Pre$lecture)slides:))Unit)4,)Part)1:))The)Cytoskeleton)

The)cytoskeleton:))an)overview:)

Physical)proper=es)of)cytoplasm:)

$$viscoelas=c)

$$thixotropic)

$$)crowded)

How)would)you)measure)these)proper=es?)

These)features)of)cytoplasm)are)largely)due)to)components)of)the)cytoskeleton.)

Elastic: Spring-like

Elastic: Spring-like

Deforming force

Elastic: Spring-like

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Deforming force

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

Viscoelastic

Spring plus dashpot

1.))Feed)macrophage)iron)par=cle)

2.))Use)magne=c)eld)to)move)phagocytosed)par=cle)back)and)forth)at)varied)speeds.)

Result:)At)low)shear)stress,)cytoplasm)is)quite)s=;))at)high)shear)stress,)viscosity)of)cytoplasm)is)low)and)exhibits)liPle)resistance)to)bead)movement.)I.e.,)cytoplasm)is)thixotropic.)What)might)explain)this)property)at)the)molecular)level)re.)cytoskeletal)interac=ons?)

Demonstra=on)that)cytoplasm)is)thixotropic:))

Experimental,analysis,of,,diusion,barriers/crowdedness,of,cytoplasm:,

1. Prepare)uniform$sized)prepara=ons)of)uorescent)dextran)par=cles)of)dierent)sizes)from)5$100)nm)in)diameter.)

2. Micro$inject)into)cultured)cell.)3. Measure)diusion)coecient.)Result:))dextran)par=cles)with)diameter)

50)nm)exhibited)signicantly)slower)diusion)rates)than)in)free)solu=on.)In)cytoskeleton$rich)regions,)size)limit)was)even)smaller)(~20)nm).)

What)may)be)some)consequences)of)crowdedness)re.)cytoskeletal)func=ons?)What)is)the)signicance)of))the)>50)nm)barrier?)

K.)Porters)microtrabecular)lacce)model)of)cytoplasm:)Based)on)high)voltage)TEM)of)whole)mount)views)of)cells)grown)on)EM)grids.)

The)Major)brous)polymers)of)the)cytoskeleton:)

Fibrous,Elements,of,Cytoplasm:,

Microtubules)(24nm)diam.):))Composed)of)polymerized)alpha$beta)tubulin)dimers)and)associated)binding)proteins.)

Intermediate)laments)(10)nm)diam):)Polymerized)IF)subunits)(many)dierent)types))and)associated)binding)proteins.)

Ac=n/microlaments)(7)nm)diam):)Polymerized)globular)(G)$ac=n)and)associated)binding)proteins.))

Ac=n)laments)and)MTs)are)polarized)polymers;)IFs)are)apolar.)))))))))))))))))))plus))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))minus)

Ac=n/MT)polarity)is)a)cri=cal)property)with)respect)to)func=ons)for)these)polymers)both)with)respect)to)assembly/disassembly)driven)processes)and)molecular)motor)dependent)processes.)))

Side)view)of)a)crawling)broblast)

Lamellipodium/leading)edge)

Lamellipodium/leading)edge)

There)are)several)dis=nct)types)of)ac=n)lament)arrays:)

a))uniformly)polarized)bundles)within)microvilli)b))mixed)polarity)ac=n)bundles)termed)stress)bers.)c))loosely)ordered)cor=cal)ac=n)and)d))sheet$like)branched)arrays)of)rapidly)turning)over)laments)that)extend)the)lamellipodium)of)a)crawling)cell.)

Intermediate)laments)course)out)from)surface)of)nucleus))to)the)plasma)membrane.)

Microtubules)extend)out)from)a)perinuclear)MT)organizing)center:)the)centrosome.))

Epithelial)Cell))

Ac=n)laments) Unipolar)ac=n)bundles)

Mixed)polarity)contrac=le)ring)of)laments)

Intermediate)laments,)desmosomes)and)hemidesmosomes)

MTs)break)away)from)centrosome)and)are)oriented)along)long)axis)of)cell)with)minus)ends)pointed)apically)

What)are)some)of)the)func=ons)of)the)cytoskeleton?)))

