Praktické aspekty forenzní DNA diagnostiky

RNDr. Jiří Fišer19. dubna 2011

Olomouc

DNA PROFIL

D3S1358

TH01

D21S11

D18S51

Penta E

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1PO

Penta D

Amelogenin

vWA

D8S1179

TPOX

FGA

16/17

7/8

28 15/16

7/9

12 11/13

9/13

11/13

10 5/14

X/Y

16/17

12/15

8/11

19/26

DNA profil v grafické podobě

DNA profil v podobě alfanumerického znaku

Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři

DNA profil

PCR a anylýza produktů

Koncetrace DNA (fakultativní krok)

Kvantifikace DNA v izolátu (fakultativní krok)

Izolace DNA

Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok)

Vzorek

• STOPY vznikly v souvislosti s prověřovanou skutečností, jsou

neopakovatelné a jsou vlastním předmětem našeho zkoumání

• POROVNÁVACÍ VZORKY zajišťovány až následně dle potřeby, případně i

opakovaně a slouží k identifikaci stopy resp. jejího původce

Rozdělení forenzních vzorků

• Kriminalistickou stopou jsou všechny následky vzájemné interakce mezi sledovaným objektem a jeho okolím, zanechané jak na prostředí, tak i na sledovaném objektu.

• Interakce (odraz, stopa) musí být v souvislosti se sledovanou (kriminalisticky relevantní) událostí. Odraz (stopa) musí existovat alespoň od svého vzniku do zjištění a musí být vyhodnotitelná současnými forenzními metodami a prostředky.

• Biologické stopy se řadí mezi stopy materiální, vznikající na nejrůznějších objektech neživé nebo živé přírody.

• Biologické stopy mívají velmi často latentní charakter.• Biologické stopy se velmi často vyskytují v korelaci se stopami jiného typu.• Biologickým materiálem pro forenzní účely se rozumí krev, sliny, sperma,

trichologický a jiný materiál lidského, případně i živočišného a rostlinného původu.

Forenzní stopy (biologické) – obecná definice

Forenzní vzorky a stopy (biologické) - příklady

Příklady typů zpracovávaných stop: krevní skvrny sliny (tj. nedopalky, dopisní obálky, žvýkačky, kukly, sklenice, slánky … sperma vlasy a chlupy se zachovaným kořínkem (vytržené) nečistoty z pod nehtů měkké a tvrdé tkáně (svalovina, kosti …) stěry z povrchu různých předmětů (intenzívně používané nástroje, obuv a oděvy, ovládací prvky vozidel apod.).

Příklady typů srovnávacích vzorků:

krev bukální výtěr jiný typ biologického materiálu (svalovina, kosti, zubní kartáček, hřeben, oděvy, holící strojek…)

Porovnávací vzorky – DNA analýzy

Vhodný je jakýkoliv materiál, ze kterého lze izolovat DNA

• Krev (pro laboratoř nejvýhodnější typ materiálu a proto původně preferovaná)

• Sliny(nejvýhodnější z hlediska zajišťování, i proto je v současnosti preferovaným typem porovnávacího vzorku)

• Trichologický materiál (vlasy)(pouze materiál s vytrženým kořínkem, zajišťován spíše výjimečně)

• Kosti(krajní varianta, zpravidla v případě, kdy je vzorek odebírán mrtvolám v pokročilém stupni rozkladu)

Porovnávací vzorky – DNA analýzy

• Krev byla původně preferovaným materiálem• Výhodná z hlediska izolace• Nevýhodou jsou problémy s odběrem, transportem a

skladováním• Toto částečně řeší přechod od tekuté krve ve zkumavce k tzv.

FTA kartám.

Porovnávací vzorky – DNA analýzy

• Nově preferovaným materiálem• Výhodné především z hlediska odběru• Další výhody s transportem a skladováním• Nevýhodou je pro laboratoř problematicky odhad množství

DNA ve vzorku (vhodná je kvantifikace).

Forenzní stopy

• Množství materiálu je limitováno. • Problém analýzy latentních stop.• Kvalita materiálu je neznámá.• Častý výskyt tzv. smíšených stop. • Nutnost zohlednit nároky jiných forenzních disciplín. • Nutnost zohlednit, případně upřednostnit i jiné okolnosti, pro

obajsnění případu významnější a požadavky zadavatele.• Nutnost vyžádat si, je-li to možné odpovídající typ

porovnávacích vzorků.

