PRIMERJAVA MIKROBNE POPULACIJE...faeces is possible and that human milk microbiota affects the...

I

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Maša HRIBAR

PRIMERJAVA MIKROBNE POPULACIJE

MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJ V MATERINEM

MLEKU IN BLATU DOJENČKA

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Prehrana

Ljubljana, 2016

I

UNIVERZA V LJUBLJANI

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

Maša HRIBAR

PRIMERJAVA MIKROBNE POPULACIJE MLEČNOKISLINSKIH

BAKTERIJ V MATERINEM MLEKU IN BLATU DOJENČKA

MAGISTRSKO DELO

Magistrski študij - 2. stopnja Prehrana

COMPARISON OF MICROBIAL POPULATION OF LACTIC ACID

BACTERIA IN HUMAN MILK AND INFANT FAECES

M. SC. THESIS

Master Study Programmes: Field Nutrition

Ljubljana, 2016

Hribar M. Primerjava mikrobne populacije mlečnokislinskih bakterij v materinem mleku in blatu dojenčka.

Mag. delo (Du2). Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2016

II

Magistrsko delo je zaključek magistrskega študijskega programa 2. stopnje Prehrana. Delo

je bilo opravljeno na Katedri za mlekarstvo Oddelka za zootehniko na Biotehniški fakulteti

Univerze v Ljubljani.

Komisija za študij 1. in 2. stopnje je za mentorico magistrskega dela imenovala

doc. dr. Andrejo Čanžek Majhenič, za somentorja prof. dr. Roka Orla in za recenzentko

prof. dr. Barbko Jeršek.

Mentorica: doc. dr. Andreja Čanžek Majhenič

Somentor: prof. dr. Rok Orel

Recenzentka: prof. dr. Barbka Jeršek

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednik:

Član:

Član:

Član:

Datum zagovora:

Podpisana izjavljam, da je naloga rezultat lastnega raziskovalnega dela. Izjavljam, da je

elektronski izvod identičen tiskanemu. Na univerzo neodplačno, neizključno, prostorsko in

časovno neomejeno prenašam pravice shranitve avtorskega dela v elektronski obliki in

reproduciranja ter pravico omogočanja javnega dostopa do avtorskega dela na svetovnem

spletu preko Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete.

Maša Hribar



III

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Du2

DK UDK 631.287.1+612.36-053.3:579.24/.26(043)=163.6

KG humano mleko/humani kolostrum/mlečnokislinske bakterije/blato dojenčka/

mikrobiota mlečne žleze/mikrobiota blata dojenčka

AV HRIBAR, Maša, dipl. inž. živ. in preh. (UN)

SA ČANŽEK MAJHENIČ, Andreja (mentorica)/ OREL, Rok (somentor)/ JERŠEK,

Barbka (recenzentka)

KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

LI 2016

IN PRIMERJAVA MIKROBNE POPULACIJE MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJ

V MATERINEM MLEKU IN BLATU DOJENČKA

TD Magistrsko delo (Magistrski študij - 2. stopnja Prehrana)

OP XI, 63 str., 12 pregl., 26 sl., 82 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Mikrobiota prebavnega trakta ima velik vpliv na zdravje človeka, njeno oblikovanje

pa se začne že pred porodom. Eden izmed najpomembnejših dejavnikov za

oblikovanje dojenčkove črevesne mikrobiote je način hranjenja. Materino mleko je

prva hrana večini dojenčkov, njegova mikrobiološka in biološka sestava pa vplivata

na mikrobioto dojenčkovega prebavnega trakta in s tem na mikrobioto blata. Da bi

ugotovili ali obstaja možnost prenosa istih sevov mlečnokislinskih bakterij iz

materinega mleka na blato dojenčka in obratno smo analizirali vzorce kolostruma in

mleka 30 in 90 dni po rojstvu, ter mekonija in blata 3, 30 in 90 dni po rojstvu pri 17

parih mama-dojenček, pri dveh dodatnih dojenčkih pa smo preiskovali le

morfološke značilnosti izolatov blata. DNA izolatov izoliranih iz vzorcev smo

analizirali z RAPD z začetnimi oligonukleotidi GTG5, M13 in KGT-80 GC. Ker

smo želeli ugotoviti prisotnost ali celo prevlado istega seva pri mami in njenem

dojenčku, smo določili relativno podobnost med sevi, glede na vzorce pomnožkov

dobljenih z začetnim oligonukleotidom GTG5. Iz posamezne skupine sevov smo

nato izbrali po enega predstavnika in jih skupno 52 poslali na sekvenčno analizo

variabilne regije V1-V3 16S rDNK. Pri desetih od 17 parov mama-dojenček, pri

enem dvakrat, smo posamezen sev mlečnokislinskih bakterij zasledili v obeh

okoljih, tako v vzorcih materinega mleka kot v vzorcih blata njenega dojenčka.

Poleg tega smo za 10 različnih sevov pridobljenih iz vzorcev mleka mam ter za 6

različnih sevov iz vzorcev blata različnih dojenčkov ugotovili, da se je posamezen

sev pri isti osebi lahko obdržal tudi dlje časa. Naša raziskava nakazuje, da se

mlečnokislinske bakterije iz materinega mleka nahajajo v blatu dojenčka in da zato

verjetno mikrobiota materinega mleka vpliva na oblikovanje mikrobiote dojenčka.



IV

KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Du2

DC UDC 631.287.1+612.36-053.3:579.24/.26(043)=163.6

CX human milk/ colostrum/ lactic acid bacteria/ infant faeces/ mammary gland

microbiota/ infant faeces microbiota

AU HRIBAR, Maša

AA ČANŽEK MAJHENIČ, Andreja (supervisor)/ OREL, Rok (co-advisor)/ JERŠEK,

Barbka (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Food Science and

Technology

PY 2016

TY COMPARISON OF MICROBIAL POPULATION OF LACTIC ACID

BACTERIA IN HUMAN MILK AND INFANT FAECES

DT M. Sc. Thesis (Master Study Programmes: Field Nutrition)

NO XI, 63 p., 12 tab., 26 fig., 82 ref.

LA sl

Al sl/en

AB Gut microbiota importantly influence human health and its formation starts even

before birth. One of the most important factors for establishing infant gut

microbiota is feeding style. Human milk is an initial food for most infants and its

microbiological and biological composition is affecting infant gut microbiota and

thus infant faeces microbiota. To establish if there is possible transfer of lactic acid

bacteria from human milk to infant faeces and vice-versa we analysed isolates from

colostrum and human milk samples, sampled 30 and 90 days after birth, and

meconium and infant faeces samples, sampled 3, 30 and 90 days after birth in 17

mother-infant pairs, in two additional infants we were investigating only

morphological aspects of faeces isolates. DNA of isolates was analysed with RAPD

with GTG5, M13 and KGT-80 GC primers to obtain genomic patterns, of which

only GTG5 primer was successful. Since we wanted to establish if there are the

same strains of lactic acid bacteria in mother’s milk and in faeces of her baby, we

determined strain similarity. From each group of strains with similar DNA pattern

we selected one representative strain and a total of 52 representatives were sent for

sequence analysis of V1-V3 16S rDNK variable region. At ten out of 17 mother-

infant pairs, of those in one pair two times, we identified the same strain of lactic

acid bacteria in both environments, in human milk and infant faeces. Moreover, we

observed the same strains in various samples of human milk at the same mother,

and same strains in various samples of infant faeces at the same infant. Our

research indicates that transfer of lactic acid bacteria from human milk to infant

faeces is possible and that human milk microbiota affects the formation of infant

faeces microbiota.



V

KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ................................................ III

KEY WORDS DOCUMENTATION .............................................................................. IV

KAZALO VSEBINE .......................................................................................................... V

KAZALO SLIK ............................................................................................................... VII

KAZALO PREGLEDNIC ................................................................................................ IX

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ............................................................................................. X

1 UVOD ........................................................................................................................ 1

1.1 DELOVNA HIPOTEZA ........................................................................................... 1

2 PREGLED OBJAV ................................................................................................. 2

2.1 MATERINO MLEKO ............................................................................................... 2

2.1.1 Biološka sestava materinega mleka ........................................................................ 2

2.1.1.1 Kolostrum .................................................................................................................. 3

2.1.1.2 Materino mleko prehodnega obdobja ........................................................................ 3

2.1.1.3 Zrelo materino mleko ................................................................................................ 3

2.1.1.4 Potencialni onesnaževalci v materinem mleku .......................................................... 3

2.1.2 Mikrobiološka sestava materinega mleka ............................................................. 3

2.1.2.1 Mikrobiološka sestava kolostruma ............................................................................ 4

2.1.2.2 Mikrobiološka sestava zrelega mleka ........................................................................ 4

2.1.2.3 Izvor mikroorganizmov v materinem mleku ............................................................. 6

2.1.2.4 Vpliv uživanja probiotikov na mikrobioto materinega mleka ................................... 8

2.2 ČREVESNA MIKROBIOTA DOJENČKA .............................................................. 9

2.2.1 Mikrobiološka sestava blata dojenčka ................................................................... 9

2.2.2 Pomen načina hranjenja za črevesno mikrobioto dojenčka .............................. 11

2.2.2.1 Pomen materinega mleka za črevesno mikrobioto dojenčka ................................... 12

2.2.2.2 Pomen mlečne formule za črevesno mikrobioto dojenčka ...................................... 12

2.2.2.3 Pomen trde hrane za razvoj črevesne mikrobiote dojenčka ..................................... 12

2.2.2.4 Drugi vplivi na oblikovanje črevesne mikrobiote dojenčka .................................... 13

2.2.3 Pomen mlečnokislinskih bakterij ......................................................................... 13

2.2.3.1 Probiotiki ................................................................................................................. 14

2.2.3.2 Prebiotiki .................................................................................................................. 15

3 MATERIAL IN METODE ................................................................................... 16

3.1 POTEK POSKUSA ................................................................................................. 16

3.2 MATERIALI ........................................................................................................... 17

3.2.1 Kriterij za vključitev parov mama-dojenček v raziskavo .................................. 17

3.2.2 Gojišča .................................................................................................................... 18

3.2.2.1 Trdo gojišče Rogosa ................................................................................................ 18

3.2.2.2 Tekoče gojišče MRS ................................................................................................ 18

3.2.3 Pribor ...................................................................................................................... 18



VI

3.2.4 Aparature ............................................................................................................... 19

3.2.5 Reagenti .................................................................................................................. 19

3.2.6 Programska oprema .............................................................................................. 20

3.3 METODE ................................................................................................................. 20

3.3.1 Priprava vzorcev .................................................................................................... 20

3.3.2 Morfološki pregled kolonij z barvanjem po Gramu .......................................... 20

3.3.3 Izolacija DNA s toplotno lizo ................................................................................ 21

3.3.4 RAPD ...................................................................................................................... 21

3.3.4.1 RAPD z začetnim oligonukleotidom GTG5 ............................................................ 22

3.3.4.2 RAPD z začetnim oligonukleotidom M13 .............................................................. 22

3.3.4.3 RAPD z začetnim oligonukleotidom KGT 80-GC .................................................. 23

3.3.5 Agarozna gelska elektroforeza ............................................................................. 24

3.3.6 Priprava DNA za sekvenciranje ........................................................................... 24

4 REZULTATI .......................................................................................................... 27

4.1 MORFOLOŠKE LASTNOSTI IZBRANIH IZOLATOV MLEČNOKISLINSKIH

BAKTERIJ .......................................................................................................................... 27

4.1.1 Makromorfološke lastnosti kolonij mlečnokislinskih bakterij .......................... 27

4.1.2 Mikromorfološke lastnosti mlečnokislinskih bakterij ........................................ 27

4.2 ANALIZA RAPD IN IDENTIFIKACIJA IZOLATOV ......................................... 28

4.2.1 Gelska elektroforeza .............................................................................................. 28

4.2.2 Relativna podobnost izolatov in identifikacija izbranih izolatov ...................... 28

4.3 TAKSONOMSKA UVRSTITEV IZOLATOV V VRSTE ..................................... 44

4.3.1 Pregled vrst mlečnokislinskih bakterij ................................................................ 46

5 RAZPRAVA ........................................................................................................... 47

6 SKLEPI ................................................................................................................... 52

7 POVZETEK ........................................................................................................... 53

8 VIRI ........................................................................................................................ 55

ZAHVALA



VII

KAZALO SLIK

Slika 1: Zastopanost bakterijskih rodov v materinem mleku (Solís in sod., 2010: 309). ...... 4 Slika 2: Shematski prikaz spreminjanja števila mikroorganizmov v mlečni žlezi (Fernández

in sod., 2013: 3). .................................................................................................................... 6 Slika 3: Potencialen model prenosa črevesnih bakterij matere v kolostrum in mleko

(Fernández in sod., 2013: 4). ................................................................................................. 7

Slika 4: Sorodnost med mikrobioto mleka in ostalega ženskega mikrobioma (Cabrera-

Rubio in sod., 2012: 550). ..................................................................................................... 8

Slika 5: Dejavniki, ki vplivajo na spremembe v sestavi črevesne mikrobiote v prvih 24

mesecih življenja (Mackie in sod., 1999; Marques in sod., 2010; Fouhy in sod., 2012). ... 10 Slika 6: Zastopanost bakterijskih rodov v blatu dojenčka (Solís in sod., 2010: 309). ........ 11 Slika 7: Shematski prikaz poteka praktičnega dela. ............................................................ 16 Slika 8: Kolonije mlečnokislinskih bakterij izolirane iz materinega mleka pri paru mama

dojenček LJ-095, zrasle po inkubaciji izolatov v anaerobnih razmerah (2 dni, 37 °C) na

gojišču Rogosa. .................................................................................................................... 27 Slika 9: Slike mikroskopskih razmazov barvanih po Gramu nekaterih naključnih vzorcev.

............................................................................................................................................. 28 Slika 10: Relativna podobnost profilov RAPD (GTG5) mlečnokislinskih bakterij izoliranih

pri paru mama-dojenček IZ-003 in identifikacija izbranih izolatov. ................................... 29 Slika 11: Relativna podobnost profilov RAPD (GTG5) mlečnokislinskih bakterij izoliranih

pri paru mama-dojenček LJ-004 in identifikacija izbranih izolatov. ................................... 30 Slika 12: Relativna podobnost profilov RAPD (GTG5) mlečnokislinskih bakterij izoliranih



pri paru mama-dojenček LJ-027 in identifikacija izbranih izolatov. ................................... 33

Slika 15: Relativna podobnost profilov RAPD (GTG5) mlečnokislinskih bakterij izoliranih
















VIII








IX

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Prevladujoče bakterijske vrste oziroma rodovi v materinem mleku

(Fernández in sod., 2013: 2). ................................................................................................. 5 Preglednica 2: Vzorci blata dojenčka in materinega mleka ter skupno število izolatov,

pridobljeno iz vzorcev pri posameznem paru mama-dojenček ........................................... 17 Preglednica 3: Sestava 20 µL reakcijske mešanice za RAPD z začetnim oligonukleotidom

GTG5 (Versalovic in sod., 1994). ....................................................................................... 22 Preglednica 4: Razmere reakcije RAPD z začetnim oligonukleotidom GTG5 (Versalovic in

sod., 1994) ........................................................................................................................... 22 Preglednica 5: Sestava 20 µL reakcijske mešanice za RAPD z začetnim oligonukleotidom

M13 (Torriani in sod., 1999). .............................................................................................. 23 Preglednica 6: Razmere reakcije RAPD z začetnim oligonukleotidom M13 (Torriani in

sod., 1999) ........................................................................................................................... 23 Preglednica 7: Sestava 20 µL reakcijske mešanice za RAPD z začetnim oligonukleotidom.

KGT 80-GC (Katedra za mlekarstvo, Domžale). ................................................................ 23 Preglednica 8: Razmere reakcije RAPD z začetnim oligonukleotidom KGT 80-GC

(Katedra za mlekarstvo, Domžale) ...................................................................................... 24 Preglednica 9: Sestava 30 µL-reakcijske mešanice za PCR pomnoževanja variabilne regije

V1 in V3 16S rDNA z začetnima oligonukleotidoma P1 in P4 (Klijn in sod., 1991). ........ 25 Preglednica 10: Razmere PCR za pomnoževanje variabilne regije V1 - V3 16S rDNA

izbranih izolatov (Klijn in sod., 1991). ................................................................................ 25 Preglednica 11: Identifikacija izolatov glede na rezultate sekveniranja variabilne regije V1-

V3 16S rDNA ...................................................................................................................... 44 Preglednica 12: Pregled izoliranih vrst mlečnokislinskih bakterij iz posameznih bioloških

vzorcev................................................................................................................................. 46



X

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

BD blato dojenčka

BLAST programsko orodje (angl. Basic Local Alignment Search Tool)

DC dendritične celice

DNA deoksiribonukleinska kislina (angl. Deoxyribonucleic Acid)

dNTP deoksiribonukleotid trifosfat (mešanica nukleotidov)

E. Enterococcus

EDTA etilendiamintetraocetna kislina (angl. Ethylenediaminetetraacetic acid)

EFSA Evropska agencija za varno hrano (angl. European Food Safety Authority)

ESPGHAN Evropsko združenje za pediatrično gastroenterologinjo, hepatologijo in

prehrano (angl. The European Society for Paediatric Gastroenterology

Hepatology and Nutrition)

FAO Organizacija Združenih narodov za prehrano in kmetijstvo (angl. Food and

Agriculture Organization of the United Nations)

FOS fruktooligosaharidi

GOS galaktooligosaharidi

IgA imunoglobulin A (protitelesa razreda A)

ITM indeks telesne mase

kb kilobazni par

KE kolonijske enote

L. Lactobacillus

MF mlečna formula

MKB mlečnokislinske bakterije

MM materino mleko

MO mikroorganizmi

MRS gojišče de Man-Rogosa-Sharpe

NCBI National Center for Biotechnology Information

OMM oligosaharidi materinega mleka

P. Pediococcus

PCR verižna reakcija s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction)

RAPD naključno pomnožena polimorfna DNA (angl. Randomly Amplified

Polymorphic DNA)

rDNA ribosomalna deoksiribonukleinska kislina (angl. Ribosomal

Deoxyribonucleic Acid)

RNA ribonukleinska kislina (angl. Ribonucleic Acid)

RPM obrati na minuto (angl. Revolutions Per Minute)

sIgA sekretorni imunoglobulin A

sp. vrsta (angl. species)

spp. podvrsta (angl. subspecies)



XI

TAE TRIS acetatni pufer

TGF - β transformirajoči rastni faktor beta

UPGMA metoda neponderirane aritmetične sredine (angl. Unweighted Pair Group

Method with Arithmetic mean)

UV ultravijoličen

WHO Svetovna zdravstvena organizacija (angl. World Health Organization)



1

1 UVOD

Mikrobna populacija v blatu dojenčka (BD) je odraz mikrobne populacije v dojenčkovem

prebavnem traktu. Raznolikost in številčnost posameznih predstavnikov bakterij v

prebavnem traktu vpliva na otrokovo zdravje in dobro počutje. Prva mikrobiota je še

posebej pomembna, saj predstavlja izhodiščno točko za razvoj zdrave mikrobiote v

odraslem obdobju. Na oblikovanje dojenčkove mikrobiote v prvem letu vpliva več

dejavnikov, med katerimi sta najpomembnejša način poroda in način hranjenja. V

slovenski študiji, ki je zajemala mamice in otroke iz treh slovenskih regij, se je izkazalo, da

je prve tri mesece izključno dojilo 68 % mater (Benedik, 2015), kar pomeni, da je materino

mleko (MM) pomemben vir dojenčkove prehrane, medtem ko je v evropskem prostoru

MM prva hrana 42-71 % otrok (Callen in Pinelli, 2004). Več raziskav je pokazalo, da se v

materinem mleku nahajajo mikroorganizmi in da le ti verjetno predstavljajo enega od virov

za oblikovanje dojenčkove črevesne mikrobiote. Moč vpliva pa lahko ugotovimo z

mikrobiološkimi analizami mleka in blata (Fernández in Rodríguez, 2014), zato smo se v

nalogi osredotočili na možen prenos mikrobne populacije mlečnokislinskih bakterij (MKB)

iz MM v BD. V ta namen smo pregledali mikrobioto iz vzorcev kolostruma in mleka ter

vzorcev blata dojenčka, vzorčenih ob različnih časih. Iz primerjave mikrobne populacije

MKB mleka in blata pri paru mama-otrok smo želeli ugotoviti, v kolikšni meri je MM vir

otrokove črevesne mikrobiote. Predvsem za seve, prisotne v obeh okoljih, pa lahko

predpostavimo njihovo robustnost, kar je vsekakor prednost v primeru nadaljnjih raziskav

sevov kot potencialnih probiotikov.

