Cromatografia per esclusione molecolare o filtrazione su gel Le molecole proteiche fluiscono lungo...
-
Upload
fulvio-rosa -
Category
Documents
-
view
245 -
download
1
Transcript of Cromatografia per esclusione molecolare o filtrazione su gel Le molecole proteiche fluiscono lungo...
Cromatografia per esclusione molecolare o filtrazione su gel
Le molecole proteiche fluiscono lungo una colonna riempita con granuli di un materiale inerte poroso (gel).
Il gel consiste in una rete aperta, tridimensionale. I pori all’interno del gel sono di dimensioni tali che non sono accessibili a grandi molecole ma sono accessibili a piccole molecole.
Le molecole grandi non possono entrare e restano nel volume escluso. Le molecole piccole entrano nei pori e sono ritardate nella colonna.
vol eluizione
Abs280
PM 100.000
PM 25.000
Il volume morto (V0) (detto anche volume della fase mobile) corrisponde al volume della colonna non occupato dalla fase stazionaria solida.
Materiale usato per gel filtrazione
Gel filtrazione: condizioniIl materiale di supporto dovrebbe essere completamente inerte rispetto alla proteinaAdsorbimento di proteine sul gel
Interazione elettrostatica – si evita utilizzando alta f. ionicaInterazione idrofobica – si evita utilizzando bassa f. ionica
La capacità risolutiva dipende dal rapporto volume colonna/volume campione,dal grado di diffusione del campione e da un eventuale comportamento non ideale della colonna.
Omogeneità del campione importante perché:
Inconveniente: Effetti gravitazionali fanno sì che le parti più dense del campione penetrino nel gel producendo un fronte diffuso. Si può ovviare a ciò facendo correre la colonna al contrario
Gel filtrazione: condizioni Turbolenza del flusso può causare allargamento della banda proteicaSi può ovviare a ciò diminuendo la velocità di flusso.
Granuli fini possono migliorare la qualità della separazione
migliore risoluzioneraggiungimento più veloce dell’equilibrio
Inconvenienti dei granuli fini: necessitano maggior pressione di esercizio con conseguente possibile distorsione e blocco del flusso
Granuli fini e rigidi
Considerazioni praticheVolume campione = 1 – 3 % volume colonnaForma della colonna
colonna larga colonna lunga
vantaggi: maggior vel. di flussosvantaggi: minor risoluzione, difficoltà ad applicare il campione in maniera omogenea
vantaggi: piccole distorsioni orizzontali nell’ applicazione del campione non provocano grosse perdite di risoluzionesvantaggi: minor velocità di flusso
Altezza colonna: 20 – 40 volte il diametroIl gel viene risospeso nella soluzione tampone e versato nella colonna in un singolo step.Vel. di flusso – dipende dal tipo di gelGel costituito da particelle soffici: 2-5 cm/h (destrano (Sephadex); poliacrilammide (Biogel))Gel costituito da particelle rigide: 10-15 cm/h (destrano/poliacrilammide (Ultrogel) Destrano/bisacrilammide (Sephacryl))
Applicazione e raccolta del campione
volume campione: 1-3% vol. colonna, conc: 10-20 mg/mlApplicazione campione
Raccolta campione
Ve è funzione approssimativamente lineare del log di massa molecolare
MOLECOLE CHE POSSIEDONO GRUPPI IONIZZABILI
Aminoacidiproteine
Acidi nucleici nucleotidi
ELETTROFORESI
Metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di uncampo elettrico.