Forenzní stopy – místa výskytu

• Předměty zaslané rovnou do laboratoře- Dostatek času a „laboratorní zázemí“- Ideální podmínky při vyhledávání a detekci stop

Forenzní stopy – místa výskytu

• Interiéry mimo laboratoř (byty, kanceláře, garáže, sklady, výrobní prostory atd.)

- Podmínky ztíženy, nelze využít všechny dostupné metodiky při průkazech

- Výhodou je možnost posoudit původní stav stop

Forenzní stopy – místa výskytu

• Exteriéry, vozidla- Podmínky opět ztíženy, nelze využít všechny dostupné metodiky při

průkazech - Často i časová nouze (teplota, déšť, tma)- Často jsou proto zajišťovány celé předměty s podezřením, že na jejich

povrchu se mohou vyskytovat forenzní stopy- V případě potřeby možno odtáhnout, ohledat v garáži a využít „zázemí

laboratoře“

Kvalita materiálu

Forenzní stopy - množství materiálu

Množství materiálu – mikroskopický preparát

Latentní stopy

• Pouhým okem nezjistitelné• Může se tedy jednat o jakýkoliv předmět na jehož povrchu lze

předpokládat přítomnost biologického materiálu • Může přinést zásadní informace, jindy policejním technikem zneužíváno ke

splnění úkolů zajistit stopu za každou cenu

Nutnost zohlednit nároky jiných forenzních disciplín

• Trasologie (otisky např. podešví bot

nebo rukavic v krvi)

• Daktyloskopie (často rovněž latentní

stopy jejichž zviditelněním může dojít ke zničení stop biologických)

• Chemie a mikrostopy

(například materiál zajišťovaný z rukou a zpod nehtů osob)

Zohlednění jiných okolností

• Biologické stopy jsou v tomto případě až druhotné, důležitější je, že jejich tvar a rozmístění vypovídá o tom, že místo nálezu oběti bylo i místem útoku. Svědčí i o jeho intenzitě.

Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři

DNA profil

PCR a anylýza produktů

Koncetrace DNA (fakultativní krok)

Kvantifikace DNA v izolátu (fakultativní krok)

Izolace DNA

Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok)

Vzorek

Izolace DNA• Množství DNA pro analýzu 15 STR lokusů (stačí 250 pg - 10 ng, 6pg DNA v jedné buňce) • Délka analyzovaných STR úseků DNA je malá (od cca 80 bazí po maximálně 600 bazí)

• Množství je ovšem limitováno!• Nestandardní, proměnlivé typy materiálu• Různá a často nezjistitelná kvalita materiálu• Možná přítomnost inhibitorů PCR reakce• Možná kontaminace materiálem (DNA) jiné osoby

• Izolace pomoci Chelex-Resin• Miniizolace na speciálních kolonkách • FTA karty• Izolace pomocí organických chemikálií fenol- chloroform,

apod.

Automatický izolátor DNAIzolace DNA

Promývací a lyzační pufryMikrokolony k „vychytávání“ DNAPřístroje nutné k provedení izolace

FTA karta- alternativní varianta- snadné skladování a transport- pro některé typy vyšetření nevhodná

Detail laboratorního boxuLaminární box třídy II-ochrana vzorku a současně ochrana personálu

Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři

DNA profil

PCR a anylýza produktů

Koncetrace DNA (fakultativní krok)

Kvantifikace DNA v izolátu (fakultativní krok)

Izolace DNA

Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok)

Vzorek

Kvantifikace DNA • ELFO na agarozovém gelu.• UV - spektrofometrie.• Fluorescenční značky a fluorometr.

