Izradio: Ljiljana Kudra Potpis:

Prevodi monografija metoda u Evropskoj farmakopeji

TAKA (TEMPERATURA) TOPLJENJA METODA KAPILARE (Ph.Eur. 6.0.; 2.2.14. str. 32)

Temperatura topljenja, odreena metodom zataljene kapilare, je ona temperatura na kojoj i posljednja estica kompaktnog sloja vrste supstance u kapilari pree u teno stanje. Kada je propisano u monografiji, isti aparat i metoda se koriste za odreivanje drugih karakteristika, kao to je formiranje meniskusa ili opsega topljenja, koji karakterie ponaanje supstance pri topljenju.AparatAparat se sastoji od:

- odgovarajue staklene posude za zagrijavanje u kojima se nalazi voda, teni parafin ili silikonsko ulje,

opremljene odgovarajuim zagrijavanjem - mjealice koje obezbjeuju ujednaenost temperature u kupatilu, - odgovarajueg termometra sa skalom u podiocima ne veim od 0.5C i sa oznakom za dubinu

uranjanja. Opseg termometra nije vei od 100C. - kapilarnih cijevica od tvrdog stakla koje ne otputa alkalije, unutranjeg prenika od 0.9 mm do 1.1 mm sa debljinom zida 0. 10-0.15 mm, koje su na jednom kraju zataljene.MetodaUkoliko nije drugaije propisano, fino spraena supstanca se sui u vakumu i iznad bezvodnog silikagela R tokom 24 asa. U kapilaru se unese dovoljna koliina supstance da se dobije kompaktan sloj visine 4-6 mm. Povea se temperatura kupatila na oko 10 C ispod oekivane take topljenja, a potom se prilagodi brzina zagrijavanja na oko 1C/min. Kada temperatura dostigne 5C ispod oekivane take topljenja, na adekvatan nain se unese kapilarna cjevica u instrument. Za gore navedeni aparat, uroni se kapilara tako da se njen zatvoreni kraj nalazi blizu centra rezervoara termometra, ija je oznaka za dubinu uranjanja u nivou povrine tenosti. Zabiljei se temperatura na kojoj i poslednja estica prelazi u teno stanje.Kalibracija aparata. Aparat se moe kalibrisati sa referentnim supstancama za taku topljenja, kao to su one koje daje Svjetska zdravstvena organizacija(WHO) ili drugim odgovarajuim supstancama.TAKA (TEMPERATURA) TOPLJENJA- METODA OTVORENE KAPILARE(Ph.Eur. 6.0.; 2.2.15. str. 32,33) Za odreivanje se take topljenja odreenih supstanci koristi se ova metoda , poznata kao "slip point " i "rising melting point ".

Koriste se staklene kapilarne cjevice, otvorene sa oba kraja, duine oko 80 mm, spoljanjeg prenika 1.4 1.5 mm i unutranjeg prenika 1. 0 1.2 mm. Dovoljna koliina supstance, koja je prethodno tretirana kako je opisano, unese se u u svaku od pet kapilarnih cjevica, tako da u svakoj formira stub visine 10 mm, a zatim se cjevice ostave da stoje jedno vrijeme na propisanoj temperaturi.Ukoliko nije drugaije propisano, supstance konzistencije voska se paljivo i kompletno istope na vodenom kupatilu prije unoenja u kapilaru. Zatim se kapilara sa supstancom ostavi 2 sata na temperaturi 2-8C. Zakai se jedna cjevica na termometar graduisan podiocima od 0.5C, tako da supstanca bude odmah do rezervoara termometra. Termometar, sa zakaenom cjevicom, unese se u u au, tako da rastojanje izmeu dna ae i donjeg dijela rezervoara termometra bude 1 cm. aa se napuni vodom do dubine od 5 cm. Postepeno se poveava temperatura vode, brzinom od 1C/min.

Temperatura na kojoj data supstanca pone da se podie u kapilarnoj cjevici, smatra se takom topljenja.Ponovi se postupak sa ostale etiri cjevice i rezultat izrauna kao srednja vrijednost ovih pet oitanja.

TAKA (TEMPERATURA) TOPLJENJA- METODA TRENUTNOG TOPLJENJA(Ph.Eur. 6.0.; 2.2.16. str. 33.) Temperatura topljenja t ovom metodom izraunava se prema slijedeem izrazu:

t = t1+ t2 / 2gdje je t1 temperatura trenutnog topljenja supstance, a t2 temperatura na kojoj prestaje trenutno topljenje supstance u kontaktu sa metalnom, oitane pod uslovima datim u nastavku.Aparat. Aparat se sastoji od metalnog bloka, otpornog na ispitivanu supstancu, koji dobro provodi toplotu, kao to je na primjer mesing, ija je gornja povrina dobro uglaana. Ploa se uniformno grije kroz cijelu masu uz pomo gasnog grijaa sa mikro podeavanjem ili elektrinog grijaa sa finim podeavanjem. Na ploi se nalazi cilindrino udubljenje dovoljno iroko da se postavi termometar, iji ivin stub treba da se odrava u istom poloaju tokom kalibracije aparata i odreivanje take topljenja ispitivane supstance. Cilindrino udubljenje je paralelno sa sa gornjom uglaanom povrinom bloka, od koje se nalazi na rastojanju od oko 3 mm. Aparat se kalibrie koritenjem odgovarajuih supstanci poznate take topljenja.

Metoda. Ploa se zagrijava odgovarajuom brzinom do temperature od oko 10C ispod oekivane temperature topljenja, a potom brzinu zagrijavanja treba podesiti na oko 1C/min. U vremenski pravilnim razmacima nanese se nekoliko estica spraene i po potrebi osuene supstance, pripremljene po kapilarnoj metodi, na plou, u blizini rezervoara termometra, istei povrinu bloka poslije svakog testa. Zabiljei se temperatura t1 , na kojoj se supstanca trenutno topi pri kontaktu sa metalom. Prekine se zagrijavanje. Tokom hlaenja, u pravilnim vremenskim razmacima nanese se nekoliko estica supstance na blok , istei povrinu bloka poslije svakog testa. Zabiljei se temperatura t2 na kojoj supstanca prestaje da se trenutno topi u kontaktu sa metalom.

Kalibracija aparata. Aparat se moe kalibrirati sa referentnim supstancama za taku topljenja, kao to su one koje daje Svjetska zdravstvena organizacija (WHO) ili drugim odgovarajuim supstancama. BISTRINA I STEPEN OPALESCENCIJE

(Ph.Eur. 6.0.; 2.2.1 str. 21)

*Preveden je dio Opte monografije koji se radi u laboratoriji:

VIZUELNA METODA

U epruveti od bezbojnog, transparentnog i neutralnog stakla unutarnjeg dijametra 15-25 mm, uporediti ispitivanu supstancu sa referentnim standardom svjee primljenim prema propisu. Visina rastvora treba da bude 40 mm. Uporediti rastvore na dnevnom svjetlu 5 minuta nakon pripreme standardnog rastvora gledajui vertikalno u odnosu na crnu podlogu.

Difuzija svjetla mora biti takva da referentna suspenzija I bude razliita od vode R i da je referentna suspenzija II razliita od referentne suspenzije I.

Tenost je oznaena kao bistra ako je bistrina ista kao kod vode R ili kao kod rastvaraa upotrebljenog pod dole navedenim uslovima ili ako opalescencija nije intenzivnija od opalescencije standardnog rastvora I.

Rastvor hidrazin sulfata:

Rastvoriti 1,0 g hidrazin sulfata R u vodi R i razblaiti vodom do 100,0 ml. Ostaviti da stoji 4-6 sati.

Rastvor heksametilentetramina:

Rastvoriti 2,5 g heksametilentetramina u 25,0 ml vode u odmjernom sudu od 100,0 ml.

Primarna opalescentna suspenzija ( formazin suspenzija):

U rastvor heksametilentetramina dodati 25,0 ml rastvora hidrazin sulfata. Izmjeati i ostaviti 24 sata. Ova suspenzija je stabilna 2 mjeseca pod uslovom da se uva u staklenom posuu bez povrinskih oteenja. Suspenzija ne smije ostavljati tragove na staklu i treba je prije upotrebe dobro promukati.Standard za opalescenciju (radna otopina)Razblaiti 15,0 ml primarne opalescentne otopine do 1000,0 ml vodom R. Ova otopina se svjee priprema i moe stajati najdue 24 sata.

Referentne suspenzije:Pripremiti referentne suspenzije prema Tabeli 2.2.1.-1.Dobro izmjeati prije upotrebe.

IIIIIIIV

Standard za opalescenciju

Radna otopina5,0 ml10,0 ml30,0 ml50,0 ml

Voda R95,0 ml90,0 ml70,0 ml50,0 ml

STEPEN OBOJENOSTI TENOSTI

( Ph.Eur. 6.0.;2.2.2. str.22 )

Ispitivanje stepena obojenosti tenosti u oblasti smee-uto-crveno je mogue provesti koristei jednu od dvije dole navedene metode, prema propisu u pojedinanoj monografiji.

Rastvor je bezbojan ako ima izgled vode R ili rastvaraa ili nije intenzivnije obojen od referentnog rastvora B9.

METOD I

Koristei identine epruvete od bezbojnog, transparentnog stakla spoljanjeg dijametra 12 mm, uporediti 2,0 ml ispitivane tenosti sa 2,0 ml vode R ili rastvaraa ili referentne otopine(pogledati tabelu referentnih otopina) propisanog u monografiji. Uporediti boju na dnevnom svjetlu, gledajui horizontalno prema bijeloj podlozi.

METOD II

Koristei identine epruvete od bezbojnog, transparentnog, neutralnog stakla unutranjeg dijametra 15-25 mm uporediti ispitivanu tenost sa vodom R, ili rastvaraem ili referentnom otopinom(pogledati tabelu referentnih otopina) propisanom u monografiji. Visina rastvora treba da bude 40 mm. Uporediti boju na difuznom svjetlu gledajui vertikalno u odnosu na bijelu podlogu.

REAGENSI

Primarna otopina /Osnovni rastvori

uti rastvor

Rastvoriti 46,0 g feri-hlorida R u oko 900,0 ml smjee od 25,0 ml hloridne kiseline R i 975,0 ml vode R i razblaiti istom smjeom do 1000,0 ml. Titrirati i podesiti sadraj FeCl3,6H2O u rastvoru na 45,0 mg/ml dodajui istu kiselu smjeu. Zatititi rastvor od svjetla.

Titracija. U erlenmajer od 250,0 ml, sa staklenim bruenim epom, prenijeti 10,0 ml rastvora, 15,0 ml vode R, 5,0 ml hloridne kiseline R i 4,0 g kalij-jodida R. Zaepiti erlenmajer, ostaviti u mraku 15 minuta i zatim dodati 100,0 ml vode R. Titrirati osloboeni jod sa 0,1 M natrij - tiosulfatom koristei 0,5 ml rastvora kroba R, dodatog pri kraju titracije, kao indikatora.

1 ml 0,1 M natrij-tiosulfata odgovara 27,03 mg FeCl3,6H2O.

Crveni rastvor. Rastvoriti 60,0 g kobalt hlorida R u oko 900,0 ml smjee od 25,0 ml hloridne kiseline R i 975,0 ml vode R i razblaiti istom smjeom do 1000,0 ml. Titrirati i podesiti sadraj CoCl,6H2O u rastvoru na 59,5 mg/ml dodajui istu kiselu smjeu.

Titracija. U erlenmajer od 250,0 ml, sa staklenim bruenim epom, prenijeti 5,0 ml crvenog rastvora, 5,0 ml rastvora razblaenog H2O2 R i 10,0 ml 300 g/l rastvora NaOH R. Paljivo zagrijati i ostaviti da kljua 10 minuta, ohladiti

ostaviti da se ohladi i dodati 60,0 ml razblaene sulfatne kiseline R i 2,0 g kalij-jodida R. Zatvoriti erlenmajer i rastvoriti precipitat mukajui paljivo. Titrirati osloboeni jod rastvorom 0,1 M natrij-tiosulfata koristei rastvor kroba, dodat pri kraju titracije, kao indikator. Zavrna taka je postignuta kada se boja promijeni u rozu.

1 ml 0,1 M Na2S2O3 odgovara 23,79 mg CoCl,6H2O

Plavi rastvor. Rastvoriti 63,0 g CuSO4 R u oko 900,0 ml smjee od 25,0 ml hloridne kiseline R i 975,0 ml vode R i razblaiti istom smjeom do 1000,0 ml. Titrirati i podesiti sadraj CuSO4,5H2O u rastvoru na 62,4 mg/ml dodajui istu kiselu smjeu.Titracija. U erlenmajer od 250,0 ml, sa staklenim bruenim epom, prenijeti 10,0 ml rastvora, 50,0 ml vode R, 12,0 ml razblaene siretne kiseline R i 3,0 g kalij-jodida R. Titrirati osloboeni jod 0,1 M natrijtiosulfatom koristei 0,5 ml rastvor kroba,dodatog pri kraju titracije, kao indikator. Zavrna taka titracije je postignuta pojavom svijetlo smee boje.