1.1 DELOVNA HIPOTEZA

Posamezne seve MKB bo moč zaslediti v obeh okoljih, tako v vzorcih kolostruma oziroma

materinega mleka, kot v vzorcih blata njenega dojenčka.



2

2 PREGLED OBJAV

2.1 MATERINO MLEKO

MM je popolna hrana za dojenčka v prvih šestih mesecih starosti, saj ga oskrbuje s

hranilnimi in bioaktivnimi snovmi, ki jih potrebuje za rast in razvoj. Njegova sestava se s

časom spreminja in je vselej v skladu z dojenčkovimi potrebami, prilagojeno pa je tudi

delovanju njegovih prebavil. ESPGHAN (angl. The European Society for Paediatric

Gastroenterology Hepatology and Nutrition) priporoča prehod na mešano hrano med 4. in

6. mesecem starosti, ter dopolnilno dojenje do enega leta (Agostoni in sod., 2008) . Dojenje

ugodno vpliva tako na mater kot dojenčka, hkrati pa MM sodeluje pri oblikovanju

dojenčkovega imunskega sistema ter mu tako nudi zaščito pred raznimi okužbami in

alergijami, na primer drisko, atopičnim dermatitisom, astmo ter dolgoročnim tveganjem za

debelost (Arenz in sod., 2004; Martín in sod., 2004; Harder in sod., 2005; Owen, 2005;

Hunt in sod., 2011). Obenem je pri dojencih (dojeni dojenčki) zaznati manj infekcijskih,

vnetnih in alergijskih bolezni, kot pri zalivancih, ki so hranjeni z mlečnimi formulami

(MF) (Fernández in Rodríguez, 2014).

2.1.1 Biološka sestava materinega mleka

MM je izloček zrelih mlečnih žlez, zgrajenih iz nabreklih alveolarnih celic in razvejanih

mlečnih vodov, potopljenih v vezivno in maščobno tkivo. Proces sinteze mleka imenujemo

laktogeneza in jo delimo v dve obdobji. Prvo obdobje, laktogeneza I, nastopi že med

nosečnostjo približno na polovici, njen začetek pa prepoznamo po povečani koncentraciji

laktoze in α-laktalbumina v krvi. Mlečna žleza je podvržena spremembam in postane

izločevalna mlečna žleza. Pod vplivom hormona prolaktina začno alveolarne celice tvoriti

in izločati majhne količine mleziva oz. kolostruma, ki vsebuje veliko natrija, klorida ter

zaščitnih snovi kot so imunoglobulini in laktoferin. Obilnejše izločanje kolostruma pa v

obdobju pred porodom preprečujejo visoke koncentracije v krvi prisotnega progesterona.

Laktogeneza II, ki se začne dva do osem dni po porodu in jo sproži hiter padec

progesterona v krvi, pa je zaznamovana z obilnim nastajanjem in izločanjem MM.

Kolostrum, ki je začetno rumenkasto mleko, bogato z beljakovinami, se tvori prve štiri dni

po porodu. Nadomesti ga mleko prehodnega obdobja, kar sovpada s pričetkom laktacije, ki

po približno 10-ih dneh preide v zrelo mleko (Riordan, 2005; Lawrence R. A. in Lawrence

R. M., 2011).

Glede na obdobje laktacije in s tem po sestavi, ločimo tri faze mleka, in sicer kolostrum ali

mlezivo, mleko prehodnega obdobja in zrelo mleko. Vsaka od teh faz sovpada z

otrokovimi spreminjajočimi se potrebami po hranilnih in bioaktivnih snoveh.



3

2.1.1.1 Kolostrum

Kolostrum je prvo mleko in se od zrelega mleka razlikuje že po videzu. Je gosta, rumena

tekočina, ki jo v majhnih količinah izločajo mlečne žleze prvih nekaj dni po porodu,

približno do 5 dni po porodu. Je bogat s serumskimi beljakovinami, imunskimi

komponentami kot so sekretorni imunoglobulin A (sIgA), laktoferin in levkociti ter

rastnimi faktorji kot sta epidermalni in transformirajoči rastni faktor beta (TGF-β). Vsebuje

relativno nizke koncentracije laktoze in maščob, iz česar lahko predvidevamo, da ima

večjo imunološko kot hranilno vlogo. Nivoji natrija, klorida in magnezija so višji, nivoja

kalija in kalcija pa nižja kot v zrelem MM. Kolostrum vsebuje dvakrat večjo koncentracijo

oligosaharidov materinega mleka (OMM) kot zrelo MM (Ballard in Morrow, 2013;

Andreas in sod., 2015). OMM delujejo kot prebiotiki in nudijo ugodnejše pogoje za rast

koristnim mikroorganizmom (MO), obenem pa zavirajo rast nekaterih potencialno

škodljivih MO (Hanson in Winberg, 1972; Martín in sod., 2004).

2.1.1.2 Materino mleko prehodnega obdobja

MM prehodnega obdobja ima nekaj značilnosti kolostruma, obenem pa je zaznamovan s

povečano proizvodnjo MM, ki zadošča prehranskim in razvojnim potrebam hitro rastočega

otroka med petim in štirinajstim dnem po porodu (Ballard in Morrow, 2013).

2.1.1.3 Zrelo materino mleko

Približno dva tedna po porodu začne v mlečnih žlezah nastajati zrelo mleko, katerega

sestava se štiri do šest tednov po porodu stabilizira. Kljub relativno stalni sestavi lahko

prihaja do manjših sprememb, ki pa so v primerjavi s spremembami v sestavi MM v prvem

mesecu po porodu praktično zanemarljive (Ballard in Morrow, 2013). V primerjavi s

kolostrumom je bogatejše s kazeinskimi beljakovinami in maščobami. Vsebnost beljakovin

v MM postopno pada od drugega do sedmega meseca. Nastajanje laktoze je najvišje med

četrtim in sedmim mesecem, nato se začne zmanjševati, medtem ko se vsebnost maščob v

MM postopno povečuje skozi celotno obdobje laktacije (Andreas in sod., 2015).

2.1.1.4 Potencialni onesnaževalci v materinem mleku

Poleg naravno prisotnih zaščitnih snovi, pa lahko MM vsebuje tudi snovi, ki so potencialno

škodljive za dojenčka. Gre za tako imenovane okoljske onesnaževalce, ki jih mati vnese v

telo preko hrane ali pa se iz materinih maščobnih zalog izločajo v MM (Nickerson, 2006).

MM pa lahko deluje tudi kot vektor prenosa nekaterih patogenih mikroorganizmov, npr.

virusa HIV-1, obenem pa kot zaščitni faktor pred njimi (Fernández in sod., 2013).

2.1.2 Mikrobiološka sestava materinega mleka

MM je dolgo časa veljalo za sterilno, v zadnjih letih pa se je pokazalo kot vir komenzalnih

in potencialno probiotičnih MO (Fernández in sod., 2013).



4

S spreminjanjem biološke sestave MM se posledično spreminja tudi mikrobiološka

sestava. Med laktacijo se izrazito spreminjajo razmerja zastopanosti posameznih rodov

MO, kar lahko vidimo na Sliki 1. Populacija MO v MM je običajno sestavljena iz nekaj

glavnih rodov MO, tako imenovanih "core" MO, ter ostalih, ki so manj zastopani. Skupno

je bilo v različnih vzorcih mleka identificiranih preko 200 različnih bakterijskih vrst iz 50

različnih rodov, medtem ko je pri posamezni mamici zastopanost vrst manjša, najpogosteje

od 2 do 18 vrst (Fernández in Rodríguez, 2014). Sicer pa si študije, opravljene na tem

področju, pogosto nasprotujejo celo v "core" populaciji, kar nakazuje na to, da so si

mikrobiote MM širom sveta precej različne in težje primerljive.

Slika 1: Zastopanost bakterijskih rodov v materinem mleku (Solís in sod., 2010: 309).

2.1.2.1 Mikrobiološka sestava kolostruma

Bakterijska raznolikost je največja v obdobju izločanja kolostruma. Da so razlike velike,

lahko opazimo tudi pri pregledu objav, kjer lahko zaznamo trend prevladujočih rodov

bakterij, identificiranih v kolostrumu, in sicer Weissella, Leuconostoc, Enterococcus,

Staphylococcus, Streptococcus, Bifidobacterium, Lactobacillus in Lactococcus (Jiménez in

sod., 2008a; Solís in sod., 2010; Ozgun in Vural, 2011; Cabrera-Rubio in sod., 2012).

Rezultati slovenske študije Moje-mleko so pokazali, da so v kolostrumu slovenskih mam

najpogosteje prisotni rodovi Staphylococcus, Gemella, Pediococcus in Streptococcus

(Obermajer in sod., 2015; Škorjanc, 2015).

2.1.2.2 Mikrobiološka sestava zrelega mleka

Po navedbah nekaterih študij naj bi v zrelem MM, v obdobju 1 do 6 mesecev po porodu,

prevladovali laktobacili, ki se jim pridružijo še bakterije ustne votline iz rodov Veillonella,

Leptotrichia in Prevotella. Ostali normalno prisotni rodovi bakterij v MM so

Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Weissella,

Propionibacterium, Micrococcus in Bifidobacterium (Mackie in sod., 1999; Cabrera-Rubio

in sod., 2012; Fernández in sod., 2013). Hunt in sod. (2011), ki so v študiji proučevali zrelo

mleko 16-ih mamic, so navedli kot prevladujoče rodove Staphylococcus, Streptococcus,

Serratia, Pseudomonas, Corynebacterium, Ralstonia, Propionibacterium, Sphingomonas



5

in Bradyrhizobiaceae in so predstavljali 51 % mikrobiote MM. Zanimiva je tudi njihova

ugotovitev, da sta rodova Lactobacillus in Bifidobacterium predstavljala le 2 do 3 %

populacije. Preglednica 1 prikazuje pregled bakterij, ki so bile v več študijah identificirane

v MM bodisi s pomočjo konvencionalnih gojitvenih tehnik ali s pomočjo genetskih tehnik.

Glede na pester nabor bakterij vidimo, da je MM je pomemben vir MKB za otroka (Martín

in sod., 2003, 2007)

Preglednica 1: Prevladujoče bakterijske vrste oziroma rodovi v materinem mleku (Fernández in sod., 2013:

2).

Bakterijska vrsta/rod

Identifikacija

bakterij z

gojitvenimi

tehnikami

Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve,

Bifidobacterium longum, Corynebacterium sp., E. durans, E. faecalis, E. faecium, E. hirae,

E. mundtii, E. spp., Kocurta rhizophila, L. acidophilus, L. animalis, L. brevis, L. casei, L.

crispatus, L. fermentum, L. gasseri, L. gastricus, L. helveticus, L. oris, L. plantarum, L.

reuteri, L. rhamnosus, L. salivarius, L. vaginalis, Lactobacillus ssp., Lactococcus lactis,

Leuconostoc mesenteroides, P. pentosaceous, Peptostreptococcus spp., Rothia

mucilaginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus hominis, Staphylococcus sp., Streptococcus australis, Streptococcus

gallolyticus, Streptococcus lactarius, Streptococcus mitis, Streptococcus oris, Streptococcus

parasanguis, Streptococcus salivarius, Streptococcus spp., Streptococcus vestibularis

Identifikacija

bakterij z

genetskimi

tehnikami

Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium bifidum,

Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenolatum, Bifidobacterium longum,

Bifidobacterium sp., Bradyrhizobiaceae, Clostridium sp., Clostridium sp., Corynebacterium

sp., E. faecalis, E. faecium, Enterococcus, L. fermentum, L. gasseri, L. rhamnosus,

Lactobacillus sp., Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum, Leuconostoc fallax,

Propionibacterium sp., Propionibacterium acnes, Pseudomonas sp., Ralstonia sp., Serratia

sp., Sphingomonas sp., Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis,

Staphylococcus sp., Streptococcus mitis, Streptococcus parasanguis, Streptococcus

salivarius, Streptococcus sp., Weissella cibaria, Weissella confusa

Poleg sestave se spreminja tudi velikost populacije MO v mlečnih žlezah in posledično v

MM. Kot prikazuje slika 2, se začne razvoj mikrobiote mlečne žleze pri ženski že v zadnjih

treh mesecih nosečnosti in doseže vrh ob zaključku nosečnosti. Vzpostavljena velikost in

sestava mikrobne populacije mlečne žleze se nato vzdržuje med celotnim obdobjem

laktacije, ki pa z odstavitvijo dojenčka začne padati in v nekaj dneh oz. v nekaj tednih

izgine (Fernández in sod., 2013).



6

Slika 2: Shematski prikaz spreminjanja števila mikroorganizmov v mlečni žlezi (Fernández in sod., 2013: 3).

2.1.2.3 Izvor mikroorganizmov v materinem mleku

Na podlagi podatkov iz literature o raznolikosti mikrobne sestave MM, ki se spreminja

glede na področje, kjer je bila raziskava opravljena ter glede na posameznika, se porajajo

vprašanja o vplivu genetike, okolja in prehranskih navad oziroma od kod in na kakšen

način pridejo MO v mleko oz. v tkivo mlečne žleze (Hunt in sod., 2011; Urbaniak in sod.,

2014). Taka in podobna vprašanja so še vedno predmet mnogih raziskav, ki ponujajo kar

nekaj modelov možnih prenosov. Poskusi spremljanja dojenja z ultrazvočnim slikanjem so

pokazali, da je pri dojenju možen povraten tok MM iz dojenčkove ustne votline nazaj v

mlečne vode (Ramsay in sod., 2004). Mikrobiota dojenčkove ustne votline je pretežno

oblikovana iz vaginalne in črevesne mikrobiote mame, pridobljenima med porodom, ki se

jima pridružijo še MO z materine kože in se nato skupaj z MM v manjši, a ne zanemarljivi

meri, povrnejo v mlečne vode. Tudi direkten prenos MO z materine kože med sesanjem

prispeva k mikrobni sestavi MM (Fernández in Rodríguez, 2014), a manj, kajti rodovi na

koži so predvsem aerobni (Treven in sod., 2015). Tretja pot prenosa bakterij v mlečno

žlezo, kateri je trenutno posvečeno največ pozornosti, je endogena »črevesno-mlečna pot«,

ki pravi, da se lahko nekateri MO vertikalno prenesejo iz materinega črevesja preko mleka

v otrokov prebavni trakt. Endogena pot se torej začne pri materi, ki z zauživanjem hrane v

svoja prebavila vnese tudi MKB. Fagocitne celice v črevesni sluznici, predvsem

dendritične celice, ki lahko s posebnimi izrastki prehajajo skozi črevesno epitelno

pregrado, ki jo tvori plast enterocitov, ki so med seboj povezani s tesnimi stiki, lahko

fagocitirajo žive mikroorganizme iz črevesne svetline. Dokazano je, da ne pride do

znotrajceličnega uničenja vseh fagocitiranih mikroorganizmov, ampak jih del ostane v teh

celicah živih. Celice s fagocitiranimi mikroorganizmi lahko po krvi in limfi potujejo v

oddaljene dele telesa, tudi v mlečno žlezo. Tako lahko razložimo pojav enakih sevov



7

bakterij v MM in materinem črevesu. Tu sodelujejo pri oblikovanju mikrobiote MM in

nato z dojenjem mikrobiote dojenčkovega prebavnega trakta. Potencialen model te poti

prikazuje slika 3 (Martín in sod., 2004; Fernández in Rodríguez, 2014; Treven in sod.,

2015). S to hipotezo bi potrdili še en pomemben vpliv materine prehrane na zdravje otroka,

obenem pa se ponuja priložnost za prenos probiotičnih bakterij preko matere na dojenčka.

Slika 3: Potencialen model prenosa črevesnih bakterij matere v kolostrum in mleko (Fernández in sod., 2013:

4).

Na mikrobioto MM vpliva več faktorjev, ki skupaj oblikujejo edinstven mikrobni prstni

odtis in je različen od mikrobiot drugih delov ženskega telesa. Slika 4 prikazuje sorodnost

med MO kolostruma ter mleka 1 oz. 6 mesecev po rojstvu in MO drugih niš ženskega

telesa, vključujoč kožo, vagino, ustno votlino, blato ter črevesno sluznico. Ko so z metodo

modela glavnih osi (angl. principal component analysis) primerjali 500000 zaporedij 16S

gena (V1-V2 regija), pridobljenih iz vzorcev mikrobiot vseh telesnih niš 18-ih mamic, se je

izkazalo, da se mikrobiota MM razlikuje od mikrobiot vzorcev ostalih niš in ni zgolj

rezultat okužbe z mikrobioto kože. V študiji so ugotavljali tudi vpliv načina poroda, in

sicer vaginalni ter načrtovani in nenačrtovani carski rez. Ugotovili so, da je mikrobiota

mleka žensk, ki so rodile z načrtovanim carskim rezom, po sestavi precej bolj podobno

mikrobioti kože, medtem ko je mikrobiota mleka žensk, ki so rodile z nenačrtovanim

carskim rezom precej bolj podobna mikrobioti mleka žensk, ki so rodile vaginalno

(Cabrera-Rubio in sod., 2012). V novejši študiji (Urbaniak in sod., 2016) pa vpliva načina

poroda in donošenosti oziroma prezgodnjega poroda niso potrdili.



8

Slika 4: Sorodnost med mikrobioto mleka in ostalega ženskega mikrobioma (Cabrera-Rubio in sod., 2012:

550).

