PRACTICA CROMATOGRAFIA EN GEL Y CUANTIFICACIÓN DE...
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PRACTICA CROMATOGRAFIA EN GELY CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNASJ.A. REIG
Para saber lo que tengo debo l ifiseparar las partes y cuantificar
1 de 20€2 de 10€1 moneda de 1 €10 monedas 0.20€4 monedas 0.10€3 d d 0 023 monedas de 0.02€2 monedas de 0.01€
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CROMATOGRAFIA Y ELECTROFORESIS: Técnicas de separación y resolución de una mezcla de moléculas paraTécnicas de separación y resolución de una mezcla de moléculas para aislar un componente o llevar a cabo un análisis.
PRACTICA DE BIOQUIMICA : CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL YPRACTICA DE BIOQUIMICA : CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GEL Y DETERMINACION DE PROTEINA EN PLASMA
Perfil cromatografico de un veneno
Fracción IV
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CROMATOGRAFIA Diferente velocidad de desplazamiento de moléculas en una mezcla al ser arrastradas por una fase movil a través de un en una mezcla al ser arrastradas por una fase movil a través de un soporte sólido o estacionario… arrastre por presión, capilaridad etc.
Puntode aplicación
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Fase estacionariaFase movileluyente
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CROMATOGRAFIA EN PAPEL
distancia migrada por moleculaRf= --------------------------------------
distancia migrada por frente
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CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (SILICAGEL (SiO2) ( ( 2)ALUMINA (Al2O3)
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CROMATOGRAFIA EN COLUMNAPRACTICA DE LABORATORIO
H2O
Bi G l P4BioGel P4
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VASO PLASTICO CONELUYENTE (AGUA DESTILADA)
COLUMNACON GELCON GELEN SUSPENSION
PLACA POROSACANULA GOMA
PINZA DE ROSCAGRADILLACON TUBOSCON TUBOSMARCADOSSIN NUMERAR
TUBO EPPENDORFMUESTRA A SEPARAR
PIPETA PASTEUR
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CROMATOGRAFIASEGÚN EL SOPORTE
INTERCAMBIO IONICOSepara por cargaIntercambio aniónicoIntercambio catiónico
AFINIDADAFINIDADSepara por afinidad en la unión con un dominio
FILTRACION EN GELSepara por tamaño
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CROMATOGRAFIA DE FILTRACION EN GELO DE EXCLUSION MOLECULARLAS MOLECULAS SE SEPARAN EN FUNCION DEL TAMAÑOLAS GRANDES FLUYEN MAS RAPIDAMENTE LAS PEQUEÑAS SE QUEDAN RETENIDASLAS GRANDES FLUYEN MAS RAPIDAMENTE, LAS PEQUEÑAS SE QUEDAN RETENIDASMAS TIEMPO EN EL GEL Y SALEN MAS TARDE DE LA COLUMNA, DISTINTA VELOCIDADDE MIGRACION
Azul dextrano+Vit B12
3ml
AZUL DEXTRANOVIT. B12
1 2 3 4 5 6…………………….
C antifica emosAZUL DEXTRANOPM=200.000VOLUMEN DE EXCLUSIÓN (V0) 6x3ml=18ml
PM=1355CuantificaremosX colorimetria
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Aplicar la muestra
MUESTRAazul
1 quitar tapa 2 Vaciar con1.quitar tapa 2.Vaciar conPipeta pasteur 3. Aplicar muestra
y... quitar pinza!!Tuboeppendorf
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eluyente
Dejar resbalar por lasparedes de la columna,sin bombardear el gel!sin bombardear el gel!
3mL
L t d b t l l
3mL
La muestra debe penetrar en el gelsin que se seque el gel!!añadiremos un poco (2 dedos)de eluyente, para evitar distorsiones y conectamos la cánula al erlenmeyeren la leja superior con la fase movil.