1 ml 0,1 M Na2S2O3 odgovara 24,97 mg CuSO4,5H2O

Standardni rastvoriKoristei tri primarne otopine/ osnovna rastvora pripremiti pet standardnih rastvora prema tabelama:

Tabela 2.2.2.-1

Standardni rastvoruti rastvor Crveni rastvorPlavi rastvorHloridna kiselina

10 g /1 HCl

B (smei rastvor)3,0 ml3,0 ml2,4 ml1,6 ml

BY(smee-uto)2,4 ml1,0 ml0,4 ml6,2 ml

Y (uto)2,4 ml0,6 ml0,0 ml7,0 ml

GY (zelenkasto-uto9,6 ml0,2 ml0,2 ml0,0 ml

R (crveno)1,0 ml2,0 ml0,0 ml7,0 ml

Referentni rastvori za metode I i II

Koristei 5 standardnih otopina, pripremiti slijedee referentne otopine.

Tabela:2.2.2.-2 Referentni rastvori B

Referentni rastvorStandardni rastvor BHloridna kiselina

(10 g / l HCl)

B 175,0 ml25,0 ml

B 250,0 ml50,0 ml

B 337,5 ml62,5 ml

B 425,0 ml75,0 ml

B 512,5 ml87,5 ml

B 65,0 ml95,0 ml

B 72,5 ml97,5 ml

B 81,5 ml98,5 ml

B 91,0 ml99,0 ml

Tabela:2.2.2-3 Referentni rastvori BY

REFERENTNI RASTVORISTANDARDNI RASTVOR BYHloridna kiselina (10 g / ml HCl)

BY1100,0 ml0,0 ml

BY275,0 ml25,0 ml

BY350,0 ml50,0 ml

BY425,0 ml75,0 ml

BY512,5 ml87,5 ml

BY65,0 ml95,0 ml

BY72,5 ml97,5 ml

Tabela : 2.2.2 4 Referentni rastvori Y

Referentni rastvori YStandardni rasrtvori YHloridna kiselina (10 g / l HCl)

Y 1100,0 ml0,0 ml

Y 275,0 ml25,0 ml

Y 350,0 ml50,0 ml

Y 425,0 ml75,0 ml

Y 512,5 ml87,5 ml

Y 65,0 ml95,0 ml

Y 72,5 ml97,5 ml

Tabela 2.2.2-5 Referentni rastvori GY

Referentni rastvoriStandardni rastvor GYHloridna kiselna (10 g / l HCl)

GY125,0 ml75,0 ml

GY215,0 ml85,0 ml

GY38,5 ml91,5 ml

GY45,0 ml95,0 ml

GY53,0 ml97,0 ml

GY61,5 ml98,5 ml

GY70,75 ml99,25 ml

Tabela: 2.2.2-6 Referentni rastvori R

Referentni rastvori RStandardni rastvor RHloridna kiselina (10 g / l HCl)

R1100,0 ml0,0 ml

R275,0 ml25,0 ml

R350,0 ml50,0 ml

R437,5 ml62,5 ml

R525,0 ml75,0 ml

R612,5 ml87,5 ml

R75,0 ml95,0 ml

uvanjeZa metodu I referentni rastvori se mogu uvati u zapeaenim posudama od bezbojnog, neutralnog i transparentnog stakla vanjskog promjera 12 mm, zatienim od svjetlosti.

Za metod II, referentni rastvori se pripremaju neposredno prije upotrebe.

POTENCIOMETRIJSKO ODREIVANJE pH

( Ph. Eur. 6.0; 2.2.3. str. 24)

pH vrijednost je broj koji prema prihvaenoj konvenciji predstavlja koncentraciju vodonikovih jona u nekom vodenom rastvoru. pH vrijednost ispitivane otopine zavisnosti od pH vrijednosti referentne otopine (pHs) prema slijedeem izrazu :

pH = pHs -

u kojem je E potencijal elije, izraen u voltima, koja sadri ispitivanu otopinu a Es je potencijal elije , izraen u voltima,koja sadri otopinu poznatog pH (pHs), k je promjena potencijala po pH jedinici ,izraena u voltima, a izraunata iz Nernstove jednaine.

Temperatura (C

k

150,0572

200,0582

250,0592

300,0601

350,0611

Potenciometrijsko odreivanje pH se izvodi tako da se mjeri razlika potencijala izmeu dvije odgovarajue elektrode koje su uronjene u otopinu koja se ispituje; jedna od ovih elektroda je selektivna prema vodonikovim jonima (obino je to staklena elektroda ) dok je druga referentna elektroda ( npr. zasiena kalomelova elektroda ).

Aparati: Mjerni aparat je voltimetar ulaznog otpora 100 puta veeg od onog koji imaju koritene elektrode.

Najee imaju dvije skale, jednu u pH jedinicama a drugu u mV. Osjetljivost aparata omoguava razlikovanje najmanje 0.05 pH jedinice ili najmanje 3 mV.

Postupak: Ukoliko nije drugaije propisano u monografiji sva mjerenja se vre na istoj temperaturi ( 20-25 (C ). Tabela 1 pokazuje promjenu pH u zavisnosti od temperature odreenog broja referentnih rastvora pufera koji se koriste za kalibraciju. U sluaju da je potrebna korekcija temperature trebalo bi da se postupi prema upustvu proizvoaa. Aparat se kalibrie pufer otopinom kalijum hidrogenftalata ( primarni standard ) i nekim drugim rastvorom pufera razliite pH vrijednosti (preporuuje se da to bude jedan od onih prikazanih u narednoj tabeli ). Izmjerena pH vrijednost treeg rastvora pufera, sa pH izmeu predhodna dva, ne smije se razlikovati vie od 0.05 pH jedinica od prave vrijednosti pH ovog rastvora. Elektrode se urone u ispitivani rastvor i oitavanje izvri pod istim uslovima kao za rastvor pufera.

Ako je aparat esto u upotrebi kalibracije se moraju obavljati redovno. Ako se aparat ne koristi esto kalibraciju treba obaviti prije svakog mjerenja.

Svi ispitivani rastvori i referentni rastvori se moraju pripremiti sa vodom bez prisustva ugljen dioksida R.

Priprema referentnih pufer otopina

Kalijum tetraoksalat 0.05 M. Rastvori se 12.61 g C4H3KO8 2H2O u vodi R i istim rastvaraem dopuni do 1000 ml.

Kalijum hidrogentartarat, zasieni rastvor na 25 (C. Snano se promuka viak C4H3KO6 sa vodom R osloboenom od CO2 na 25 (C.Filtrira se i dekantuje. Priprema se neposredno prije upotrebe.

Kalijum dihidrogencitrat 0.05 M. Rastvori se 11.41 g C6H7KO7 u vodi R osloboenoj od CO2 i sa istim rastvaraem dopuni do 1000 ml. Priprema se neposredno prije upotrebe.

Kalijum hidrogen ftalat 0.05 M. Rastvori se 10.13 g C8H5KO4 predhodno suen na 1102 (C, u vodi bez ugljen dioksida R i istim rastvaraem dopuni do 1000 ml.

Kalijum dihidrogenfosfat 0.025 M + dinatrijum hidrogen fosfat 0.025 M. Rastvori se 3.39 g KH2PO4 i 3.53 g Na2HPO4, predhodno suen 2 h na 1202 (C, u vodi R osloboenoj od CO2 i dopuni se istim rastvaraem do 1000 ml.

Kalijum dihidrogenfosfat 0.0087 M + dinatrijum hidrogenfosfat 0.0303 M. Rastvori se 1.18 g KH2PO4 i 4.30 g Na2HPO4 predhodno suen 2 h na 1202 (C (C , u vodi R osloboenoj od CO2 i istim rastvaraem se dopuni do 1000 ml.

Dinatrijum tetraborat 0.01 M. Rastvori se 3.80 g Na2B4O7 . 10H2O u vodi R osloboenoj od CO2 i istim rastvaraem se dopuni do 1000ml. uva se zatieno od ugljen-dioksida iz vazduha.

Natrijum karbonat 0.025 M + natrijum hidrogenkarbonat 0.025 M. Rastvori se 2.64 g Na2CO3 i 2.09 g NaHCO3 u vodi R osloboenoj od CO2i istim rastvaraem se dopuni do 1000 ml.

Kalcijum hidroksid zasieni ( na 25 C). Mjeati dovoljnu koliinu kalcijum hidroksida sa vodom bez ugljen dioksida, dekantirati na 25 C. uvati zatieno od atmosferskog ugljen dioksida.

UVANJE

Pufer rastvore uvati u prikladnim otpornim, dobro zatvorenim kontejnerima, tip I hidrolitike klase stakla ili plastinim pakovanjima prikladnim za vodene rastvore.

Tabela 1. pH referentnih pufer otopina na razliitim temperaturama

Tempera.

(CKalijum-tetraoksalat

0.05 MKalijum

Hidrogen

tartarat

Zasien na 25(CKalijum-dihidrogencitrat

0.05 MKalijum-hidrogen

ftalat

Kalijum-dihidrogen

fosfat 0.0027 M

+

Dinartrijum-hidrogen

fosfat0.025 MKalijum-dihidrogen

fosfat 0.0087 M

+

Dinatrijum-hidrogen

fosfat 0.0303 MDinatrijum-tetraborat 0.01 MNatrijum-karbonat 0.025 M

+

Natrijum-bikarbonat 0.025 MKalicijum hidroksid zasieni

25 C

C4H3KO8.2 H2OC4H5KO6C6H7KO7C8H5KO4KH2PO4 +Na2HPO4KH2PO4 +Na2HPO4Na2B4O7 .10 H2ONa2CO3 +NaHCO3Ca(OH)2

15

20

25

30

351.67

1.68

1.68

1.68

1.693.56

3.55

3.553.80

3.79

3.78

3.77

3.764-00

4.00

4.01

4.02

4.026.90

6.88

6.87

6.85

6.847.45

7.43

7.41

7.40

7.399.28

9.23

9.18

9.14

9.1010.12

10.06

10.01

9.97

9.9312,81

12,63

12,45

12,29

12,13

+0.001-0.0014-0.0022+0.0012-0.0028-0.0028-0.0082-0.0096-0,034

= promjena pH po stepenu Celzijusu

RELATIVNA GUSTINA

(Ph. Eur. 6.0; 2.2.5.; str. 25)

Relativna gustina neke supstance predstavlja omjer mase odreene zapremine supstance na temperaturi t1 i mase iste zapremine vode, na temperaturi t2.

Ukoliko nije drugaije navedeno, koristi se relativna gustina . Uobiajeno je da se relativna gustina moe izraziti i kao . Gustina , definisana kao masa jedinice volumena supstance na 20C, moe se takoe koristiti, a izraava se u kg / m3 ili g/cm3 ( 1 kg*m-3= 10-3 g*cm-3). Ove veliine su u meusobnoj vezi prema sljedeim jednainama gdje je gustina izraena u gramima po kubnom cm:

ili

ili

EMBED Equation.3 Relativna gustina ili gustina odrede se sa preciznou do onog broja decimalnih mjesta propisanih u monografiji, uz upotrebu boice za odreivanje gustine (vrste ili tene supstance), hidrostatike vage (vrste supstance), hidrometra (tenosti) ili digitalnog denzitometra sa oscilirajuim pretvaraem /prijemnikom (tenosti i gasovi)

Kada se odreivanje provodi vaganjem, zanemaruje se pritisak vazduha ,koji moe prouzrokovati greku od 1 jedinice na treoj decimali. Kod upotrebe denzitometra pritisak zraka nema uticaja.

Denzitometar sa oscilirajuim prijemnikom sastoji se od:

- cijevi u obliku slova U, od borosilikatnog stakla, u koju se smjeta ispitivana tenost,

- magnetno-elektrinog ili piezo-elektrinog sistema za pobuivanje , koji uzrokuje oscilscije cijevi kao podupirueg oscilatora, na karakteristinim frekvencijama u zavisnosti od gustine tenosti koja se ispituje;

- ureaja za mjerenje perioda oscilacije (T), koji uz pomo aparata moe biti pretvoren u direktno oitavanje gustine ili upotrijebljen za preraunavanje gustine preko konstanti A i B

Rezonantna frekvencija (f) je funkcija konstante elastinosti (c) i mase(m)sistema :

M= masa cijevi

V = unutranji volumen cijevi.

