PRACTICA N 14: TECNICAS PARA ESTUDIOS MORFOLOGICOS DE HELMINTOS Y ARTROPODOS Para conservar los parsitos de forma indefinida, a fin de que su morfologa y estructura no se alteren con el tiempo, es preciso fijar los tejidos. Dependiendo del grupo zoolgico al que pertenezca el parsito que pretendemos conservar, y la naturaleza de sus estructuras corporales, la tcnica empleada podr variar. En el caso de que se trate de animales blandos, musculosos o retrctiles, previamente a la fijacin se debe proceder a la relajacin del animal, para que pueda permitir su estudio y determinacin sin alteraciones morfolgicas. 1. Relajacin: Los animales pueden ser dormidos o relajados con varios procedimientos: a) Con lquidos calientes (70-75C). El lquido de Travasos a 70-75C hace que el cuerpo, de los Nematodos sumergidos el l, se relaje y estire, antes de que mueran. b) Con fro: Colocando a los ejemplares en medio isotnico y enfrindolos en la nevera. (En el caso de las duelas y otros platelmintos, da buen resultado situar los animales entre dos lminas de cristal y mantenerlas apretadas hasta su muerte y posterior fijacin.) c) Colocando los ejemplares vivos en medio isotnicos al que se le va aadiendo lentamente solucin alcohlica de mentol y en el que deben de permanecer una hora. 2. Conservacin indefinida: Los parsitos se pueden conservar indefinidamente en lquidos con base en fijadores como el formol 4% o el alcohol 70 %, dependiendo del filo, pero conviene realizar una fijacin previa con fijadores ms especficos. 3. Etiquetado: Para que un espcimen o una muestra tengan valor y puedan servir como base de un estudio cientfico debe ineludiblemente de ir acompaado de etiquetas identificativas en la que se indiquen: Nombre especfico, Nombre del hospedador, Ubicacin del parsito, Localidad de recogida, fecha, y colector. Lquidos Fijadores: Existen diversos lquidos fijadores que preservan los tejidos durante mucho tiempo. Fijacin de Platelmintos y Acantocfalos:. La mayora de ellos tienen como base el formol, el alcohol, y el cido actico. Cuando no se pretende realizar posteriores estudios histolgicos, el ms sencillo y utilizado de los fijadores es el formol al 4 % . Formol al 4% Formalina (formol comercial al 40%) 1 parte Suero fisiolgico 9 partes Cuando se desea conservar la flexibilidad de los ejemplares, se pueden emplear satisfactoriamente para Platelmintos y Acantocfalos los fijadores de Gilson, de Bouin o el formol-actico- formol, cuyas composiciones a continuacin se indican. Fijador de Gilson:

Sublimado corrosivo 5 g. Agua destilada 220 ml Acido Ntrico 4 ml Acido actico glacial 1 ml Alcohol etlico 70% 25 ml

Fijador de Bouin: Solucin acuosa saturada de cido pcrico 75 partes Formol comercial 25 partes Acido actico glacial 5 partes Formol - actico - alcohol (F.A.A.) Alcohol etlico al 95 % 50 partes Formol comercial 10 partes Acido actico glacial 2 partes Agua destilada 25 partes

Fijacin de Artrpodos, Nematodos, o aquellos que tengan estructuras calcreas: deben de fijarse en Alcohol de 70%. En Nematodos, por su cutcula externa, los compuestos con base en formol no so los ms adecuados, por que se deben fijar en alcohol de 70%. Se puede emplear, previamente, el lquido de Trasvasos, o una solucin de glicerina y alcohol o formalina caliente al 5%. Lquido de Trasvasos: Solucin salina fisiolgica de Ringer (0.9 %) 92 parteso o o

Formol comercial 5 partes Acido actico glacial 3 partes. Al cabo de una hora puede pasarse para su conservacin definitiva en alcohol al 70%.

Solucin de glicerina - alcohol:

Alcohol etlico de 70% 90 ml. Glicerina 10 ml Puede servir como conservante definitivo.