• RT-PCR se značenou specifickou sondou. (specifická, přesná, citlivá, vyžaduje malé

množství materiálu)

Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři

DNA profil

PCR a anylýza produktů

Koncetrace DNA (fakultativní krok)

Kvantifikace DNA v izolátu (fakultativní krok)

Izolace DNA

Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok)

Vzorek

Koncentrace roztoku DNA

• Postupy na principu filtrace.• Volitelná denzita filtrační frity (používá se zpravidla 30 000 – 100 000)• Typ lze volit i dle koncentrovaného objemu

Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři

DNA profil

PCR a anylýza produktů

Koncetrace DNA (fakultativní krok)

Kvantifikace DNA v izolátu (fakultativní krok)

Izolace DNA

Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok)

Vzorek

PCRPCR - polymerázová řetězová reakce

In vitro enzymatické namnožení žádaného úseku DNA

- Primery –oligonukleotidy, uměle syntetizované nukleotidové řetězce cca 15 - 30 bazí, vymezují

analyzovanou oblast (mohou být značené fluorescenčními barvami)

- enzym – Taq polymeráza, „připojuje“ na 3´ konec primeru, k matrici komplementární báze

- nukleotidy dNTPs (deoxynukleosidtrifosfáty)- matrice – DNA- pufry pro zajištění optimálního prostředí

Sekvenátor

LADDER - žebřík

Modrá část ladderu

Návaznost kroků během analýzy DNA v laboratoři

DNA profil

PCR a anylýza produktů

Koncetrace DNA (fakultativní krok)

Kvantifikace DNA v izolátu (fakultativní krok)

Izolace DNA

Určení typu biologického materiálu (fakultativní krok)

Vzorek

DNA PROFIL

D3S1358

TH01

D21S11

D18S51

Penta E

D5S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1PO

Penta D

Amelogenin

vWA

D8S1179

TPOX

FGA

16/17

7/8

28 15/16

7/9

12 11/13

9/13

11/13

10 5/14

X/Y

16/17

12/15

8/11

19/26

DNA profil v grafické podobě

DNA profil v podobě alfanumerického znaku

alela TH01 Penta E5 0,005 0,059 Penta D6 0,223 D5S818 D7S820 0,0027 0,145 0,177 0,002 D13S317 0,016 D16S539 CSF1PO 0,011 D8S1179 TPOX8 0,095 0,007 0,005 0,123 0,143 0,011 0,002 0,005 0,007 0,5739 0,205 0,030 0,064 0,066 0,177 0,068 0,032 0,227 0,011 0,077

9.3 0,314 D18S5110 0,011 0,007 0,141 0,036 0,052 0,284 0,059 0,275 0,120 0,086 0,068

10.3 D3S1358 0,002 vWA11 0,005 1,000 0,007 0,091 0,368 0,366 0,191 0,280 0,298 0,161 0,002 0,064 0,24112 0,002 0,100 0,161 0,366 0,245 0,139 0,341 0,316 0,193 0,002 0,143 0,04113 0,005 0,100 0,077 0,150 0,109 0,045 0,211 0,059 0,195 0,005 0,350 1,00014 0,157 0,166 0,041 0,007 0,039 0,002 0,030 0,011 0,061 0,075 0,22315 0,225 0,193 0,061 0,002 1,000 0,002 1,000 0,007 0,020 0,109 0,10516 0,234 0,152 0,052 1,000 1,000 1,000 0,002 0,166 0,007 FGA17 0,232 0,125 0,020 1,000 0,293 0,002 0,00218 0,123 0,052 0,050 0,245 0,002 0,01819 0,018 0,045 0,023 0,086 1,000 0,06620 1,000 0,032 0,009 0,016 0,13421 0,018 1,000 1,000 0,198

21.2 0,00222 0,002 0,211

22.2 0,01123 0,155

23.2 1,000 0,00724 0,11825 D21S11 0,06826 57 0,005 0,00527 59 0,036 0,00528 61 0,161 1,00029 63 0,177

29.2 64 0,00230 65 0,211

30.2 66 0,07331 67 0,080

31.2 68 0,07032 69 0,025

32.2 70 0,11133 71 0,002

33.2 72 0,04334 7335 75 0,002

1,000

Autor RNDr. Daniel Vaněk PhD.