Uvoenjem dvije konstante A=c/(42 x V) i B=M/V dobivamo klasinu jednainu za oscilirajui transducer:

Konstante A i B su odreene radom instrumenta sa U cijevi napunjenom sa dva uzorka razliite poznate gustine , npr. degasifikovana voda R i zrak. Kontrolna mjerenja provode se dnevno uz upotrebu degasifikovane vode R. Rezultati kontrolnih mjerenja ne smiju odstupati od referentne vrijednosti vie od specificirane greke (=0,998203 g*cm-3; = 1,000000). Npr. za instrument sa specifikacijom tanosti

0,0001g/cm3 treba pokazati oitavanje 0,9982 0,0001g/cm3 da bi bili ispunjeni uslovi za pogodnost sistema za dalja mjerenja. U suprotnom potrebna su dodatna podeavanja. Kalibracija sa referentnim materijalom se redovno provodi . Mjerenja se provode po istoj proceduri kao za kalibraciju. Temperatura ispitivane tenosti se podesi ,u termostatu, na 20 C prije mjerenja i unoenja u U-cijev, da bi se izbjeglo stvaranje mjehuria zraka i skratilo vrijeme provoenja analize.

Faktori koji utiu na tanost ukljuuju:

- ujednaenost temperature u mjernoj cijevi,

- nelinearnost u podruju ispitivane gustine,

- tetne rezonantne efekte,

- viskoznost, u sluaju kada otopine sa veom viskoznou od kalibratora imaju gustinu koja je oigledno

vea od stvarne vrijednosti.

Uticaj nelinearnosti i viskoznosti moe se izbjei upotrebom kalibratora koji imaju gustinu i viskoznost slinu onoj koju ima ispitivana tenost ( 5% za gustinu , 0 % za viskoznost) Denzitometar moe imati funkciju automatske korekcije viskoznosti i korekcije greaka koje su posljedica temperaturnih promjena i nelinearnosti.

Preciznost je funkcija ponovljivosti i stabilnosti frekvencija oscilatora, koje zavise od stabilnosti volumena, mase i konstante elastinosti elije.

Denzitometri su u mogunosti da postignu mjerenja sa grekom iji je red veliine od 1x10-3 g/cm-3 do 1x10-5g/cm-3 i ponovljivosti od 1x10-4g/cm-3 do 1x10-6g/cm-3.INDEKS REFRAKCIJE(Ph. Eur. 6.0; 2.2.6.; str. 26)Indeks refrakcije medija u odnosu na zrak je jednak odnosu sinusa upadnog ugla svjetlosne zrake u zraku i sinusa ugla prelomljene zrake u datom mediju.

Ukoliko nije drugaije propisano, indeks refrakcije se mjeri na 200,5C, u odnosu na talasnu duinu D-linije natrijuma (=589,3 nm); oznaka je .

Refraktometri normalno odreuju kritini ugao. Kod takvih aparata osnovni dio je prizma poznatog indeksa refrakcijekoja je u kontaktu sa tenou koja se ispituje.

Aparat se kalibrie sa certificiranim referentnim materijalom. Kada se koristi bijela svjetlost, refraktometar treba da posjeduje sistem za kompenziranje. Aparat ispunjava zahtjeve za tanost oitanja na treoj decimali (najmanje), te je opremljen da funkcionie na propisanoj temperaturi. Termometar je graduisan na podioke od 0,5C ili manje. OPTIKA ROTACIJA( Ph.Eur. 6.0.; 2.2.7. str. 26)Optika rotacija je sposobnost hiralnih supstanci da zakreu ravan polarizovane svjetlosti. Optika rotacija se smatra pozitivnom (+) ukoliko supstanca zaokree ravan polarizovane svjetlosti udesno ( u smjeru kazaljke na satu) i negativnom (-) ukoliko zaokree ravan polarizovane svjetlosti ulijevo ( u smjeru suprotnom kazaljke na satu).

Specifina optika rotacija [ m] t je rotacija izraena u radijanima (rad), izmjerena na temperaturi t , proputanjem monohromatske svjetlosti neke talasne duine , kroz sloj debljine 1 m tenosti ili rastvora, koji sadri 1kg optiki aktivne supstance rastvorene u m3 rastvora. Iz praktinih razloga specifina optika rotacija se izraava u miliradijanima kvadratnog metra po kilogramu ( mrad.m2 .kg -1).

Farmakopeja usvaja slijedee uobiajene definicije:

Ugao optike rotacije

Ugao optike rotacije tenosti je ugao rotacije , izraen u stepenima (), za koji tenost okrene ravan polarizacije polarizovanog svjetlosnog zraka D-linije natrijevog spektra (=589,3 mn), pri njegovom prolasku kroz sloj otopine debljine 1 dm, na 20C. Postupak pripreme otopine je opisan u monografiji.

Specifina optika rotacija tenosti [ ] 20DSpecifina optika rotacija tenosti je ugao rotacije , izraen u stepenima ( ), za koji tenost zaokree ravan polarizovane svjetlosti talasne duine D-linije natrijevog spektra (=589,3 mn), izmjerenog na 20 0,5C, izraunatog za sloj debljine 1 dm i podijeljenog sa gustinom izraenom u g/cm3.

Specifina optika rotacija [ ] 20D rastvorene supstance

Predstavlja ugao rotacije (izraen u stepenima (), za koji rastvor , koji sadri 1 g/ml date supstance, zaokree ravan polarizovane svjetlosti talasne duine D-linije natrijevog spektra (=589,3 mn) izmjerenog na 20C, izraunatog za sloj debljine 1 dm. Specifina optika rotacija rastvorene supstance se uvijek izraava u odnosu na dati rastvara i koncentraciju.

Prema uobiajenom sistemu jedinica koji je usvojen u Farmakopeji specifina optika rotacija se izraava svojom vrijednou bez jedinica; aktuelna jedinica [()mldm-1g-1 ] se podrazumijeva.

Faktor konverzije iz Internacionalnog sistema jedinica u sistem dat u Farmakopeji je slijedei:

[ m] t = [ ] t x 0,1745

U odreenim sluajevima navedenim u monografiji, ugao rotacije se moe izmjeriti i na drugim temperaturama, osim na 20C, kao i na drugim talasnim duinama.

Polarimetar mora odezbijediti oitavanja sa tanou do 0,01. Skala se obino provjerava koritenjem certificiranih kvarcnih ploica. Linearnost skale moe se provjeriti pomou standardnog rastvora saharoze.

Postupak :

Odredi se nulta vrijednost na polarimetru i ugao rotacije polarizovane svjetlosti na talasnoj duini D-linije natrijevog spektra (=589,3 mn) na 20 0,5C. Mjerenja se mogu vriti na drugim temperaturama, samo kada se u monografiji propisuje korekcija temperature koju treba izvriti za datu optiku rotaciju. Nulta vrijednost aparata se odredi sa zatvorenom mjernom elijom.; za tenosti nula se odredi sa praznom mjernom elijom, dok se za vrste supstance puni propisanim rastvaraem.

Specifina optika rotacija se izraava iz slijedeih izraza :

Za tenosti [ ] 20D = / l20

Za vrste supstance [ ] 20D =1000 / lc gdje je c koncentracija otopine u g/lIzraunava se sadraj c u g/l ili sadraj c' u % m/m rastvorene supstance prema slijedeim izrazima :

c = 1000 / l [ ] 20D ; c' = 1000 / l [ ] 20D 20 = ugao rotacije u stepenima na 20C 0,5,

l = duina mjerne elije polarimetra u dm,

20 = gustina na 20C u g/cm3. Za potrebe Farmakopeje gustina se zamjenjuje relativnom gustinom(2.2.5),

c = koncentracija supstance u g / l ,

c' = sadraj supstance u procentima m/m. VISKOZNOST

( Ph.Eur. 6.0.;2.2.8. str.27)Dinamika viskoznost ili koeficijent viskoznosti je tangencijalna sila po jedinici povrine, oznaena kao tangencijalni napon izraen u paskalima, potreban da se paralelno sa kliznom povrinom pomakne, sloj tenosti povrine 1 m2 brzinom (v) od 1 m/s u odnosu na paralelni sloj tenosti, na daljinu (x) od jednog metra.

Odnos dv/dx je gradijent brzine oznaen kao brzina klizanja (rate of shear) i izraen je u recipronim sekundama (s-1), tako da je = / D

Jedinica dinamike viskoznosti je paskal sekunda (Pa.s), a najee koritena je milipaskal sekunda (mPa.s).

Kinematika viskoznost , izraena u kvadratnim metrima u sekundi, se dobije dijeljenjem dinamike viskoznosti gustinom tenosti na istoj temperaturi izraenom kilogramima po kubnom metru, tj. = / . Kinematika viskoznost je izraena u kvadratnim milimetrima po sekundi [mm2/s].

Kapilarni viskozimetar se moe koristiti za odreivanje viskoznosti Njutnovih tenosti, a rotacioni viskozimetar za odreivanje viskoznosti Njutnovih i ne-Njutnovih tenosti.

Mogu biti koriteni i drugi viskozimetri, pod uslovom da tanost i preciznost nisu manji nego kod dole opisanih viskozimetara.

METODA KAPILARNOG VISKOZIMETRA

(Ph.Eur. 6.0.;2.2.9.str.27)Odreivanje viskoznosti pomou kapilarnog viskozimetra se vri na temperaturi 20 0.1 C, osim ako nije drugaije propisano. Vrijeme potrebno da nivo tenosti padne od jedne oznake do druge se mjeri topericom sa preciznou od 1/5 sekunde. Rezultat je validan samo ako se rezultati od dva uzastopna mjerenja ne razlikuju vie od 1 %. U raun se uzima srednja vrijednost od najmanje 3 mjerenja,a predstavlja vrijeme protoka za ispitivanu tenost.Izraunati dinamiku viskoznost u milipaskal sekundama koristei sljedeu formulu:

= k t

gdje je:

k konstanta viskozimetra, izraena u kvadratnim milimetrima po sekundi na kvadrat

gustina ispitivane tenosti izraena u miligramima po kubnom milimetru a dobivena mnoenjem relativne gustine () sa 0.9982

t vrijeme protoka ispitivane tenosti, u sekundama

Konstanta k se odredi koritenjem odgovarajue kalibracione tenosti.Za izraunavanje kinematike viskoznosti (mm2/s) koristi se formula:

= ktOdreivanje se moe izvriti aparatom prikazanim na slici 2.2.9.-1., koji zadovoljava sljedee uslove:Broj veliineNominalna konstanta viskozimetraRaspon kinematike viskoznostiUnutarnji promjer tube R Volumen trbuha

CUnutarnji promjer tube N

mm2/s2mm2/smm (2%)ml (5%)mm

10,013,5 do 100,645,62,8 do 3,2

1A0,036 do 300,845,62,8 do 3,2

20,120 do 1001,155,62,8 do 3,2

2A0,360 do 3001,515,62,8 do 3,2

31,0200 do 10002,065,63,7 do 4,3

3A3,0600 do 30002,745,64,6 do 5,4

4102000 do 10 0003,705,64,6 do 5,4

4A306000 do 30 0004,075,65,6 do 6,4

510020 000 do 100 0006,765,66,8 do 7,5

Minimalno vrijeme protoka za veliinu br.1 treba da je 350 s ,a 200 s za sve ostale veliine.

Metoda:

Napuniti viskozimetar kroz cijev (L) sa dovoljnom koliinom ispitivane tenosti, prethodno zagrijane na 20C (osim ako nije drugaije propisano), da napuni balon (A) ali paziti da nivo tenosti u balonu (B) je ispod izvoda za ventilacionu cijev (M). Uroniti viskozimetar u vodeno kupatilo prethodno zagrijano na 20 0.1C (osim ako nije drugaije propisano), drati ga u uspravnom poloaju ne manje od 30 minuta da se temperature izjednae. Zatvoriti cijev (M) i podii nivo tenosti u cijevi (N) do nivoa od oko 8 mm iznad oznake (E). Drati tenost na ovom nivou zatvarajui cijev (N) i otvarajui cijev (M). Otvoriti cijev (N) i mjeriti, sa topericim sa preciznou od 1/5 sekunde, vrijeme koje je potrebno da tenost padne od oznake (E) do oznake (F).

Slika 2.2.9.- 1. : Suspended Level Viscosimeter (Ph.Eur.)

* sve dimenzije u milimetrima

METODA ROTACIONOG VISKOZIMETRA

(Ph.Eur. 6.0;2.2.10. str. 28)

Princip metode je mjerenje sile koja djeluje na rotor kada se okree pri konstantnoj angularnoj brzini ( rotaciona brzina) u tenosti. Rotacioni viskozimetar se koristi za mjerenje viskoznosti Njutnovih (veza izmeu tangencijalnog napona i gradijenta brzine je linearna) ili ne-Njutnovih tenosti (veza izmeu tangencijalnog napona i gradijenta brzine nije linearna, prividna viskoznost). Rotacioni viskozimetri se mogu podijeliti u dvije grupe: apsolutni i relativni viskozimetri. Kod apsolutnih viskozimetara protok je dobro definisan. Mjerenja daju apsolutne vrijednosti viskoznosti, to se moe porediti sa bilo kojom drugom apsolutnom vrijednosti. Kod relativnih viskozimetara protok nije definisan. Mjerenja daju relativne vrijednosti viskoznosti, to se ne moe porediti sa absolutnim vrijednostima ili drugim relativnim vrijednostima ukoliko nisu odreene metodom sa istim relativnim viskozimetrom.