Preparacin y Montaje 1.- Preparaciones semipermanentes de huevos de helmintos: A partir de heces: Se toman 1-2 gr. de heces en una pequea cantidad de agua. Se filtra la suspensin a travs de una gasa. Se mezcla el filtrado con un volumen igual de formol al 4%. Se centrifuga y elimina el sobrenadante. Se agita el sedimento y se toma una gota que se coloca sobre un cubre circular de 22 mm. Sobre ste se coloca, concntricamente; otro de 18 mm. Cuando la solucin comienza a secarse por los bordes, se coloca una gota de solucin ligera de resina damar en el centro del cubre pequeo y se invierte, apoyndolo sobre un portaobjetos , por lo que la resina se distribuir sellando el borde del cubre pequeo. Los huevos de la suspensin fecal en formol al 4% quedan entre los dos cubreobjetos. Al cabo de un mes se puede sellar al preparacin con asfalto, Murrayita o laca de uas.

Tinciones permanentes: Las preparaciones frescas, coloraciones con iodo y concentracin de la muestra facilitan la primera aproximacin al tipo de parsitos, permitiendo la deteccin de quistes y huevos. Pero la determinacin exacta de los mismos solo se logra con preparaciones permanentes, en las que los detalles citolgicos se revelan con claridad. Modo de proceder: Con varilla se extiende sobre un porta limpio una fina capa de heces. (En las heces muy duras es preciso aadir una gota de suero fisiolgico) Las heces frescas es preciso fijarlas despus de realizar el frotis. Si se secan no son tiles. Cuando la muestra est fijada con PVA, se revuelve la muestra, se filtra por gasa y tras sedimentacin se toma una pequea porcin con varilla., colocndola sobre papel absorbente para eliminar el exceso de PVA. Se extiende sobre el porta y deja secar a T ambiente durante 2 horas. Posteriormente se puede teir. 2.- Preparaciones de adultos de Helmintos. Los pequeos ejemplares fijados, que por sus especiales caractersticas de transparencia, sern estudiados bajo lupa o microscopio, debern ser montados en portaobjetos de cristal realizando as preparaciones permanentes. Procedimiento bsico: 1. Fijacin: Con formol, o alcohol, segn el tipo de animal. 2. Coloracin: En ocasiones resulta indicado, para resaltar las estructuras internas que se ven por transparencia, una coloracin sencilla con carmn, iodo, u otros colorantes. 3. Deshidratacin: Se hace pasar por baos sucesivos de alcoholes de gradacin creciente .El tiempo se fija segn tamao. 4. Intermediario: Una vez escurrido el alcohol, y sin que el ejemplar se seque, se coloca sobre el portaobjetos y se aade una gota de xilol. 5. Aclarado: Se puede aadir una gota de creosota de haya, que vuelve transparente la preparacin. 6. Inclusin: Escurrido el xilol ( y sin que nunca se seque) se pone la resina necesaria para el montaje (Blsamo de Canad, resina damar, o resinas sintticas como Eukit, , etc). Sobre la resina se coloca el cubreobjetos, procurando que no queden burbujas de aire. (Apoyando el borde del mismo sobre el porta con un ngulo de 40 , y se deja caer suavemente). Se dejan secar en posicin horizontal en estufa durante 24 horas. 7. Etiquetado: En una etiqueta adhesiva de tamao adecuado se identifica la preparacin indicando: Nombre del especimen; Hospedador,Ubicacin, Procedencia; Autor del montaje y fecha. 3.- Aclaracin de los Nematodos: La impermeabilidad de su cutcula hace que los colorantes no penetren con facilidad, por lo que, para el estudio de sus rganos internos, deben de hacerse transparentes y montarse provisionalmente en glicerina, glicerina-gelatina, fenol al 88% o lactofenol. Los ejemplares deben de estar en alcohol 70%, calentado a 70 C. Si estuvieran fijados en formol, debern pasarse a una mezcla a partes iguales de formol y alcohol 70% durante 3 horas y luego se hacen otros dos pases de 3 h. Por alcohol 70%.