Cellular stucturesIntercellular ConnectivityOrganelle movementCell MotilitySignal TransductionCell DivisionStorage/organization of cellular activitiesMembrane dynamics (e.g. lipid anchoring)mRNA localization/transport; regulation of translationhost cell-microbial pathogen interactionsExocytic and Endocytic membrane trafficTension generation, transmission and sensing, both intra and intercellularly

Modes,of,regula=ng,cytoskeletal,func=ons,

)changes)in)cytosolic)[Ca2+]))

)changes)in)cytosolic)[H)+]))phosphoryla=on/dephosphoryla=on))proteolysis))lipid)binding)(e.g.)PI)lipids)))Tension))All)of)the)above)can)lead)to)long)term)changes)in)gene)expression.))

Free)and)total[Ca2+]=))10$3)M)

Ca2+)

Ca2+)

+Ca2+)

[Ca2+]free=))10$7)10$5)M)

Ca2+)

SER)

Plasma)membrane)and)ER)Calcium))pumps)eject)Ca)ions)from)cytosol.)Regulated)Ca$channels)allow)transient)increases)in)cytosolic)[Ca2+])

Mitochondria)provide)high)capacity,)low)anity)store)for)Ca2+)(driven)by)H+)gradient))

high)anity)Ca$binding)proteins)buer)cytosolic)Ca)2+);)e.g.)calmodulin))

[Ca2+])total=)10$4M)

Ca2+$calmodulin)clamped)around)the)alpha)helical)calmodulin)binding)domain)of)a)kinase)ac=vated)by)calmodulin.)

Calcium,and,regula=on,of,,the,cytoskeleton,,

@@Conforma=onal)changes)of)cytoskeletal)proteins)induced)by)Ca2+)

binding/dissocia=on.)

$$Conforma=onal/ac=vity)changes)induced)by)binding/release)of))apo$calmodulin)or))Ca2+)$calmodulin.))

$$Ca2+)ac=va=on/inac=va=on)of)modifying)enzymes)(e.g.)kinases;)lipases;)proteases)

$$Ca2+)$calmodulin)ac=va=on/inac=va=on)of)modifying)enzymes.)

Ac=n$based)cytoskeleton:))

Overview)of)func=ons)

Ac=n)lament)structure;)Ac=n)assembly)kine=cs)

Classes)of)Ac=n)binding)proteins)

Myosin)II)and)contrac=on)of)skeletal)muscle,)purse)string)contrac=on)of)cytokine=c)contrac=le)ring/cleavage)furrow)

Overview)of)myosin)superfamily)

A))visual)tour)of)the)ac=n)cytoskeleton)

A)nega=vely)stained)TEM)image)of)ac=n)laments)

Nega=ve)stain)TEM)

1. Apply)sample)to)coated)EM)grid.)2. Wick)dry)3. Add)a)drop)of)heavy)metal)

solu=on)(e.g.)1%)uranyl)acetate))4. Incubate)with)stain)for)short)

=me)5. Wick)dry)6. View)in)TEM)

Macromolecule)excludes)stainhence)the)nega=ve)contrast)Good)for)viewing)macromolecule)complexes;)not)useful)for)larger)structures)(e.g.)whole)cells,)nuclei,)))

Examples,will,highlight,func=ons,for,ac=n,laments,$in)genera=on)of)cellular)structures)$$in)serving)as)tracks)for)movement)of)organelles)$$media=ng)cellular)contrac=lity))$$forma=on)of)cellular)protrusions)through)dynamic)ac=n)assembly)$facilita=on)of)bacterial)or)virus)infec=on)of)host)cells)

The)brush)border)surface)of)an)intes=nal)epithelial)cell.)Microvilli)are)supported)by)a)bundle)of)ac=n)laments)

TEM)of)the)brush)border;)note)the)bundle)of)ac=n)laments)in)each)microvillus.))Plus)ends)of)laments)are)at)the)=p)of)the)microvillus.)

Vesicle)transport)along)ac=n)bundles)in)an)intes=nal)epithelial)cell.)

There)are)at)least)12)dierent)members)of)the)myosin)family)of))ac=n)based)motors)associated)with)this)ac=n)cytoskeleton.)

Contracted)skeletal)muscle.)Sarcomeres)of)two)adjacent)myobrils)are)shown.)

SEM)of)cleavage)furrow)of)a)dividing)frog)egg.)This)is)mediated)by)a)contrac=le)ring)of)ac=n$myosin$II)

Lamellar,)ac=n)lled)extensions)at)leading)edge)of)crawling)cell.)Extension)is)driven)by)ac=n)lament)polymeriza=on.)

Nega=ve)stain)of)ac=n)lament)arrays)of)lamellar)extension)(membrane)removed)with)detergent).))from)V.)Small.)