Postoji nekoliko mjernih sistema za dati raspon viskoznosti kao i za nekoliko rotacionih brzina.

APARATI

Najee se koriste sljedei tipovi instrumenata:

KONCENTRINI CILINDRINI VISKOZIMETAR (APSOLUTNI VISKOZIMETAR)

U koncentrinom cilindrinom viskozimetru (koaksijalni dvostruki cilindrini viskozimetar ili jednostavni koaksijalni cilindrini viskozimetar), viskoznost se odreuje stavljanjem tenosti u upljinu izmeu unutarnjeg i vanjskog cilindra. Mjerenje viskoznosti se moe provesti rotiranjem unutarnjeg cilindra (Searle tip viskozimetra) ili vanjskog cilindra (Coutte tip viskozimetra), kao to je pokazano na slici 2.2.10.-1 i 2.2.10.-2. Za laminarni protok , viskoznost (ili prividna viskoznost) izraena u paskal-sekundama je data sljedeom formulom:

M=sila koja djeluje na cilindrinu povrinu izraena u njutn-metrima

=angularna brzina u radijanima/sekundi

h=dubina uranjanja unutarnjeg cilindra u teni medij u metrima

Ri= prenik unutarnjeg cilindra u metrima

R0=prenik vanjskog cilindra u metrima

k=konstanta aparata, izraena u radijanima po kubnom metru

Za ne-Njutnove tenosti neophodno je definisati (specificirati) tangencijalni napon () ili brzinu smicanja () pri kojoj se mjeri viskoznost. Kada je upljina uska (uslovi koji se sreu kod apsolutnih viskozimetara), postoji proporcionalna veza izmeu M i , kao i izmeu i :

gdje su A i B konstante instrumenta i raunaju se prema sljedeim jednainama:

-za koncentrine povrine

-za konusne povrine

M= sila koja djeluje na cilindrinu ili koninu povrinu izraena u njutn-metrima

=angularna brzina u radijanima/sekundi

Ri= prenik unutarnjeg cilindra u metrima

R0=prenik vanjskog cilindra u metrima

R= prenik konusa u metrima

h=dubina uranjanja unutarnjeg cilindra u teni medij u metrima

=ugao izmeu ravne povrine i konusa

=tangecijalni napon u paskalima (Pa)

= brzina smicanja (s-1)

KONUSNI VISKOZIMETRI (APSOLUTNI VISKOZIMETRI)Kod konusnog viskozimetra, tenost se stavlja u upljinu izmeu ravne povrine i konusa sa kojim formira odgovarajui ugao. Mjerenje viskoznosti se provodi rotiranjem konusa ili ravne povrine, kao to je prikazano na slikama 2.2.10.-3. i 2.2.10.-4. Za laminarni protok , viskoznost (ili prividna viskoznost) se izraava u paskal-sekundama i data je sljedeom formulom:

M= sila koja djeluje na cilindrinu ili koninu povrinu izraena u njutn-metrima

=angularna brzina u radijanima/sekundi

=ugao izmeu ravne povrine i konusa

R= prenik konusa u metrima

k=konstanta aparata, izraena u radijanima po kubnom metru

Konstante A i B aparata (pogledati pod koncentrini cilindrini viskozimetar)

VRETENASTI VISKOZIMETRI (RELATIVNI VISKOZIMETRI)Kod vretenastih viskozimetara , viskoznost se odreuje rotiranjem vretena (koje je u obliku cilindra ili diska, kao to je pokazano na slikama 2.2.10.-5 i 2.2.10.-6) uronjenog u tenost. Relativne vrijednosti viskoznosti (ili prividna viskoznost) se mogu direktno izraunati koristei faktor konverzije sa skale na datoj rotacionoj brzini.

Openito se konstanta k aparata moe odrediti na razliitim brzinama rotacije koristei certificiranu tenost za kalibraciju viskozimetra. U tom sluaju, viskoznost odgovara formuli:

Metoda

Viskoznost se mjeri prema uputama za upotrebu rotacionog viskozimetra. Temperatura mjerenja viskoznosti je naznaena u monografiji. Za ne-Njutnske sisteme, u monografiji je reeno koji se tip viskozimetra koristi, te ako se koristi apsolutni viskozimetar definie se pri kojoj rotacionoj brzini ili brzini smicanja se mjerenje obavlja. Ukoliko je nemogue postii tano naznaenu brzinu smicanja, onda se koristi malo vea i malo manja brzina i izvri se interpolacija.

Kod relativnih viskozimetara brzina smicanja nije ista kroz uzorak, pa se prema tome ne moe definisati. Pod ovim uslovima, viskoznost ne-Njutnovih tenosti odreena sa prethodnom formulom ima relativan karakter, koji ovisi od tipa vretena i angularne brzine, kao i od dimenzija pakovanja uzorka ( =minimalno 80 mm) i dubine uranjanja vretena. Vrijednosti dobijene se mogu porediti samo ako se metoda odvija pod istim eksperimentalnim uvjetima.

POTENCIOMETRIJSKA TITRACIJA

(Ph. Eur. 6.0; 2.2.20.; str. 35)

Kod potenciometrijske titracije zavrna taka titracije se odreuje praenjem promjene razlike potencijala izmeu dvije elektrode (jedna je indikatorska i jedna referentna elektroda ili dvije indikatorske elektrode) uronjene u ispitivani rastvor, kao funkciju koliine dodatog titranta.

Potencijal se obino mjeri pri nultoj ili praktino nultoj struji.

Aparat: Aparat koji se koristi (obian potenciometar ili elektronski ureaj) sastoji se od dva voltmetra sa tanou oitanja do 1 milivolta.

Koje e indikatroske elektrode biti koritene, zavisi od supstance koja se odreuje a mogu biti staklene ili metalne elektrode (na primjer, platinske elektrode, elektrode od zlata, srebra ili ive). Referentne elektrode su obino kalomelova ili srebro/srebro-hloridna elektroda.

Kod acidimetrijskih i alkalimetrijskih titracija, u koliko nije drugaije propisano koriste se kombinacije staklene i kalomelove elektrode ili staklene i srebro/srebro-hloridne elektrode.

Metoda: Ako je potrebno otopina se neutralizira, prije otapanja ispitivane supstance.

Konstruie se kriva promjene razlike potencijala u funkciji koliine dodatog titranta, nastavljajui dodavanje titranta i poslije postizanja oekivane ekvivalentne take.

Zavrna taka titracije odgovara najveoj promjeni razlike potencijala.

ABSORPCIONA SPEKTROFOTOMETRIJA INFRACRVENA

(Ph. Eur. 6.0.; 2.2.24. str.39)Infracrveni spektrofotometri se koriste za snimanje spektara u podruju od 4000 -650 cm-1 (2.5-15.4 m), a u nekim sluajevima i do 200 cm-1 (50 m).

APARAT

Spektrofotometri za snimanje spektara u navedenoj oblasti sastoje se od podesnog izvora svjetlosti, monohromatora ili interferometra i detektora.

Spektrofotometri na principu Fourier-ove transformacije koriste polihromatsko zraenje i izraunavaju oblast frekvencije spektra obradom originalnih podataka Fourier-ovom transformacijom.

Spekrtofotometri sa optikim sistemom, koji moe da proizvede monohromatsko zraenje u mjernoj oblasti takoer se mogu koristiti. Uobiajeno je da se spektri predstavljaju kao funkcija transmitance, kolinika intenziteta transmitovanog (proputenog) i upadnog zraenja. Spektri mogu biti predstavljeni i u funkciji absorbance.

Absorbanca (A) se definie kao dekadni logaritam reciprone vrijednosti transmitance (T):

A= log 10( 1/ T ) = log 10 ( I0 / I )

T= I / I0

I0 = intenzitet upadnog zraenja

I = intenzitet transmitovanog (proputenog) zraenja

PRIPREMA UZORKA

ZA SNIMANJE PRIMJENOM TRANSMISIJE ILI ABSORBANCE

Supstancu pripremti prema jednom od sljedeih postupaka.

Tenosti

Tenost se ispituje ili u vidu filma izmeu dvije ploice transparentne za infracrveno zraenje ili u eliji odgovarajue duine putanje, takoe transparentnoj za infracrveno zraenje.

Tenosti ili vrste supstance u rastvoru.

Pripremiti rastvor u odgovarajuem rastvarau. Izaberati koncentraciju i duinu putanje kivete, koji daju zadovoljavajui spektar. Optimalni rezultati se dobiju sa koncentracijama od 10 g /l do 100 g/l, za duinu putanje od 0,5 mm do 0,1 mm. Apsorpcija rastvaraa se kompenzuje postavljanjem istovjetne kivete, koja sadri koriteni rastvara, na putanju referentnog zraka. Ukoliko se koristi FT-IC instrument, absorbanca se kompenzuje uzastopnim snimanjem spektra rastvaraa i uzorka. Absorbanca rastvaraa, korigovana za vrijednost faktora kompenzacije, se oduzme upotrebom software za izraunavanje.

vrste supstance

vrste supstance se ispituju suspendovane u pogodnoj tenosti ( mull suspenzije) ili u trituratu sa vrstom supstancom ( sa KBr ili KCl se formira halide disk) . Ako je propisano u monografiji, napravi se film od izlivene mase i postavi izmeu dvije ploice transparentne za infracrveno zraenje.

A - NjujolMull

Mala koliina supstance koja se ispituje se usitni i izmijea sa minimalnom koliinom tenog parafina R, ili nekom drugom pogodnom tenou; obino je dovoljno 5 10 mg ispitivane supstance, da se pripremi odgovarajua smjesa ( mull ) sa jednom kapi tenog prafina R. Smjesa se kompresuje izmeu dvije ploice transparentne za infracrveno zraenje.

B - Disk

Usitniti i izmjeati 1-2 mg ispitivane supstance sa 300-400 mg fino spraenog i osuenog kalijum bromida R ili kalijum hlorida R, ukoliko nije drugaije propisano. Ove koliine su obino dovoljne, za disk prenika 10-15 mm i spektar odgovarajueg intenziteta. Ukoliko je supstanca hidrohlorid preporuuje se upotreba kalijum hlorida R . Smjesa se paljivo usitni, ujednaeno se nanese u odgovarajui kalup i podvrgne pritisku od oko 800 MPa (8 t.cm-2). Za supstance koje su nestabilne pod normalnim atmosferskim uslovima ili su higroskopne, disk se presuje pod vakumom. Nekoliko faktora moe da izazove formiranje loih diskova, poput prekomjernog ili nedovoljnog usitnjavanja, vlage ili drugih oneienja u disperzionom medijumu ili nedovoljnog smanjenja veliine estica. Disk se odbacuje ukoliko se pri vizuelnom ispitivanju utvrdi da transparentnost nije ujednaena ili ukoliko je transmitanca u podruju 2000 cm-1 , u odsustvu specifine absorpcione trake, manja od 60 % bez kompenzacije.

Gasovi.

Gasovi se ispituju u kiveti transparentnoj za infracrveno zraenje, sa duinom optike putanje oko 100 mm. Kiveta se vakuumira, a zatim se kroz pogodnu slavinu ili odgovarajui ventil, ispuni gasom na propisanom pritisku, koristei odgovarajui sistem za prenoenje izmeu kivete i kontejnera u kome se nalazi ispitivani gas. Ukoliko je potrebno pritisak u kiveti, podesi se na atmosferski pritiska, uvoenjem gasa transparentnog u podruju infracrvenog zraenja ( na primjer , azot R ili argon R ). Da bi se izbjegla interferencija apsorpcije uzrokovana vodom, na put referentnog zraka postavljaju se ugljen-dioksid ili drugi atmosferski gasovi u identinoj kiveti, koja je ili vakuumirana ili je ispunjena gasom transparentnim za infracrveno zraenje.

ZA SNIMANJE PRIMJENOM DIFUZNE REFLEKSIJE

vrste supstance.Pripremiti triturat ispitivane supstanca sa fino spraenim i osuenim kalijum bromidom R ili kalijum hloridom R.. Ukoliko nije drugaije propisano, udio ispitivane supstance u smjesi treba da bude oko 5 %. Usitnjenu smjesu , smjestiti u ureaj za aplikaciju uzorka i ispitati spektar refleksije.

Spektar supstance u absorpcionom modu se moe dobiti nakon matematike obrade Kubelka-Munk funkcijom.

ZA SNIMANJE PRIMJENOM UREAJA ZA TOTALNU REFLEKSIJU (Attenuated Total Reflection)

Attenuated Total Reflection podrazumjeva zrak koji je viestruko interno reflektovan, preko prenosnog medija. Ipak, postoji nekoliko uraaja sa jednostrukom refleksijom. Pripremiti supstancu kako slijedi. Ispitivanu supstancu dovesti u bliski kontakt sa internim elamentom za refleksiju (IRE) kao to je dijamant, germanijum, cink selenid, talium bromid-tralium jodid (KRS-5) ili drugi materijal sa velikim indeksom refrakcije.Osigurati blizak i ujednaen kontakt supstance sa itavom povrinom kristala ili uz upotrebu pritiska ili rastvaranjem supstance u podesnom otapalu , prekrivanjem IRE sa dobivenom otopinom i uparavanjem otopine do suha. Snimiti ATR spektar.