2.1.2.4 Vpliv uživanja probiotikov na mikrobioto materinega mleka

Z uživanjem probiotikov se do določene mere spremeni sestava mikrobiote MM, kar pa

navadno ugodno vpliva tako na mamo kot na otroka. Pogosta težava, s katero se lahko

srečajo doječe mamice, je vnetje mlečne žleze ali mastitis, povzročajo pa ga predvsem

bakterije vrst Staphylococcus aureus in Staphylococcus epidermis ter nekateri drugi

(Fernández in sod., 2013). Razen z antibiotično terapijo je omenjeno težavo moč omiliti

tudi z zauživanjem probiotičnih bakterij v obliki fermentiranih izdelkov ali prehranskih

dopolnil, ki se nato po endogeni poti prenesejo iz črevesja matere v mlečne alveole, kar

pomaga vzpostaviti bolj ugodno mikrobioto. Na voljo je nekaj študij, v katerih so

probiotični sevi L. salivarius CECT 5713, L. gasseri 5714 in L. fermentum CECT 5716

uspešno izboljšali stanje mastitisa v primerjavi s kontrolno skupino (Heikkila in Saris,

2003; Fernández in sod., 2013).

Zaužiti probiotični sevi pa imajo lahko ugodne učinke tudi na otroka, saj ga lahko ščitijo

pred infekcijskimi boleznimi in raznimi bolnišničnimi okužbami z bakterijami, ki so

visoko odporne proti antibiotikom. Probiotike s potencialno probiotičnim učinkom za

otroka najpogosteje najdemo med laktobacili kot so L. gasseri, L. rhamnosus, L.

plantarum, L. fermentum, bifidobakterijami kot na primer Bifidobacterium breve,

Bifidobacterium adolescentis in Bifidobacterium bifidum ter E. faecium (Martín in sod.,

2004).



9

2.2 ČREVESNA MIKROBIOTA DOJENČKA

Mikrobna združba v prebavilih otroka se naglo spreminja in je nestabilna, dokler ne doseže

stabilnega stanja, kar se zgodi nekje pri drugem letu starosti (Marques in sod., 2010; Fouhy

in sod., 2012).

2.2.1 Mikrobiološka sestava blata dojenčka

Po ocenah naj bi blato odraslega človeka vsebovalo več kot 1011

KE/g blata, ki pripadajo

več kot 400 različnim bakterijskim vrstam, kjer pomembno vlogo igra predvsem

raznolikost vrst in sevov, ki sestavljajo črevesno mikrobioto (Mackie in sod., 1999; Fouhy

in sod., 2012). Pri odraslem človeku je v kolonu gostota MO največja, in sicer 1010

- 1011

KE/g črevesne vsebine, saj je prehod črevesne vsebine tu počasnejši.

Otrok in njegov prebavni trakt naj bi bila pred porodom sterilna, čeprav nekaj raziskav

kaže (Gosalbes in sod., 2013; Matamoros in sod., 2013), da se že pred porodom prične

poseljevanje otrokovega telesa z MO in se zelo intenzivno nadaljuje po porodu. Nadaljnja

poselitev otroškega prebavnega trakta z mikrobi je zapleten proces, na katerega vpliva

mnogo dejavnikov okolja kot so način poroda (carski rez oziroma vaginalni porod),

prehrana dojenčka (izključno dojenje oziroma MF), donošenost ali nedonošenost,

antibiotična terapija, bolnišnično okolje, bolezni oziroma okužbe, država rojstva, stik z

mamo in bolnišničnim osebjem ter telesna masa in prehrana matere (Slika 5) (Mackie in

sod., 1999; Fallani in sod., 2010; Marques in sod., 2010; Fouhy in sod., 2012).

Najpomembnejša dejavnika sta način poroda in način prehrane dojenčka.



10

Slika 5: Dejavniki, ki vplivajo na spremembe v sestavi črevesne mikrobiote v prvih 24 mesecih življenja

(Mackie in sod., 1999; Marques in sod., 2010; Fouhy in sod., 2012).

Črevesna mikrobiota dojenčka je kompleksen ekosistem, sestavljen iz številnih različnih

rodov, vrst in sevov. V mekoniju dojenčka je 108,7

KE/g, po desetih dneh pa v BD naraste

do 1010

KE/g in se stabilizira (Solís in sod., 2010). Poleg števila pa se s časom spreminja

tudi mikrobiološka sestava BD. Takoj ob rojstvu je novorojenčkov prebavni trakt praktično

sterilen, a ga zelo hitro poselijo fakultativno anaerobne bakterije kot so

Enterobacteriaceae, streptokoki, enterokoki in stafilokoki, med katerimi najdemo tudi

potencialno patogene seve, vendar le redko izzovejo obolenja. Namesto tega počasi

porabijo kisik, proizvedejo nove metabolite in s tem pripravijo okolje za striktno anaerobne

bakterije kot so bifidobakterije, Clostridium in Bacteroides, torej bakterijske skupine, ki

naj bi pomembno sodelovale pri zorenju dojenčkovih prebavil (Conroy in sod., 2009;

Marques in sod., 2010). Počasi začne naraščati tudi število laktobacilov, precej hitreje pa

naraste število bifidobakterij, ki pri 10-dni starem dojenčku predstavljajo že več kot

polovico mikrobne populacije blata dojenčka, njihovo število pa se, z manjšim upadom,

obdrži do starosti 90 dni (Solís in sod., 2010). Sicer pa na število MO v BD, bolj kot starost

dojenčka vpliva način hranjenja. Tako imajo dojenci za 101 KE/g manj prisotnih MO kot

zalivanci (Jiménez in sod., 2008b).

Najpogostejši predstavniki mikrobiote BD so iz rodov Lactobacillus, Bifidobacterium,

Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus ter Escherichia coli, Enterobacter cloacae in

Klebsiella pneumoniae (Fanaro in sod., 2003; Solís in sod., 2010).



11

Slika 6: Zastopanost bakterijskih rodov v blatu dojenčka (Solís in sod., 2010: 309).

Otroci rojeni vaginalno, so najprej izpostavljeni fekalni in vaginalni mikrobioti matere, ki

jo je takoj po porodu mogoče zaznati v žrelu in ustni votlini novorojenčkov. Med njimi so

najpogostejši Streptococcus, Escherichia coli in Listeria monocytogenes. V porodnem

kanalu nosečih žensk je bilo identificiranih več kot 18 rodov bakterij, med njimi laktobacili

in bifidobakterije ter različni streptokoki (Mackie in sod., 1999). Dojenčki rojeni s carskim

rezom imajo, v primerjavi z vaginalno rojenimi, večinoma manj bifidobakterij in bakterij

vrste Bacteroides fragilis, a več bakterij vrste Clostridium difficile, Klebsiella in

Enterobacter. Vaginalno rojeni so pogosteje poseljeni s fekalnimi in vaginalnimi MO

matere, medtem ko otroci rojeni s carskim rezom z mamo pogosteje delijo MO s kože

(stafilokoki) (Dominguez-Bello in sod., 2010), poleg tega pa očitnejša rast Bacteroides,

Bifidobacterium in Escherichia coli nastopi kasneje pri otrocih rojenih s carskim rezom

(Conroy in sod., 2009; Marques in sod., 2010).

Zaradi velikega vpliva črevesne mikrobiote na dozorevanje in regulacijo imunskega

sistema dojenčka, imajo lahko motnje v procesu normalnega poseljevanja črevesa, kot na

primer antibiotično zdravljenje in okužbe s patogenimi MO, različne dolgoročne posledice,

ki se v študijah najpogosteje povezujejo z ekcemi, alergijskim rinitisom in sindrom

razdražljivega črevesa (Conroy in sod., 2009; Marques in sod., 2010; Fouhy in sod., 2012;

Gosalbes in sod., 2013).

2.2.2 Pomen načina hranjenja za črevesno mikrobioto dojenčka

Način hranjenja ima velik vpliv na črevesno mikrobioto dojenčka zaradi različne biološke

in mikrobiološke sestave MM oz. MF. Znano je tudi, da mikrobiota BD odraža mikrobioto

glede na način prehranjevanja. Tako imajo dojenci na splošno stabilnejšo a manj raznoliko

mikrobno populacijo MO, kjer prevladujejo predvsem bifidobakterije in laktobacili,

medtem ko se pri zalivancih oblikuje mikrobiota, bogata z anaerobnimi bakterijami (Ahrné

in sod., 2005; Flint in sod., 2012).



12

2.2.2.1 Pomen materinega mleka za črevesno mikrobioto dojenčka

Dojenček na dan popije približno 800 ml MM ter s tem zaužije nekje od 105 do 10

7 g

bakterij, od katerih jih velika večina pride živih do črevesja dojenčka. Preživelost MO, ki

jih zaužije dojenček je boljša, kot če bi jih zaužil odrasel človek, predvsem zaradi krajšega

prehoda in višje vrednosti pH v želodcu (Heikkila in Saris, 2003; Blüher in sod., 2013;

Fernández in Rodríguez, 2014). To pomeni, da je pri dojencih MM eden glavnih virov

MO.

2.2.2.2 Pomen mlečne formule za črevesno mikrobioto dojenčka

Čeprav si proizvajalci MF močno prizadevajo čim bolj posnemati sestavo MM, predvsem z

dodajanjem oligosaharidov, probiotikov in drugih snovi, pa žal še vedno MF in MM

drugače vplivata na oblikovanje črevesne mikrobiote dojenčka (Wang in sod., 2015). Po

rezultatih neke študije, je v primerjavi z dojenci, je pri zalivancih tri do desetkrat povečano

tveganje za nastanek nekrotizirajočega enterokolitisa, ki predstavlja velik problem

predvsem pri nedonošenčkih (Lin in Stoll, 2006), zaznati pa je tudi več infekcijskih,

vnetnih in alergijskih bolezni (Fernández in Rodríguez, 2014). Pri zalivancih so številčneje

zastopane bakterije rodov Clostridium, Bacteroides, Klebsiella in Nitrobacteria, manj pa je

Firmicutes, obenem pa je v njihovi mikrobioti manjše število in manjša raznolikost

bifidobakterij. Pri delno dojenih dojenčkih pa je prisotnih več stafilokokov in sevov vrste

L. rhamnosus. Na splošno pa velja, da je črevesna mikrobiota zalivancev bolj raznolika od

črevesne mikrobiote dojencev (Conroy in sod., 2009; Fouhy in sod., 2012; Wang in sod.,

2015). Prav zaradi teh razlik dodajajo nekaterim MF probiotične seve. Zgleden primer

pozitivnega učinka dodajanja probiotičnih bakterij v MF je študija, v kateri so pri otrocih,

starih med 6 in 12 mesecev in ki so bili prvih 6 mesecev zalivani z MF z dodatkom L.

fermentum CECT5716 ugotovili, da so imeli za 48 % zmanjšano pogostnost okužb

prebavnega trakta, za 27 % okužb zgornjih dihal in za 30 % skupnih okužb v primerjavi s

kontrolno skupino zalivanih otrok, ki so uživali MF brez dodanega probiotičnega seva

(Maldonado in sod., 2012). Zelo podobne učinke lahko dobimo tudi z dodajanjem

prebiotičnih oligosaharidov (kombinacija GOS/FOS), ki posnemajo delovanje

oligosaharidov materinega mleka. Tudi tu obstaja vrsta raziskav z zmanjšanjem incidence

okužb in alergijskih bolezni (Agostoni in sod., 2004; Fouhy in sod., 2012).

2.2.2.3 Pomen trde hrane za razvoj črevesne mikrobiote dojenčka

Tudi uvajanje goste hrane vpliva na nadaljnji razvoj črevesne mikrobiote (Fouhy in sod.,

2012). Po priporočilih Evropskega združenja za pediatrično gastroenterologinjo,

hepatologijo in prehrano (ESPGHAN), naj se z uvajanjem trde hrane ne bi pričelo pred 17.

in ne po 26. tednu starosti (Agostoni in sod., 2009). Med uvajanjem goste hrane naraste

število Bacteriodes, Bifidobacterium, Clostridium coccoides in Firmicutes (Fouhy in sod.,

2012).



13

2.2.2.4 Drugi vplivi na oblikovanje črevesne mikrobiote dojenčka

Jemanje antibiotikov vpliva na sestavo črevesne mikrobiote, predvsem z zmanjševanjem

zastopanosti rodov Bifidobacterium in Bacteriodes (Conroy in sod., 2009).

Eden od pomembnih dejavnikov, ki vplivajo na sestavo in oblikovanje otroškega

mikrobioma, je struktura družine v smislu števila sorojencev. Ta ugotovitev je precej

podobna higienski hipotezi, ki predvideva manjšo pojavnost alergij v večjih družinah. Pri

prvorojencih naj bi veljalo, da imajo v črevesju več ne-Escherichia coli enterobakterij in

klostridijev ter manjše razmerje med anaerobnimi in fakultativno anaerobnimi MO, kar je

podobno kot pri otrocih, rojenih s carskim rezom. Po drugi strani pa so pri otrocih s

starejšimi sorojenci ugotovili večjo zastopanost predstavnikov rodu Bifidobacterium

(Fouhy in sod., 2012).

V raziskavi, kjer so spremljali sestavo črevesne mikrobiote otrok od rojstva do sedmega

leta starosti in prehranski status pri sedmih letih so ugotovili, da so pri otrocih z normalnim

indeksom telesne mase (ITM) pri sedmih letih pogosteje zastopane bakterije iz rodu

Bifidobacterium in le redko Staphylococcus aureus (Kalliomäki in sod., 2008).

Novejše raziskave kažejo na to, da na otrokovo črevesno mikrobioto lahko vpliva materina

porodna masa, kar pa je lahko povezano s tem, da imajo matere z višjim ITM tudi

spremenjeno črevesno mikrobioto, obenem pa rodijo dojenčke z višjim ITM. Otroci mater

s prekomerno telesno maso imajo pri enem mesecu starosti pogosto zmanjšano število

bakterij iz rodov Bacteroides in Prevotella ter povečano število Clostridium histolyticum

pri šestih mesecih starosti. Črevesna mikrobiota otrok debelih mater je številčnejše

zastopana s strani Clostridium leptum, Staphylococcus aureus in manj s Clostridium

perfringens kot pri otrocih normalno težkih mater. Pri šestih mesecih pa imajo otroci

normalno težkih mater večje število bakterij rodu Bifidobacterium (Fouhy in sod., 2012).

2.2.3 Pomen mlečnokislinskih bakterij

MKB kot glavni produkt fermentacije proizvajajo mlečno kislino. Veliko jih najdemo kot

del normalne mikrobiote ljudi in živali, obenem pa se kot starterske kulture uporabljajo v

živilski industriji. Uživanje MKB pa ima mnogo ugodnih učinkov na človekovo zdravje

(Masood in sod., 2011; Ozgun in Vural, 2011; Patrick, 2012).

Najpomembnejši in najštevilčnejši rod med MKB je Lactobacillus, ki danes vključuje 221

vrst grampozitivnih, katalaza-negativnih, nesporogenih, paličastih bakterij, od katerih jih

ima kar nekaj imunomodulatorne učinke (Lomax in Calder, 2009; LPSN, 2015). Pri

novorojenčkih je v blatu število laktobacilov 105 KE/g, kasneje pa naraste na 10

6 do 10

8

KE/g blata (Heilig in sod., 2002).



14

Nekatere MKB uspešno preprečujejo okužbe s patogenimi MO, na primer z mehanizmom

kompeticijskega izključevanja, ohranjajo integriteto črevesne pregrade s stimulacijo

izločanja mucinov, varujejo pred poškodbami črevesnih celic, oskrbujejo črevesne celice s

kratkoverižnimi maščobnimi kislinami, konjugirano linolno kislino in γ-aminobutirično

kislino, sintetizirajo vitamine (vitamini skupine B) in bioaktivne snovi (bakteriocini,

eksopolisaharidi, biosurfaktanti, antioksidanti, organske kisline, vodikov peroksid,…),

presnavljajo spojine, ki lahko škodijo gostitelju, fermentirajo neprebavljive polisaharide,

vzdržujejo kislo okolje v črevesju, vzpodbujajo razvoj črevesnega limfnega tkiva,

vzpodbujajo imunski odziv ter uravnavajo protivnetne in vnetne signale (Olivares in sod.,

2006; Marques in sod., 2010; Leblanc in sod., 2011; Flint in sod., 2012; Fouhy in sod.,

2012; Kanmani in sod., 2013; Jandhyala in sod., 2015)

2.2.3.1 Probiotiki

Glede na to, da imajo MKB velik vpliv na dolgoročno zdravje otroka, kar nekaj študij

proučuje, kako spreminjanje dojenčkove mikrobiote z dodajanjem probiotičnih dopolnil

materi ali otroku v prvih 24 mesecih vpliva na otrokovo zdravje (Fouhy in sod., 2012).

Večina probiotikov, uporabljenih v teh raziskavah, je bilo izoliranih iz vzorcev MM.

Danes najbolj uveljavljena definicija probiotikov, ki sta jo povzela tudi WHO in FAO

(angl. Food and Agriculture Organization) pravi, da so to živi MO, ki zaužiti v zadostnih

količinah pozitivno učinkujejo na zdravje gostitelja (WHO/FAO, 2006). Velja pa tudi

omeniti, da EFSA (angl. European Food Safety Authority), ni odobrila nobene zdravstvene

trditve v povezavi s probiotiki ( EFSA, 2011).

Med probiotičnimi bakterijami, ki so namenjene za humano uporabo, je največ

pripadnikov bakterij rodu Lactobacillus, ki se lahko dodajajo v prehrano mame ali otroka.

Dodajanje seva L. rhamnosus GG v prehrano nosečim materam v obdobju 2 do 4 tedne

pred porodom ter do tri tedne po porodu, je pomembno vplivalo na oblikovanje črevesne

mikrobiote dojencev. V neki študiji je prisotnost L. rhamnosus GG ugodno delovala na rast

bifidobakterij pri materi, zato sta se posledično povečala raznolikost in število

bifidobakterij v BD, obenem pa je po petem dnevu po porodu začelo naraščati število

Bifidobacterium breve, medtem ko je pri otrocih mam, ki so prejemale placebo, število

bifidobakterij začelo naraščati šele po treh tednih (Gueimonde in sod., 2006). Po drugi

strani je direktno dodajanje Bifidobacterium breve v MM, ki so si ga mamice izčrpavale, v

prvih 28 dnevih življenja, vplivalo na povečano zastopanost omenjene vrste v BD, obenem

pa stimulira rast rodu Lactobacillus po šestih tednih (Kitajima in sod., 1997).

Število raziskav proučevanja probiotičnih učinkov MKB narašča, predmet raziskav pa so

pogosto učinki probiotikov na preprečevanje pojavnosti atopijskih bolezni, predvsem

atopijskega dermatitisa. Rezultati vpliva še niso povsem potrjeni, trenutno pa največ

obetajo raziskave zmanjševanja pojavnosti ekcemov (Prescott in Bjorksten, 2007; Cuello-



15

Garcia in sod., 2015). Dojenčkova črevesna mikrobiota, ki je bogata z laktobacili,

varovalno vpliva na pojavnost alergij pri petih letih pri otrocih staršev, ki imajo alergije

(Johansson in sod., 2011). Študija v kateri so zadnji mesec nosečnosti in prve tri mesece po

porodu materam z anamnezo atopijskega dermatitisa v prehrano dodajali L. rhamnosus

GG, je pokazala, da je pri dveh letih za ekcemom zbolelo le 15 % otrok mater, ki so

uživale probiotik, medtem ko je bila pojavnost ekcema v kontrolni skupini 47 % (Rautava

in sod., 2002).