• Metodi FRONTALI - in soluzione libera• Metodi ZONALI – attraverso un mezzo
poroso
cartagel Acetato di cellulosa
ELETTROFORESIELETTROFORESI
Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.Tecnica soprattutto ANALITICA ma anche PREPARATIVA.E’ un mezzo di separazione molto potente, fra i piu’ usati in biochimica
UN METODO ANALITICO PER CAPIRE:
• NUMERO di proteine presenti in una miscela
• GRADO DI PUREZZA
• PUNTO ISOELETTRICO
• PESO MOLECOLARE
Elettroforesi:is a method whereby charged molecules in solution, proteins and nucleic acids,
migrate in response to an electrical field
Una molecola proteica, a pH I.E.P, ha carica totale 0
SI MUOVE IN UN CAMPO ELETTRICO
allo stato stazionarioEz = 6 r v
E = campo elettricoz = carica = viscosità del mezzor = raggio (raggio di Stockes)v = velocità
La mobilità elettroforetica u = v/E = z/6 r, è proporzionale al rapporto carica/raggio
In soluzione è possibile separare le molecole PM 20.000 carica –5PM 40.000 carica –5Hanno diverso rapporto carica/raggio
A parità di carica, la mobilità elettroforetica u log PM
Their rate of migration through the electrical field, depends on the strength of the field, on the net charge, size, and shape of the molecules, and also on the ionic strength, viscosity, and temperature of the medium in which the molecules are moving
Fattori che influenzano la velocità di migrazione:
1. CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma)
2. TAMPONE (Concentrazione, pH)
3. SUPPORTO (setacciante, non setacciante)
SUPPORTINon setaccianti(Carta), acetato di cellulosa
SetacciantiGel di poliacrilammide (PAG)Gel di Agarosio
Setaccio molecolare un gel in cui la resistenza al movimento di una particella aumenta all’aumentare delle dimensioni della particella stessa.
In un gel con capacità di setaccio molecolare aumenta la differenza di mobilità tra proteine di diverso peso molecolare.
Agarose and Polyacrylamide
• Although agarose and polyacrylamide differ greatly in their physical and chemical structures, they both make porous gels.
• A porous gel acts as a sieve by retarding or, in some cases, by completely obstructing the movement of macromolecules while allowing smaller molecules to migrate freely.
• By preparing a gel with a restrictive pore size, the operator can take advantage of molecular size differences among proteins
Agarose and Polyacrylamide
• Because the pores of an agarose gel are large, agarose is used to separate macromolecules such as nucleic acids, large proteins and protein complexes
• Polyacrylamide, which makes a small pore gel, is used to separate most proteins and small oligonucleotides.
• Both are relatively electrically neutral
It inhibits convection and diffusion, which would otherwise impede separation of molecules
It allows a permanent record of results through staining after run.
Other Roles of the Solid Support Matrix?
The Net Charge is Determined by the pH of the
Medium
• Proteins are amphoteric compounds, that is, they contain both acidic and basic residues
• Each protein has its own characteristic charge properties depending on the number and kinds of amino acids carrying amino or carboxyl groups
• Nucleic acids, unlike proteins, are not amphoteric. They remain negative at any pH used for electrophoresis
Elettroforesi su gel
Il gel è costituito da una rete di filamenti che formano pori e quindi molecole con carica uguale ma con dimensioni diverse si separano per effetto di forze frizionali diverse.
Il gel è costituito da acrilammide (CH2=CH-CO-NH2)In presenza di (NH4)2S2O8 e di TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletildiammina) l’acrilammide da’ luogo a polimeri. Queste unità formano il polimero.
Se è presente anche N,N’-metilene bis-acrilammide anche essa partecipa alla polimerizzazione formando legami tra le catene
Reazione esotermica (H = -84 kJ/mol)Il radicale persolfato funge da precursore di molecole radicaliche, le quali agiscono come “iniziatori di catena” reagendo con l’acrilamide
Polimero
La quantità di iniziatore influenza la struttura del gel finale:1. Un eccesso causa un decremento della lunghezza media delle catene e quindi perdita di elasticità2. Un difetto produce reazione troppo lenta e quindi aumenta la probabilità che l’O2 atmosferico agisca da terminatore di catena
Concentrazione e separazione
La porosità del gel dipende da1) Lunghezza catene (dipende da conc. acrilammide)2) Numero di legami tra le catene (dipende dal rapporto tra acrilammide e bis-acrilammide)
Conc. acrilammide (%) Range di separazione
15
10
7.5
5.0
12000 – 43000
16000 – 68000
36000 – 94000
57000 - 212000
SDS-PAGE
Le proteine vengono fatte reagire con un detergente anionico, sodio dodecilsolfato (H3C-(CH2)10-CH2OSO3
- Na+ e formano complessi carichi negativamente.