IDENTIFIKACIJA UZ UPOTREBU REFERENTNIH SUPSTANCI

Pripremiti istim postupkom ispitivanu i referentnu supstancu i snimiti spektre izmeu 4000 cm 1 i 670 cm 1

(2,5 m 15 m ) pod istim radnim karakteristikama instrumenta. Maksimumi absorpcije( minimumi transmitance) u spektru dobijenom sa ispitivanom supstancom odgovaraju po svom poloaju i relativnom intenzitetu onima u spektru dobijenom sa referentnom supstancom (CRS).

Kad se u spektrima dobijenim sa supstancama u vrstom stanju uoe razlike u poloaju maksimuma apsorpcije, pripremiti ispitivanu i referentnu supstancu na isti nain, tako da one kristaliu ili se prevedu u isti oblik ili postupiti prema propisu u monografiji, a potom se snimiti spektre.

IDENTIFIKACIJA UZ UPOTREBU REFERENTNIH SPEKTARA

Provjera mogunosti rezolucije.

Za instrumente sa monohromatorom, snimiti spektar polistirenskog filma debljine oko 35 m.

Razlika x ( vidjeti Sliku 2.2.24.-1) izmeu procenta transmisije apsorpcionog minimuma A na 2870 cm-1 ( 3,48 m ) i procenta transmisije apsorpcionog maksimuma B na 2849.5 cm-1 (3,51 m ) mora biti vea od 18. Razlika y izmeu procenta transmisije apsorpcionog minimuma C na 1589 cm-1 (6,29 m ) i procenta transmisije apsorpcionog maksimuma D na 1583 cm-1 ( 6,32 m ) mora biti da bude vea od 10.

Za FT-IR instrumente, koristiti odgovarajuu rezoluciju uz prikladan apodisation preporuen od proizvoaa.

Rezolucija se provjerava na odgovarajui nain, na primjer snimanjem spektra polistirenskog filma debljine oko 30m. Razlika u absorpciji na absorpcionom minimumu na 2870 cm-1 i absorpcije na absorpcionom maksimimu na 2849.5cm-1 je vea od 0,33. Razlika u absorpciji na absorpcionom minimumu na 1589 cm-1 i absorpcije na absorpcionom maksimimu na1583cm-1 je vea od 0,08.

Potvrivanje skale talasnih brojeva.

Skala talasnih brojeva se moe verifikovati koritenjem polistirenskog filma, koji ima maksimume absorpcije na talasnim brojevima (cm-1 ) datim u dole navedenoj tabeli 2.2.24.-1. Brojevi u zagradama oznaavaju tanost sa kojom su te vrijednosti ustanovljene.

Tabela 2.2.24.-1- Apsorpcioni maksimumi polistirenskog filma.

PRIHVATLJIVA ODSTUPANJA (cm -1)

ABSORPCIONI MAKSIMUM (cm-1)

Instrumenti sa monohromatoromFourier-transform instrumenti

3060,0 1,5 1,0

2849,5 2,0 1,0

1942,9 1,5 1,0

1601,2 1,0 1,0

1583,0 1,0 1,0

1154,5 1,0 1,0

1028,3 1,0 1,0

MetodaIspitivana supstanca se pripremi prema uputstvima datim za referentni spektar/referentnu supstancu. Pri istim radnim karakteristikama instrumenta , koritenim za provjeru rezolucije, snimi se spektar ispitivane supstance.

Poloaji i intenziteti absorpcionih traka na spektru ispitivane supstance trebaju biti usklaeni sa poloajima i intenzitetima absorpcionih traka na spektru referentne supstance.

Kompenzacija absorpcije vodene pare i ugljen dioksida

Za instrumente sa Fourier transformacijom, spektralna interferencija vodene pare i ugljen dioksida kompenzuje se koritenjem odgovarajueg algoritma, prema instrukcijama proizvoaa. Alternativno, spektar se moe snimiti sa instrumentom osloboenim vazduha (vakumiranim ili ispunjenim gasom transparentnim u oblasti IC zraenja) ili osiguravanjem apsolutno identinih uslova prilikom snimanja jednozranih / nekompenzovanih / spektara za uzorak i background.

NEISTOE U GASOVIMA

Za ispitivanje neistoa koristiti kivetu transparentnu za infracrveno zraenje, odgovarajue optike duine puta (npr.1-20 m). Kivetu napuniti prema opisu u odjeljku Gasovi . Za detekciju i odreivanje neistoa postupiti prema propisu u monografiji.

ABSORPCIONA SPEKTROFOTOMETRIJA; ULTRALJUBIASTA I VIDLJIVA

( Ph.Eur.6.0.; 2.2.25. str. 41 )Odreivanje absorbance. Absorbansa (A)otopine je definisana kao dekadni logaritam reciprone vrijednosti transparencije (T) za monohromatsku svjetlost:

A= log10 (1/T) = log10 (I0 / I)

T= I/I0

I0 intenzitet ulazne monohromatske svjetlosti

I -- intenzitet proputene monohromatske svjetlosti

U odsustvu drugih fiziko-hemijskih faktora izmjerena apsorbanca (A) je proporcionalna duini puta (b) koju svjetlost prolazi i koncentraciji supstance u rastvoru ija se apsorbanca mjeri :

A= *c*b

- molarna apsorbanca , ako je b izraeno u centimertima i c u mol/l.

Izraz

EMBED Equation.3 predstavlja specifinu absorbancu otopljene supstance i odnosi se na absorpciju otopine 10 g/l u eliji promjera 1 cm , izmjerenoj na definisanoj talasnoj duini, tako da je:

Ukoliko nije drugaije propisano , izmjeriti absorbancu na propisanoj talasnoj duini uz upotrebu elije 1 cm. Ukoliko nije drugaije propisano , mjerenja se izvode u odnosu na isto otapalo ili smjesu otapala. Absorbancija otapala mjerena u odnosu na zrak , na propisanoj talasnoj duini ne bi trebala da prelazi 0,4 a uputno je da bude manja od 0,2. Nacrtati absorpcioni spektar sa absorbancom ili njenom funkcijom na ordinati , a talasnom duinom ili njenom funkcijom na apscisi.

Kada monografija navodi jednu vrijednost za poziciju absorpcionog maksimuma, podrazumijeva se da izmjerena vrijednost moe odstupati najvie.

Instrument. Spektrofotometar pogodan za mjerenje u ultraljubiastom I vidljivom podruju spectra sastoji se od optikog sistema koji je u mogunosti da proizvede monohromatsku svjetlost u podruju od 200 do 800 i ureaja podesnog za mjerenje absorbance.

Kontrola talasnih duina. Verificirati/potvrditi skalu talasnih duina koristei absorpcione maksimume otopine holmium perhlorata R, linije vodonikove ili deuteriumove lampe ili linije lampe sa ivinim parama prema Tabeli 2.2.25.-1. Dozvoljen je odstupnje 1 nm u UV podruju i 3 nm u vidljivom podruju. Odgovarajui certificirani referentni material takoer se moe koristiti.

Tabela 2.2.25.-1 Apsorpcioni maksimumi za kontrolu talasnih duina

241,15 nm (Ho) 404,66 nm (Hg)

253,7 nm (Hg) 435,83 nm (Hg)

287,15 nm (Ho) 486,0 nm (D)

302,25 nm (Ho) 486,1 nm (H)

313,16 nm (Hg) 536,3 nm (Ho)

334,15 nm (Hg) 546,07 nm (Hg)

361,5 nm (Ho) 576,9 nm (Hg)

365,48 nm (Hg) 579,07 nm (Hg)

Kontrola absorbance. Provjeriti absorbansu uz upotrebu pogodnih filtera ili otopina kalijum dihromata R, na talasnim duinama navedenim u Tabeli 2.2.25.-2 , koja za svaku talasnu duinu daje tanu vrijednost i dozvoljena odstupanja za specifinu absorbancu. Tabela je bazirana na odstupanju absorpcije za 0,01.

Tabela 2.2.25.-2

Talasna duina

(nm) Specifina absorbanca Maksimalna odstupanja

235 124.5 122.9 - 126.2

257 144.5 142.8 - 146.2

313 48.6 47.0 - 50.3

350 107.3 105.6 - 109.0

430 15.9 15.7 - 16.1

Za kontrolu absorbance, pripremiti otopinu kalij dihromata R , prethodno osuenog do konstantne mase na 130C. Za kontrolu absorbance na 235 nm,257 nm,313nm I 350 nm,otopiti 57,0-63,0 mg K2Cr2O7 R u

0,005 M sulfatnoj kiselini i razblaiti do 1000 ml istom kiselinom. Za kontrolu absorbance na 430 nm, otopiti

57,0-63,0 mg K2Cr2O7 u 0,005 M sulfatnoj kiselini i razblaiti do 100 ml istom kiselinom. Pogodan certificirani material se moe koristiti u iste svrhe.

Granice za rasutu svjetlost. Za detekciju rasute svjetlosti mogu se koristiti odgovarajui filteri ili otopine na datoj talasnoj duini: npr. absorbanca otopine 12g/l KCl R u eliji promjera 1 cm raste postepeno izmeu 220 i 200 nm i vea je od 2,0 na 198 nm uz vodu kao kompenzacionu tenost. Moe se koristiti i pogodan certificirani material .

Rezolucija/razdvajanje( za kvalitativnu analizu). Kada je propisano u monografiji, izmjeriti rezolucionu sposobnost aparata na slijedei nain: snimiti spektar 0,02 %V/V otopine toluene R u heksanu R. Minimalna vrijednost odnosa absorbanci na 269 nm/266 nm je navedena u monografiji. Moe se koristiti i pogodan certificirani material .

irina spektralnog proreza ( za kvantitativna odreivanja). Da bi se izbjeglo uvoenje greke promjenom irine spektralnog proteza , kod instrumenata sa mogunou izmjene na odbranoj talasnoj duini, prorez mora biti mali u odnosu na irinu na polovinu irine apsorpcione trake, ali istovremeno treba biti to iri da obezbijedi veliku jainu ulazne svjetlosti I0. Prema tome izbrani slith-width je onaj kod koga daljim smanjenjem ne dolazi do izmjene u oitavanju absorbance.elije/kivete. Dozvoljeno odstupanje promjera za kivete koje se koriste je 0,005 cm. Kada se napune istim otapalom, elije namjenjene za mjerenje absorpcije slijepe otopine i absorpcije otopine uzorka moraju imati istu transparenciju. Ukoliko to nije sluaj mora se primjeniti adekvatna korekcija.

Kivete se moraju paljivo istiti i odraavati.

DERIVACIONA SPEKTROFOTOMETRIJA

Derivaciona spektrofotometrija ukljuuje transformaciju absorpcionog spektra (nultog reda) u prvi, drugi ili vii red derivacionog spectra.

Derivacioni spektar prvog reda (prvi izvod) je dijagram stepena promjene absorbance u odnosu na promjenu talasne duine (dA/d).

Derivacioni spektar drugog reda je krivulja apsorpcionog spektra u odnosu na talasnu duinu (d2A/d2). Derivacioni spektara drugog reda na bilo kojoj zavisi od koncentracije prema slijedeoj jednaini:

EMBED Equation.3

= koncentracije otopine apsorbujue supstance u g / l.

Instrument. Koristiti spektriofotmetar koji odgovara naprijed navedenim zahtjevima i opremljen je analognim otpor-kapacitet diferencijalnim modulom ili digitalnim diferencijatorom ili drugim sredstvima za dobivanje derivacionog spectra. Neke metode za dobivanje derivacionog spectra drugog reda rezultiraju pomakom talasnih duina u odnosu na spektar nultog reda to treba uzeti u obzir.

Test provjere rezolucije/razdvajanja. Kada je propisano u monografiji, snimi derivacioni spektar drugog reda 0,02 % V/V otopine toluena R u metanolu R, koristei methanol R kao kompenzacionu otopinu. Spektar pokazuje mali negativni pik smjeten izmeu dva velika negativna pika na 261 nm i 268 nm, kao to je vidljivo na slici 2.2.25.-1. Ako nije drugaije propisano u monografiji , odnos A/B nije manji od 0,2.

Procedura. Pripremiti otopinu ispitivane supstance , podesiti postavku instrumenta/radne karakteristike prema uputstvu proizvoaa i izraunati koliinu ispitivane supstance na nain propisan u monografiji.

Slika 2.2.25.-1

HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU

(Ph. Eur. 6.0; 2.2.27; str. 43)

TLC je separaciona tehnika gdje stacionarnu fazu predstavlja odgovarajui materijal naneen u ujednaenom sloju na nosa od stakla, plastike ili aluminija. Otopine analiziranih supstanci nanose se na plou prije razvijanja. Separacija je bazirana na adsorpciji, raspodjeli, jonskoj izmjeni ili kombinaciji mehanizama, a omoguena je migracijom (razvijanjem) otopina (analizirane otopine) u otapalu ili smjesi otapala (mobilna faza) preko tankog sloja (stacionarna faza).