Nekrotizirajoči enterokolitis je najpogostejše bolezensko stanje pri nedonošenih otrocih, za

katerega so vzroki še neznani, zdravljenje je zato oteženo. Incidenca nekrotizirajočega

enterokolitisa je večja pri zalivancih, kar podaja vprašanje o tem, katera komponenta MM

varovalno vpliva na otroka (Lin in Stoll, 2006). Eden izmed potencialnih načinov

zdravljenja je uživanje probiotikov predvsem iz rodu Lactobacillus, ki pomembno

zmanjšajo tveganje za nastanek nekrotizirajočega enterokolitisa (Lau in Chamberlain,

2015).

Kar nekaj raziskav na mišjih modelih je bilo osredotočenih na imunomodulatorne učinke

MKB izoliranih iz MM. Za sev L. fermentum CECT 5716 je bilo dokazano, da na miših

deluje imunostimulatorno, zmanjšuje vnetje črevesa, vnetni odziv in poškodbe črevesa, v

kombinaciji z L. gasseri CECT 5714 pa zmanjša incidenco in resnost alergijskih reakcij za

beljakovine mleka, sev L. salivarius CECT 5713 pa deluje protivnetno (Díaz-Ropero in

sod., 2007; Pérez-Cano in sod., 2010; Fernández in Rodríguez, 2014).

2.2.3.2 Prebiotiki

Poleg probiotikov imajo velik vpliv na razvoj črevesne mikrobiote dojnčka tudi prebiotiki,

ki se naravno nahajajo v MM. Prebiotiki so za človeka neprebavljivi ogljikovi hidrati, zato

pridejo nerazgrajeni v debelo črevo, kjer pa ustvarijo ustrezne razmere za rast in razvoj

koristnih črevesnih MO, predvsem bifidobakterij in laktobacilov. Najpogosteje dodajana

prebiotika sta inulin in oligofruktoza. Bakterije, ki največ pridobijo z dodajanjem

prebiotikov so bifidobakterije, tudi na račun zmanjšane rasti Bacteroides, Clostridium ali

koliformnih bakterij, kar velja za bolj ustrezno črevesno mikrobioto.

Oligosaharidov, ki se v MM nahajajo v koncentracijah od 10 do 12 g/L, zaenkrat še ne

znamo tehnološko proizvesti, zato se MF dodajajo fruktooligosaharidi (FOS) ali/in

galaktooligosaharidi (GOS) (Fouhy in sod., 2012). Največ raziskav, ki proučujejo vpliv

dodajanja prebiotikov v MF na dojenčkovo črevesno mikrobioto, kaže na statistično

značilno povečanje števila bifidobakterij in laktobacilov v blatu dojenčkov, ki so uživali

MF z dodanimi prebiotiki (Agostoni in sod., 2004; Fouhy in sod., 2012).



16

3 MATERIAL IN METODE

3.1 POTEK POSKUSA

Praktični del magistrske naloge sem opravljala v času od 1. 6. 2014 do 29. 9. 2014 v

akreditiranem laboratoriju na Inštitutu za mlekarstvo in probiotike na Oddelku za

zootehniko, BF.

Slika 7: Shematski prikaz poteka praktičnega dela.

Popis vzorcev

mleka in blata

Izbor ustreznih parov

mama-dojenček Priprava izolatov iz

bioloških vzorcev

Predhodno pripravljene

mikrobne združbe

Shranjevanje

izolatov pri -20 °C

Razmaz na

gojišču Rogosa

Morfološki pregled z

barvanjem po Gram-u Izolacija DNA

s toplotno lizo

Analiza profilov naključno pomnožene

polimorfne DNA z gelsko elektroforezo

Identifikacija vrste

Izolacija DNA

Ugotavljanje relativne podobnosti Dicejevim

koeficientom korelacije

PCR z začetnima oligonukleotidoma P1 in P4

za pomnoževanje regije V1-V3 16S rDNA

Izbor predstavnika sevov iz posamezne

skupine

Nacepljanje

bioloških vzorcev

RAPD z začetnimi nukleotidi

M13, GTG5 in KGT 80-GC

Sekvenciranje pomnožkov V1-V3 16S rDNA



17

3.2 MATERIALI

3.2.1 Kriterij za vključitev parov mama-dojenček v raziskavo

Pare mama-dojenček smo izbrali tako, da je bil pri posameznem paru na voljo vsaj en

vzorec blata dojenčka (mekonij, BD) in vsaj en vzorec materinega mleka (kolostrum,

MM), skupno pa vsaj trije vzorci. Našim zahtevam je ustrezalo 17 parov mama-dojenček.

Pri dveh dodatnih dojenčkih smo preiskovali le morfološke značilnosti izolatov iz blata.

Preglednica 2 prikazuje, kateri vzorci blata dojenčka in mleka, odvzeti ob različnih časih

po rojstvu, so bili na voljo pri posameznem paru mama-dojenček. Podano je tudi skupno

število izolatov, ki smo jih pridobili iz vzorcev blata in mleka pri posameznem paru mama-

dojenček.

Preglednica 2: Vzorci blata dojenčka in materinega mleka ter skupno število izolatov, pridobljeno iz vzorcev

pri posameznem paru mama-dojenček

Oznaka

para

mama-

dojenček

MATERINO MLEKO/

odvzeto dni po rojstvu (MM)

BLATO DOJENČKA/

odvzeto dni po rojstvu (BD) Št.

izolatov 0

(M0)

30

(M30)

90

(M90)

0

(B0)

3

(B3)

30

(B30)

90

(B90)

IZ-003 / 1 / / 3 5 5 14

LJ-004 3 5 / / 19 / / 27

LJ-007 2 / 4 / / 4 4 14

LJ-024 3 3 5 / 10 / / 21

LJ-027 / 3 5 10 7 / / 25

LJ-034 9 17 5 8 8 / 3 50

LJ-039 3 14 / / 9 / / 26

LJ-053 9 3 / / 11 / 3 26

LJ-063 / 12 4 3 / / / 19

LJ-066 1 8 / / 9 / / 18

LJ-083 / / 3 / / 2 8 13

LJ-095 1 15 5 / 10 / / 31

LJ-101 8 8 / / 3 / / 19

LJ-107 5 11 2 / / / 5 23

LJ-121 / 9 5 / / 5 / 19

LJ-126 10 1 / / 19 / / 30

LJ-140 8 / / / 7 / 5 20

LJ-086 * *

LJ-144 *

Skupno št.

izolatov 395

Legenda: / : vzorec ni bil pridobljen; *: le morfološka preiskava



18

3.2.2 Gojišča

3.2.2.1 Trdo gojišče Rogosa

Trdo gojišče Rogosa smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck, 1054139,

Darmstadt, Nemčija). Zatehtano količino dehidriranega gojišča smo zmešali z deionizirano

in mikrofiltrirano vodo in mešanico segrevali do popolne raztopitve. Gojišču smo dodali

260 µL ocetne kisline na 200 mL gojišča in ga nato v brezprašni komori razlili v petrijeve

plošče in počakali, da se strdi.

Čeprav je gojišče Rogosa (Merck, 1054139, Darmstadt, Nemčija) priporočeno kot

selektivno za laktobacile, pa je njegova selektivnost v glavnem slaba, saj poleg

laktobacilov pogosto rastejo tudi bifidobakterije, pediokoki, enterokoki. Zaradi bogate

sestave, kar ustreza prehransko zahtevnim mlečnokislinskim bakterijam, smo ga uporabili

kot gojišče za izolacijo MKB iz bioloških vzorcev.

3.2.2.2 Tekoče gojišče MRS

Tekoče gojišče MRS smo pripravili po navodilih proizvajalca (Merck, Darmstadt,

Nemčija). Zatehtano količino dehidriranega gojišča smo v stekleničkah (po 200 mL)

zmešali z deionizirano in mikrofiltrirano vodo in mešanico segrevali do popolne raztopitve.

Gojišče smo nato 15 min avtoklavirali pri 118 °C.

3.2.3 Pribor

standarden laboratorijski material (npr. spatule, žlice, pincete, steklene epruvete,

merilni valji),

anaerobne škatle (GenBox) in generatorji anaerobnih razmer (BioMérieux, Marcy,

L'Etoile, Francija),

pipete (0,5 – 10 μL; 10 – 20 μL; 20 – 100 μL; 100 – 1000 μL) in pripadajoči

nastavki za pipete,

stekleničke s pokrovčki (200 mL),

epruvete (200 μL; 500 μL; 1,5 mL; 2 mL),

centrifugirke (10 mL),

plastične petrijeve plošče za enkratno uporabo,

cepilne zanke za enkratno uporabo,

sterilna plastična palčka za razmaz vzorcev,

pribor za pripravo agaroznega gela,

gorilnik,

avtoklavirani zobotrebci.



19

3.2.4 Aparature

PCR ciklični termostat (Mastercycler gradient, Eppendorf, Nemčija),

gelska elektroforeza Power pac 300 (Bio-Rad Laboratories, ZDA),

fotoaparat za UV slikanje (Uvitec, Anglija),

UV Transiluminator (UVISave, Uvitec, Anglija),

PCR komora (UV2, UVP, ZDA),

digestorij (Modelle 80, Waldner, Nemčija),

inkubator (BT150, Marijan Krokter, Slovenija),

avtoklav (A- 21 CA, Kambič Laboratorijska oprema, Slovenija),

brezprašna mikrobiološka komora M12 (Iskra PIO, Slovenija),

centrifuga (mikro 22R, Hettich Zentrifugen, Nemčija; Sigma 3K18, Nemčija),

vodna kopel (WB-30, Kambič Laboratorijska oprema, Slovenija),

vrtični mešalnik (Vibromix Železniki, Slovenija),

analitska tehtnica (PBS/PBJ, Kern, Nemčija; AT 400, Mettler Toledo, Švica),

čistilec vode (Milli RO 10 plus in Milli Q plus, Merck Millipore, Nemčija),

mikrovalovna pečica (32 L Bosch, Nemčija).

3.2.5 Reagenti

50x pufer TAE, pH 8,0 (tris/acetat/EDTA),

Agaroza: SeaKem®LE Agarose (Lonza, Rockland, ZDA)

Barvilo SYBR® Safe DNA gel stain (10,000 kratne koncentracije, Invitrogen,

Oregon, ZDA),

ocetna kislina (Fluka, Buchs, Švica),

molekulski označevalec velikosti 1 kb (GeneRulerTM

1kb DNA Ladder, Fermentas,

Litva),

5X Colorless Go Taq® Flexi Bruffer (Promega, Madison, ZDA),

5X Green Go Taq® Flexi Buffer (Promega, Madison, ZDA),

Go Taq® DNA Polymerase, 5u/μL (Promega, Madison, ZDA),

dNTP Mix, 10 mM (Thermo Scientific, Walthman, ZDA),

začetni oligonukleotid GTG5 (5´-GTGGTGGTGGTGGTG-3´),

začetni oligonukleotid M13 (5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'),

začetni oligonukleotid KGT-80GC (5'-CGCGTGCCCA3'),

MgCl2, 25 mM (Promega, Madison, ZDA),

Etilendiamintetraocetna kislina (EDTA), 50 mM (Sigma, ZDA),

Mutanolizin, 1 μL v 100 μL EDTA (Sigma, ZDA),

Lizocim, 1 mg v 100 μL EDTA (Sigma, ZDA),



20

Komplet za izolacijo DNA, ang.Wizard genomic DNA purification kit (Promega,

Madison, ZDA): Nuclei lysis solution, Rnase solution, Protein precipitation

solution, Isopropanol, Rehydration solution,

Komplet za barvanje po Gramu ang. Color Gram 2 (BioMérieux, Marcy-LʾEtoile,

Francija): barvilo kristal vijolično, lugol, mešanica etanola in acetona (1:1), barvilo

safranin, etanol (70 %).

3.2.6 Programska oprema

ImageJ (National Institutes of Health, ZDA) – program za obdelavo slik,

BioNumerics® 5.1 (Applied Maths, Belgija) – bioinformacijski program,

BLAST (angl. Basic Local Alignment Search Tool) –baza podatkov (BLAST, 2016).

3.3 METODE

3.3.1 Priprava vzorcev

Izolati bakterij, ki smo jih uporabili za magistrsko nalogo, so bili različno predpripravljeni,

a vsi shranjeni pri -80 °C. Iz dela bioloških vzorcev so bili pridobljeni že posamezni

izolati, in sicer tako, da so bili vzorci mekonijev in BD ter kolostrumov in MM

homogenizirani ter razredčeni z razredčevanjem po Kochu. Ustrezne razredčitve so bile

cepljene na trdo gojišče Rogosa, po inkubaciji pa je bilo s števnih plošč naključno izbranih

nekaj kolonij in namnoženih v mikroepruvetah v tekočem gojišču MRS. Po inkubaciji so

bile kulture centrifugirane, supernatant odlit, usedlina z bakterijami pa je bila shranjena v

tekočem gojišču MRS z glicerolom pri -80 °C do nadaljnje uporabe.

Iz drugega sklopa bioloških vzorcev pa so bile pripravljene mikrobne združbe in shranjene

pri -80 °C. Slednje smo odtalili in cepili na trdo gojišče Rogosa. Po inkubaciji v

anaerobnih razmerah (2 dni, 37 °C) smo s gojišča naključno izbrali nekaj kolonij ter jih s

cepilno zanko aseptično prenesli v 800 μL tekočega gojišča MRS v mikroepruvetah. Po

inkubaciji (2 dni, 37 °C) smo kulture s cepilno zanko razmazali na gojišče Rogosa in

inkubirali (2 dni, 37 °C), preostanek kultur smo centrifugirali, supernatant odlili in shranili

v tekočem gojišču MRS z glicerolom pri -80 °C.

Skupno smo tako pridobili 395 izolatov čiste kulture.

3.3.2 Morfološki pregled kolonij z barvanjem po Gramu

Za določitev makromorfoloških značilnostih smo opazovali izgled površine, velikost,

obliko in barvo kolonij zraslih na gojišču Rogosa, medtem ko smo za natančnejši opis

https://en.wikipedia.org/wiki/National_Institutes_of_Health



21

mikromorfologije bakterij, izoliranih z gojišča Rogosa, bakterijske celice barvali po

Gramu. Po pregledu s svetlobnim mikroskopom lahko ugotovimo, ali je bakterija po

Gramu pozitivna ali negativna, obenem pa lahko določimo obliko, velikost in formacijo

bakterij v vzorcu.

Vzorec kulture smo s cepilno zanko iz tekočega gojišča MRS iz mikroepruvet prenesli na

objektno stekelce, posušili na zraku in fiksirali ob ognju. Fiksiran vzorec smo najprej

barvali z barvilom kristal-vijolično, ki smo ga pred dodatkom lugolove raztopine sprali z

destilirano vodo. Odvečno oz. nevezano barvilo kristal-vijolično smo nato sprali z

mešanico etanola in acetona ter z destilirano vodo. Na koncu smo dodali še safranin, ki pa

obarva po Gramu negativne bakterije rdeče, medtem ko se po Gramu pozitivne bakterije

obarvajo modro-vijolično. Na spran in osušen preparat smo nanesli imerzijsko olje in ga

mikroskopirali s svetlobnim mikroskopom pri 1000-kratni povečavi.

3.3.3 Izolacija DNA s toplotno lizo

Za genotipizacijo izbranih izolatov smo DNA izolirali neposredno iz kolonij s pomočjo

toplote. V ta namen smo s sterilnim zobotrebcem aseptično prenesli po eno kolonijo s

trdega gojišča Rogosa v mikroepruvete s 15 μL pufra 5xGoTaq Flexi (Promega, Madison,

ZDA) in premešali z vrtičnim mešalnikom. Tako pripravljene mešanice smo prenesli v

ciklični termostat Mastercycler gradient (Eppendorf, Nemčija) in jih za 10 minut

izpostavili temperaturi 99 °C. Dobljene lizate smo ohladili na 4 °C.

3.3.4 RAPD

Za razlikovanje izbranih izolatov smo uporabili metodo RAPD (naključno pomnožena

polimorfna DNA, angl. randomly amplified polymorphic DNA), ki temelji na

pomnoževanju naključnih delov DNA z uporabo nespecifičnih začetnih oligonukleotidov v

verižni reakciji s polimerazo (angl. polymerase chain reaction PCR). Vzorci nastalih

pomnožkov so značilni za posamezen sev, kar omogoča razlikovanje genetsko različnih

sevov. Metoda je primerna za analize velikega števila bakterijskih sevov v dokaj kratkem

času.

Za naše analize RAPD smo izbrali nespecifične začetne oligonukleotide GTG5, M13 in

KGT-80GC. Reakcijske mešanice in razmere reakcij RAPD za posamezen oligonukleotid

so prikazane v podpoglavjih 3.3.4.1, 3.3.4.2 in 3.3.4.3. Pri vsaki izvedbi reakcije RAPD

smo vključili tudi negativno kontrolo, kjer smo v reakcijsko mešanico namesto zeleno

obarvanega GoTaq® flexi pufra (5x) (Promega, Madison, ZDA) z DNA vzorca dodali

sterilno mikrofiltrirano in avtoklavirano vodo.



22

3.3.4.1 RAPD z začetnim oligonukleotidom GTG5

V preglednici 3 je prikazana sestava reakcijske mešanice za RAPD z začetnim

oligonukleotidom GTG5, s katerim je bilo analiziranih vseh 395 izolatov. Vsaka

mikroepruveta je vsebovala 20 µL reakcijske mešanice.

Preglednica 3: Sestava 20 µL reakcijske mešanice za RAPD z začetnim oligonukleotidom GTG5 (Versalovic

in sod., 1994).

Reagent Količina Končna koncentracija

zeleno obarvan GoTaq® flexi pufer (5x) z DNA vzorca 4,0 µL 1x

MgCl2 (25 mM) 2,4 µL 3 mM

začetni oligonukleotid GTG5 (10 µM) 4,0 µL 2 µM

dNTP (10 mM) 1,0 µL 0,5 mM

GoTaq®DNA polimeraza (5U/µL) 0,1 µL 0,025 U/µL

mikrofiltrirana in avtoklavirana voda 8,5 µL

Tako pripravljene mikroepruvete smo kratko centrifugirali ter prenesli v ciklični termostat

Mastercycler Gradient (Eppendorf, Nemčija), kjer smo izbrali razmere RAPD z začetnim

oligonukleotidom GTG5, ki jih prikazuje preglednica 4.