1.4 g di SDS legano circa 1.0 g di proteina. La quantità di SDS che si lega è proporzionale al PM della proteina e quindi anche la carica negativa che questa assume è proporzionale al suo PM, ma hanno uguale densità di carica o carica per unità di lunghezza.
proteina--
- --
- -- --
--
-
Qualsiasi sia il punto isolelettrico delle molecole proteiche esse diventano cariche negativamentee possono essere separate su gel in base alla carica negativa acquisita dipendente dal suo PM
SDS viene utilizzato insieme ad agenti riducenti (DTT) che rompono ponti S-S, trattando a caldo il campione. Tale trattamento permette di dissociare le molecole nelle loro subunità.
PROTEINA NATIVA
RUOLO DELL’SDS NELLA CORSA
PERDITA DELLE STRUTTURE SECONDARIA E TERZIARIA
ACQUISIZIONE DI UNA CARICA NETTA NEGATIVA
RAPPORTO CARICA/MASSA SIMILE PER TUTTE LE PROTEINE NEL CAMPIONE
L’SDS LEGA LE PROTEINE IN UN RAPPORTO DI UN ANIONE OGNI 2 aa
LE CARICHE, IL PM E LA FORMA DI UNA PROTEINA NATIVA INFLUISCONO SULLA CORSA
La separazione avviene quindi per differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa carica per ogni proteina denaturata con SDS rimane costante.
Il trattamento con SDS elimina le differenze di forma, quindi la lunghezza della catena polipeptidica, che riflette la massa, e’ l’unico determinante della velocita’ di migrazione.
Continuous and Discontinuous Buffer Systems
• A continuous system has only a single separating gel and uses the same buffer in the tanks and the gel
• In a discontinuous system a nonrestrictive large pore gel, called a stacking gel, is layered on top of a separating gel
• The resolution obtainable in a discontinuous system is much greater than that obtainable in a continuous one. However, the continuous system is a little easier to set up
Continuous and Discontinuous Buffer Systems
running gel: è la parte inferiore e la sua funzione è quella di separare le proteine dei vari campioni sulla base del loro peso molecolare. È composto dagli stessi ingredienti dello stacking gel, ma in quantità diverse. In particolare è la concentrazione di acrilammide a variare, a seconda della porosità desiderata: concentrazioni maggiori portano a pori di dimensioni minori, dunque capaci di separare le proteine con una risoluzione maggiore.
stacking gel: è la parte superiore del gel e la sua funzione è quella di concentrare il campione proteico caricato negli appositi pozzetti, in modo che tutti i campioni comincino la loro migrazione dallo stesso punto di partenza.
Gel su lastra
0.5 – 1 mm spessore
Tris(idrossimetil)amminometano
Tris Cl pH 6.8
Tris Cl pH 8.8
CH3
H2C
OH
H2C
CH2OHNH3+
OH
Cl-
IL GEL VA IMMERSO IN UNA SOLUZIONE DI CORSA CONTENENTE GLICINA
25 mM Tris HCl pH 8.3192 mM Glicina0.1% SDS
Gel discontinuo
La concentrazione (o impaccamento) delle proteine in una banda sottile viene ottenuta grazie al pH discontinuo
Infatti nei due gel sono presenti tamponi (Tris-HCl) a pH diverso (stacking pH 6.8 e running pH 8.8)
Nel tampone di corsa (Tris-Glicina pH 8.3) è presente anche un diverso tipo di ioni (Glicinato)
Anche il campione è tamponato a pH 6.8 nel loading buffer
Nel buffer a pH 8.3 la glicina è carica negativamente e comincia a migrare con una certa velocità
pH 8.3
Arrivata al loading buffer e allo stacking (entrambi a pH 6.8) la glicina è quasi neutra ed è la specie più lenta, mentre gli ioni Cl- sono la specie più veloce
pH 6.8
pH 8.8
Cl-
Cl-Cl-
Cl-
Cl-
Cl- Cl-Cl-
Cl-
GlyGly Gly
Gly
Questo fa sì che le proteine vengano racchiuse in una regione ad elevata mobilità elettroforetica
EFFETTO STACKING
All’inizio del separating gel il pH 8.8 riporta la glicina ad un rapporto carica/massa maggiore rispetto a quello delle proteine. La glicina supera i polipeptidi, che non trovandosi più in una regione ad elevata mobilità elettroforetica rallentano notevolmentee si ritrovano compattati in una linea molto sottile. Ora le proteine si trovano tutte allo stesso livello.Nel separating la concentrazione di acrilamide è più alta, e comincia la separazionedel campione in base al peso molecolare.