APARATURAPloe: Hromatografija se provodi na gotovim ploama sa komercijalno pripremljenim i naneenim tankim slojem stacionarne faze , kao to je opisano u Ph.Eur. (4.1.1)Reagensi .

Priprema ploa prije upotrebe. Moe biti potrebno da se ploe prije upotrebe operu, a se moe postii razvijanjem ploe sa pogodnim otapalom. Ploe mogu biti impregnirane prije upotrebe procedurama kao to je razvijanje, uranjanje ili prskanje. Ako je potrebno, ploe se u vrijeme upotrebe aktiviraju zagrijavanjem u penici, na temperaturi od 120 C, u trajanju 20 minuta.

Hromatografske kade za razvijanje: predstavljaju posude ravnog dna ( jednostruke ili dvostruke) od inertnog, transparentnog materijala, prikladne veliine za ploe koje se koriste, sa odgovarajuim poklopcem za dobro zatvaranje. Kade za horizontalno razvijanje snabdjevene su sa lijebom za mobilnu fazu i dodatnom opremom za usmjeravanje mobilne faze na stacionarnu fazu.Mikropipete, mikroprice, kalibrisane kapilare

Predstavljaju odgovarajue pomono sredstvo za pravilno nanoenje analiziranih otopina.Ureaj za detekciju fluorescencije Mjeri direktnu fluorescenciju ili njenu inhibiciju.Ureaji i reagensi za vizuelizaciju Pogodni ureaji koriste se za derivatizaciju i prenos na plou reagensa prskanjem, uranjanjem ili izlaganjem parama i gdje je potrebno omoguavaju vizuelizaciju grijanjem razdvojenih komponenti. Dokumentacija Moe se koristiti ureaj za dokumentovanje vizueliziranih hromatograma kao npr. ureaj za digitalizaciju slike..METODE

Nanoenje uzoraka Nanijeti propisanu koliinu otopine, na liniji parelelnoj sa donjim rubom ploe, a koja se nalazi na propisanoj udaljenosti od donjeg ruba i obe strane ploe. Meusobno rastojanje centara uzastopnih takastih mrlja treba biti najmanje 10 mm (5 mm na HP ploama), odnosno 5 mm (2 mm HP ploe) izmeu ivica trakastih mrlja. Aplicirati otopine u porcijama koje daju takaste mrlje radijusa 2-5 mm (1-2 mmHP ploe) ili trake duine 10-20 mm (5-10 mm HP ploe), a irine 1-2 mm.

U monografijama koje dozvoljavaju primjenu normalnih/standardnih i visoko efikasnih TLC ploa, radni uslovi za HPTLC ploe navedeni su u zagradi [ ], nakon uslova za normalne ploe.Vertikalno razvijanje Zidove kade za razvijanje treba obloiti filter papirom. U kadu se sipa koliina mobilne faze dovoljna da, nakon impregnacije filter papira, obezbjedi potrebnu dubinu uranjanja prema dimenzijama ploe koja e se koristiti. Ukoliko nije drugaije naznaeno zasiivanje (kada sa poklopcem koji dobro dihtuje) se provodi na temperaturi od 20 25C u trajanju od jedan sat.. Ukoliko nije drugaije naznaeno u monografiji hromatografiranje se provodi u kadi zasienoj parama mobilne faze.Nanese se propisani volumen analiziranih otopina na prethodno opisan nain. Kada se osue mrlje nanesene na startnu liniju plou smjestiti u kadu u vertikalnom poloaju, a da startna linija bude iznad nivoa mobilne faze. Poklopcem dobro zatvoriti kadu i ostaviti na 20-25C, zatienu od svjetlosti Plou izvaditi iz kade kada mobilna faza pree propisano rastojanje, mjereno izmeu centra aplicirane mrlje i fronta otapala. Osuiti plou i izvriti vizuelizaciju mrlja na propisani nain. Izvaditi plou kada mobilna faza pree propisanu udaljenost

Kod dvodimenzionalne hromatografije plou osuenu nakon prvog razvijanja uranjamo u mobilnu fazu okomito u odnosu na prvi put razvijanja..Horizontalno razvijanje Nanijeti propisani volumen otopine na gore opisan nain. Kada se osue nanesene mrlje, pipetom ili pricom unijeti dovoljnu koliinu mobilne faze u lijeb komore, smjestiti plou u komoru nakon provjere da se ista nalazi u horizontalnom poloaju, te povezati sa usmjerivaem protoka mobilne faze prema uputi proizvoaa opreme. Ukoliko je propisano razviti plou startujui istovremeno sa oba kraja. Zatvoriti i ostaviti na 20-25C. Kada mobilna faza pree propisanu distancu ploa se izvadi iz kade. Osuiti plou i izvriti vizuelizaciju mrlja na propisani nain.Kod dvodimenzionalne hromatografije plou osuenu nakon prvog razvijanja uranjamo u mobilnu fazu okomito u odnosu na prvi put razvijanja.

VIZUELNA PROCJENA

Identifikacija. Glavna mrlja na hromatogramu test otopine vizuelno se uporeuje sa odgovarajuom mrljom na hromatogramu referentne otopine . Uporeivanje mrlja vri se po boji, veliini i Rf vrijednostiRf vrijednost je definisana kao odnos puta ispitivane supstance, od starta do sredine mrlje i puta mobilne faze,

od starta do fronta.

Verifikacija separacione moi propisane za identifikaciju

Izvoenje prema zahtjevima za pogodnost opisanim u Ph.Eur. 4.1.1 Reagensi je dovoljno u normalnim uslovima. Samo u posebnim sluajevima propisuju se dodatni kriteriji u pojedinanim monografijama. Test za srodne supstance .Sekundarna mrlja na hromatogramu test otopine vizuelno se uporeuje sa odgovarajuom mrljom na hromatogramu referentne otopine koja sadri oneienja ili sa mrljom na hromatogramu referentne otopine pripremljene razblaivanjem test otopineVerifikacija separacione moi propisane za ovaj test je opisana u odgovarajuoj monografiji.

Verifikacija moi detekcije.Mo detekcije je zadovoljavajua ako su taka ili crta jasno vidljive na hromatogramu referentne otopine sa najveim razblaenjem.KVANTITATIVNO MJERENJEZahtjevi za rezoluciju i separaciju su propisani u monografiji. Supstance razdvojene tankoslojnom hromatografijom, a absorbuju UV-Vis zraenje mogu se odrediti direktno sa ploe koritenjem odgovarajueg instrumenta (denzitometar). Dok se u instrumentu pomjera ploa ili mjerni dio instrumenta mjeri se refleksija upadnog svjetla. Slino, fluorescencija moe biti mjerena koritenjem odgovarajueg optikog sistema. Supstance koje sadre radionuklide mogu biti kvantifikovane na 3 naina: direktno pomjeranjem ploe du podesnog brojaa ( vidjeti Radiofarmaceutski preparati (0125), rezanjem ploa u trake te mjerenjem radioaktivnosti pojedinih traka sa podesnim brojaem ili struganjem stacionarne faze, otapanjem u podesnom koktelu za scintilaciju i mjerenjem radioaktivnosti sa tenim scintilacionim brojaem.Aparat za direktno mjerenje (skeniranje) TLC ploa sastoji se od :

dio za tano pozicioniranje i reproducibilno nanoenje uzorka na plou, dio za pomicanje ploe ili mjerni ureaj uzdu x ili y ose, ureaj za biljeenje i podesan integrator ili kompjuter ,, za supstance koje apsorbuju u UV/Vis podruju fotometar sa izvorom svjetlosti, optiki ureaj koji moe da generira monohromatsku svjetlost i fotoelija adekvatne osjetljivosti se koriste za mjerenje refleksije ili transmisije; ukoliko se mjeri fluorescencija, potreban je podesan filter koji e sprijeiti ekscitacionoj svjetlosti a omoguiti emitovanoj svjetlosti prolaz do detektora za supstance koje sadre nukleotide potreban je podesan broja radioaktivnosti. Linerno podruje rada brojaa mora biti verifikovano.

Metoda. Pripremiti otopinu ispitivane supstance (test otopina) prema propisu u monografiji i, ako je potrebno, pripremiti referentnu otopinu supstance koja se odreuje uz upotrebu istog otapala . Nanijeti jednake volumene svake od navedenih otopina na ploi i razviti.

Supstance koje apsorbuju UV-Vis zraenje. Pripremiti i nanijeti ne manje od 3 referentne otopine supstance koja se odreuje, a ija koncentracija obuhvata oekivanu vrijednost koncentracije test otopine ( oko 80 %, 100% i 120%).Tretirati propisanim reagensom, ukoliko je potrebno, i izmjereiti refleksiju, transmisiju ili fluorescenciju na hromatogramima test i referentne otopine.izmjerene vrijednosti koristiti za izraunavanje koliine supstance u test otopini.

Supstance koje sadre radionuklide. Pripremiti i nanijeti test otopinu koja sadri oko 100% oekivane vrijednosti. Odrediti radioaktivnost u funkciji duine puta i prijaviti radioaktivnost svakog rezultirajueg pika kao procenat ukupne vrijednosti radioaktivnosti.

Primjedba:Kriteriji za procjenu pogodnosti sistema opisani su u poglavlju Ph.Eur. 2.2.46 Tehnike hromatografskog razdvajanja. Stepen do kojeg je mogue izmijeniti pojedine parametre hromatografskog sistema da bi ispunili zahtjeve za pogodnost sistema dati su takoe u navedenom poglavlju.GASNA HROMATOGRAFIJA

(Ph. Eur. 6.0. ;2.2.28.str. 45)Gasna hromatografija je hromatografska separaciona tehnika bazirana na razliitoj raspodjeli ispitivanih supstanci izmeu dvije faze koje se meusobno ne mijeaju , u kojoj mobilnu fazu predstavlja gas nosa , koji prolazi kroz ili preko stacionarne faze smjetene u koloni.

Tehnika je primjenjiva na supstance ili njihove derivate koji su isparljivi na primijenjenoj temperaturi injektora.

GC je bazirana na mehanizmu adsorpcije, raspodjeli mase ili razliitoj veliini molekula.

APARATURA

Aparatura se sastoji od injektora, hromatografske kolone smjetene u penici, detektora i sistema za biljeenje podataka (integratora ili pisaa ). Gas nosa putuje kroz kolonu pod kontrolisanim uslovima pritiska i protoka, a zatim putuje kroz detektor.

Hromatografija se provodi ili na konstantnoj temperaturi ili u skladu sa zadatim temperaturnim programom.

INJEKTORI

Direktno injiciranje otopina je uobiajen nain iniciranja ako nije drugaije navedeno u monografiji. Injicranje moe biti izvedeno ili direktno na poetak kolone koristei se pricom ili injekcionim ventilom, ili u isparavajuu komoru sa opremom za raspodjelu toka.

Injiciranje isparljive faze moe biti izvedeno sa statikim ili dinamikim head-space injekcionim sistemom.

Dinamiki head-space (oslobodi i uhvati) injekcioni sistem posjeduje ureaj kojim se isparljiva supstanca u otopini prenese na adsorpcionu kolonu koja se termostatira na niskoj temperaturi.Zadrana supstanca se zatim otputa/desorbuje u mobilnu fazu postupkom brzog zagrijavanja adsorpcione kolone.

Statiki head-space injekcioni sistem podrazumjeva termostatom kontroliranu komoru za zagrijavanje uzoraka u koju se smjetaju zatvorena viale sa uzorkom u tenom ili vrstom stanju na tano odreen vremenski period koji dozvoljava isparljivoj komponenti u uzorku da postigne izjednaenje gasne i negasne faze. Nakon toga propisana koliinahead space viale unese se u gasni hromatograf.

STACIONARNE FAZE

Stacionarnom fazom se ispunjavaju kolone koje mogu biti:

Kapilarne kolone od kvarcnog stakla ije je unutranji zid obloen filmom stacionarne faze ,

Punjena kolona napunjena inertnim esticama impregniranim stacionarnom fazom ,

Punjena kolona napunjena vrstom stacionarnom fazom.

Kapilarne kolone su internog dijametra od 0.1mm do 0.53 mm i duine od 5 m do 60 m. Tenost ili stacionarna faza, koja moe biti hemijski vezana na unutranju povrinu, je film debljine od 0.1m do 5m.

Punjene kolone , napravljene od stakla ili metala, obino su duge od 1m do 3m sa unutranjim promjerom od 2 mm do 4 mm. Stacionarna faza je obino porozni polimer ili vrsti nosa impregriran sa tenom fazom.