Preglednica 4: Razmere reakcije RAPD z začetnim oligonukleotidom GTG5 (Versalovic in sod., 1994)

Reakcija Število ciklov Temperatura [oC] Trajanje

Začetek 1 95 7 min

Denaturacija

30

95 1 min

Prileganje 40 1 min

Podaljševanje 65 8 min

Zaključek 1 65 16 min

3.3.4.2 RAPD z začetnim oligonukleotidom M13


oligonukleotidom M13. S tem začetnim oligonukleotidom je bilo analiziranih 55 izolatov,

ki so se po analizi z začetnim oligonukleotidom GTG5 razvrstili v genetsko podobne

skupine, ki so bile sestavljene iz izolatov MM in BD. Vsaka mikroepruveta je vsebovala

20 µL reakcijske mešanice.



23

Preglednica 5: Sestava 20 µL reakcijske mešanice za RAPD z začetnim oligonukleotidom M13 (Torriani in

sod., 1999).




začetni oligonukleotid M13 (100 µM) 0,1 µL 0,5 µM

dNTP (10 mM) 0,2 µL 0,1 mM




Mastercycler Gradient (Eppendorf, Nemčija), kjer smo izbrali razmere reakcije RAPD z

začetnim oligonukleotidom M13, ki jih prikazuje preglednica 6.

Preglednica 6: Razmere reakcije RAPD z začetnim oligonukleotidom M13 (Torriani in sod., 1999)


Začetek 1 95 3 min

Denaturacija

40

95 1 min

Prileganje 45 20 s



3.3.4.3 RAPD z začetnim oligonukleotidom KGT 80-GC


oligonukleotidom KGT 80-GC, s katero so je bilo analiziranih 55 izolatov, ki so se po

analizi z začetnim oligonukleotidom GTG5 razvrstili v genetsko podobne skupine, ki so

bile sestavljene iz izolatov MM in BD. Vsaka mikroepruveta je vsebovala 20 µL reakcijske

mešanice.

Preglednica 7: Sestava 20 µL reakcijske mešanice za RAPD z začetnim oligonukleotidom. KGT 80-GC

(Katedra za mlekarstvo, Domžale).




začetni oligonukleotid KGT 80-GC (100 µM) 0,1 µL 0,5 µM

dNTP (10 mM) 0,4 µL 0,2 mM





24


Mastercycler Gradient (Eppendorf, Nemčija), kjer smo izbrali razmere reakcije RAPD z

začetnim oligonukleotidom KGT 80-GC, ki jih prikazuje preglednica 8.

Preglednica 8: Razmere reakcije RAPD z začetnim oligonukleotidom KGT 80-GC (Katedra za mlekarstvo,

Domžale)


Začetek 1 95 3 min

Denaturacija

35

95 1 min

Prileganje 37 2 min



3.3.5 Agarozna gelska elektroforeza

Za analizo pomnožkov DNA, ki smo jih dobili z RAPD, smo uporabili agarozno gelsko

elektroforezo, ki ločuje fragmente DNA po njihovi velikosti. Ne glede na uporabljen

začetni oligonukleotid, smo vedno pripravili 1,8 % agarozni gel. Za pripravo potrebne

količine agaroznega gela, smo v stekleničko zatehtali ustrezno količino agaroze ter dolili

ustrezno količino pufra TAE 1x (pH 8,0). Pripravljeno mešanico smo segrevali do bistrosti

in homogenosti, nato pa smo jo deloma ohladili in nalili v modelček s predhodno

vstavljenim glavničkom. Strjen gel smo prenesli v elektroforezno banjico, napolnjeno z

pufrom TAE 1x, odstranili glavniček in v posamezen žepek nanesli po 15 μL pomnožkov

RAPD. Kot velikostno lestvico DNA smo uporabili molekularni označevalec velikosti

1 kb, ki smo jo nanesli pred in po vzorcih vsakega para mama-dojenček. Gelska

elektroforeza je potekala 240 minut pri 50 V. Po končani elektroforezi smo gel prenesli v

banjico z pufrom TAE 1x z dodanim SYBR® Safe, kjer se je barval 30 minut. Obarvan gel

smo pregledali pod UV svetlobo in dokumentirali. Dokumentirane gele smo v nadaljevanju

najprej obdelali s programom Image J (National Institutes of Health, ZDA), kjer smo

optimizirali kontrast in ostrino. Z bioinformacijskim programom BioNumerics® 5.1

(Applied Maths, Belgija), smo izračunali relativno podobnost med sevi s Dicejevim

koeficientom korelacije, kjer smo pri primerjavi fragmentov uporabili 3 % toleranco, nato

pa z algoritmom UPGMA (metoda neponderirane aritmetične sredine) izrisali

dendrograme. Glede na relativno podobnost smo izolate razvrstili v skupine, za katere je

bil vključitveni kriterij vsaj 70 % relativna podobnost (Rantsiou in sod., 2006).

3.3.6 Priprava DNA za sekvenciranje

Ker smo želeli pridobiti podatke o vrstni pripadnosti analiziranih izolatov, smo jih ustrezno

pripravili in poslali na sekvenciranje. V ta namen smo najprej izbrali vzorce po kriteriju, da

https://en.wikipedia.org/wiki/National_Institutes_of_Health



25

se pri analizi RAPD z začetnim oligonukleotidom GTG5 isti vzorec pomnožkov ponovi

vsaj enkrat pri posameznem paru mama-dojenček.

Kolonije izbranih vzorcev smo nacepili v tekoče gojišče MRS. Po inkubaciji (24 ur, 37 °C)

smo odpipetirali po 1 mL zraslih kultur v mikrocentrifugirke in izolirali DNA s kompletom

Wizard genomic DNA purification kit po navodilih proizvajalca (Promega, Madison,

ZDA). Izolirano DNA smo uporabili kot tarčno DNA v PCR pomnoževanja variabilne

regije 16S rDNA, do uporabe pa smo jo hranili pri -20 °C.

Za sekvenciranje smo pripravili pomnožke, ki smo jih pridobili z namnoževanjem

variabilne regije V1-V3 16S rDNA z začetnima oligonukleotidoma P1 in P4 (Klijn in sod.,

1991). V preglednici 9 je prikazana sestava reakcijske mešanice (30 µL) za en vzorec, ki

smo jih pripravili za PCR pomnoževanje dela variabilne regije V1-V3 16S rDNA z

oligonukleotidoma P1 in P4 (Preglednica 10). Poleg smo vključili tudi negativno kontrolo,

kjer smo v reakcijsko mešanico namesto zeleno obarvanega GoTaq® flexi pufra (5x) z

DNA vzorca dodali sterilno mikrofiltrirano in avtoklavirano vodo.

Preglednica 9: Sestava 30 µL-reakcijske mešanice za PCR pomnoževanja variabilne regije V1 in V3 16S

rDNA z začetnima oligonukleotidoma P1 in P4 (Klijn in sod., 1991).


zeleno obarvan GoTaq® flexi pufer (5x) 6,0 µL 1x

MgCl2 (25 mM) 1,8 µL 1,5 mM

začetni oligonukleotid P1 (100 µM) 0,15 µL 0,5 µM

začetni oligonukleotid P4 (100 µM) 0,15 µL 0,5 µM

dNTP (10 mM) 0,3 µL 0,1 mM


DNA 2,0 µL


Preglednica 10: Razmere PCR za pomnoževanje variabilne regije V1 - V3 16S rDNA izbranih izolatov (Klijn

in sod., 1991).


Začetek 1 95 3 min

Denaturacija

30

95 1 min

Prileganje 54 30 s

Podaljševanje 72 30 s


Ustreznost dobljenih pomnožkov DNA smo pregledali z agarozno gelsko elektroforezo. V

ta namen smo pripravili 1,5 % agarozni gel (kot je opisano v poglavju 3.3.5) ter po 8 μL

pomnožkov nanesli v posamezen žepek. Elektroforeza je potekala 120 minut pri napetosti



26

50 V, kot velikostno lestvico DNA smo uporabili molekularni označevalec velikosti 1 kb,

na vsak gel pa smo nanesli tudi negativno kontrolo.

Pomnožke DNA smo poslali na inštitut Microsynth Avstrija (Dunaj), kjer so bili

sekvencirani. Dobljene rezultati zaporedij nukleotidov smo obdelali s spletnim orodjem

BLAST (BLAST, 2016) in jih primerjali s tistimi, ki so na voljo v genski bazi NCBI ter

tako lahko analizirane seve identificirali.



27

4 REZULTATI

4.1 MORFOLOŠKE LASTNOSTI IZBRANIH IZOLATOV MLEČNOKISLINSKIH

BAKTERIJ

Makromorfološke lastnosti izolatov smo opazovali z njihovo zraslostjo na trdem gojišču

Rogosa, ki spodbuja rast MKB, medtem ko smo mikromorfološke lastnosti opazovali s

pregledom pod svetlobnim mikroskopom.

4.1.1 Makromorfološke lastnosti kolonij mlečnokislinskih bakterij

Kolonije MKB zrasle po inkubaciji v anaerobnih razmerah (2 dni, 37 °C) na gojišču

Rogosa so bile okrogle oblike z gladkim robom in bele do krem barve, primer lahko

vidimo na sliki 8. Enake makromorfološke lastnosti smo določili pri vseh 395 sevih MKB

(Preglednica 2).

Slika 8: Kolonije mlečnokislinskih bakterij izolirane iz materinega mleka pri paru mama dojenček LJ-095,

zrasle po inkubaciji izolatov v anaerobnih razmerah (2 dni, 37 °C) na gojišču Rogosa.

Legenda: A: materino mleko, 90 dni (M90), B: materino mleko, 90 dni (M90) in C: materino mleko, 30 dni (M30).

4.1.2 Mikromorfološke lastnosti mlečnokislinskih bakterij

Po mikroskopskem pregledu razmazov nekaj naključnih vzorcev MKB izoliranih iz BD, ki

so zrasli na gojišču Rogosa, smo določili da gre za po Gramu pozitivne bakterije, med

katere spadajo MKB. Na sliki 9 lahko vidimo primere mikromorfoloških raznolikosti

izolatov (A: koki, ki se združujejo v skupke; B: paličice; C: zelo dolge paličice).

B C

A



28

Slika 9: Slike mikroskopskih razmazov barvanih po Gramu nekaterih naključnih vzorcev.

Legenda: A: koki, ki se združujejo v skupke (LJ-086; blato 30); B: paličice (LJ-086; blato 90); C: zelo dolge paličice (LJ-

144; blato 30).

4.2 ANALIZA RAPD IN IDENTIFIKACIJA IZOLATOV

V nalogi smo z RAPD skupno analizirali 395 izolatov, pridobljenih iz skupno 6 bioloških

vzorcev (3 vzorci mekonija B0, 12 vzorcev B3, 4 vzorci B30 in 7 vzorcev B90 ter 12

vzorcev kolostruma M0, 14 vzorcev M30 in 9 vzorcev M90) 17-ih parov mama-dojenček.

Želeli smo ugotoviti morebitno prisotnost, ali celo prevlado, istega(ih) seva(ov) pri mami

in njenem dojenčku, pri čemer smo uporabili 3 različne RAPD začetne oligonukleotide, in

sicer M13, KGT 80-GC in GTG5.

4.2.1 Gelska elektroforeza

Po elektroforezi pomnožkov, pridobljenimi z vsemi tremi začetnimi oligonukleotidi, se je

kot najboljši izkazal začetni oligonukleotid GTG5 (slike od 10 do 26). Pri uporabi začetnih

oligonukleotidov M13 in KGT 80-GC so bili profili RAPD pogosto nejasni, proge šibko

izražene ali pa smo dobili negativne rezultate v smislu praznih gelov (rezultati niso

prikazani). Zato smo v nadaljevanju s programom BioNumerics® 5.1 ugotavljali relativno

podobnost sevov na podlagi profilov RAPD, pridobljenih z uporabo začetnega

oligonukleotida GTG5.

4.2.2 Relativna podobnost izolatov in identifikacija izbranih izolatov

Na slikah od 10 do 26 so prikazane relativne podobnosti profilov RAPD za seve

posameznega para mama-dojenček, kjer smo relativno podobnost profilov RAPD določali

z Dicejivim koeficientom korelacije, pri primerjavi fragmentov pa smo uporabili 3 %

toleranco. Dendrogrami pa so izrisani z metodo UPGMA. Za uvrstitev sevov v isto

skupino smo izbrali 70 % relativno podobnost kot navajajo Rantsiou in sod. (2006).



29

Glede na rezultate sekveniranja regije V1-V3 16S rDNA smo izbrane izolate identificirali.

Na podlagi relativne podobnosti profilov RAPD, dobljenih z začetnim oligonukleotidom

GTG5, smo izbrali 52 naključnih sevov, ki so predstavljali en profil RAPD. DNA izbranih

predstavnikov smo izolirali s komercialnim kompletom in jo pomnoževali v PCR s parom

začetnih oligonukleotidov P1 in P4. Dobljene pomnožke smo poslali v laboratorij

Microsynth na Dunaju, kjer so opravili analizo zaporedja nukleotidov variabilne regije V1-

V3 16S rDNA. Dobljena zaporedja nukleotidov, dolga 660 bp, smo nato s programom

BLAST primerjali z zaporedji, ki so na voljo v genski bazi podatkov NCBI. Za 44 od

skupno 52 sekvenciranih izolatov se je izkazalo, da z veliko verjetnostjo pripadajo vrstam,

ki so zapisane pri slikah od 10 do 26.

Pri paru mama-dojenček IZ-003 je bil na voljo en vzorec mleka (M30) ter trije vzorci blata

(B3, B30 in B90), iz vseh vzorcev pa smo skupaj pridobili 14 izolatov MKB. Pri 70 %

relativni podobnosti lahko ločimo 3 skupine sevov (A do C, slika 10), in sicer skupina A v

kateri so prisotni tako izolati iz mleka (M30), kot izolati iz blata ob vseh možnih časih (B3,

B30 in B90). V skupinah B in C je prisoten po en izolat blata 3 dni po rojstvu. Analiza

zaporedja nukleotidov predstavnika B30/6 (99 % verjetnost) je razkrila da gre za vrsto L.

rhamnosus, medtem ko gre v primeru B3/3 (99 % verjetnost) za E. faecium.

Slika 10: Relativna podobnost profilov RAPD (GTG5) mlečnokislinskih bakterij izoliranih pri paru mama-

dojenček IZ-003 in identifikacija izbranih izolatov.

Legenda: M: mleko; 0, 30 ali 90: dan odvzema mleka po rojstvu; B: blato; 0, 3, 30 ali 90: dan odvzema blata po rojstvu;

/število: zaporedno število izolata pri paru mama-dojenček; puščica in okvir: identifikacija izolata.

Pri paru mama-dojenček LJ-004 smo imeli na voljo 2 vzorca mleka (M0, M30) in 1 vzorec

blata (B3), iz katerih smo skupaj pridobili 27 izolatov. Zaradi neuspešne kultivacije štirih

izolatov smo delo nadaljevali s 23-imi. Pri 70 % relativni podobnosti lahko ločimo 4

skupine (A do D, slika 11). Skupino A sta zastopala dva izolata M30, skupino B izolati iz

L. rhamnosus

E. faecium

Relativna podobnost (%)

A

B

C



30

B3, v skupinah C in D pa so bili prisotni tako predstavniki mleka, kot blata, in sicer so se v

skupini C nahajali izolati iz kolostruma in B3, v skupini D pa izolati B3 in M30. Po

identifikaciji izolatov se je izkazalo, da gre v primeru M30/23 (99 % verjetnost) za vrsto

Pediococcus acidilactici/ lolii/ pentosaceus, v primeru B3/13 (100 % verjetnost) in M0/2

(99 % verjetnost) za vrsto E. faecalis ter v primeru B3/5 za L. casei/paracasei (99 %

verjetnost). V primeru predstavnika B3/20 pa skupine nismo uspeli identificirati na nivoju

vrste.


dojenček LJ-004 in identifikacija izbranih izolatov.



Pri paru mama-dojenček LJ-007 smo iz dveh vzorcev mleka (M0 in M90) ter dveh vzorcev

blata (B30 in B90) pridobili 14 izolatov, od katerih 4 izolatov ni bilo možno kultivirati. Po

primerjavi profilov RAPD so se pri 70 % relativni podobnosti oblikovale tri skupine (A do

C, slika 12). V skupini A sta izolata iz dveh vzorcev mleka (M0 in M90), v skupini B je

izolat blata 30 dni po rojstvu, v skupini C pa so izolati iz blata 30 in 90 dni po rojstvu.

Analiza zaporedja nukleotidov predstavnikov skupin A in C je pokazala, da oba izolata

pripadata vrsti P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus (99 % podobnost za oba).

L. casei/paracasei

E. faecalis

E. faecalis

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus


A

B

C

D



31





Pri paru LJ-024 mama-dojenček smo imeli na voljo 4 vzorce, in sicer 3 vzorce mleka ob

vseh odvzetih časih (M0, M30 in M90) ter 1 vzorec blata 3 dni po rojstvu (B3). Izoliranih

je bilo 21 izolatov, od tega jih je bilo za nadaljnjo analizo uporabnih 19. Pri 70 % relativni

podobnosti lahko ločimo 7 skupin (A do G, slika 13), in sicer skupina A v kateri so izolati

mleka (M90), skupina C, v kateri so izolati kolostruma (M0), skupina G v kateri so izolati

mleka 30 dni po rojstvu, ter skupine B, D, E in F v katerih so razvrščeni izolati iz blata 3

dni po rojstvu. Izolata kolostruma iz skupine C, sta na videz precej podobna izolatu B3 iz

skupine D. Predstavnike skupin, z dvema ali več izolati, smo poslali na analizo zaporedja

nukleotidov. V dveh primerih (M90/10 in B3/14) identifikacija ni bila uspešna, medtem ko

smo uspeli identificirati vrsto L. fermentum/delbrueckii predstavniku skupine G, M30/4

(99 % verjetnost) ter pri M0/2 (skupina C) E. faecalis s 100 % verjetnostjo.

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus


A

B

C



32





Pri paru mama-dojenček LJ-027 smo imeli na voljo vzorce blata, in sicer B0 in B3 ter

mleka M30 in M90, za analizo je bilo uporabljenih 22 od 25 izhodiščnih izolatov. Pri 70 %

relativni podobnosti so se izolati razporedili v eno skupino (A, slika 14), kjer so bili

prisotni vsi izolati iz vzorcev blata (B0 in B3) in mleka (M90 in M30). Analiza zaporedja

nukleotidov je izolat M90/22 uvrstila v vrsto P. acedilactici z 96 % verjetnostjo.