Cl-Cl- Cl- Cl-
Gly PROTEINECOLORANTE
8.8
6.8
Gel discontinuo
Il gel SDS-PAGE può essere effettuato con un sistema tampone discontinuo ad un pH diverso (pH 8.3) da quello che costituisce il gel, a sua volta composto di 2 fasi a pH diverso.
I campioni vengono concentrati in zone molto piccole, portando aduna migliore separazione delle diverse specie
Il sistema è costituito da uno stacking gel (pH 6.8) e da un resolvinggel (pH 8.8).
Il campione viene introdotto nello stacking gel. In questa zona, sotto l’effetto del campo elettrico, gli ioni si muovono;i complessi proteina-SDS, hanno mobilità intermedia tra gli ioni Cl- e la glicina presente nel tampone di corsa.
Quando le specie raggiungono il resolving gel a pH 8.8, la glicina, completamente ionizzata supera i complessi proteina-SDS.
Questi quindi si separano in un campo elettrico costante sulla base della loro carica, all’interno del resolving gel.
La mobilità di una proteina è direttamente proporzionale al logaritmo decimaledella MASSA MOLECOLARE
Determining Molecular Weights of Proteins by SDS-PAGE
• Run a gel with standard proteins of known molecular weights along with the polypeptide to be characterized
• A linear relationship exists between the log10 of the molecular weight of a polypeptide and its Rf
• Rf = ratio of the distance migrated by the molecule to that migrated by a marker dye-front
• The Rf of the polypeptide to be characterized is determined in the same way, and the log10 of its molecular weight is read directly from the standard curve
NATIVE-PAGE
Si fa in assenza di SDS. Mentre nel SDS-page la mobilità dipende principalmente dal PM, nel native-page la mobilità dipende dalla carica e dal dimensione idrodinamica della proteina.Quindi dipende dalla specifica composizione amminoacidica della proteina, pH del running buffer. Dato che la proteina mantiene una struttura foldata, la sua mobilità varia con la natura della sua conformazione (più alta mobilità per conformazioni più compatte, più bassa per strutture più grosse come oligomeri e proteine unfoldate).
Quindi native-page sono sensibili a qualunque processo che altera la carica o la conformazione della proteina. Questo lo rende un ottimo strumento per studiare:
Cambiamenti della carica a causa di degradazione chimica (es. deamminazione) Conformazioni proteiche folded, unfolded o molten globule oligomeri e aggregati (sia covalenti che non covalenti) fenomeni di legame quali proteina-proteina o proteina-leganti
Preparazione del gel SDS di acrilammide
Resolving gel (15%) (per 2 minigel)H2O 2.5 ml
Lower Tris pH 8.8* 2.5 mlAcrilammide-bis metilene acrilammide (30-08)** 5.0 ml10% APS*** 35 lTEMED**** 6 l *18.17 g Tris + 0.4 g SDS in 100 ml soluzione. Portare a pH 8.8 con HCl** Soluzione acquosa contenente 30% acrilammide e 0.8% bis-metile acrilammide***Genera le specie radicaliche che permettono la polimerizzazione****TEMED = N,N,N’,N’-tetrametilen-diammina. Catalizza la reazione di formazione di radicali da parte di (NH4)2S2O8.
Stacking gel (5%) (dose per 2 minigel)H2O 2.9 mlUpper Tris pH 6.8* 1.25 mlAcrilammide-bis metilene acrilammide (30-08)** 835 l10% APS 20 lTEMED 8 l *6.6 g Tris + 0.4 g SDS in 100 ml soluzione. Portare a pH 6.8 con HCl
Trattamento campioni
Trattamento campioni 14 l di ogni campione vengono scaldati a 100 °C per 2’ insieme a 7 l di una soluzione (3xFSB) composta da: 150 ml Tris-HCl pH 6.8150 mM DTT6% SDS0.3 % blue di bromofenolo30% glicerolo Bollire a b.m. tutti i campioni per 2’. Centrifugare e caricare su gel 10 l .