Nosai za analize polarnih komponenti na kolonama punjenim stacionarnom fazom niskog kapaciteta i niske polarnosti moraju biti inertni da bi se izbjeglo razvlaenje pika. Reaktivnost nosaa se moe smanjiti siliniziranjem prije nanoenja tene faze. Takoe esto se koristi i diatomejska zemlja koja je oprana u kiselinama i kalcificirana. Na raspolaganju su materijali sa razliitim veliinama estica, a najee upotrebljavane veliine estica su u podruju od 150 m do 180 m i od 125 m do 150 m.

MOBILNE FAZE

Retenciono vrijeme i odgovor pika zavisi od protoka gasa nosaa; retenciono vrijeme je upravo proporcionalno duini kolone a razdvajanje je proporcionalno kvadratnom korjenu duine kolone. Za punjene kolone protok gasa nosaa je obino izraen u milimetrima po minuti pri atmosferskom pritisku i sobnoj temperaturi. Protok se mjeri na izlazu iz detektora ili sa kalibrisanim ureajem ili biretom sa baloniima sapunice na radnoj temperaturi kolone. Linearna brzina gasa nosaa kroz punjenu kolonu obrnuto je proporcionalna kvadratnom korjenu internog dijametra kolone za zadati volumen protoka. Protoci od 60ml / min u koloni sa internim dijametrom od 4 mm i 15 ml / min u koloni sa internim dijametrom 2 mm, daju jednake linearne brzine a shodno tome i slina retenciona vremena.

Helijum ili azot se obino koriste kao gas nosa za pakovane kolone, dok se za kapilarne kolone obino koristi azot, helijum ili vodonik.

DETEKTORI

Plameno jonizacijski detektor se najee koristi dok se mogu koristiti i drugi detektori kao to su elektron privlaei detektori , azot-fosforni detektor , maseni spektrometar i detektor termalne provodljivosti , infracrveni spektrofotometar sa Furier -ovom transformacijom i drugi detektori zavisno od analize.

METODA

Stabilizirati kolonu, injektor i detektor na temperaturama i protocima gasa nosaa zadatim u monografiji dok se ne postigne ujednaena bazna linija. Pripremiti, prema propisu, otopinu ispitivanog uzorka i referentne otopine. Otopine ne smiju sadravati vrste estice. Kriteriji za procjenu pogodnosti sistema su opisani u poglavlju Hromatografske separacione tehnike ( 2.2.46 ). Stepen do kojeg podeavanje/izmjena pojedinih parametara hromatografskog sisrtema moe biti provedeno, da bi se ispunili krikeriji za pogodnost sistema, takoe je dat u istom poglavlju.

GASNI HROMATOGRAF SA STATIKIM HEAD-SPACE

Gasni hromatograf sa statikim head-space je tehnika naroito pogodna za razdvajanje i odreivanje isparljivih komponenti prisutnih u vrstom ili tenom uzorku. Metoda je bazirana na ispitivanju gasne faze koja je u ekvilibrijumu sa tenom ili vrstom fazom.

APARAT

Aparat se sastoji od gasnog hromatografa koji je opremljen ureajem za uvoenje uzorka povezanim na modul sa automatskom kontrolom pritiska i temperature. Ukoliko je potrebno ureaj za uklanjanje otapala moe biti dodan.

Ispitivani uzorak se smjeta u spremnik sa odgovarajuim zatvaraem i sistemom ventila koji omoguavaju prolaz gasa nosaa. Spremnik se nalazi u termostatom kontroliranoj komori , na temperaturi podeenoj u zavisnosti od ispitivane supstance.

Supstanca se dri na toj temperaturi dovoljno dugo da se postigne ekvilibrijum izmeu gasne i tene ili vrste faze.

Gas nosa putuje kroz spremnik i nakon odgovarajueg vremenskog perioda otvaranjem podesnog ventila usmjeri se gas nosa prema hromatografskoj koloni i time uzorak u gasnom stanju unese u nju.

Umjesto hromatografa posebno opremljenog za navedeno uvoenje uzorka mogue je koristiti airtight pricu i konvencionalni hromatograf. Ekvilibrijum izmeu faza tada se postie u odvojenoj komori, a gasna faza se prenosi na kolonu, uz mjere predostronosti kojima se izbjegava promjena uspostavljenog ekvilibrijuma.

METODA

Odrediti odgovarajue postavke instrumenta za dobivanje adekvatnog odgovora uz upotrebu refrentnih preperata.

DIREKTNA KALIBRACIJA

U odvojene identine spremnike unijeti ispitivane i svaku pojedinanu referentnu otopinu, kako je propisano u monografiji, izbjegavajui kontakt izmeu ureaja za uzorkovanje i uzoraka. Hermetiki zatvoriti i smjestiti u termostatom kontroliranu komoru, na monografijom propisanu temperaturu i pritisak. Nakon postizanja ekvilibrijuma provesti hromatografiranje pod propisanim uslovima.

STANDARDNO DODAVANJE

U set identinih spremnika dodati jednake volumene preparata za ispitivanje. U sve osim jednog dodati podesne koliine referentnog pripravka poznate koncentracije odreivanih supstanci tako da se dobije serija preparata sa ravnomjernim porastom koncentracije supstance.

Hermetiki zatvoriti spremnike i smjestiti ih u termostatiranu komoru sa temperaturom i pritiskom podeenim prema propisu u monografiji. Nakon postizanja ekvilibrijuma provesti hromatografiranje pod propisanim uslovima.

Izraunati jednainu linearnosti grafikom metodom najmanjih kvadrata , te iz tih podataka dobiti koncentraciju supstance u ispitivanom preparatu.

Alternativno , nacrtati dijagram srednjih vrijednosti oitavanja u odnosu na dodate koliine ispitivane supstance. Povui liniju kroz take do presjeka sa koncentracionom osom. Udaljenost izmeu ove take i intersekcije osa (koordinatnog poetka ) predstavlja koncentraciju odreivane supstance u odreivanom preparatu.

VIESTRUKA HEAD-SPACE EKSTRAKCIJA (UZASTOPNO UZIMANJE )

Ukoliko je propisana ova metoda je u potpunosti opisana u monografiji.

Primjedba:Kriteriji za procjenu pogodnosti sistema opisani su u poglavlju Ph.Eur. 2.2.46 Tehnike hromatografskog razdvajanja. Stepen do kojeg je mogue izmijeniti pojedine parametre hromatografskog sistema da bi ispunili zahtjeve za pogodnost sistema dati su takoe u navedenom poglavlju.

PROVODLJIVOST

(Ph. Eur. 6.0, ; 2.2.38., str. 59)Struja I (u amperima) koja protie kroz sprovodnik je direktno proporcionalna primjenjenoj elektromotornoj sili (u voltima) i obrnuto proporcionalna otporu R (u omima) sprovodnika:

Provodljivost (raniji naziv specifina provodnost) otopine (), je po definiciji reciprona vrijednost otpornosti (). Otpornost se definie kao koeficijent elektrinog polja i gustine struje. Otpornost R (u omima) sprovodnika je data izrazom:

prema tome: ili

gdje je S= popreni presjek sprovodnika (cm2), a L duina izraena u cm; L/S odgovara idealnoj konstanti.

Jedinica za provodljivost u IS sistemu je simens po metru (Sm-1). U praksi se elektrina provodljivost otopine izraava u simensima/ cm (Scm-1) ili u mikrosimensima po centimetru (Scm-1). Jedinica za otpornost u IS sistemu je om metar (m). Otpornost otopine se openito izraava u om-centimetrima (cm ). Ukoliko nije drugaije propisano , referentna temperatura za izraavanje provodljivosti ili otpornosti je 250C.

Aparat i operativna procedura koji su opisani dalje u tekstu su primjenjive za laboratorijska mjerenja provodljivosti vee od 10 Scm-1. Mjerenje provodljivosti vode je opisano u posebnoj monografiji.

APARAT

Aparat koji se koristi mjeri otpor kolone tenosti izmeu elektroda uronjene sprave za mjerenje (sprovodna elija). Aparat je snadbjeven sa alternativnom strujom, kako bi se izbjegao efekat polarizacije elektroda. Aparat je opremljen sa temperaturnom sondom i temperaturnom spravom za kompenziranje.

Provodna elija sadri dvije paralelne platinske electrode obloene sa crnom platinum, svaka sa povrinom S, i odvojena od druge na udaljenosti L. Obje su zatiene sa staklenom cijevi. Takoe mogu se koristiti i druge vrste elija.

OPERATIVNA PROCEDURA

Odreivanje konstante elijeIzabere se provodna elija koja je odgovarajuih osobina i ispita se provodnost otopine. to se oekuje vea provodljivost, mora se odabrati vea konstanta elije (niska ). Najee upotrebljavane protone

elije imaju konstante reda veliine 0,1 cm-1, 1 cm-1 i 10 cm-1. Koristi se certificiran referentni materijal, npr. otopina kalij hlorida, koja je odgovarajua za mjerenje. Vrijednost provodljivosti certificiranog referentnog materijala treba biti blizu oekivane vrijednosti provodljivosti otopine koja se ispituje. Ostali (drugi) referentni materijali se mogu koristiti posebno za elije sa konstantom od 0,1 cm-1. elija se ispere nekoliko puta sa destiliranom vodom R i najmanje dva puta sa certificiranim referentnim materijalom koji se koristi za odreivanje konstante provodne elije. Mjeri se otpornost provodne elije koristei certificirani referentni materijal na 250C10C. Konstanta elije Kcell (u cm-1) zavisi od geometrije sprovodne elije i data je izrazom:

RCRM= mjerena otpornost, izraena u mega omima

KCRM= provodljivost otopine certificiranog referentnog materijala , izraena u mikrosimensima/ centimetru

Izmjerena vrijednost konstante Kcell provodne elije ne smije odstupati vie od 5 % od naznaene vrijednosti.

Ukoliko se odreivanje konstante elije obavlja na temperaturi drugaijoj od naznaene za certificirani referentni materijal, vrijednost provodljivosti se moe izraunati iz sljedeeg izraza:

kT=vrijednost provodljivosti na razliitoj temperaturi

kTCRM= vrijednost provodljivosti certificiranog referentnog materijala

T=temperatura kalibracije

TCRM= temperatura naznaena za certificirani referentni materijal

= temperaturni koeficijent za provodljivost certificiranog referentnog materijala, za kalij hlorid =0,021

Odreivanje provodljivosti otopine koja se ispitujeNakon kalibracije aparata sa otopinom certificiranog referentnog materijala , provodna elija se ispere nekoliko puta sa destiliranom vodom R i najmanje dva puta sa vodenom otopinom koja se ispituje. Nakon toga se provode uzastopna mjerenja kao to je opisano u monografiji. MASENA SPEKTROMETRIJA

(Ph. Eur. 6.0. ;2.2.43. str. 68)Masena spektrometrija (spektrometrija masa) se zasniva na direktnom mjerenju odnosa mase i pozitivnih ili negativnih naboja jona (m/z) analizirane supstance u gasnoj fazi. Taj odnos je izraen u jedinicama atomske mase (atomic mass units - 1 a.m.u.= jedna dvanaestina mase atoma C12) ili u daltonima (1 Da = masa hidrogenovog atoma).

Joni, proizvedeni u jonizacionoj komori aparata, se ubrzavaju i zatim razdvajaju u analizatoru prije dolaska na detektor. Sva ova deavanja se odvijaju u komori u kojoj sistem pumpi odrava vakum od 10-3 do 10-6 Pa.

Dobiveni spektar pokazuje relativni udio razliitih grupa jona u funkciji m/z. Signal koji odgovara jednom jonu bit e predstavljen sa nekoliko pikova koji odgovaraju statistikoj distribuciji razliitih izotopa tog jona. Taj grafiki prikaz (pattern) se naziva izotopski profil (isotopic profile) i (bar za male molekule) pik koji odgovara najzastupljenijem izotopu za svaki atoma naziva se monoizotopski pik.

Informacija dobivena masenom spektrometrijom je u biti kvalitativna (odreivanje molekulske mase, informacija o strukturi na osnovu dobivenih fragmenata) ili kvantitativna (koristei interne ili eksterne standarde) sa limitima detekcije u rasponu od pikomola do femtomola.

UVOENJE UZORKA

Prvi korak u analizi je unoenje uzorka u aparat bez naruavanja vakuma. U uobiajenoj metodi direktnog unoenja uzorka, nazvanoj direct liquid introduciton, uzorak je smjeten na kraju cilindrinog tapia (u kvarcnoj kiveti, na vlaknu ili metalnoj povrini). tapi se uvodi u spektrofotometar nakon prolaska kroz vakum bravu (vacum lock) gdje se odrava nii vakum, izmeu atmosferskog pritiska i visokog vakuma unutar aparata.

Drugi sistemi za unoenje uzoraka omoguavaju da se analiziraju smjese komponenti poto se prethodno izvri njihovo razdvajanje na odgovarajuem aparatu povezanom na maseni spektrometar.

Gasna hromatografija/ masena spektrometrija..Upotrebom odgovarajuih kolona (kapilarnih i semikapilarnih) mogue je kraj kolone direktno uvesti u jonski izvor bez upotrebe separatora.