E. faecalis

L. fermentum/

delbrueckii


A

B

C

D

E

F

G



33





Pri paru mama-dojenček LJ-034 smo imeli na voljo 6 bioloških vzorcev in skupno 50

izolatov, od katerih smo jih uspešno kultivirali 44. Na sliki 15 lahko opazimo, da so se pri

70 % relativni podobnosti razvrstili v 7 skupin (A do G). Skupino A sta predstavljala

izolata iz B90. Sekvenca zaporedja nukleotidov variabilne regije V1-V3 16S rDNA je

predstavniku skupine (B90/44) določila vrsto P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus (99 %

verjetnost). V skupini B je prisoten izolat blata (B90/41). V skupini C je bila prisotna

večina izolatov iz blata (B0 in B3), katerega predstavnik (B3/38) pripada vrsti P.

acidilactici/ lolii/ pentosaceus (99 % verjetnost). V skupini D so prisotni tako izolati mleka

(M90), kot izolat mekonija (B0/28). V skupini E so bili prisotni izolati kolostruma (M0),

M30 in M90, ki so pripadali vrstam L. fermentum/ plantarum (M30/8 z 99 % verjetnostjo;

M30/17 z 97 % verjetnostjo; M0/2 z 96 % verjetnostjo), P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus

(M30/9 z 99 % verjetnostjo) in L. fermentum/ delbrueckii (M30/13 z 99 % verjetnostjo).

Skupini F in G pa zastopata posamezna izolata materinega mleka, in sicer M0/1 in M30/6.

P. acidilactici


A



34





P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus

L. fermentum/

plantarum

L. fermentum/

delbrueckii

L. fermentum/

plantarum

L. fermentum/

plantarum


A

B

C

D

E

F

G



35

Pri paru mama-dojenček LJ-039 smo iz dveh vzorcev mleka (M0, M30) in enega vzorca

blata (B3) izolirali skupno 26 izolatov, vendar treh v nadaljevanju nismo uspeli namnožiti.

Preostalih 23 izolatov pa se je po primerjavi sorodnosti profilov RAPD razvrstilo v dve

skupni (A in B, slika 16). Skupino A zastopajo mlečnokislinske bakterije iz vzorcev M0,

M30 in B3 katere predstavnik B3/17 z 99 % verjetnostjo pripada P. acidilactici/ lolii/

pentosaceus. Skupino B pa v celoti zastopajo izolati M30, katere predstavnik M30/5 z

97 % verjetnostjo pripada vrsti L. fermentum/ plantarum.





Pri paru mama-dojenček LJ-053 smo imeli na voljo dva vzorca mleka (M0 in M30) ter dva

vzorca blata (B3 in B90), iz katerih smo izolirali 26 izolatov in jih nadaljnje uporabili 25.

Analiza profilov RAPD je vzorce razdelila v štiri skupine (A do D, slika 17). V skupino A

so se razvrstili vsi izolati B90 in vsi izolati B3, razen tistega v skupini B (B3/15). Analiza

zaporedja nukleotidov predstavnikov skupine A, z 99 % verjetnostjo uvršča B3/17 v vrsto

P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus in B90/23 v vrsto L. casei/ paracasei (99 % verjetnost).

Skupina C zajema izolate vzorcev mleka (M0 in M30), katere predstavnik (M0/10) z 99 %

verjetnostjo pripada vrsti P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus. V skupini D pa se nahajata dva

izolata iz kolostruma (M0).

L. fermentum/

plantarum

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus


A

B



36





Pri paru mama-dojenček LJ-063 smo imeli na voljo dva vzorca mleka (M30 in M90) ter en

vzorec blata (B0), iz katerih je bilo izoliranih 19 izolatov, v nadaljevanju pa uporabljenih le

10. Po primerjavi profilov RAPD so se vsi izolati razen enega, M30/2 (skupina B),

razvrstili v skupino A (slika 18). Analiza zaporedja nukleotidov predstavnika skupine A

(B0/9) je pokazala, da izolati z 99 % verjetnostjo pripadajo vrsti E. faecium/ lactis.

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus

L. casei/paracasei

P. acidilactici/

lolii/ pentosaceus


A

B

C

D



37





Pri paru mama-dojenček LJ-066 smo imeli na voljo dva vzorca mleka (M0 in M30) in en

vzorec blata (B3), iz katerih je bilo izoliranih 18 izolatov. Zaradi neuspešne kultivacije 3

izolatov smo jih za nadaljnje analize uporabili 15. Na sliki 19 lahko vidimo, da so izolati

razvrstili v eno skupino, v kateri so bili torej prisotni izolati kolostruma (M0), blata 3 dni

po rojstvu (B3) ter mleka 30 dni po rojstvu (M30). Identifikacija izolata B3/7 je pokazala,

da ta z 98 % verjetnostjo pripada vrsti P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii, medtem ko

M30/14 z 99 % verjetnostjo pripada vrsti E. faecium/ lactis.





Pri paru mama-dojenček LJ-083 smo imeli na voljo vzorce M90, B30 in B90, iz katerih

smo pridobili 13 izolatov, 11 pa jih je bilo kultiviranih za nadaljnje analize. Analiza

E. faecium/lactis

E. faecium/lactis

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii



A

B

A



38

profilov RAPD je izolate razdelila v tri skupine (A do C, slika 20), kjer so skupino A

oblikovali izolati iz vzorca, skupino B izolati iz vzorca B90, skupno C pa je zastopal en

predstavnik materinega mleka 90 dni po rojstvu. Predstavnik skupine A (B30/1) z 99 %

verjetnostjo pripada vrsti L. rhamnosus, medtem ko predstavnik skupine B (B90/8) z 99 %

verjetnostjo pripada vrsti L. vaginalis.





Pri paru mama-dojenček LJ-095 smo iz treh vzorcev mleka (M0, M30 in M90) ter enega

vzorca blata (B3) z Rogose izolirali 31 izolatov, 28 pa smo jih uporabili v nadaljnjih

analizah. Kot vidimo s slike 21, so se izolati po analizi profilov RAPD razporedili v 6

skupin (A do F), kjer vsako sestavljajo zgolj izolati iz istega vzorca. Izolati M30 so se

razporedili v skupine A, C in F, izolati iz vzorca B3 v skupini B in D ter izolati iz M90 v

skupino E. Analiza zaporedja nukleotidov je pokazala, da M30/6 (skupina C) z 96 %

verjetnostjo pripada rodu Lactobacillus, M30/25 iz skupine F z 99 % verjetnostjo pripada

vrsti L. gasseri, M90/3 iz skupine E vrsti P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii (99 %

verjetnost). Predstavnikov skupin A, B in D (M30/27, B3/15 in B3/19) nismo uspeli

identificirati na nivoju vrste.

L. rhamnosus

L. vaginalis


A

B

C



39





Pri paru mama-dojenček LJ-101 smo imeli na voljo vzorce M0, M30 in B3, iz katerih je

bilo izoliranih 19 izolatov in nadalje uporabljenih 12. Kot vidimo s slike 22 je analiza

profilov RAPD razvrstila vse izolate, razen dveh izolatov mleka 30 dni po rojstvu (skupini

A in B), v skupino C, v kateri so bili prisotni izolati M0, M30 in B3. Analiza zaporedja

nukleotidov predstavnika skupine C (M0/6) pa nakazuje, da sev z 99 % verjetnostjo

pripadajo vrsti P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii.

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii

L. spp.

L. gasseri


A

B

C

D

E

F



40





Pri paru mama-dojenček LJ-107 smo imeli na voljo vzorce mleka ob vseh časih odvzema,

in sicer M0, M30 in M90 ter vzorec blata B90, iz katerih je bilo pripravljenih 23 izolatov.

Na sliki 23 vidimo, da so se izolati razvrstili v 4 skupine (A do D). Skupino A

predstavljajo izolati iz vzorca B90, katere predstavnik B90/18 z 99 % verjetnostjo pripada

vrsti L. casei/ paracasei, v skupini B je en sam predstavnik B90, skupino C predstavljajo

izolati kolostruma s predstavnikom M0/3 iz vrste P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii (99 %

verjetnost), skupino D pa predstavljajo izolati iz vzorcev M30 in M90, katerih predstavnik

M30/10 z 97 % verjetnostjo pripada vrsti P. pentosaceus.

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii


A

B

C



41





Pri paru mama-dojenček LJ-121 smo imeli na voljo vzorce M30 in M90 ter B30, iz katerih

smo uspeli izolirati 19 izolatov in jih v nadaljevanju uporabili 15. Po analizi profilov

RAPD so se izolati razvrstili v tri skupine (A do C, slika 24). V skupini A sta izolata iz

vzorca M90, katere predstavnik M90/10 z 99 % verjetnostjo pripadat vrsti P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii. V skupini B, so prisotni izolati iz vzorcev mleka (M30) in blata (B30),

katere predstavnik M30/5 z 96 % verjetnostjo pripada vrsti E. faecium/ lactis. V skupini C

pa so prisotni izolati dveh vzorcev mleka (M30 in M90), predstavnik M90/9 te skupine pa

z 99 % verjetnostjo pripada vrsti P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii.

L. casei/paracasei

P. pentosaceus

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii


A

B

C

D



42




/število: zaporedno število izolata pri paru mama-dojenček; puščica in okvir: identifikacija seva.

Pri paru mama-dojenček LJ-126 smo izolirali 30 izolatov iz dveh vzorcev mleka, in sicer

M0 in M30 ter iz vzorca blata B3, v nadaljevanju pa smo uporabili le 23 izolatov iz

vzorcev M0 in B3. Po analizi profilov RAPD so se izolati razdelili v tri skupine (A do C,

slika 25). V skupini A se nahajajo izolati B3, dva iz sledeče skupine smo identificirali na

nivoju vrste, in sicer B3/14 z 99 % verjetnostjo pripada L. fermentum/ plantarum, medtem

ko B3/4 z 99 % verjetnostjo pripada vrsti L. rhamnosus. V skupini B je osamljen

predstavnik kolostruma M0/1. Skupina C zajema izolate blata (B3) in kolostruma (M0).

Dva izolata iz skupine smo identificirali, in sicer B3/11 z 99 % verjetnostjo pripada vrsti L.

gasseri, in M0/22, ki z 99 % verjetnostjo pripada vrsti P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii.

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii

E. faecium/lactis


A

B

C



43





Pri paru mama-dojenček LJ-140 smo imeli na voljo vzorec kolostruma M0 ter vzorca blata

B3 in B90. Izoliranih je bilo 20 izolatov, od katerih smo jih v nadaljevanju analizirali 9. Po

analizi RAPD so se izolati razporedili v tri skupine (A do C, slika 26). V skupini A so

zajeti izolati M0, B3 in B90, predstavnik B90/9 pa z 99 % verjetnostjo pripada vrsti L.

fermentum/ delbrueckii. Skupino B pa predstavljajo izolati iz kolostruma (M0), katere

predstavnik (M0/3), z 99 % verjetnostjo pripada vrsti E. faecalis

P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii

L. fermentum/

plantarum

L. gasseri

L. rhamnosus


A

B

C



44





4.3 TAKSONOMSKA UVRSTITEV IZOLATOV V VRSTE

Zaporedja nukleotidov variabilne regije V1-V3 16S rDNA predstavnikov genetsko

podobnih skupin smo s pomočjo programa BLAST primerjali s tistimi, ki so na voljo v

genski banki NCBI in ugotovili, da izolati pripadajo vrstam E. faecalis, E. faecium, E.

faecium/lactis, L. vaginalis, L. fermentum/delbrueckii, L. casei/ paracasei, L.

fermentum/plantarum, L. gasseri, L. rhamnosus, P. acidilactici, P. acidilactici/ lolii/

pentosaceus, P. pentosaceus in rod Lactobacillus. V preglednici 11 so zbrani rezultati

identifikacije in verjetnosti s katero izolati pripadajo identificirani vrsti ali rodu.

Preglednica 11: Identifikacija izolatov glede na rezultate sekveniranja variabilne regije V1-V3 16S rDNA

Par mama-dojenček Sekvenciran sev Vrsta Verjetnost (%)

IZ-003 B30/6 L. rhamnosus 99

B3/3 E. faecium 99

LJ-004

M30/23 P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus 99

B3/13 E. faecalis 100

B3/5 L. casei/ paracasei 99

M0/2 E. faecalis 99

B3/16 Ni rezultata /

LJ-007 M90/9 P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus 99

B90/6 P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus 99

LJ-024

M90/10 Ni rezultata /

M0/2 E. faecalis 100


M30/4 L. fermentum/ delbrueckii 99

Se nadaljuje…

E. faecalis

L. fermentum/

delbrueckii


A

B



45

Nadaljevanje preglednice 11: Identifikacija predstavnikov genetsko podobnih glede na sekvenciranje V1-V3

16S rDNA

Par mama-dojenček Sekvenciran sev Vrsta Verjetnost (%)

LJ-027



M90/22 P. acidilactici 96

LJ-034



M30/8 L. fermentum/ plantarum 99


M30/13 L. fermentum/ delbrueckii 99



LJ-039 B3/17 P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus 99


LJ-053




LJ-063 B0/9 E. faecium/ lactis 99

LJ-066 B3/7 P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus 98

M30/14 E. faecium/ lactis 99

LJ-083 B30/1 L. rhamnosus 99

B90/8 L. vaginalis 99

LJ-095



M30/6 Lactobacillus 96


M90/3 P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii 99

M30/25 L. gasseri 99

LJ-101 M0/6 P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii 99

LJ-107



M30/10 P. pentosaceus 97

LJ-121


M30/5 E. faecium/ lactis 96


LJ-126

B3/14 L. fermentum/ plantarum 99

B3/4 L. rhamnosus 99

B3/11 L. gasseri 99


LJ-140 B90/9 L. fermentum/ delbrueckii 99

M0/3 E. faecalis 99



46

4.3.1 Pregled vrst mlečnokislinskih bakterij

Bakterije rodu Pediococcus smo najpogosteje izolirali iz mleka, predstavnike rodu

Lactobacillus iz blata, medtem ko smo predstavnike rodu Enterococcus izolirali tako iz

vzorcev mleka kot blata. Najpogosteje zastopan rod je bil Pediococcus (preglednica 12).

Preglednica 12: Pregled izoliranih vrst mlečnokislinskih bakterij iz posameznih bioloških vzorcev.

Bakterijska vrsta

MATERINO MLEKO BLATO DOJENČKA Seštevek

odvzeto dni po rojstvu odvzeto dni po rojstvu (MM+BD)

0 30 90 0 3 30 90 skupaj

E. faecalis 3 3 (3+3) 6

E. faecium 1 (0+1) 1

E. faecium/lactis 3 1 1 1 (4+2) 6

L vaginalis 1 (0+1) 1

Rod Lactobacillus 1 (1+0) 1

L. fermentum/delbrueckii 1 2 1 1 1 (4+2) 6

L. casei/ paracasei 1 2 (0+3) 3

L. fermentum/plantarum 2 3 1 1 (5+2) 7

L. gasseri 1 1 (1+1) 2

L. rhamnosus 2 2 1 (0+5) 5

P. acidilactici 1 1 (2+0) 2

P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus 6 6 5 1 5 1 2 (17+9) 26

P. pentosaceus 1 1 (2+0) 2

Skupaj 12 18 9 2 15 4 8 (39+29) 68



47

5 RAZPRAVA

V nalogi nas je zanimalo, ali bo posamezne seve MKB možno zaslediti tako v vzorcih

kolostruma oziroma materinega mleka kot v vzorcih mekonija oziroma blata njenega

dojenčka. Najprej smo izbrali pare mama-dojenček po kriteriju, da je bil na voljo vsaj en

vzorec blata dojenčka (mekonij, BD) in vsaj en vzorec materinega mleka (kolostrum,

MM), skupno pa vsaj trije vzorci. Našim zahtevam je ustrezalo 17 parov mama-dojenček.

Pri dveh dodatnih dojenčkih (LJ-86 in LJ-144) smo preiskovali le morfološke značilnosti

izolatov iz blata. Materino mleko (MM) se je zbiralo takoj po rojstvu (M0=kolostrum), po

30-ih in 90-ih dneh po rojstvu, medtem ko se je blato dojenčka (BD) zbiralo takoj po

rojstvu (B0=mekonij), po 3-eh, 30-ih in 90-ih dneh po rojstvu. Skupno smo iz vseh

bioloških vzorcev pridobili 395 izolatov, od tega 210 iz mleka in 185 iz blata.

Pri preverjanju izolatov z barvanjem po Gramu se je izkazalo, da so MO zrasli na gojišču

Rogosa tako koki kot paličice, kar je pričakovano, saj samo gojišče ne zagotavlja

selektivnosti za laktobacile.

Od skupno 395 pridobljenih izolatov smo jih v nadaljevanju, zaradi neuspele kultivacije, z

RAPD analizirali 338. Za analizo RAPD smo uporabili tri začetne oligonukleotide GTG5,

M13 in KGT 80-GC, kar je tudi priporočeno število različnih začetnih nukleotidov za

potrjevanje sorodnosti sevov (Markiewicz in sod., 2010). Žal je analiza izbranih izolatov z

začetnima nukleotidoma M13 in KGT 80-GC podala zelo nejasne rezultate, zato smo

uporabili zgolj rezultate opravljene z GTG5, kar lahko predstavlja povečano tveganje za

nastanek napak.

Z RAPD smo dobili genetske profile posameznih izolatov, ki smo jih nato obdelali s

programom BioNumerics® 5.1 (Applied Maths, Belgija). Rezultat je bila razporeditev

sevov glede na njihovo relativno podobnost. 70 % relativno podobnosti smo izbrali kot

tisto vrednost pri kateri lahko predpostavljamo, da se izolati ene skupine razlikujejo od

izolatov druge skupine. Ta vrednost je bila določena na podlagi raziskav na podobnih

vrstah mlečnokislinskih bakterij, ki so jih preiskovali z enako metodo kot mi (RAPD)

(Rantsiou in sod., 2006) in upoštevajoč podatek, da je ponovljivost te metode za isti sev

86 % (Seseña et al., 2004). Na analizo zaporedja nukleotidov regije V1-V3 16S rDNA smo

poslali predstavnika izolatov posameznega profila RAPD, ki sta ga sestavljala vsaj dva

izolata, kar je pomenilo 52 predstavnikov. S to analizo smo želeli identificirati vrsto MKB

v posamezni skupini. Z analizo zaporedja nukleotidov smo za 18 predstavnikov ugotovili,

da najverjetneje pripadajo rodu Lactobacillus in prav toliko rodu Pediococcus, 8 pa rodu

Enterococcus, medtem ko jih 8 nismo uspeli identificirati.

Našo hipotezo, da lahko posamezen sev MKB zasledimo v obeh okoljih, tako v vzorcih

kolostruma oziroma materinega mleka kot v vzorcih mekonija ali blata njenega dojenčka,



48

smo potrdili, in sicer kar pri enajstih parih mama-dojenček, medtem ko smo pri paru LJ-

004 v obeh okoljih ugotovili celo prisotnost treh različnih sevov. Iz dobljenih rezultatov

lahko zaključimo, da je prisotnost istega seva v mleku in blatu najverjetneje posledica

prenosa MKB iz MM v BD in obratno. Prav tako so bili nekateri sevi prisotni dlje časa v

vzorcih MM ali BD, kar se je pokazalo za 16 sevov, 10 različnih sevov pridobljenih iz

vzorcev mleka ter za 6 različnih sevov iz vzorcev blata različnih dojenčkov.