A model for lamellar extension through actin filament assembly at the leading edge and disassembly at the rear. (T Pollard and others)

Fig. 38-8 EM Copyright*2007*by*Saunders/Elsevier.*All*rights*reserved.*

Acrosomal)reac=on)and)fer=liza=on)of)egg)by)a)sea)cucumber)sperm.)

Echinoderm)sperm)have)to)get)their)plasma)membrane)through)a)very)thick)(up)to)100)um))extracellular)matrix)to)eect)fer=liza=on)

movie)frames)depic=ng)acrosomal)process)forma=on.)=me)elapsed~)5)sec.!!)(this)process)is)nearly)100)um)long))and)is)powered)by)the)explosive)polyermiza=on)of)an)ac=n)lament)bundle)

Prolac=n)cup)consists)in)part)of)G)ac=n)complexed)with)prolin.)Contact)with)oocyte)s=mulates)exocytosis)of)acrosomal)vesicle)(A))and)assembly)of)ac=n)bundle.))Acrosome)is)just)a)secretory)granule)lled)with)enzymes)to)digest)a)hole)in)the)jelly)layer)surrounding)the)oocyte.))

Long.)and)cross)sec=on)of)acrosomal)process)

Intracellular)movement)and)cell$cell)infec=on)by)Listeria)is)driven)by)a)comet)tail)of)ac=n)

What)is)an)advantage)of)this)type)of)cell$cell)transmission/infec=on?)

Directed)assembly)of)ac=n)pushes)these)viruses)out)of)the)cell.)

Globular)(G)$ac=n)Mr:)42kDa)

ac=n)monomer)binds)1)molecule)of)ATP)or)ADP)(hydrolysis)occurs)axer)addi=on)to)polymer))

The)subunit)is)oriented)with)plus/barbed)end)surface)at)the)boPom.))

(note,)in)mammals)there)are)mul=ple)ac=n)genes)but)we)will)consider)them)as)essen=ally)iden=cal)in)structure)and)assembly)proper=es))

A)nega=vely)stained)TEM)image)of)ac=n)laments)

Ac=n)lament)structure.)

Proteoly=c)fragments)of)muscle)myosin$II:)The)motor)(S1))domain)can)be)used)to)determine)ac=n)lament)polarity)by)adding)to)the)lament)in)the)absence)of)ATP)to)form)arrowhead)decorated)laments.)

Experimental)determina=on)of)ac=n)lament)polarity:)myosin)head/)motor)domain)decora=on)of)the)ac=n)lament)

nega=vely)stained)lament)with)arrowhead)decora=on)resul=ng)from)binding)of)myosin)head)domain)to)each)subunit)in)the)lament.)

+/)barbed)

$/pointed)

Oppositely)oriented)myosin)head)decorated)laments)

Myosin)head)bound)to)each)ac=n)monomer)

from)R.)Milligan)

barbed/+)end) pointed/$)end)

The)arrowheads)are)a)two)dimensional)projec=on)of)the)helical)array)of)myosin)heads)bound)to)the)helically)ordered)ac=n)subunits:)each)arrowhead)consists)of)13$14)myosin)heads.)

Func=onal)signicance)of)ac=n)lament)polarity)

$$Plus)end)grows)faster)and)at)a)5$10)fold)lower))cri=cal)concentra=on)than)the)minus/pointed)end.)

$$Polarity)dictates)direc=on)a)myosin)can)pull)on)or)walk)along)an)ac=n)lament.))Most)known)myosins)are)plus$end)directed)motors.))The)one))excep=on:))myosin)VI.))

A.,Key,features,of,,ac=n,lament,and,microtubule,(MT),assembly:)

Cri=cal)Concentra=on:))Subunit)concentra=on)above)which)polymeriza=on)will)occur.)The)concentra=on)of)subunit)(ac=n)monomer;)tubulin)dimer))that)is)in)equilibrium)with)polymer))once)polymeriza=on)has)reached)steady)state)equilibrium.)

)How,do,you,measure,polymer,concentra=on?,

Total)subunit)concentra=on)(tubulin)dimer/)ac=n)monomer))

[polymer])

0)))))))))))

Cri=cal)Concentra=on,)Co)

Co)for)pure)tubulin:)~)10)uM;)ac=n:)0.2)uM)

B.,,Key,features,of,MT/ac=n,assembly,

Kine=cs)of)MT/ac=n)assembly)

,,Subunit)concentra=on)must)be)>)Co)))Assembly)occurs)in)three)dis=nct)kine=c)stages:)

)Nuclea=on:))rate)limi=ng)step;)extremely)slow)for)pure))tubulin)assembly;)very)slow)for)ac=n)assembly)

)Elonga=on;)rapid)linear)forma=on)of)polymer)mediated)by)end$on)addi=on)of)subunits)to)both)end)of)growing)polymer.)