Tena hromatografija/ masena spektrometrija. Ova kombinacija je posebno korisna za analizu polarnih supstanci koje su nedovoljno isparljive ili termolabilne da bi se mogle analizirati gasnom hromatografijom povezanom sa masenom spektrometrijom. Potekoa kod ove metode je dobivanje jona u gasnoj fazi iz tene faze, pa ova tehnika zahtijeva posebne konektore (interfaces) kao to su: direct liquid introduction: mobilna faza je rasprena, i rastvara isparava ispred jonskog izvora aparata, particle-beam interface: mobilna faza koja moe imati protok do 0,6 ml/min se raspri u komori, tako da jedino analit u neutralnoj formi dosegne do jonskog izvora aparata; ova tehnika se koristi za komponente relativno niske polarnosti manjojm od 1000 Da. moving-belt interface: mobilna faza koja moe imati brzinu protoka do 1 ml/min se primjenjuje na povrinu pokretnog remena; nakon to rastvara ispari, komponente koje se analiziraju se sukcesivno prenose do jonskog izvora aparata gdje su ionizirani; ova tehnika je veoma slabo primjenjiva na veoma polarne ili supstance osjetljive na temperaturu.

Drugi naini spajanja (electrospray, thermospray, atmospheric-pressure chemical ionisation) se smatraju posebnim jonizacionim tehnikama, pa su i pomenuti u dijelu o nainima jonizacije.

Superkritina tena hromatografija/ masena spektrometrija. Mobilna faza, koja se obino sastoji od superkritinog karbondioksida, prelazi u gasno stanje nakon prolaska kroz grijani restriktor izmeu kolone i jonskog izvora.

Kapilarna elektroforeza/ masena spektrometrija. Eluent se uvodi u jonski izvor, ponekad nakon dodatka drugog solventa kako bi se mogao odrati protok od nekoliko mikrolitara u minuti. Ova tehnika je ograniena malim koliinama uzorka i potrebom koritenja isparljivih pufera.

JONIZACIONE TEHNIKE

Elektron impakt (Electron impact). Uzorak, u gasnom stanju, je joniziran snopom elektrona ija energija (obino 70 eV) je vea od jonizacione energije uzorka. Pored molekularnog jona M+, dobijaju se fragmenti koji su karakteristini za molekulsku strukturu. Ova tehnika je ograniena potrebom da se uzorak prevede u gasovito stanje. To je ini neadekvatnom za primjenu na polarnim, termolabilnim i supstancama sa visokom molekulskom masom. Electron impact tehnika je podesna za spajanje sa gasnom hromatografijom i ponekad sa tenom hromatografijom.

Hemijska jonizacija (Chemical ionisation). Ovaj tip jonizacije ukljuuje gas reagent kao to je metan, amonijak, nitrogen oksid, nitrogen dioksid ili kisik. Dobiveni spektar karakteriu joni tipa (M + H)+ ili (M - H)-, ili joni nastali spajanjim analita i reagentnog gasa. Dobiva se manje fragmenata nego kod jonizacije udarom elektrona. Varijanta ove tehnike se koristi kada je ispitivana supstanca termolabilna: uzorak, apliciran na filament, se vrlo brzo ispari Joule-Thomson-ovim efektom (desorption chemical ionisation).

Jonizacija bombardovanjem brzim atomima [Fast-atom bombardment (FAB) or fast-ion bombardment ionisation (liquid secondary-ion mass spectrometry LSIMS)]. Uzorak, otopljen u viskoznom matriksu kao to je glicerol, je apliciran na metalnu povrinu i joniziran snopom neutralnih atoma kao to su argon ili ksenon, ili cezijumovim jonima sa velikom kinetikom energijom. Iz matriksa nastaju joni tipa (M + H)+ ili (M H)- ili tzv. aduct joni. Ovaj tip jonizacije je pogodan za polarne i termolabilne supstance i omoguava dobivanje jona sa molekularnim masama i do 10 000 Da. Tehnika se moe primjenjivati kod tene hromatografije dodavanjem 1-2% glicerola u mobilnu fazu, meutim protok mora biti vrlo nizak (nekoliko mikrolitara u minuti). Ova tehnika jonizacije takoe omoguava analizu ploa za tankoslojnu hromatografiju dodatkom tankog sloja matriksa na povrinu ploa.

Jonizacija u elektrinom polju sa desorpcijom i jonizacija u elektrinom polju bez desorpcije (Field desorption and field ionisation). Uzorak se isparava u blizini tungstenovog filamenta pokrivenog mikro-iglama (microneedles) (field ionisation) ili se nanosi na taj filament (field desorption). Napon od oko 10 kV, primjenjen izmeu filamenta i elektrode, jonizira uzorak. Ove dvije tehnike uglavnom proizvode molekulske jone M+ i (M + H)+ jone i koriste se za slabo polarne i/ili termolabilne supstance.

Matrix-assisted laser desorption ionisation (MALDI). Uzorak, u pogodnom matriksu i postavljen na metalnu podlogu, se jonizira pulsnom laserskom zrakom ija talasna duina moe varirati od UV do IR (impulsi traju od pikosekunde do nekoliko nanosekundi). Ovaj nain jonizacije je esencijalan za analizu supstanci sa vrlo visokom molekulskom masom (preko 100 000 Da) ali je ogranien na time-of-flight analizatore (MALDI TOF).

Elekrtosprej (Electrospray). Ovaj nain jonizacije se provodi na atmosferskom pritisku. Uzorak, u otopini, se uvodi u jonski izvor kroz kapilarnu cijevicu, na ijem je napon od 5 kV. Gas se moe koristiti da pobolja nebulizaciju. Desolvatacija nastalih mikrokapljica proizvodi jone sa jednim ili vie naboja u gasnoj fazi. Protok moe varirati od nekoliko mikrolitara do 1 ml/min. Ova tehnika je pogodna za analizu polarnih supstanci kao i ispitivanje biomolekula sa molekularnim masama do 100 000 Da. Moe biti spojena sa tenom hromatografijom ili kapilarnom elektroforezom.

Hemijska jonizacija pod atmosferskim pritiskom (Atmospheric-pressure chemical ionisation - APCI). Jonizacija se deava na atmosferskom pritisku pod djelovanjem elektrode sa naponom od nekoliko kilovolti, a koja je smjetena na putu mobilne faze. Mobilna faza se nebulizira i termalnim efektom i djelovanjem struje nitrogena. Nastali joni nose jedan naboj i tipa su (M + H)+ u pozitivnom modu a (M H)- tipa u negativnom modu. Upotrebom ovog tipa jonizacije, mogue je koritenje visokih protoka (i do 2 ml/min), to je ini idealnom za spajanje sa tenom hromatografijom.

Termosprej (Thermospray). Uzorak je otopljen u mobilnoj fazi koja se sastoji od vode i polarnih organskih otapala te isperljivog elektrolita (obino amonium acetat). On se uvodi u jonski izvor u nebuliziranom obliku, nakon prolaska kroz metalnu kapilarnu cijevicu na kontrolisanoj temperaturi. Prihvatljivi protoci su reda 1 ml/min do 2 ml/min. Joni elektrolita joniziraju analiziranu supstancu. Ovaj proces jonizacije moe biti zamijenjen ili pojaan elektrinim pranjenjem od oko 800 volti, posebno kada su solventi potpuno organski. Ova tehnika je podesna za spajanje tene hromatografije sa masenim spektrometrom.

ANALIZATORIRazlike u osobinama analizatora ovise uglavnom od dva parametra:

rasponu u kojem m/z odnosi mogu biti mjereni, tj. mass range moi razdvajanja (resolving power) koja je karakterizirana sposobnou da se razdvoje dva jona jednakog intenziteta iji se m/z odnosi razlikuju za M, i ije preklapanje je izraeno dati procenat definisane vrijednosti (valley definition); na primjer, mo razdvajanja (M/M) od 1000 sa 10 % valley definitions omoguava razdvajanje m/z odnosa 1000 od 1001 sa razdvajanjem pikova na 10% visine od bazne linije. Meutim, mo razdvajanja, u nekim sluajevima (time-of-flight analysers, quadrupoles, ion-trap analysers), se definie kao odnos molekulske mase i irine pika na polovini visine (50% valley definition).Magnetni i elektrostatski analizatori. Joni proizvedeni u jonskom izvoru se ubrzavaju naponom voltae V, i fokusiraju ka magnetskom analizatoru (magnetsko polje B) ili elektrostatskom analizatoru (elektrostatsko polje E), ovisno o konfiguracije instrumenta. Oni slijede putanju sa radijusom r prema Laplace-ovom zakonu:

m / z = B2 r2/ 2 V

Dva tipa skenova mogu biti koritena za skupljanje i mjerenje jona nastalih u jonskom izvoru: mijenjanjem B a dranjem V nepromijenjenim ili mijenjanjem V a dranjem B nepromijenjenim. Iza magnetskog analizatora obino slijedi elektrini sektor koji slui kao filter na osnovu kinetike energije i omoguava znaajno poveanje razdvajajue moi instrumenta. Maksimalna mo razdvajanja kod ovakvih instrumenata se kree od 10000 do 150 000 i u veini sluajeva omoguava tano izraunavanje m/z odnosa za odreivanje elementarnog sastava odgovarajuih jona. Za jone sa jednim nabojem, raspon masa (mass range) iznosi 2000 do 15 000 Da. Neki se joni mogu raspadati spontano (metastabilne tranzicije) ili u sudaru sa gasom (kolizijom-aktivirane disocijacije CAD)u prostorima bez uticaja polja izmeu jonskog izvora i detektora. Prouavanje ovih razlaganja je veoma korisno za odreivanje strukture kao i za karakterizaciju specifine supstance u smjesi i ukljuuje tandem masenu spektrometriju. Postoji mnogo takvih tehnika , u zavisnosti gdje se razlaganje deava:

daughter-ion mode: -odreivanje jona nastalih raspadom jona prekursora:

B/E const., MIKES (Mass-analysed Ion Kinetic Energy Spectrscopy)

parent-ion mode: -odreivanje svih jona koji raspadom daju jon odreene m/z vrijednosti: B2/E = const.

neutral-loss mode: -detekcija svih jona koji gube isti fragment:

B/E(1-E/E0)1/2= const., gdje je E0 osnovni napon u elektrinom sektoru.

Kvadrupolni analizatori (Quadrupoles). Analizator se sastoji od 4 paralelne metalne cijevi, koje su cilindrine ili hiperboline u presijeku. One su postavljene simetrino i paralelno u odnosu na putanju jona; elektrino su povezane dvije suprotne cijevi. Naponi dva para cijevi su suprotni. Oni su rezultat promijenjive i konstantne komponente (napona). Joni proizvedeni u jonskom izvoru se prenose i razdvajaju mijenjanjem primjenjenog napona u kvadrupolu tako da odnos stalnog i promjenjivog napona ostaje stalan. Kvadrupoli obino imaju raspon masa od 1 a.m.u. do 2000 a.m.u., ali neki imaju i do 4000 a.m.u.. Iako imaju manju mo razdvajanja od magnetnih analizatora, omoguavaju dobivanje monoisotopic profile jona sa jednim nabojem u cijelom rasponu masa. Mogue je dobiti spektar koritenjem tri kvadrupola povezana u seriju, Q1, Q2, Q3 (Q2 slui kao koliziona elija (collision cell) i ne predstavlja analizator). Uobiajeno je da se kao kolizioni gas koristi argon.

Uobiajeni tipovi skenova su sljedei:

daughter-ion mode: Q1 odabire jone iji se fragmenti dobivaju kolizijom u Q2 i analiziraju u Q3,

parent-ion mode: Q3 proputa samo jone odreenog m/z omjera, dok Q1 snima zadani mass range. Samo su detektovani oni joni koji raspadanjem daju jon m/z omjera koji selektuje Q3.

neutral-loss mode: Q1 i Q3 skeniraju odreeni raspon masa, a prati se gubitak fragmenta koji je karakteristian za odreenu grupu supstanci

Takoe je mogue dobiti spektar kombinirajui kvadrupolni analizator sa magnetnim ili elektrostatskim analizatorima; takvi instrumenti se nazivaju hibridni maseni spektrometri.

Ion-trap analyser. Princip je isti kao kod kvadrupola, samo je elektrino polje u tri dimenzije. Ovaj tip analizatora omoguava praenje spektra produkt-jona tokom nekoliko generacija (MSn).

Ion-cyclotron resonance analysers. Joni su proizvedeni u eliji (cell) i podvrgnuti uniformnom, intenzivnom magnetnom polju se kreu u krunim orbitama u frekvencijama koje se mogu dovesti u direktnu korelaciju sa njihovim m/z odnosom primjenom Fourier-ove transformacije. Ovaj fenomen se naziva ion-cyclotron resonance. Analizatori ovog tipa se sastoje od tzv. superconducting magneta i imaju veliku mo razdvajanja (do 1 000 000 pa i vie) kao i MSn spektara. Meutim, potrebni su vrlo niski pritisci (re