Pri parih LJ-039, LJ-066, LJ-101, LJ-126 in LJ-140 smo določili izolate iz kolostruma in

DB v isti skupini. Pri LJ-039, LJ-066 in LJ-101 smo v isti skupini določili izolate

kolostruma, BD po 3 dneh in MM 30 dni po rojstvu, nato pa seva nismo zaznali ne v MM,

ne v BD. V vseh skupinah teh parov (LJ-039, LJ-066 in LJ-101), kjer so se nahajali izolati

iz obeh okolij, pa smo identificirali tudi izolat, ki je pripadal vrsti P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii. Pri paru mama-dojenček LJ-140 smo isti sev določili v kolostrumu, BD

po 3 dneh in MM 90 dni po rojstvu, kar nakazuje na to, da se je MO prenesel iz MM na

BD, obenem pa se je ohranil v mlečni žlezi. Pri paru LJ-126 je bilo zaznati isti sev najprej

v kolostrumu, nato pa v BD 3 dni po rojstvu, kar lepo nakazuje na vlogo MM, oziroma

kolostruma na oblikovanje dojenčkove začetne mikrobiote v prebavnem traktu. Pri paru

mama-dojenček LJ-004 lahko predvidimo prenos dveh sevov MKB iz MM na BD, kar je

razvidno iz uvrstitve izolatov iz dojenčkovega blata in materinega mleka v skupni C in D.

V skupini C so bili, podobno kot pri paru LJ-126, prisotni izolati iz kolostruma in BD 3 dni

po rojstvu, kar ponovno predstavlja prenos MO iz MM na BD, ki pa se kasneje ni uspel

obdržati v nobenem okolju. V skupini D pa je bil sev najprej zaznan v BD 3 dni po rojstvu,

nato pa v MM 30 dni po rojstvu, to pa je lahko posledica tega, da je mama pri previjanju

ali ljubkovanju otroka prenesla MO nase, kjer je nato prišel po več možnih poteh do

mlečne žleze. Obenem pa obstaja možnost, da seva v M0 nismo uspeli zaznati. Podobno

smo ugotovili tudi pri parih mama-dojenček LJ-027, LJ-034 in LJ-063. Pri paru LJ-027

smo zaznali iste seve v mekoniju, BD 3 dni po rojstvu in MM 90 dni po rojstvu, kar lahko

nakazuje prej opisan prenos, ali pa seve prej nismo uspeli zaznati oziroma njegova

določitev ni bila pravilna. Pri paru LJ-034 smo opazili podoben preskok, in sicer iz

mekonija na MM 90 dni po rojstvu, pri LJ-063 pa je bil poleg mekonija in MM 90 dni po

rojstvu prisoten tudi v MM 30 dni po rojstvu. Pri paru mama-dojenček IZ-003 smo isti sev

zaznali v obeh okoljih, tako MM, kot BD, saj so bili v isto skupino razvrščeni vzorci MM

30 dni po rojstvu in BD 3, 30 in 90 dni po rojstvu, s česar lahko sklepamo, da se je sev

uspel obdržati v dojenčkovem črevesju, ne pa v mlečni žlezi, oziroma ga v MM nismo

uspeli zaznati. Prav tako smo prisotnost istega seva v dveh različnih okoljih, in sicer ob

istih časih, ugotovili pri paru LJ-121, in sicer v BD in MM 30 dni po rojstvu, kar je smiseln

rezultat.Glede na to, da je MM eden izmed poglavitnih virov dojenčkove črevesne

mikrobiote, je rezultat smiseln (Mackie in sod., 1999; Marques in sod., 2010; Fouhy in

sod., 2012).



49

Z RAPD smo ugotovili, da je lahko posamezen sev prisoten dlje časa v MM, saj so se

izolati MM iste mame ob različnih časih pojavili v isti skupini. Slednje smo ugotovili pri

desetih mamah, za katere sklepamo, da imajo bolj stabilno mikrobioto MM. To, da se

posamezen sev dlje časa obdrži v MM so ugotovili tudi Hunt in sod. (2011). Na kar pa

lahko vpliva več dejavnikov. Poleg vpliva endogene poti na mikrobioto MM (Fernández in

Rodríguez, 2014; Treven in sod., 2015) ima vpliv tudi retrograden tok MM, ki lahko

vsebuje MO otrokove ustne votline, ki vsebuje vaginalno in črevesno mikrobioto matere,

pridobljeno med porodom in/ali mikrobioto kože matere (Ramsay in sod., 2004; Fernández

in Rodríguez, 2014). Obenem pa se v mlečnih vodih in/ali mlečnih žlezah tvorijo biofilmi

MKB, ki bi prav tako lahko pripomogli k dolgoročnemu obstoju istih sevov MKB v MM

(Martín in sod., 2004). Najpogosteje (pri petih mamah: LJ-034, LJ-039, LJ-053, LJ-066 in

LJ-101) smo opazili da se je sev obdržal iz kolostruma v MM 30 dni po rojstvu, kar je

zanimivo, saj je sev zato, da se je obdržal moral preživeti biološko spremembo iz

kolostruma v zrelo MM. V treh primerih je bil v skupini, ki je vsebovala izolate

kolostruma in MM 30 dni po rojstvu, identificirana vrsta P. pentosaceus/ acidilactici/ lolii.

Pri dveh materah (LJ-007 in LJ-140) pa smo opazili prisotnost istega seva v kolostrumu in

MM 90 dni po rojstvu. V teh dveh primerih lahko sklepamo, da izolata istega seva 30 dni

po rojstvu nismo uspeli zaznati ali pa ta ni bil prisoten. Trikrat pa smo opazili, da se je

ohranil sev v zrelem MM, in sicer v MM 30 in 90 dni po rojstvu. Ta pojav smo opazili pri

materah iz para LJ-063, LJ-107 in LJ-121.

Analiza RAPD nakazuje, da so isti sevi MKB lahko prisotni v dlje časa BD, saj so se

izolati vzorcev iz blata šestih dojenčkov ob različnih časih pojavili v istih skupinah. V

dveh primerih (LJ-027 in LJ-034) je bil sev določen v mekoniju in BD 3 dni po rojstvu,

nato pa ga nismo uspeli zaznati. V primeru LJ-027 smo v skupini identificirali izolat, ki je

pripadal vrsti P. acidilactici v primeru LJ-034 pa je izolat iz skupine pripadal vrsti P.

acidilactici/ lolii/ pentosaceus. Seva ki je bil prisoten v mekoniju, tako nikoli nismo

določili v BD 30 ali 90 dni po rojstvu. Pri LJ-053 in LJ-140 pa je bilo moč zaznati isti sev

v BD 3 in 90 dni po rojstvu, medtem ko ga v vmesnem času 3 in 30 dni po rojstvu ni bilo

moč zaznati. Vrsta L. rhamnosus, ki je bila določena pri predstavniku skupine, v kateri so

bili prisotni izolati iz BD 3, 30 in 90 dni po rojstvu pri dojenčku iz para IZ-003, kaže na to,

da je bil isti sev oz. vrsta prisoten v BD še 3 mesece po rojstvu. Vrsta P. pentosaceus/

acidilactici/ lolii je bila prisotna v B30 in B90 pri dojenčku iz para LJ-007, prej pa ga ni

bilo moč zaznati, s česar lahko sklepamo, da se je njegova prisotnost uzpostavila kasneje v

življenju dojenčka. Ugotovitev, da je posamezen sev MKB lahko prisoten dlje časa v BD je

smiselna. Dejstvo, da je posamezen sev dlje časa prisoten v BD in s tem v njegovem

prebavnem traktu, lahko pripišemo stalnemu vnosu tega seva iz okolice (hrana in okolje)

ali pa dobrim preživitvenim sposobnostim v prebavnem traktu otroka (Mackie in sod.,

1999; Marques in sod., 2010; Fouhy in sod., 2012). V študiji, kjer so spremljali mikrobioto

BD do 6 meseca so ugotovili, da je bil posamezen sev rodu Lactobacillus prisoten v BD

vsaj 3 tedne pri 17 % dojenčkov. Medtem pa ugotavljajo, da koncentracija laktobacilov v



50

BD, ki je pri enem tednu starosti 106,4

KE/g naraste na 108,8

KE/g pri 6 mesecih, nato pa

pade na 105,4

KE/g pri dveh letih starosti (Ahrné in sod., 2005).

Vse identificirane vrste MKB izolirane iz MM in/ali BD v naši študiji, so normalno

prisotne v MM in/ali BD (Jiménez in sod., 2008b; Albesharat in sod., 2011; Fernández in

Rodríguez, 2014).

V zadnjih nekaj letih je bilo narejenih kar nekaj študij, ki so proučevale prisotnost istih

MKB v MM in BD (Matsumiya in sod., 2002; Martín in sod., 2003, 2006; 2009, 2012;

Jiménez in sod., 2008b; Solís in sod., 2010; Albesharat in sod., 2011; Makino in sod.,

2011). Najpogostejši rodovi ki so najdeni tako v MM kot BD so Staphylococcus,

Enterococcus, Pediococcus, Lactobacillus in Bifidobacterium (Fernández in sod., 2013).

V študiji, kjer so ugotavljali prisotnost istih sevov v blatu matere, MM in BD pri 15 parih

mama-dojenček, so pri devetih parih ugotovili prisotnost istega seva v vsaj enem vzorcu

pridobljenem od matere in v BD. Izolirani sevi, prisotni pri materi in njenem dojenčku so

bili iz vrst L. plantarum, L. fermentum, L. brevis, E. faecium in E. faecalis (Albesharat in

sod., 2011), katere smo vse razen L. brevis, ugotovili tudi v naših vzorcih.

V podobni raziskavi (Martín in sod., 2003), so uspeli določiti iste seve iz vrst L. gasseri in

E. faecalis pri vseh osmih materah (MM, areola) in njihovih dojenčkih (BD in bris ustne

votline). V drugi študiji so pri 19-ih od 20-ih parov mama-dojenček našli iste seve iz rodov

Staphylococcus, Lactobacillus in Bifidobacterium v MM in BD. Pri večini je bil opažen

prenos vsaj dveh sevov, medtem ko sta si dva para delila 4 seve. Vertikalni prenos MKB

rodu Lactobacillus (L. gasseri, L. fermentum, L. salivarius, L. vaginalis, L. plantarum

in/ali L. reuteri) so potrdili pri 9-ih parih mama-dojenček (Martín in sod., 2012). Rezultati

sovpadajo z našimi, saj smo potrdili prisotnost istih sevov vrst L. fermentum/plantarum in

L. fermentum/delbrueckii, s čimer lahko predvidimo, da je najverjetneje šlo za eno od oblik

prenosa iz MM v BD.

Znano je, da v primeru dojenja mikrobiota BD odraža mikrobioto MM, oziroma obstajajo

razlike med dojenčki hranjenimi z MF ali MM, kar predstavlja še en dokaz, da je prehod iz

MM na BD možen (Heikkila in Saris, 2003; Ahrné in sod., 2005; Jiménez in sod., 2008b),

obenem pa lahko zaključimo, da mikrobiota MM vpliva na mikrobioto DB. Vendar to da

MM in BD vsebujeta iste vrste, še ne pomeni, da so direktno (vertikalno) preneseni iz MM

v BD.

Nenazadnje so sevi, ki uspejo preživeti prenos iz MM na BD možni probiotiki (Rodríguez

in sod., 2012). Za potrjevanje probiotičnega učinka pri naših izolatih bi bile potrebne

nadaljnje raziskave.



51

Ker je delo z MO zahtevno, dopuščamo, da je v katerikoli stopnji analize prišlo do napake.

Možna je nenamerna kontaminacija, neuspela kultivacija bakterij kakor tudi nezmožnost

detekcije nekaterih bakterij z uporabljenimi metodami. Obenem pa je lahko napaka nastala

tudi zaradi naključnega izbiranja kolonij in premajhnega števila le-teh.



52

6 SKLEPI

Potrdili smo hipotezo, da je moč zaslediti posamezne seve mlečnokislinskih

bakterij v obeh okoljih, tako v vzorcih materinega mleka kot v vzorcih blata

njenega dojenčka, iz česar lahko predvidimo prenos sevov iz materinega mleka v

črevo dojenčka in s tem blato dojenčka. Prisotnost istega seva v materinem mleku

in blatu dojenčka smo opazili v pri desetih od sedemnajstih parov mama-dojenček.

Pri nekaterih preiskovancih (materah in otrocih) smo izolirali iste seve v več

vzorcih materinega mleka ali blata dojenčka, kar kaže na to, da se posamezni sev

pri isti osebi lahko obdrži dlje časa. To je valjalo za 16 različnih sevov pridobljenih

iz vzorcev mleka 10 mam ter za 6 različnih sevov iz vzorcev blata različnih

dojenčkov.

Na podlagi določenega zaporedja nukleotidov variabilne regije V1-V3 16S rDNK

izolatov iz materinega mleka in blata dojenčka, smo identificirali bakterije rodov

Lactobacillus, Pediococcus in Enterococcus.



53

7 POVZETEK

Mikrobiota prebavnega trakta ima velik vpliv na zdravje človeka, njeno oblikovanje pa se

pri dojenčku začne že pred porodom. Eden izmed najpomembnejših dejavnikov za

oblikovanje dojenčkove črevesne mikrobiote, ki služi kot temelj za oblikovanje odrasle

mikrobiote, je način hranjenja. Mikrobiota prebavnega trakta se razlikuje med dojenčki

hranjenimi z MF ali MM, obenem pa mikrobiološka in biološka sestava MM vplivata na

mikrobioto dojenčkovega prebavnega trakta in s tem na mikrobioto blata.

Da bi ugotovili, ali obstaja možnost prenosa istih sevov MKB iz MM v BD in obratno smo

analizirali vzorce kolostruma (M0) in mleka (M30 in M90) ter mekonija (B0) in blata (B3,

B30 in B90) pri 17 parih mama-dojenček. Pri nacepljanju bioloških vzorcev na trdo gojišče

Rogosa smo pridobili skupno 395 izolatov. DNA izolatov smo iz posameznih kolonij

izolirali s toplotno lizo in jo kot matrično DNA uporabili pri RAPD, ki smo jih izvedli z

začetnimi oligonukleotidi GTG5, M13 in KGT-80 GC. Dobljene pomnožke smo analizirali

z gelsko elektroforezo, za določanje genetske sorodnosti med sevi pri posameznem paru

mama-dojenček pa smo uporabili program BioNumerics® 5.1 z mejo 70 % relativne

podobnosti (Applied Maths, Belgija). Iz posamezne skupine sevov smo izbrali po enega

predstavnika in jih poslali na sekvenčno analizo odseka V1-V3 16S rDNK. Dobljena

zaporedja nukleotidov 52 sevov smo s spletnim orodjem BLAST primerjali z zaporedji, ki

so na voljo v genski bazi NCBI.

Profili RAPD pridobljeni z začetnim oligonukleotidom GTG5 so se izkazali za najbolj

primerno za naše vzorce, zato smo sorodnost med sevi določali s programom

BioNumerics® 5.1 (Applied Maths, Belgija) le pri pomnožkih RAPD z GTG5. Rezultati

sekvenciranja variabilne regije V1-V3 16S rDNA pa so pokazali, da sevi najverjetneje

pripadajo vrstam E. faecalis, E. faecium, E. faecium/lactis, L. vaginalis, Lactobacillus , L.

fermentum/delbrueckii, L. casei/ paracasei, L. fermentum/plantarum, L. gasseri, L.

rhamnosus, P. acidilactici, P. acidilactici/ lolii/ pentosaceus in P. pentosaceus. Iz

rezultatov primerjav zaporedij nukleotidov s tistimi, ki so na voljo v bazi smo potrdili

prisotnost posameznih vrst iz rodov Lactobacillus, Pediococcus in Enterococcus v vsaj

enem vzorcu M0, M30 in M90, B0, B, B30 in B90. Laktobacilov nismo določili v B0 in

enterokokov v B90, kar namiguje, da v vzorcih niso bili prisotni ali pa so bili pod mejo

detekcije. Vse identificirane vrste iz MM in BD so normalni predstavniki mikrobiote MM

in BD.

Pri desetih od 17 parov mama-dojenček smo potrdili našo hipotezo, da bo posamezen sev

MKB moč zaslediti v obeh okoljih, tako v vzorcih kolostruma oziroma MM kot v vzorcih

mekonija oziroma blata njenega dojenčka. Pri enem paru mama-dojenček pa smo zaznali

dva različna seva v obeh okoljih. V 16 primerih pa se je preneseni sev uspel dlje časa



54

obdržati v vzorcu MM ali BD. Naša raziskava nakazuje, da je prenos MKB iz MM na BD

možen in da mikrobiota MM vpliva na mikrobioto BD.

Pri desetih mamah smo ugotovili prisotnost določenega seva v več vzorcih MM (M0 ali

M30 ali M90). Najverjetneje je da so se iste MKB, s pomočjo oblikovanega biofilma

uspele obdržati v mlečnih žlezah in/ali mlečnih vodih, da je mama uživala hrano z istimi

MO in prebiotičnimi faktorji in so se MBK preko endogene poti prenesle v MM ali pa so

se MKB preko retrogradnega toka iz okolice večkrat prenesle v MM.

Pri šestih dojenčkih smo ugotovili, da je bil posamezen sev prisoten v vsaj dveh vzorcih

BD (B0, B3, B30 ali B90). Glede na rezultate lahko sklepamo, da so se nekateri sevi MKB

obdržali v prebavnem traktu dojenčka, ali pa so bili konstantno prisotni v okolju in nato

preneseni v njegov prebavni trakt.



55

8 VIRI

Agostoni C., Axelsson I., Goulet O., Koletzko B., Michaelsen K. F., Puntis J. W. L., Rigo

J., Shamir R., Szajewska H., Turck D. 2004. Prebiotic oligosaccharides in dietetic

products for infants: a commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition. Journal

of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 39, 5: 465–473

Agostoni C., Braegger C., Decsi T., Kolacek S., Koletzko B., Michaelsen K. F., Mihatsch

W., Moreno L. a, Puntis J., Shamir R., Szajewska H., Turck D., van Goudoever J. 2009.

Breast-feeding: A commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition. Journal of

Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 49, 1: 112–125

Agostoni C., Decsi T., Fewtrell M., Goulet O., Kolacek S., Koletzko B., Michaelsen K. F.,

Moreno L., Puntis J., Rigo J., Shamir R., Szajewska H., Turck D., van Goudoever J.,

ESPGHAN Committee on Nutrition. 2008. Complementary feeding: a commentary by

the ESPGHAN Committee on Nutrition. Journal of Pediatric Gastroenterology and

Nutrition, 46, 1: 99–110

Ahrné S., Lönnermark E., Wold A. E., Aberg N., Hesselmar B., Saalman R., Strannegård I.