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AZULDEXTRANO VIT. B12
Ley de Lambert-Beer
Relación exponencial Relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una sustancia y su concentración
Absorbancia 1A=log Io/I A=1 lg Io/I =1 Io/I=10 inciden 100 y salen 10
V0 Ve
bso ba c a og o/ g o/ o/ 0 c de 00 y sa e 0Se absorbe un 90% de luz. Si la absorbancia es 2 Io/I=100 se absorbe un 99%Cuanto mayor absorbancia mayor concentración MAS LUZ SE ABSORBE,MENOS SALElog Io/I
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VeVo
Gel P4 RANGO EXCLUSIONGel P4 RANGO EXCLUSION800-4000
VitB12
D=1,7cmr=0,85cm
AD
VitB12
AD=200.000 excluidoVit B12=1355 parcialmente incluida
Vt= πr2xhVt (cc = ml)
Vo volumen exterior de la columna recorrido por moléculas no incluídas (marcador= azul dextrano)Ve volumen al que sale la vit. B12
Se puede normalizar para cada columna el comportamiento cromatografico en función delos paramentros de cada columna.
Ve-VoKd=Kd= ---------
Vt-Vo
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DETERMINACION DE CONCENTRACION PROTEICAMEDIANTE REACCION CON BIURET2ª parte de la práctica
REACTIVO DE BIURET:Cu(SO4) y NaOH
PROHIBIDAS LAS SIESTAS
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DETERMINACION DE LA CANTIDAD DE PROTEINA EN UNA MUESTRA DE SUERO
REACTIVOBIURET (azul)
1 2 3 4 5 6 M
SOLUCIONESTÁNDAR ALBUMINA 10mg/ml
Reactivo 1
M t ALBUMINA 10mg/mlAbs Muestrasuero
Y=mX+b Y=mXMAbs
mg proteinax0 1 3 5 8 10
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0.15abs
0.12
0.05
0.1
8,5mg/0.1ml
0 1 3 5 8 10 mg Proteina
8,5mg/0.1ml
g
0 15
0.05
0.1
0.15
ajustar una recta
1 3 5 8 100100L=0.1mL
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PIPETAS DE VIDRIO Y PIPETEADORES
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INDIVIDUAL!! NOMBRES Y APELLIDOS (CON MAYUSCULAS)Tubo/Abs
1-02-0,03
P4/800-4000 Φ=1,7 cm
2 0,033-0,014-0,065-0,76-0,237 0 40
Cromatografia en gel que separa por….P4/800-40007-0,40
-----etc
Vo VeA0.50
Abs
1 2 3 4 5 6......
0.25Tubo nº/ml 3 mLTubo/abs
1(0mg)/02(1mg)/0,05
0 2Abs
3 l/ i
( g)/0,05……6(10mg/0,28
0.050.10.150.2
X=7,7mg/0.1ml
A=0.12
LOS CUESTIONARIOS
=3ml/xminManual=77Ordenador=72,7
x1001 3 5 8 10
LOS CUESTIONARIOSSE ENTREGAN AL FINALIZAR!
mg PROTEÍNA 77mg/mL
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OTRAS CROMATOGRAFIASCROMATOGRAFIA DE GASES
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Identificacion en base a standars
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CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION (HPLC)
Adsorventes de distinta hidrofobicidad sonempaquetados en columnas
sac
¿?Si
¿?
F2-
F1+ sac
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ELECTROFORESIS:MIGRACION DIFERENCIAL DE MOLECULAS EN EL SENO DE UN CAMPO ELECTRICOMIGRACION DIFERENCIAL DE MOLECULAS EN EL SENO DE UN CAMPO ELECTRICOSOBRE UN SOPORTE DETERMINADO.PAPELAGAROSAPOLIACRILAMIDAPOLIACRILAMIDA
MOVILIDAD DEPENDE DE CARGA Y TAMAÑO
-
+pI
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ELECTROFORESIS EN AGAROSAACIDOS NUCLEICOS
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ELECTROFORESIS DE SDS-POLIACRILAMIDAPROTEINASPROTEINAS
REVELADO CON COLORANTES:AZUL DE COOMASSIE
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MUCHO CUIDADO EN EL UC O CU OLABORATORIO...!
No olvideis la bata de laboratorioNo olvideis los guiones de prácticasNo olvideis los guiones de prácticasNo olvideis traer firmado la hoja de conocimiento de normativaNo olvideis una calculadora, un lapiz y una goma....