной регистрации

концентрации аммиака в воздухе ротовой полости в диагностике

инфекции Helicobacter pylori / Е. А. Корниенко, М. А. Дмитриенко, С.

Н. Дроздова [и др.] // Терра-Медика. Лабораторная диагностика. –

2004. - № 2 (4). - С. 14 - 17.

250. Soltesz V. Optimal survival of Helicobacter pylori under various transport

conditions / V. Soltesz, B. Zeeberg, T. Wadstrom // Journal of Clinical

Microbiology. - 1992. - № 30. - Р. 1453–1456.

251. Кишкун А. А. Современные методы диагностики и оценки

эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori / А.

А. Кишкун // Клиническая лабораторная диагностика. – 2002.- № 8.–

С. 41-46.

252. Coudron P. E. Factors affecting and susceptibility testing of Helicobacter

pylori in liquid media / P.E. Coudron, C.W. Stratton // Journal of Clinical

Microbiology. – 1995. - № 33. – Р. 1028–1030.

253. Puera A. D. Helicobacter pylori and ulcerogenesis /A. D. Puera //American

Journal of Medicine. - 2006. - № 100. - Р. 3456-3459.

154

254. Ломов С. Ю. Роль факторов патогенности в механизме

хеликобактерных поражений желудка / С. Ю. Ломов // Журнал

микробиологии. – 1997. - № 6. – С. 108-111.

255. Германюк Т. А. Дослідження фармацевтичного ринку

антигелікобактерних препаратів та аналіз мінімізації витрат

антигелікобактерної терапії / Т. А. Германюк, С. П. Дзюбенко //

Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики. –

2012. - № 2 (9). – С. 102-106.

155

ДОДАТОК

156