Glicerina: En una placa, con tapa no ajustada, se coloca glicerina al 10% en alcohol de 70%. para que la evaporacin lenta del alcohol permita el aclarado por la glicerina. (Puede tardar varios das) Glicerogelatina: o Gelatina incolora (Knox u otra) 8 g o Agua destilada 52 ml o Glicerina 50 ml o Albmina de huevo (freca) 5 ml o Cristales de fenol 0.1 g Modo de preparacin: Remojar la gelatina en agua 1 hora. Disolver calentando ligeramente. Aadir la glicerina y la clara de huevo, agitar hasta mezclar por completo y despus calentar a 75 C durante 30 mint. Filtrar a travs de varias capas de franela fina. Aadir cristales de fenol al filtrado y mantener en frasco de boca ancha firmemente cerrado. Modo de empleo: Para montar el jemplar, transferirlo de la glicerina a un porta y cubrirlo con 23 gotas de gliceroglatina fundida . Colocar un cubreobjetos circular. Cuando se haya endurecido, se colocan unas gotas de Permount encima de cubreobjetos y se coloca otro cubreobjetos, ms grande, cuadrado. Se sella la preparacin rebordeando. ste mtodo es excelente para las preparaciones permanentes de huevos de helmintos. Fenol al 88%: (Atencin es corrosivo de metales y piel!!!!) El aclarado es ms rpido si desde alcohol al 70% se pasa a fenol al 88%. Los ejemplares grandes se colocan en una placa, mientras que los pequeos se puede hacer en un porta excavado con un cubre. El tiempo del aclarado es aproximadamente de 5 a 10 minutos. Una vez terminada la observacin se elimina el fenol con varios pasos por alcohol de 70%, donde se conservarn o en alcohol-glicerina. Lactofenol: Aunque menos rpido tamin es menos custico y ms seguro de usar que el fenol. o Fenol licuado 1 parte. o Acido lctico 1 parte o Glicerina . 2 partes o Agua destilada. 1 parte Si se utiliza en caliente, el aclarado es ms rpido y existe menos distorsin. 4.- Preparaciones semipermanentes de Nematodos. Una alternativa al procedimiento anterior que sirve para el montaje in toto tanto de Nematodos como de pequeos artrpodos. Lquido de Hoyer:o o o o

Goma arbiga.. 30 g. Agua destilada. 50 ml Glicerina.. 20 ml. Hidrato de coral 200g.

Mezclar en el orden indicados y filtrar a travs de 8-10 capas de gasa. Empleo: Se coloca una gota de lquido de montado en un portaobjetos, orientando los ejemplares, y aplicando un cubreobjetos. Para extender los ejemplares vivos se calienta la preparacin en la llama de alcohol. Al cabo de un mes se puede sellar los bordes, con goma de asfalto de Murrayita, o laca de uas. 5.- Preparaciones permanentes teidas de Platelmintos y Acantocfalos. El estudio de pequeos animales montados enteros, se facilita, si previamente son coloreadas algunas de sus estructuras con diversos procedimientos. Hematoxilina de Herlich: o Hematoxilina. 2 g. o Alcohol etlico 100ml o Glicerina 100 ml o Acido actico glacial 10 ml o Sulfato alumnico-potsico 10 g. Solucin madre: Se mezcla la hematoxilina con el alcohol y se aade la glicerina y el cido actico. El sulfato Al-K, se disuelve en agua destilada templada, y se aade lentamente agitando. Se deja madurar 3-4 semanas en un frasco semitapado. Para teir se emplea una parte de solucin madre en 3-4 partes de alcohol a 35%. Mtodo de empleo: Los ejemplares, conservados en alcohol 70%, se pasan a alcohol 35% durante 10 a 15 minutos., tindolos con una disolucin de hematoxilina durante 10-15 mint. Se decoloran con alcohol 70% (solo quedan rosa las gnadas). Se alcaliniza con alcohol 70% con bicarbonato sdico, durante 20 mint. Deshidratacin con alcoholes de gradacin creciente, (20 minutos en cada uno). Se aclaran con aceite de clavo o metilsalicilato. Se montan en resina. Carmn actico de Semichon:o o o