Populační data

Caucasian-American African- American Hispanic- American

Pravděpodobnost náhodné shody

1:1.83x1017 1:1.42x1019 1:2.94x1017

Síla vyloučení 0.9999994 0.9999996 0.9999983Data poskytovaná firmou PROMEGA

 

 

Kompatibilita výsledků zkoumání

- CODIS a ENFSI nezávazná doporučení ohledně výběru STR polymorfismů- Poskytované výsledky jsou kompatibilní s výsledky všech policejních laboratoří- Existují pouze drobné rozdíly v rozsahu zkoumání- Kvalita výstupů je zaručená akreditací laboratoře- Výsledky jsou podávány v kvalitě a formě plně postačující pro porovnání s

DNA profily uloženými v ND DNA a případně i pro uložení do ND DNA.

D3S1358 D5S818 D8S1179 Amelogenin

TH01 D13S317 FGA Penta D

D21S11 D7S820 TPOX D19S433

D18S51 D16S539 Penta E

vWA CSF1PO D2S1338

Analýza Y-chromozomu

DYS456 DYS458 DYS393 Y GATA H4

DYS389I DYS19 DYS391 DYS437

DYS390 DYS385a DYS439 DYS438

DYS389II DYS385b DYS635 DYS448

DYS392

- analýza vhodná pro smíšené vzorky, kdy je malé množství materiálu mužského původu „překryto“ výrazným přebytkem materiálu ženského původu (mravnostní delikty)

- analyzujeme celkem 17 STR polymorfizmů lokalizovaných na Y chromozomu- tato sestava sedmnácti polymorfizmů obsahuje i všechny oblasti

doporučované ENFSI- výhodou je možnost zjistit příbuzenské vazby po paternální línii (celá sestava

alel se dědí z otce na syna, s výjimkou mutací, beze změn)- nemožnost takto analyzovat materiál ženského původu

Založená na totožném principu jako klasická, základní analýza jaderné DNA

Národní DNA databáze

D3S1358

TH01

D21S11

D18S51

Penta E D5

S818

D13S317

D7S820

D16S539

CSF1PO

Penta D Am

elogenin

vWA

D8S1179

TPOX

FGA

16/17

7/8

28 15/16

7/9

12 11/13

9/13

11/13

10 5/14

X/Y

16/17

12/15

8/11

19/26

DNA profil v podobě alfanumerického znaku

• Je provozována pouze Policií ČR• Založen na databázovém programu „CODIS“• Obsahuje DNA profily v alfanumerické podobě• Nelze z něj zjistit žádné vlastnosti či zdravotní

predispozice vyšetřované osoby• Součástí je i fyzická sbírka vzorků DNA• Uloženy pod tzv. „identifikátorem“ (informace o typu vzorku, pracovišti a pracovníkovi,

roku zpracování a případu …)

• Umožňuje rychlé a efektivní porovnávání• Některé statistické výpočty na základě aktuálních

frekvencí výskytu jednotlivých alel• DNA profily stop, obžalovaných a odsouzených,

pracovníků laboratoře a další eliminační vzorky• Umožňuje eliminovat „parciální chyby“ v analýze• Vkládání , vymazávání a úpravu dat ošetřuje pouze

vnitřní policejní předpis• Některé nejasné a sporné body, různý právní výklad

Typy DNA analýz

1. Jaderná DNA lidského původu- nejčastěji prováděná analýza- založená zpravidla na vyšetření vybraných polymorfních oblastí typu STR- výsledkem je tzv. DNA profil v podobě alfanumerického řetězce

2. Analýza Y-chromozomu- Y-chromozom je u lidí výhradně „mužskou záležitostí“- založená rovněž na vyšetření polymorfních oblastí typu STR- výhodou je jedinečná možnost úspěšně analyzovat DNA muže přítomnou ve vzorku ženského původu v jinak nedetekovatelném množství (v poměru 1 : 100 i více)- nevýhodou i výhodou zároveň je skutečnost, že znaky dislokované na Y-chromosomu se beze změny dědí z otce na syna

3. Analýza mitochondriální DNA (mt-DNA)- v jediné buňce je až několik tisíc kopií mt-DNA, která je navíc velmi krátká, tuto metodu je proto možno aplikovat i na jinak neanalyzovatelné stopy- analýza je založena na sekvenování dvou tzv. hypervariabilních úseků (HVRI a HVRII)- nevýhodou je vysoká pracnost a tedy i cena, dědičnost pouze po maternální línii- ve srovnání s jadernou DNA nižší síla identifikace

4. Analýza DNA non humánního původu- analýza a individuální identifikace DNA zvířecího původu (psi, koně, skot…)

Kolik to stojí a jak dlouho to trvá

3 dnya více

180 min.a více

20 min

90 min.