Corsa e sviluppo del gel
Soluzione tampone per la corsa elettroforetica 25 mM Tris250 mM glicina 0.1 % SDSpH 8.3 Voltaggio 15 V/cm Sviluppo del gel Immergere il gel per 30’ – 12 ore in una soluzione contenente 0.25 g di Coomassie Brilliant Blue, 45 ml CH3OH, 10 ml CH3COOH,
45 ml H2O. Questa soluzione è in grado di complessarsi alle catene proteiche in modo
aspecifico mediante i gruppi cationici (ARG preferezialmente) presenti sulla loro superficie. Rimuovere l’eccesso di colorante immergendo il gel in una soluzione contenete 30% CH3OH, 10% CH3COOH, 60% H2O.
Alla fine della corsa il gel può essere colorato con blu Coomassie. Il colorante lega arginina, lisine e istidine, rendendo visibili le proteine su gel in base alla loro quantità.
Le intensità non sono quantitative se le proteine sono a PM molto diverso !
Ogni sistema di colorazione ha i suoi pregi e difetti:
la colorazione con blu Coomassie, ad esempio, è lineare e quindi in grado di fornire una quantificazione più accurata di quanto non faccia il silver staining (non lineare), ma è molto meno sensibile (fino a 100 volte)
Coomassie 100 ng
Argentica 1 ng
Isoelectric Point
• There is a pH at which there is no net charge on a protein; this is the isoelectric point (pI).
• Above its isoelectric point, a protein has a net negative charge and migrates toward the anode in an electrical field.
• Below its isoelectric point, the protein is positive and migrates toward the cathode.
Isoelectric Focusing
• Isoelectric focusing is a method in which proteins are separated in a pH gradient according to their isoelectric points
• Focusing occurs in two stages; first, the pH gradient is formed
• In the second stage, the proteins begin their migrations toward the anode if their net charge is negative, or toward the cathode if their net charge is positive
• When a protein reaches its isoelectric point (pI) in the pH gradient, it carries a net charge of zero and will stop migrating
IEF ISOELETTROFOCALIZZAZIONE
• separazione di sostanze anfotere• Separazione sulla base del pI• GEL con GRADIENTE DI pH• Si usano ANFOLITI (elettroliti anfoteri)• Sono miscele di acidi alifatici sintetici
poliammino-policarbossilici che formano un gradiente di pH nella matrice prima della sua polimerizzazione
• Gli analiti migrano verso la zona di pH corrispondente al proprio punto isoelettrico (FOCALIZZAZIONE)
• E’ utile una CALIBRAZIONE con proteine a pI noto
Il gradiente di pH e’ formato dall’ introduzione nel gel di composti conosciuti come “anfoliti”, che sono miscele complesse di acidi poliammino-policarbossilici sintetici.
Gli anfoliti possono essere acquistati per diversi range di pH, sia a banda larga (ad es. da pH 3 a pH 10) che a banda stretta (ad es. da pH 7 a pH 8)
Two-Dimensional Gel Electrophoresis
• Two-dimensional gel electrophoresis is widely used to separate complex mixtures of proteins into many more components than is possible in conventional one-dimensional electrophoresis
• Each dimension separates proteins according to different properties
O’Farrell 2D Gel System
• The first dimension tube gel is electrofocused
• The second dimension is an SDS slab gel
• The analysis of 2-D gels is more complex than that of one-dimensional gels because the components that show up as spots rather than as bands must be assigned x, y coordinates
O’Farrell 2D Gel System
MAPPA DI PROTEINE: proteomica differenzialeSEQUENZIAMENTO di proteina da singola macchiaAnalisi con SPETTROMETRIA DI MASSA
SDS-PAGE(Sodium Dodecyl (lauryl) Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)
POZZETTI PER CARICAMENTO
STACKING GEL
SEPARATING GEL
TRIS-HCl 0.5 M pH 6.8
ACRILAMIDE 5%
SDS
TRIS-HCl 1.5 M pH 8.8
ACRILAMIDE > 5%
SDS
-
+