Acido Actico glacial 1 parte Agua destilada 1 parte Polvo de Carmn exceso

Solucin madre: En un matraz Erlenmeyer, se mezclan en proporciones iguales: Acido actico glacial y Agua destilada, aadiendo en exceso polvo de carmn. Se calienta al bao Mara (95100 C) durante 15 minutos. Se enfra rpidamente al grifo y se deja sedimentar el carmn no disuelto, filtrando el sobrenadante. Par teir se diluye una parte en 2-3 de alcohol al 70%. Mtodo: Los ejemplares conservados en alcohol, se transfieren directamente a la solucin tintrea. tienen (dependiendo del tamao) durante 5 a 15 minutos. Se decoloran con alcohol clohdrico ( alcohol de 70% con un 1% de cido clorhdrico), hasta que solo queden rasa claro las gnadas. Se alcaliniza con alcohol 70% con bicarbonato durante 20 minutos. Se deshidratan con pases por alcohol de 95% y absoluto. Se montan en resina sinttica. 6.- Preparacin y conservacin de Artrpodos. Dpteros: Las larvas y pupas se matan metindolas en agua hirviendo, y pasndolas al cabo de 1 o 2 minutos a alcohol de 70%, donde se conservan.

Imagos de mosquitos y moscas, se matan en un frasco con cianuro o cloroformo, conservndose posteriormente en alcohol de 70%, o debidamente pinchados con alfiler entomolgica y extendidos. Siphonaptera: (Pulgas). Para aclararlas se sumergen en solucin acuosa de Hidrxido potsico al 10%, durante 24-36 horas. Se pasan despus a agua acidificada con unas gotas de clohdrico. Se deshidratan con pases de 30 minutos en alcoholes de gradacin creciente, se aclara en creosota de haya, quitando su exceso con xilol y se montan en goma de damar o resina sinttica. Garrapatas y piojos: Se matan con agua hirviendo (unos segundos). Se estiran las patas, (con pinzas o agujas), se pasan a alcohol de 70%. Para su montado en portas, se sigue el procedimiento empleado con las pulgas, omitiendo el paso por Hidrxido sdico. caros: Pueden montarse vivos o a partir de alcohol de 70% en lquido de Hoyer. Piezas bucales de Artrpodos picadores-chupadores: Para hacer la diseccin de la boca de un artrpodo, 1s e coloca la cabeza en una gota de glicerina. bajo lupa y con agujas, se separan los msculos que unen las piezas quitinizadas. Si se quiere una preparacin duradera, se puede montar en lquido de Hoyer, como los caros PREPARACION DE MONTAJES DE HELMINTOS FIJACION: A los platelmintos grandes hay que prensarlos.

Amarrarlos entre dos lminas con pabilo y ejercer presin. Colocarlo en una solucin de AFA.

COLORACIN Y MONTAJE: A.- LAVADO: Desprensar y colocar en agua destilada durante 30 120 minutos.

B.- TINCION: Colocar los parsitos en el colorante hematoxilina durante 30 minutos a mas.

C.- DECOLORACION: Colocar en agua cida. Luego lavar el exceso acido y detener la decoloracin en agua destilada.

Realizar el viraje de colorante en agua alcalina.

D.- DESHIDRATACION: Deshidratar en Alcoholes de 30- 50 70 80 90 - Absoluto. (10 minutos cada uno).

E.- ACLARAMIENTO: Con xilol.

F.- MONTAJE: Con Entellan.

OBSERVACIONES

Adulto de Fasciola hepatica

Proglotide de Diphylobothrium pacificum

PREPARACION DE MONTAJES DE ARTROPODOS MONTAJE: Sacar al parasito del conservador y colocarlo en NaoH 10% para su aclaracin.

Neutralizar colocndolo en acido actico 10%.

Lavar en agua destilada varias veces. Realizar en montaje con Entellan

OBSERVACIONES

Pediculus humanus.

Pulex irritans.

Ixodes sp.