)Steady)state)equilibrium:))Although)there)is)no)net)change)in)polymer)concentra=on;)polymer)is)in)constant)exchange)with)the)Co)pool)of)subunits)at)both)ends)of)the)polymer.)[Polymer])))))))))[s.u.]Co,

=me)

[polymer])

Nuclea=on)

elonga=on)

Steady)state)equilibrium)

Kine=cs)of)MT/ac=n)assembly:))Assume)this)curve)is)for)assembly)of)2)uM)ac=n)and)that)[Co])is)0.2)uM;)what)is)the)[polymer])at)steady)state?)))

=me)

[polymer])

Nuclea=on)

elonga=on)

Steady)state)equilibrium)

Kine=cs)of)MT/ac=n)assembly:))Assume)this)curve)is)for)assembly)of)2)uM)ac=n)and)that)[Co])is)0.2)uM;)what)is)the)[polymer])at)steady)state?)))

1.8)uM)

Ac=n)lament)nuclea=on)is)rate)limi=ng)and)occurs)through)forma=on)rst)of)a)highly)unstable)dimer,)and)then)a)trimer)which)can)then)elongate)by)subunit)addi=on)onto)both)ends.)

From)Pollard)and)Earnshaw)text)

C.,,Key,Features,of,ac=n/MT,Assembly:))

During)elonga=on)phase)rate)of)polymer)elonga=on)is)linear)and)is)linearly)dependent)on)the)total)subunit)concentra=on.)

Rate)of)polymer)elonga=on)is)faster)at)the)plus)end)(also)called)barbed)end)for)ac=n)lament))than)at)the)minus)(pointed))end)of)the)polymer.)

The)Co)for)subunit)addi=on)is)also)lower)at)the)plus)end)than)at)the)minus)end,)although)this)dierence)is)much)greater)and)func=onally)more)important)for)ac=n.)

)The)plus)end)is)also)the)fast)disassembly)end)for)both)MTs)and)ac=n)laments.)

The)plus/barbed)end)grows)faster)and)at)a)lower)cri=cal)concentra=on)than)the)minus/pointed)end.))

minus)

plus)

,D.,,Key,Features,of,MT/ac=n,Assembly:,Lag,in,hydrolysis,of,bound,nucleo=de,aMer,s;ubunit,addiiton,to,polymer)

)For)both)G$ac=n)and)tubulin)dimer,)nucleo=de)(NTP))hydrolysis)occurs)upon)incorpora=on)into)polymer.)

)However,)this)hydrolysis)occurs)at)a)rate)slower)than)subunit)addi=on)under)condi=ons)of)high)free)subunits)available)for)addi=on,)at)least)at)the)growing)plus)end.)

))Thus,)at)the)plus)end,)there)is)an)NTP)cap)of)NTP)containing)subunits)under)condi=ons)of)rapid)assembly)

)However,)if)the)available)pool)of)subunits)is)at)or)below)the)Co,)then)the)plus)end)will)contain)subunits)with)NDP)rather)than)NTP;)(key)for)MT)assembly)dynamics);)for)ac=n)laments,)regions)of)the)lament)containing)ADP)bound)subunits)are)structurally)dierent)from)subunits)with)bound)ATP)or)ADP.Pi.)

Copyright*2007*by*Saunders/Elsevier.*All*rights*reserved.*

As)a)growing)lament)ages,)subunits)in)the)oldest)part)of)the)lament)will)contain)the)most)ADP)subunits)

Ac=n)laments)age)from)+$>$)end)axer)subunit)addi=on)at)the)+)end)because)ATP)hydrolysis)and)then)release)of)Pi)are)slow)processes)

Actin drugs: inhibitors and filament stabilizers

Cytochalasins: Bind barbed/plus ends, inhibits polymerization

Latrunculin: Binds monomers and inhibits polymerization, will induce depolymerization

Phalloidin/jasplakinolide: Bind and stabilize filaments, phalloidin can be labeled with a fluorescent dye, making it very useful for staining actin filaments in cells. Jas. is cell permeable and can be used on live cells.