400 Kča více

200 Kč

80 Kč30 Kč

Chelex Resin-100 FTA technologie QiaGen kit fenol-chloroform

A. Izolace DNA ze vzorku

Klesající kvalita vzorku

Kolik to stojí a jak dlouho to trvá

B. Kvantifikace DNA (je stanovena koncentrace DNA v roztoku, lze

realizovat i dodatečně)

3 hodiny 300 Kč

C. Koncentrace (týká se pouze vzorků o nízké koncentraci DNA nebo

vzorků obsahujících inhibitory)

1 hodina a více 150 Kč

Alternativní kroky, které lze vypustit

Kolik to stojí a jak dlouho to trvá

D. PCR reakce (vlastní namnožení analyzovaných oblastí na DNA)

2-3 hodiny 700 - 1 100 Kč

E. Analýza PCR produktů (konečně výsledek)

1 hodina (dvě měření) 150 Kč

Kolik to stojí a jak dlouho to trvá

Sumarizace

Kvalitní stopa a bezproblémový průběh analýzy

A. + D. + E.

4 hodiny 20 minut 880 Kč

Problematická stopa

B. + B. + C. + D. + E.

4 dny a více od 2 100 Kč (jedno vyšetření)

KVALITA

Vzdělávání v oblasti forenzní genetikyreg. č. CZ.1.07/2.3.00/09.0080

Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.

INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ

INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ

Rok 2007

• 8 laboratoří (policejní i civilní, akreditované i neakreditované)• 4 vzorky simulující běžně zkoumané stopy• 3 vzorky simulují srovnávací materiál• vyžadována analýza STR polymorfismů autosomálních i lokalizovaných na Y chromozomu

Rok 2009/2010

• 10 laboratoří (policejní i civilní, akreditované i neakreditované)• 3 vzorky simulující běžně zkoumané stopy• 2 vzorky simulují srovnávací materiál• nebyla vyžadována analýza STR polymorfismů lokalizovaných na Y chromozomu

Rok 2010/2011

• 12 laboratoří (policejní i civilní, akreditované i neakreditované)• 3 vzorky simulující běžně zkoumané stopy• 2 vzorky simulují srovnávací materiál• nebyla vyžadována analýza STR polymorfismů lokalizovaných na Y chromozomu

Rok 2007Počet laboratoří Počet

analyzovaných „porovnávacích vzorků“

Procento chybných analýz

Počet analyzovaných „stop“

Procento chybných analýz

8 40 48

• Y-STR polymorfismy počítány jako samostatná analýza• Alela 9.1 v systému D7S820• prakticky žádný kvalitativní rozdíl mezi akreditovanými a „ostatními“ subjekty• pouze 5 laboratoří vypracovalo i nepovinnou část – určení typu biologické stopy

Procento úspěšných laboratoří: 0% !!!!!

22,5% 31,3%

Rok 2009/2010Počet laboratoří Počet

analyzovaných „porovnávacích vzorků“

Procento chybných analýz

Počet analyzovaných „stop“

Procento chybných analýz

10 20 30

• analýza Y-STR polymorfismů nevyžadována• pouze 6 laboratoří vypracovalo i nepovinnou část – určení typu biologické stopy• prakticky žádný kvalitativní rozdíl mezi akreditovanými a „ostatními“ subjekty

Procento úspěšných laboratoří: 40% !

5% 26,7%

Rok 2010/2011Počet laboratoří Počet

analyzovaných „porovnávacích vzorků“

Procento chybných analýz

Počet analyzovaných „stop“

Procento chybných analýz

12 24 36

• analýza Y-STR polymorfismů nevyžadována• pouze 6 laboratoří vypracovalo i nepovinnou část – určení typu biologické stopy• prakticky žádný kvalitativní rozdíl mezi akreditovanými a „ostatními“ subjekty

Procento úspěšných laboratoří: 58,3%

0% 13,9%

Přeji všem úspěšný vstup do praxe

a co nejméně chyb

při analýzách!