L., Molin G., Adlerberth I. 2005. Lactobacilli in the intestinal microbiota of Swedish

infants. Microbes and Infection, 7, 11-12: 1256–1262

Albesharat R., Ehrmann M. a, Korakli M., Yazaji S., Vogel R. F. 2011. Phenotypic and

genotypic analyses of lactic acid bacteria in local fermented food, breast milk and faeces

of mothers and their babies. Systematic and Applied Microbiology, 34, 2: 148–155

Andreas N. J., Kampmann B., Mehring Le-Doare K. 2015. Human breast milk: a review

on its composition and bioactivity. Early Human Development, 91, 11: 629–635

Arenz S., Rückerl R., Koletzko B., von Kries R. 2004. Breast-feeding and childhood

obesity - a systematic review. International Journal of Obesity and Related Metabolic

Disorders, 28, 10: 1247–1256

Ballard O., Morrow A. L. 2013. Human milk composition: nutrients and bioactive factors.

Pediatric Clinics of North America, 60, 1: 49–74

Benedik E. 2015. Prehrana v času nosečnosti in dojenja ter maščobno-kislinska sestava

humanega mleka. Doktorska disertacija. Ljubljana, Biotehniška fakulteta,

Interdisciplinarni študij Bioznanosti: 81 str.



56

BLAST. 2016. Bethesda, NCBI-National Center for Biotechnology Information: baza

podatkov.

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (januar, 2016)

Blüher S., Molz E., Wiegand S., Otto K.-P., Sergeyev E., Tuschy S., L’Allemand-Jander

D., Kiess W., Holl R. W. 2013. Body mass index, waist circumference, and waist-to-

height ratio as predictors of cardiometabolic risk in childhood obesity depending on

pubertal development. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 98, 8: 3384–

3393

Cabrera-Rubio R., Collado M. C., Laitinen K., Salminen S., Isolauri E., Mira A. 2012. The

human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and

mode of delivery. American Journal of Clinical Nutrition, 96, 3: 544–551

Callen J., Pinelli J. 2004. Incidence and duration of breastfeeding for term infants in

Canada, United States, Europe, and Australia: a literature review. Birth, 31, 4: 285–292

Conroy M. E., Shi H. N., Walker W. A. 2009. The long-term health effects of neonatal

microbial flora. Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 9, 3: 197–201

Cuello-Garcia C. A., Brożek J. L., Fiocchi A., Pawankar R., Yepes-Nuñez J. J.,

Terracciano L., Gandhi S., Agarwal A., Zhang Y., Schünemann H. J. 2015. Probiotics

for the prevention of allergy: a systematic review and meta-analysis of randomized

controlled trials. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 136, 4: 952–961

Díaz-Ropero M. P., Martín R., Sierra S., Lara-Villoslada F., Rodríguez J. M., Xaus J.,

Olivares M. 2007. Two Lactobacillus strains, isolated from breast milk, differently

modulate the immune response. Journal of Applied Microbiology, 102, 2: 337–343

Dominguez-Bello M. G., Costello E. K., Contreras M., Magris M., Hidalgo G., Fierer N.,

Knight R. 2010. Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial

microbiota across multiple body habitats in newborns. Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America, 107, 26: 11971–11975

EFSA. 2011. Guidance on the scientific requirements for health claims related to gut and

immune function. EFSA Journal, 9, 4: 1984, doi: 10.2903/j.efsa.2011.1984: 12 str.

Fallani M., Young D., Scott J., Norin E., Amarri S., Adam R., Aguilera M., Khanna S., Gil

A., Edwards C. A., Doré J. 2010. Intestinal microbiota of 6-week-old infants across

Europe: geographic influence beyond delivery mode, breast-feeding, and antibiotics.

Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 51, 1: 77–84



57

Fanaro S., Chierici R., Guerrini P., Vigi V. 2003. Intestinal microflora in early infancy:

composition and development. Acta Paediatrica, 92, Suppl. 441: 48–55

Fernández L., Langa S., Martín V., Maldonado A., Jiménez E., Martín R., Rodríguez J. M.

2013. The human milk microbiota: origin and potential roles in health and disease.

Pharmacological Research, 69, 1: 1–10

Fernández L., Rodríguez J. M. 2014. Breast milk: source of bacteria for the infant gut. V:

Intestinal microbiota probiotics and prebiotics. Orel R. (ed.). Ljubljana, Institute for

Probiotics and Functional Foods: 72–94

Flint H. J., Scott K. P., Louis P., Duncan S. H. 2012. The role of the gut microbiota in

nutrition and health. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, 9, 10: 577–589

Fouhy F., Ross R. P., Fitzgerald G. F., Stanton C., Cotter P. D. 2012. Composition of the

early intestinal microbiota: knowledge, knowledge gaps and the use of high-throughput

sequencing to address these gaps. Gut Microbes, 3: 203–220

Gosalbes M. J., Llop S., Vallès Y., Moya A., Ballester F., Francino M. P. 2013. Meconium

microbiota types dominated by lactic acid or enteric bacteria are differentially

associated with maternal eczema and respiratory problems in infants. Clinical &

Experimental Allergy, 43, 2: 198–211

Gueimonde M., Sakata S., Kalliomäki M., Isolauri E., Benno Y., Salminen S. 2006. Effect

of maternal consumption of Lactobacillus GG on transfer and establishment of fecal

bifidobacterial microbiota in neonates. Journal of Pediatric Gastroenterology and

Nutrition, 42, 2: 166–170

Hanson L. A., Winberg J. 1972. Breast milk and defence against infection in the newborn.

Archives of Disease in Childhood, 47, 256: 845–848

Harder T., Bergmann R., Kallischnigg G., Plagemann A. 2005. Duration of breastfeeding

and risk of overweight: a meta-analysis. American Journal of Epidemiology, 162, 5:

397–403

Heikkila M. P., Saris P. E. J. 2003. Inhibition of Staphylococcus aureus by the commensal

bacteria of human milk. Journal of Applied Microbiology, 95, 3: 471–478



58

Heilig H. G. H. J., Zoetendal E. G., Vaughan E. E., Marteau P., Akkermans A. D. L., de

Vos W. M. 2002. Molecular diversity of Lactobacillus spp. and other lactic acid

bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S

ribosomal DNA. Applied and Environmental Microbiology, 68, 1: 114–123

Hunt K. M., Foster J. A., Forney L. J., Schütte U. M. E., Beck D. L., Abdo Z., Fox L. K.,

Williams J. E., McGuire M. K., McGuire M. A. 2011. Characterization of the diversity

and temporal stability of bacterial communities in human milk. PLoS ONE, 6, 6:

e21313, doi:10.1371/journal.pone.0021313: 8 str.

Jandhyala S. M., Talukdar R., Subramanyam C., Vuyyuru H., Sasikala M., Reddy D. N.

2015. Role of the normal gut microbiota. World Journal of Gastroenterology, 21, 29:

8787

Jiménez E., Delgado S., Fernández L., García N., Albújar M., Gómez A., Rodríguez J. M.

2008a. Assessment of the bacterial diversity of human colostrum and screening of

staphylococcal and enterococcal populations for potential virulence factors. Research in

Microbiology, 159, 9-10: 595–601

Jiménez E., Delgado S., Maldonado A., Arroyo R., Albújar M., García N., Jariod M.,

Fernández L., Gómez A., Rodríguez J. M. 2008b. Staphylococcus epidermidis: a

differential trait of the fecal microbiota of breast-fed infants. BMC Microbiology, 8, 1:

143, doi: 10.1186/1471-2180-8-143: 11 str.

Johansson M. A., Sjögren Y. M., Persson J.-O., Nilsson C., Sverremark-Ekström E. 2011.

Early colonization with a group of lactobacilli decreases the risk for allergy at five years

of age despite allergic heredity. PLoS ONE, 6, 8: e23031, doi:

10.1371/journal.pone.0023031: 8 str.

Kalliomäki M., Collado M. C., Salminen S., Isolauri E. 2008. Early differences in fecal

microbiota composition in children may predict overweight. American Journal of

Clinical Nutrition, 87, 3: 534–538

Kanmani P., Satish Kumar R., Yuvaraj N., Paari K. A., Pattukumar V., Arul V. 2013.

Probiotics and its functionally valuable products - a review. Critical Reviews in Food

Science and Nutrition, 53, 6: 641–658

Kitajima H., Sumida Y., Tanaka R., Yuki N., Takayama H., Fujimura M. 1997. Early

administration of Bifidobacterium breve to preterm infants: randomised controlled trial.

Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition, 76, 2: F101–F107



59

Klijn N., Weerkamp a H., De Vos-W. M. 1991. Identification of mesophilic lactic acid

bacteria by using polymerase chain reaction-amplified variable regions of 16S rRNA

and specific DNA probes. Applied and Environmental Microbiology, 57, 11: 3390–

3395

Lau C. S. M., Chamberlain R. S. 2015. Probiotic administration can prevent necrotizing

enterocolitis in preterm infants: a meta-analysis. Journal of Pediatric Surgery, 50, 8:

1405–1412

Lawrence R. A., Lawrence R. M. 2011. Breastfeeding: a guide for the medical profession.

7th

ed. Missouri, Elsevier: 1114 str.

Leblanc J. G., Laiño J. E., del Valle M. J., Vannini V., van Sinderen D., Taranto M. P., de

Valdez G. F., de Giori G. S., Sesma F. 2011. B-Group vitamin production by lactic acid

bacteria - current knowledge and potential applications. Journal of Applied

Microbiology, 111, 6: 1297–1309

Lin P. W., Stoll B. J. 2006. Necrotising enterocolitis. Lancet (London, England), 368,

9543: 1271–1283

Lomax A. R., Calder P. C. 2009. Probiotics, immune function, infection and inflammation:

a review of the evidence from studies conducted in humans. Current Pharmaceutical

Design, 15, 13: 1428–1518

LPSN. 2016. Genus Lactobacillus. LPSN - List of Prokaryotic Names with Standing in

Nomenclature: 55 str.

http://www.bacterio.net/index.html (avgust, 2016)

Mackie R. I., Sghir A., Gaskins H. R. 1999. Developmental microbial ecology of the

neonatal gastrointestinal tract. American Journal of Clinical Nutrition, 69, 5: 1035S–

1045S

Makino H., Kushiro A., Ishikawa E., Muylaert D., Kubota H., Sakai T., Oishi K., Martín

R., Ben Amor K., Oozeer R., Knol J., Tanaka R. 2011. Transmission of intestinal

Bifidobacterium longum subsp. longum strains from mother to infant, determined by

multilocus sequencing typing and amplified fragment length polymorphism. Applied

and Environmental Microbiology, 77, 19: 6788–6793



60

Maldonado J., Cañabate F., Sempere L., Vela F., Sánchez A. R., Narbona E., López-

Huertas E., Geerlings A., Valero A. D., Olivares M., Lara-Villoslada F. 2012. Human

Milk Probiotic Lactobacillus fermentum CECT5716 reduces the incidence of

gastrointestinal and upper respiratory tract infections in infants. Journal of Pediatric

Gastroenterology and Nutrition, 54, 1: 55–61

Markiewicz L. H., Biedrzycka E., Wasilewska E., Bielecka M. 2010. Rapid molecular

identification and characteristics of Lactobacillus strains. Folia Microbiologica, 55, 5:

481–488

Marques T. M., Wall R., Ross R. P., Fitzgerald G. F., Ryan C. A., Stanton C. 2010.

Programming infant gut microbiota: influence of dietary and environmental factors.

Current Opinion in Biotechnology, 21, 2: 149–156

Martín R., Heilig H. G. H. J., Zoetendal E. G., Jiménez E., Fernández L., Smidt H.,

Rodríguez J. M. 2007. Cultivation-independent assessment of the bacterial diversity of

breast milk among healthy women. Research in Microbiology, 158, 1: 31–37

Martín R., Jiménez E., Heilig H., Fernandez L., Marin M. L., Zoetendal E. G., Rodriguez J.

M. 2009. Isolation of Bifidobacteria from breast milk and assessment of the

bifidobacterial population by PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis and

quantitative real-time PCR. Applied and Environmental Microbiology, 75, 4: 965–969

Martín R., Jiménez E., Olivares M., Marín M. L., Fernández L., Xaus J., Rodríguez J. M.

2006. Lactobacillus salivarius CECT 5713, a potential probiotic strain isolated from

infant feces and breast milk of a mother-child pair. International Journal of Food

Microbiology, 112, 1: 35–43

Martín R., Langa S., Reviriego C., Jiménez E., Marín M. L., Olivares M., Boza J., Jiménez

J., Fernández L., Xaus J., Rodríguez J. M. 2004. The commensal microflora of human

milk: New perspectives for food bacteriotherapy and probiotics. Trends in Food Science

and Technology, 15, 3-4: 121–127

Martín R., Langa S., Reviriego C., Jiménez E., Marín M. L., Xaus J., Fernández L.,

Rodríguez J. M. 2003. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut.

Journal of Pediatrics, 143, 6: 754–758

Martín V., Maldonado-Barragán A., Moles L., Rodriguez-Baños M., Campo R. Del,

Fernández L., Rodríguez J. M., Jiménez E. 2012. Sharing of bacterial strains between

breast milk and infant feces. Journal of Human Lactation, 28, 1: 36–44



61

Masood M. I., Qadir M. I., Shirazi J. H., Khan I. U. 2011. Beneficial effects of lactic acid

bacteria on human beings. Critical Reviews in Microbiology, 37, 1: 91–98

Matamoros S., Gras-Leguen C., Le Vacon F., Potel G., de La Cochetiere M.-F. 2013.

Development of intestinal microbiota in infants and its impact on health. Trends in


Matsumiya Y., Kato N., Watanabe K., Kato H. 2002. Molecular epidemiological study of

vertical transmission of vaginal Lactobacillus species from mothers to newborn infants

in Japanese, by arbitrarily primed polymerase chain reaction. Journal of Infection and

Chemotherapy: 8, 1: 43–9

Nickerson K. 2006. Environmental contaminants in breast milk. Journal of Midwifery &

Women’s Health, 51, 1: 26–34

Obermajer T., Lipoglavšek L., Tompa G., Treven P., Lorbeg P. M., Matijašić B. B., Rogelj

I. 2015. Colostrum of healthy Slovenian mothers: microbiota composition and

bacteriocin gene prevalence. PLoS ONE, 10, 4: e0123324, doi:

10.1371/journal.pone.0123324: 19 str.

Olivares M., Díaz-Ropero M. P., Martín R., Rodríguez J. M., Xaus J. 2006. Antimicrobial

potential of four Lactobacillus strains isolated from breast milk. Journal of Applied


Owen C. G. 2005. Effect of infant feeding on the risk of obesity across the life course: a

quantitative review of published evidence. Pediatrics, 115, 5: 1367–1377

Ozgun D., Vural H. C. 2011. Identification of Lactobacillus strains isolated from faecal

specimens of babies and human milk colostrum by API 50 CHL system. Journal of

Medical Genetics and Genomics, 3: 46–49

Patrick O. M. 2012. Lactic acid bacteria in health and disease. Rwanda Journal of Health

Sciences, 1, 1: 39–50

Pérez-Cano F. J., Dong H., Yaqoob P. 2010. In vitro immunomodulatory activity of

Lactobacillus fermentum CECT5716 and Lactobacillus salivarius CECT5713: two

probiotic strains isolated from human breast milk. Immunobiology, 215, 12: 996–1004

Prescott S. L., Bjorksten B. 2007. Probiotics for the prevention or treatment of allergic

diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 120, 2: 255–262



62

Ramsay D. T., Kent J. C., Owens R. A., Hartmann P. E. 2004. Ultrasound imaging of milk

ejection in the breast of lactating women. Pediatrics, 113, 2: 361–367

Rantsiou K., Drosinos E. H., Gialitaki M., Metaxopoulos I., Comi G., Cocolin L. 2006.

Use of molecular tools to characterize Lactobacillus spp. isolated from Greek traditional

fermented sausages. International Journal of Food Microbiology, 112, 3: 215–222

Rautava S., Kalliomaki M., Isolauri E. 2002. Probiotics during pregnancy and breast-

feeding might confer immunomodulatory protection against atopic disease in the infant.

Journal of Allergy and Clinical Immunology, 109, 1: 119–121

Riordan J. 2005. Breastfeeding and human lactation. 3rd

ed. Kansas, Jones And Bartlett

Publishers: 819 str.

Rodríguez E., Arqués J. L., Rodríguez R., Peirotén Á., Landete J. M., Medina M. 2012.

Antimicrobial properties of probiotic strains isolated from breast-fed infants. Journal of

Functional Foods, 4, 2: 542–551

Seseña S., Sánchez I., Palop L. 2004. Genetic diversity (RAPD-PCR) of lactobacilli

isolated from “Almagro” eggplant fermentations from two seasons. FEMS

Microbiology Letters, 238, 1: 159–165

Solís G., de los Reyes-Gavilan C. G. G., Fernández N., Margolles A., Gueimonde M. 2010.

Establishment and development of lactic acid bacteria and bifidobacteria microbiota in

breast-milk and the infant gut. Anaerobe, 16, 3: 307–310

Škorjanc U. 2015. Kolostrum kot vir mlečnokislinskih bakterij in bifidobakterij za

novorojenca. Magistrsko delo. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo:

42 str.

Torriani S., Zapparoli G., Dellaglio F. 1999. Use of PCR-based methods for rapid

differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp.

lactis. Applied and Environmental Microbiology, 65, 10: 4351–4356

Treven P., Mrak V., Bogovič Matijašić B., Horvat S., Rogelj I. 2015. Administration of

probiotics Lactobacillus rhamnosus GG and Lactobacillus gasseri K7 during pregnancy

and lactation changes mouse mesenteric lymph nodes and mammary gland microbiota.

Journal of Dairy Science, 98, 4: 2114–2128



63

Urbaniak C., Angelini M., Gloor G. B., Reid G. 2016. Human milk microbiota profiles in

relation to birthing method, gestation and infant gender. Microbiome, 4, 1: 1, doi:

10.1186/s40168-015-0145-y: 9 str.

Urbaniak C., Cummins J., Brackstone M., Macklaim J. M., Gloor G. B., Baban C. K., Scott

L., O’Hanlon D. M., Burton J. P., Francis K. P., Tangney M., Reid G. 2014. Microbiota

of human breast tissue. Applied and Environmental Microbiology, 80, 10: 3007–3014

Versalovic J., Schneider M., Bruijn F. J. de, Lupski J. R. 1994. Genomic fingerprint of

bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in

Molecular and Cellular Biology, 5: 25–40

Wang M., Li M., Wu S., Lebrilla C. B., Chapkin R. S., Ivanov I., Donovan S. M. 2015.

Fecal microbiota composition of breast-fed infants is correlated with human milk

oligosaccharides consumed. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 60, 6:

825–833

WHO/FAO. 2006. Probiotics in food: Health and nutritional properties and guidelines for

evaluation. Report of a Joint FAO/WHO expert consultation on the health and

nutritional properties of powder milk with live lactic acid bacteria. Rome, World Health

Organization/ Food and Agriculture Organization of United Nations: 71 str.



ZAHVALA

Najlepše bi se rada zahvalila vsem, ki me imajo radi in mi dovolijo, da imam jaz rada njih!

PRIMERJAVA MIKROBNE POPULACIJE...faeces is possible and that human milk microbiota affects the...

Documents

Transcript of PRIMERJAVA MIKROBNE POPULACIJE...faeces is possible and that human milk microbiota affects the...